RU2706297C2 - Композиции для получения глюкозных сиропов - Google Patents

Композиции для получения глюкозных сиропов Download PDF

Info

Publication number
RU2706297C2
RU2706297C2 RU2016135029A RU2016135029A RU2706297C2 RU 2706297 C2 RU2706297 C2 RU 2706297C2 RU 2016135029 A RU2016135029 A RU 2016135029A RU 2016135029 A RU2016135029 A RU 2016135029A RU 2706297 C2 RU2706297 C2 RU 2706297C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
ser
ala
thr
gly
leu
Prior art date
Application number
RU2016135029A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2016135029A3 (ru
RU2016135029A (ru
Inventor
Сиро ФУКУЯМА
Кейити АЯБЕ
Original Assignee
Новозимс А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Новозимс А/С filed Critical Новозимс А/С
Publication of RU2016135029A publication Critical patent/RU2016135029A/ru
Publication of RU2016135029A3 publication Critical patent/RU2016135029A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2706297C2 publication Critical patent/RU2706297C2/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/30—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols, e.g. xylitol; containing starch hydrolysates, e.g. dextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/30—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols, e.g. xylitol; containing starch hydrolysates, e.g. dextrin
    • A23L29/35—Degradation products of starch, e.g. hydrolysates, dextrins; Enzymatically modified starches
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
    • C12N9/2457—Pullulanase (3.2.1.41)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01001—Alpha-amylase (3.2.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01003—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01041—Pullulanase (3.2.1.41)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C13—SUGAR INDUSTRY
    • C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
    • C13K1/00—Glucose; Glucose-containing syrups
    • C13K1/06—Glucose; Glucose-containing syrups obtained by saccharification of starch or raw materials containing starch
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Jellies, Jams, And Syrups (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к пищевой промышленности. Представлена композиция для получения глюкозного сиропа из ожиженного крахмала, содержащая фермент альфа-амилазу, пуллуланазу и глюкоамилазу, где альфа-амилаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 90% тождественность последовательности SEQ ID NO: 5 или ее зрелого полипептида, где пуллуланаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 90% тождественность последовательности SEQ ID NO: 3 или ее зрелого полипептида, и где глюкоамилаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 90% тождественность последовательности SEQ ID NO: 4 или ее зрелого полипептида. Изобретение позволяет повысить выход глюкозного сиропа. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 пр.

Description

Ссылка на перечень последовательностей
Настоящая заявка содержит перечень последовательностей в машиночитаемой форме, который включен в данный документ посредством ссылки.
Предпосылки изобретения
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим альфа-амилазу, пуллуланазу и глюкоамилазу. Кроме того настоящее изобретение относится к способам получения глюкозного сиропа, содержащего высокий % DX.
Описание уровня техники
Крахмал, как правило, состоит из приблизительно 80% амилопектина и 20% амилозы. Амилопектин представляет собой разветвленный полисахарид, в котором линейные цепи из остатков альфа-1,4-D-глюкозы соединены альфа-1,6-глюкозидными связями. Амилопектин частично расщепляется альфа-амилазой, которая гидролизует 1,4-альфа-глюкозидные связи, что дает разветвленные и линейные олигосахариды.
Альфа-амилазы используют в промышленных масштабах для различных целей, как, например, на начальных стадиях переработки крахмала (например, ожижении). Длительное расщепление амилопектина альфа-амилазой приводит в результате к образованию так называемых предельных альфа-декстринов, которые не подвергаются дальнейшему гидролизу альфа-амилазой. Альфа-амилазы (1,4-α-D-глюкан-глюканогидролаза, EC 3.2.1.1) составляют группу ферментов, которые катализируют гидролиз крахмала и других линейных и разветвленных олиго- и полисахаридов с 1,4-глюкозидными связями.
Разветвленные олигосахариды можно подвергать гидролизу до линейных олигосахаридов при помощи деветвящего фермента. Оставшиеся разветвленные олигосахариды можно деполимеризовать до D-глюкозы при помощи глюкоамилазы, которая гидролизует линейные олигосахариды до D-глюкозы.
Деветвящие ферменты, которые могут разрушать амилопектин, разделены на два класса: изоамилазы (E.C. 3.2.1.68) и пуллуланазы (E.C. 3.2.1.41) соответственно. Изоамилаза гидролизует альфа-1,6-D-глюкозидные ветвящиеся связи в амилопектине и предельных бета-декстринах, и ее можно отличить от пуллуланаз по неспособности изоамилазы разрушать пуллулан и по ограниченному действию на предельные альфа-декстрины.
В области техники хорошо известно добавление изоамилаз или пуллуланаз при способах превращения крахмала. Пуллуланаза является деветвящим ферментом для крахмала с пуллулан-6-глюкано-гидролазной активностью (EC3.2.1.41), который катализирует гидролиз α-1,6-глюкозидных связей в пуллулане, высвобождая мальтотриозу с восстанавливающими углеводными концами. Как правило, пуллуланазу используют в комбинации с альфа-амилазой и/или глюкоамилазой.
Пуллуланазы известны из уровня техники. В патентах US 6074854 и US 5817498 раскрыта пуллуланаза из Bacillus deramificans. В WO 2009/075682 раскрыта пуллуланаза, полученная из Bacillus acidopullulyticus.
Глюкоамилаза (1,4-альфа-D-глюкан-глюкогидролаза, EC 3.2.1.3) представляет собой фермент, который катализирует отщепление D-глюкозы от невосстанавливающих концов молекул крахмала или родственных олиго- и полисахаридов. Глюкоамилазы продуцируются несколькими видами нитчатых грибов и дрожжей, причем такие ферменты из Aspergillus, Talaromyces, Penicillium и Trametes являются особенно важными в коммерческом отношении.
В коммерческом отношении глюкоамилазы используют для превращения крахмалистого материала, который уже частично гидролизован альфа-амилазой и, например, пуллуланазой до глюкозы в виде сиропа.
Перед ферментативной обработкой размер частиц крахмального материала, такого как цельные зерна, может быть уменьшен, например, путем помола, чтобы открыть доступ к структуре и обеспечить возможность дальнейшей обработки. При сухом помоле цельные зернышки подвергают помолу и используют. Мокрый помол обеспечивает хорошее разделение зародыша и муки (гранул крахмала и белка) и его часто применяют в местах, где гидролизат крахмала используют в получении, например, сиропов. Как сухой, так и мокрый помол хорошо известны в области переработки крахмала, и их можно использовать в способе по настоящему изобретению.
После помола, как правило, крахмальный материал является ожиженным. Ожижение выполняют в присутствии альфа-амилазы, предпочтительно бактериальной альфа-амилазы и/или кислой грибной альфа-амилазы.
Во время ожижения длинноцепочечный крахмал расщепляется на более короткие разветвленные и линейные элементы (мальтодекстрины) при помощи альфа-амилазы. Ожижение можно выполнять как трехстадийный процесс с горячей суспензией. Процесс ожижения выполняют при температуре 70-95°C, например 80-90°C, например около 85°C, в течение от приблизительно 10 минут до 5 часов, как правило, в течение 1-2 часов. После такой обработки ожиженный крахмал, как правило, будет характеризоваться "декстрозным эквивалентом" (DE) 10-15.
В целом ожижение и условия ожижения хорошо известны из уровня техники.
Для получения глюкозного сиропа ожиженный крахмальный материал осахаривают. При типичном способе осахаривания мальтодекстрины, полученные во время ожижения, превращаются в декстрозу при добавлении глюкоамилазы и деветвящего фермента, такого как изоамилаза (патент США № 4335208) или пуллуланаза. Температуру понижают до 60°C перед добавлением глюкоамилазы и деветвящего фермента. Процесс осахаривания длится 24-72 часов. Перед добавлением осахаривающих ферментов pH снижают до значения ниже 4,5, в то же время поддерживая высокую температуру (выше 95°C) для инактивации ожижающей альфа-амилазы.
Для получения сиропа используемые ферментативные композиции должны по меньшей мере содержать глюкоамилазу и пуллуланазу, однако, альфа-амилазная активность часто также будет присутствовать, например при использовании глюкоамилазы из Aspergillus niger альфа-амилаза из A. niger из организма-источника также будет присутствовать в композиции. Неожиданно было обнаружено, что для достижения высоких значений % DX в сиропе, например свыше 95%, уровень альфа-амилазы, присутствующей в композиции, необходимо тщательно контролировать.
Настоящее изобретение предусматривает композиции и способы для получения высокоглюкозных сиропов с % DX около 96%.
Применениями сиропов с более высоким содержанием DX являются: получение DMH (декстрозы моногидрата), химических продуктов брожения, таких как органические кислоты (такие как лимонная кислота, молочная кислота и т. д.) или аминокислоты (такие как L-лизин, L-треонин, L-триптофан, глутамат натрия и L-цистеин), высокофруктозных кукурузных сиропов, кристаллической глюкозы и других специализированных сиропов.
Краткое описание изобретения
В первом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей фермент альфа-амилазу, пуллуланазу и глюкоамилазу, где соотношение дозы пуллуланазы, выраженной как NPUN/г, и дозы альфа-амилазы, выраженной как FAU(A)/г или KNU/г, составляет по меньшей мере 60.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения глюкозного сиропа из ожиженного крахмала, включающему (a) приведение ожиженного крахмала в контакт с глюкоамилазой, пуллуланазой и необязательно альфа-амилазой, где соотношение дозы пуллуланазы, выраженной как NPUN/г DS, и дозы альфа-амилазы, выраженной как FAU(A)/г DS или как KNU/г DS, составляет по меньшей мере 60, в частности, по меньшей мере 75, в частности, по меньшей мере 100, конкретнее, по меньшей мере 150, конкретнее, по меньшей мере 200, конкретнее, по меньшей мере 250, конкретнее, по меньшей мере 300, конкретнее, по меньшей мере 400, конкретнее, по меньшей мере 500, конкретнее, по меньшей мере 600, конкретнее, по меньшей мере 800 или, в случае отсутствия альфа-амилазы, пуллуланаза присутствует в дозе по меньшей мере 0,5, в частности, по меньшей мере 0,75, в частности, по меньшей мере 1,0, в частности, по меньшей мере 1,5 NPUN/г DS, и (b) осахаривание ожиженного крахмала.
Определения
Альфа-амилаза. Альфа-амилазы (1,4-альфа-D-глюкан-глюканогидролаза, E.C. 3.2.1.1) представляют собой группу ферментов, которые катализируют гидролиз крахмала и других линейных и разветвленных олиго- и полисахаридов с 1,4-глюкозидными связями. Альфа-амилазы, используемые в соответствии с настоящим изобретением, можно получать из грибных или бактериальных источников. В контексте настоящего изобретения, активность грибной альфа-амилазы можно определять как FAU(A) при помощи анализа с альфа-амилазой, описанного в разделе «Материалы и способы». Активность бактериальных альфа-амилаз можно определять как единицы Kilo Novo альфа-амилазы (KNU) в соответствии с процедурой, описанной ниже в абзаце под заголовком «Единицы Kilo Novo альфа-амилазы (KNU)».
Единицы кислой альфа-амилазы (FAU(A)). Активность кислой альфа-амилазы можно измерить в FAU(A) (единицах кислой грибной альфа-амилазы). 1 FAU(A) определяют как количество фермента, которое расщепляет 5,260 мг сухой массы крахмала за час при стандартных условиях, определенных в таблице «Первая реакция, расщепление крахмала» ниже.
Кислая альфа-амилаза, эндо-альфа-амилаза (1,4-альфа-D-глюкан-глюканогидролаза, E.C. 3.2.1.1), гидролизует альфа-1,4-глюкозидные связи во внутренних участках молекулы крахмала с образованием декстринов и олигосахаридов с различными длинами цепей. Интенсивность цвета, образуемого с йодом, прямо пропорциональна концентрации крахмала. Амилазную активность определяют с использованием обратной колориметрии как снижение концентрации крахмала при определенных аналитических условиях.
FAU(A), активность кислой альфа-амилазы определяют в соответствии со следующим описанием. Принцип реакции основан на двух стадиях. На первой стадии фермент кислая альфа-амилаза гидролизует крахмал до различных олигосахаридов. На второй стадии йод образует комплекс синего цвета с крахмалом, а не с продуктами расщепления. Интенсивность цвета тем самым прямо пропорциональна концентрации крахмала. Активность определяют с использованием обратной колориметрии как снижение концентрации крахмала при определенных аналитических условиях.
Первая реакция, расщепление крахмала
Субстрат Крахмал, примерно 0,3 г/л
Буфер Цитратный, примерно 0,05 M
CaCl2, 1,85 мМ
pH 2,50 ± 0,05
Температура инкубации 37°C
Время реакции 180 секунд
Рабочий диапазон для фермента 0,01-0,04 FAU(A)/мл
Вторая реакция, комплекс крахмал-йод
Йод 0,0432 г/л
Температура инкубации 37°C
Время реакции 60 секунд
Длина волны 600 нм
Единицы Kilo Novo альфа-амилазы (KNU)
Активность бактериальной альфа-амилазы можно определять, используя картофельный крахмал в качестве субстрата. Способ основан на разложении крахмала в растворе при помощи амилазы и того факта, что крахмал дает сине-черный цвет в присутствии йода. По мере прохождения ферментативной реакции аликвоты реакционной смеси отбирали и анализировали на содержание крахмала в них путем смешивания с раствором йода. По мере разрушения крахмала сине-черный цвет в присутствии йода тускнеет и постепенно превращается в красновато-коричневый цвет. Его сравнивают со стандартом из цветного стекла. Конечная точка достигается, когда цвет соответствует стандарту из стекла.
Одну единицу Kilo Novo альфа-амилазы (KNU) определяют как количество фермента, которое при стандартных условиях, определенных в таблице «KNU» ниже (т. е. при 37°C +/- 0,05; 0,0003 M Ca2+ и pH 5,6), расщепляет с образованием декстринов 5260 мг/час крахмала в виде сухого вещества; например растворимого крахмала Merck Amylum.
KNU
Температура 37±0,05°C
pH 5,6
Концентрация субстрата 4,63 мг сухого веса/мл
Время реакции 7-20 мин, до 1 ч
Концентрация Ca2+ примерно 0,0003 M для реакционной смеси, содержащей 2 мл раствора образца
Пуллуланаза. Термин «пуллуланаза» означает деветвящий фермент для крахмала с пуллулан-6-глюкано-гидролазной активностью (EC3.2.1.41), который катализирует гидролиз α-1,6-глюкозидных связей в пуллулане, высвобождая мальтотриозу с восстанавливающими углеводными концами. В контексте настоящего изобретения пуллуланазную активность определяют как NPUN в соответствии с процедурой, описанной в «Материалах и способах» и в следующем абзаце.
Пуллуланазная активность (NPUN). NPUN (новая единица Novozymes пуллуланазы) представляет собой единицу эндопуллуланазной активности, измеренной при помощи следующей процедуры.
1 NPUN = одну единицу пуллуланазы (NPUN) определяют как количество фермента, которое высвобождает восстанавливающие концы, соответствующие 0,35 мкмолям глюкозы, за минуту при стандартных условиях, определенных в таблице «Первая реакция, расщепление пуллулана» ниже.
При первой реакции субстрат одинаково присутствует как в анализируемом образце, так и в холостой пробе. Однако реакцию с анализируемым образцом осуществляют при pH 5,0, в то время как реакция в холостой пробе отсутствует при pH 9,6, где ни пуллуланазы, ни амилоглюкозидазы (глюкоамилаза) не являются активными как ферменты.
Первая реакция, расщепление пуллулана
Субстрат BH4-восстановленный пуллулан, 5,3 г/л
Буфер (анализируемого образца) Ацетатный, примерно 0,1 M
EDTA, 5,3 мМ
Акарбоза, 0,018% (если образец содержит глюкоамилазу)
pH (анализируемого образца) 5,0
Буфер (холостой пробы) CHES, 42 мМ
ацетатный, 17 мМ
EDTA, 5,3 мМ
pH (холостой пробы) 9,6
Температура инкубации 50°C
Время реакции 540 секунд
Рабочий диапазон для фермента 0,03-0,15 NPUN/мл
При второй реакции pH доводят до примерно 9,6 и глюкоза в образце фосфорилируются до невосстанавливающего D-глюкозо-6-фосфата глюкокиназой, которая обладает наилучшей активностью и стабильностью в данном диапазоне и является специфичной по отношению к глюкозе при pH 9 (см. Goward, Biochem. J. 1986, 237, pp 415-420). Данная стадия зависит от одинакового pH в анализируемом образце и холостой пробе для удаления равных количеств глюкозы в обоих.
Вторая реакция, удаление фоновой глюкозы
Субстрат глюкоза в образце, после первой реакции
Буфер CHES, 58 мМ (анализируемый образец) или 76 мМ (холостая проба)
ацетатный, 43 мМ (анализируемый образец) или 7,2 мМ (холостая проба)
EDTA, 2,2 мМ
ATP, 1,11 мг/мл
MgCl2, 4,4 мМ
Глюкокиназа 0,11 ед./мл
pH примерно 9,6
Температура инкубации 50°C
Время реакции 720 секунд
Глюкоамилаза. Термин глюкоамилаза (1,4-альфа-D-глюкан-глюкогидролаза, EC 3.2.1.3) определен как фермент, который катализирует отщепление D-глюкозы от невосстанавливающих концов молекул крахмала или родственных олиго- и полисахаридов. В контексте настоящего изобретения глюкоамилазную активность определяют как AGU в соответствии с процедурой, описанной в «Материалах и способах» и в следующем абзаце.
Глюкоамилазная активность (AGU). Единицу глюкоамилазы (AGU) определяют как количество фермента, которое гидролизует 1 микромоль мальтозы за минуту в 0,1 M ацетатном буфере при температуре инкубации 37°C, pH 4,3, начальной концентрации мальтозы 100 мМ и времени реакции 6 минут, образуя при этом альфа-D-глюкозу. Определение употребляется по отношению к рабочему диапазону для фермента 0,5-4,0 AGU/мл.
После инкубации реакцию можно останавливать при помощи NaOH и количеств глюкозы, измеренных при помощи следующего двухстадийного способа цветной реакции: глюкоза фосфорилируется ATP в реакции, катализируемой гексокиназой. Образованный глюкозо-6-фосфат окисляется до 6-фосфоглюконата глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназой. В этой же реакции эквимолярное количество NAD+ восстанавливается до NADH с получаемым в результате этого повышением поглощения при 340 нм.
Условия реакции определены в таблице ниже.
Цветная реакция
Трис примерно 35 мМ
ATP 0,7 мМ
NAD+ 0,7 мМ
Mg2+ 1,8 мМ
Гексокиназа > 850 ед./л
Глюкозо-6-P-DH > 850 ед./л
pH примерно 7,8
Температура 37,0°C ± 1,0°C
Время реакции 420 с
Длина волны 340 нм
Степень полимеризации (DP). DP означает число (n) единиц ангидроглюкопиранозы в данном сахариде. Примерами DP1 являются моносахариды, такие как глюкоза и фруктоза. DP2 являются дисахариды, такие как мальтоза и сахароза.
Клетка-хозяин. Термин «клетка-хозяин» означает любой тип клеток, который является восприимчивым к трансформации, трансфекции, трансдукции или подобным процедурам с помощью конструкции нуклеиновой кислоты или вектора экспрессии, содержащих полинуклеотид по настоящему изобретению. Термин «клетка-хозяин» охватывает любого потомка исходной клетки, который не является идентичным исходной клетке вследствие мутаций, которые происходят в ходе репликации.
Зрелый полипептид. Термин «зрелый полипептид» означает полипептид в его конечной форме после трансляции и любых посттрансляционных модификаций, таких как процессинг N-концевой части, усечение C-концевой части, гликозилирование, фосфорилирование и т. д. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления зрелый полипептид SEQ ID NO: 6 состоит, главным образом, из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 6, зрелый полипептид SEQ ID NO: 7 состоит, главным образом, из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 7, зрелый полипептид SEQ ID NO: 8 состоит, главным образом, из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 8, зрелый полипептид SEQ ID NO: 5 состоит, главным образом, из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 9, зрелый полипептид SEQ ID NO: 10 состоит, главным образом, из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 10, зрелый полипептид SEQ ID NO: 11 состоит, главным образом, из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 11, зрелый полипептид SEQ ID NO: 12 состоит, главным образом, из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 12, зрелый полипептид SEQ ID NO: 13 состоит, главным образом, из аминокислот 18-576 из SEQ ID NO: 13, зрелый полипептид SEQ ID NO: 14 состоит, главным образом, из аминокислот 18-576 из SEQ ID NO: 14.
В частности, зрелый полипептид SEQ ID NO: 6 может состоять из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 6.
Зрелый полипептид SEQ ID NO: 7 может состоять из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 7.
Зрелый полипептид SEQ ID NO: 8 может состоять из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 8.
Зрелый полипептид SEQ ID NO: 9 может состоять из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 9.
Зрелый полипептид SEQ ID NO: 10 может состоять из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 10.
Зрелый полипептид SEQ ID NO: 11 может состоять из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 11.
Зрелый полипептид SEQ ID NO: 12 может состоять из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 12.
Зрелый полипептид SEQ ID NO: 13 может состоять из аминокислот 18-576 из SEQ ID NO: 13.
Зрелый полипептид SEQ ID NO: 14 может состоять из аминокислот 18-576 из SEQ ID NO: 14.
В дополнительных вариантах осуществления зрелый полипептид SEQ ID NO: 6 состоит из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 6, зрелый полипептид SEQ ID NO: 7 состоит из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 7, зрелый полипептид SEQ ID NO: 8 состоит из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 8, зрелый полипептид SEQ ID NO: 9 состоит из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 9, зрелый полипептид SEQ ID NO: 10 состоит из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 10, зрелый полипептид SEQ ID NO: 11 состоит из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 11, зрелый полипептид SEQ ID NO: 12 состоит из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 12, зрелый полипептид SEQ ID NO: 13 состоит из аминокислот 18-576 из SEQ ID NO: 13, и зрелый полипептид SEQ ID NO: 14 состоит из аминокислот 18-576 из SEQ ID NO: 14.
Предсказание последовательностей зрелых полипептидов может быть основано на программе SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), с помощью которой предсказывают, что аминокислоты 1-17 из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14 представляют собой сигнальный пептид. Последовательность, обозначенная аминокислотами 19-474 (в частности, 19-471) из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12 или аминокислотами 19-471 из SEQ ID NO: 13 или из SEQ ID NO: 14 представляет собой каталитический домен. Последовательность, обозначенная аминокислотами 480-573 из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12 или аминокислотами 483-576 из SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 14 представляет собой крахмал-связывающий домен.
В соответствии с другими вариантами осуществления зрелый полипептид SEQ ID NO: 18 обозначен аминокислотами 22-450 из SEQ ID NO: 18.
В дополнительных вариантах осуществления зрелый пептид с SEQ ID NO: 19 обозначен аминокислотами 22-471 из SEQ ID NO: 19, при этом аминокислоты 1-21 представляют собой сигнальный пептид.
Идентичность последовательностей. Родство между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями описывают параметром «тождественность последовательности».
В контексте настоящего изобретения тождественность последовательностей для двух аминокислотных последовательностей определяют с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), который реализован в программе Needle из пакета программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Применяемыми параметрами являются штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продление гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EBLOSUM62 (версия BLOSUM62 для EMBOSS). Выводимые данные в Needle, обозначенные как «наиболее длинный идентичный участок» (полученные с применением опции - nobrief), применяют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:
(идентичные остатки x 100)/(длина выравниваемого участка - общее число гэпов в выравниваемом участке).
В контексте настоящего изобретения тождественность последовательности для двух последовательностей дезоксирибонуклеотидов определяют с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, выше), который реализован в программе Needle из пакета программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, выше), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Применяемыми параметрами являются штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продление гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EDNAFULL (версия NCBI NUC4.4 для EMBOSS). Выводимые данные в Needle, обозначенные как «наиболее длинный идентичный участок» (полученные с применением опции - nobrief), применяют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:
(идентичные дезоксирибонуклеотиды x 100)/(длина выравниваемого участка - общее число гэпов в выравниваемом участке).
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способам и композициям для получения сиропа с высоким содержанием глюкозы. В частности, глюкозные сиропы со значениями % DX (% DP1) свыше 95%.
Неожиданно было обнаружено, что для достижения высоких значений % DX в сиропе, например свыше 95%, уровень альфа-амилазы, присутствующей в композиции, необходимо тщательно контролировать.
Способы и композиции в соответствии с настоящим изобретением предусматривают глюкозные сиропы с более высоким % DX при оптимизации уровней альфа-амилазы таким образом, что при данном соотношении NPUN и AGU NPUN/FAU(A) или NPUN/KNU корректируют так, чтобы оно составляло по меньшей мере 60, в частности, по меньшей мере 80. Сиропы с высоким % DX можно получать при используемых в промышленном масштабе концентрациях субстрата - как правило, более 30% первоначального содержания твердых веществ (DS).
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения глюкозного сиропа из ожиженного крахмала, включающему (a) приведение ожиженного крахмала в контакт с глюкоамилазой, пуллуланазой и необязательно альфа-амилазой, где соотношение дозы пуллуланазы, выраженной как NPUN/г DS, и дозы альфа-амилазы, выраженной как FAU(A)/г DS или KNU/г DS, составляет по меньшей мере 60, в частности, по меньшей мере 75, в частности, по меньшей мере 100, конкретнее, по меньшей мере 150, конкретнее, по меньшей мере 200, конкретнее, по меньшей мере 250, конкретнее, по меньшей мере 300, конкретнее, по меньшей мере 400, конкретнее, по меньшей мере 500, конкретнее, по меньшей мере 600, конкретнее, по меньшей мере 800 или, в случае отсутствия альфа-амилазы, пуллуланаза присутствует в дозе по меньшей мере 0,5, в частности, по меньшей мере 0,75, в частности, по меньшей мере 1,0, в частности, по меньшей мере 1,5 NPUN/г DS, и (b) осахаривание ожиженного крахмала.
В некоторых вариантах осуществления способ включает приведение ожиженного крахмала в контакт с глюкоамилазой, пуллуланазой и необязательно альфа-амилазой, где соотношение дозы пуллуланазы, выраженной как NPUN/г DS, и дозы альфа-амилазы, выраженной как FAU(A)/г DS или KNU/г DS, находится в диапазоне 100-700, как, например, в диапазоне 200-600, как, например, в диапазоне 300-500, как, например, в диапазоне 350-500, как, например, в диапазоне 375-475 или как, например, в диапазоне 400-450.
В соответствии с другими вариантами осуществления способ включает приведение ожиженного крахмала в контакт с глюкоамилазой, пуллуланазой и необязательно альфа-амилазой, где доза альфа-амилазы находится в диапазоне 0-0,008 FAU(A)/г DS, и доза пуллуланазы находится в диапазоне 0,5-1,5 NPUN/г DS.
В других вариантах осуществления доза альфа-амилазы находится в диапазоне 0-0,007 FAU(A)/г DS и доза пуллуланазы находится в диапазоне 0,6-1,4 NPUN/г DS. В других вариантах осуществления доза альфа-амилазы находится в диапазоне 0-0,006 FAU(A)/г DS и доза пуллуланазы находится в диапазоне 0,7-1,3 NPUN/г DS.
В других вариантах осуществления доза альфа-амилазы находится в диапазоне 0-0,005 FAU(A)/г DS и доза пуллуланазы находится в диапазоне 0,75-1,25 NPUN/г DS.
В других вариантах осуществления доза альфа-амилазы находится в диапазоне 0-0,004 FAU(A)/г DS и доза пуллуланазы находится в диапазоне 0,8-1,2 NPUN/г DS.
В других вариантах осуществления доза альфа-амилазы находится в диапазоне 0-0,003 FAU(A)/г DS и доза пуллуланазы находится в диапазоне 0,9-1,1 NPUN/г DS.
В других вариантах осуществления доза альфа-амилазы находится в диапазоне 0-0,0025 FAU(A)/г DS и доза пуллуланазы находится в диапазоне 0,95-1 NPUN/г DS.
Соотношение пуллуланазы, выраженной как NPUN/г DS, и глюкоамилазы, выраженной как AGU/г DS, в частности, может находиться в диапазоне 2-15, как, например в диапазоне 2-10, в диапазоне 2-5, в диапазоне 3-5 или в диапазоне 3,5-4.
В соответствии с другими вариантами осуществления способ включает приведение ожиженного крахмала в контакт с глюкоамилазой, пуллуланазой и необязательно альфа-амилазой, где доза пуллуланазы находится в диапазоне 0,5-1,5 NPUN/г DS и доза глюкоамилазы находится в диапазоне 0,125-0,375 AGU/г DS.
В других вариантах осуществления доза пуллуланазы находится в диапазоне 0,6-1,4 NPUN/г DS и доза глюкоамилазы находится в диапазоне 0,15-0,35 AGU/г DS.
В других вариантах осуществления доза пуллуланазы находится в диапазоне 0,7-1,3 NPUN/г DS и доза глюкоамилазы находится в диапазоне 0,175-0,325 AGU/г DS.
В других вариантах осуществления доза пуллуланазы находится в диапазоне 0,8-1,2 NPUN/г DS и доза глюкоамилазы находится в диапазоне 0,2-0,3 AGU/г DS.
При низких уровнях глюкоамилазы может потребоваться более длительное время осахаривания. В одном варианте осуществления доза глюкоамилазы, выраженная как AGU/г DS, составляет по меньшей мере 0,1, в частности, по меньшей мере 0,15, в частности, по меньшей мере 0,18, в частности, по меньшей мере 0,2, конкретнее, по меньшей мере 0,22, конкретнее, по меньшей мере 0,23, конкретнее, по меньшей мере 0,25, еще конкретнее, по меньшей мере 0,28.
При помощи способа и композиций в соответствии с настоящим изобретением можно получать очень высокие значения % DX. В определенном варианте осуществления глюкозный сироп содержит DP1 (% DX) по меньшей мере 95,8%, в частности, по меньшей мере 95,9%, в частности, по меньшей мере 96%, конкретнее, по меньшей мере 96,1%.
Время осахаривания может варьировать в зависимости от дозы фермента. В одном определенном варианте осуществления время осахаривания составляет по меньшей мере 24 ч, по меньшей мере 30 ч, по меньшей мере 36 ч, по меньшей мере 48 ч, по меньшей мере 54 ч, по меньшей мере 60 ч, по меньшей мере 72 ч.
При способе в соответствии с настоящим изобретением гидролиз/осахаривание крахмала может происходить, в частности, при pH, который находится в диапазоне 3,5-5,0, как, например, при pH в диапазоне 4,0-4,5, и при температуре, которая находится в диапазоне 59-70°C, как, например, в диапазоне 59-65°C или как, например, в диапазоне 59-62°C.
Ожиженный крахмал, используемый в качестве субстрата для способа осахаривания в соответствии с настоящим изобретением, может быть крахмальной суспензией или частично гидролизованным крахмалом (в ожиженном виде или мальтодекстрином). В частности, крахмал в крахмальной суспензии или частично гидролизованный крахмал может характеризоваться декстрозным эквивалентом (DE) в диапазоне 5-42, как, например, в диапазоне 5-30, в диапазоне 8-18 или как, например, в диапазоне 9-14.
Крахмал может быть из любого источника, в частности, из кукурузы, пшеницы или маниока. Крахмальная суспензия или частично гидролизованный крахмал может характеризоваться наличием остаточной альфа-амилазной активности в результате процесса ожижения или она может быть деактивирована, как, например, путем снижения pH до значения ниже 4,5, с поддержанием в то же время высокой температуры (выше 95°C) для инактивации ожижающей альфа-амилазы.
Проводимость указанной крахмальной суспензии или частично гидролизованного крахмала, в частности, может находиться в диапазоне 0-500 микроСм/см. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления содержание кальция соответствует 0-200 ppm свободного кальция.
При способе в соответствии с настоящим изобретением гидролиз/осахаривание крахмала может происходить, в частности, при pH, который находится в диапазоне 3,5-5,0, как, например, при pH в диапазоне 4,0-4,7, и при температуре, которая находится в диапазоне 58-70°C, как, например, в диапазоне 58-65°C, как, например, в диапазоне 59-65°C или как, например, в диапазоне 59-62°C.
Композиция, содержащая ожиженный крахмал, предусмотренный в качестве исходного материала; т. е. композиция, содержащая ожиженный крахмал, предусмотренный на стадии i) способа, может содержать 25-45% сухих твердых веществ (% DS), как, например, 25-40% DS.
Способ в соответствии с настоящим изобретением применим при используемых в промышленности дозах субстрата. В одном варианте осуществления первоначальное содержание твердых веществ (DS) в ожиженном крахмальном субстрате составляет по меньшей мере 25%, в частности, по меньшей мере 30%, конкретнее, по меньшей мере 35%, еще конкретнее, по меньшей мере 40%.
Ферментативные композиции
Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим глюкоамилазу, пуллуланазу и альфа-амилазу.
В определенном варианте осуществления композиция содержит фермент альфа-амилазу, пуллуланазу и глюкоамилазу, где соотношение дозы пуллуланазы, выраженной как NPUN/г, и дозы альфа-амилазы, выраженной как FAU(A)/г или как KNU/г, составляет по меньшей мере 60.
Конкретнее, композиция содержит фермент альфа-амилазу, пуллуланазу и глюкоамилазу, где соотношение дозы пуллуланазы, выраженной как NPUN/г, и дозы альфа-амилазы, выраженной как FAU(A)/г или как KNU/г, составляет по меньшей мере 75, в частности, по меньшей мере 100, конкретнее, по меньшей мере 150, конкретнее, по меньшей мере 200, конкретнее, по меньшей мере 250, конкретнее, по меньшей мере 300, конкретнее, по меньшей мере 400, конкретнее, по меньшей мере 500, конкретнее, по меньшей мере 600, конкретнее, по меньшей мере 800.
В другом варианте осуществления соотношение дозы пуллуланазы, выраженной как NPUN/г, и дозы альфа-амилазы, выраженной как FAU(A)/г или как KNU/г, находится в диапазоне 60-1000, конкретнее, 70-800, конкретнее, 80-600, конкретнее, 90-500, конкретнее, 100-400.
Соотношение дозы пуллуланазы, выраженной как NPUN/г, и дозы альфа-амилазы, выраженной как FAU(A)/г или KNU/г, в частности, может находиться в пределах диапазона 100-700, как, например, в пределах диапазона 200-600, как, например, в пределах диапазона 300-500, как, например, в пределах диапазона 350-500, как, например, в пределах диапазона 375-475 или как, например, в пределах диапазона 400-450.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, в которой соотношение пуллуланазы, выраженной как NPUN/г, и глюкоамилазы, выраженной, как AGU/г, составляет по меньшей мере 2, в частности, по меньшей мере 2,5, в частности, по меньшей мере 3, конкретнее, по меньшей мере 3,5, конкретнее, по меньшей мере 5, конкретнее, по меньшей мере 10, еще конкретнее, по меньшей мере 15.
Соотношение пуллуланазы, выраженной как NPUN/г, и глюкоамилазы, выраженной как AGU/г, в частности, может находиться в пределах диапазона 2-15, как, например, в пределах диапазона 2-10, в пределах диапазона 2-5, в пределах диапазона 3-5 или в пределах диапазона 3,5-4.
Пуллуланаза
В способе по настоящему изобретению можно применять любую пуллуланазу. В одном варианте осуществления пуллуланаза является пуллуланазой из Bacillus deramificans, например, раскрытой в патентах US 6074854 и US 5817498, или пуллуланазой, полученной из Bacillus acidopullulyticus, например, раскрытой в WO2009/075682 (SEQ ID 4; GENESEQP: AXB71624).
Коммерчески доступные пуллуланазы включают Promozyme D2, доступный от Novozymes A/S, Bagsvaerd, Дания), Novozym 26062 (Novozymes) и Optimax L 1000 (DuPont-Genencor)
Глюкоамилаза
Глюкоамилазу, используемую в соответствии с настоящим изобретением, можно получать из любого подходящего источника, например, получать из микроорганизма или растения. Предпочтительные глюкоамилазы являются грибного или бактериального происхождения, выбранными из группы, состоящей из глюкоамилаз Aspergillus, в частности, глюкоамилазы G1 или G2 A. Niger (Boel et al., 1984, EMBO J. 3 (5): 1097-1102) или ее вариантов, таких как раскрытые в WO 92/00381, WO 00/04136 и WO 01/04273 (от Novozymes, Дания); глюкоамилазы A. Awamori,, раскрытой в WO 84/02921, глюкоамилазы A. oryzae (Agric. Biol. Chem., 1991, 55 (4): 941-949) или их вариантов или фрагментов. Другие варианты глюкоамилазы Aspergillus включают варианты с повышенной термоустойчивостью: G137A и G139A (Chen et al., 1996, Prot. Eng. 9: 499-505); D257E и D293E/Q (Chen et al., 1995, Prot. Eng. 8: 575-582); N182 (Chen et al., 1994, Biochem. J. 301: 275-281); дисульфидные связи, A246C (Fierobe et al., 1996, Biochemistry 35: 8698-8704 и введение остатков Pro в положение A435 и S436 (Li et al., 1997, Protein Eng. 10: 1199-1204.
Другие глюкоамилазы включают глюкоамилазу Athelia rolfsii (ранее именуемого Corticium rolfsii) (см. патент США № 4727026 и Nagasaka et al., 1998, “Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticium rolfsii, Appl Microbiol Biotechnol 50:323-330), глюкоамилазы Talaromyces, в частности, полученные из Talaromyces emersonii (WO 99/28448), Talaromyces leycettanus (патент США № Re. 32153), Talaromyces duponti и Talaromyces thermophilus (патент США № 4587215).
Предусматриваемые грибные глюкоамилазы включают глюкоамилазу Trametes cingulata, раскрытую в WO 2006/069289.
В одном варианте осуществления глюкоамилаза получена из штамма рода Pycnoporus, в частности, штамма Pycnoporus, который описан в WO 2011/066576 (SEQ ID NO: 2, 4 или 6), или из штамма рода Gloephyllum, в частности, штамма Gloephyllum, который описан в WO 2011/068803 (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 или 16), или штамма рода Nigrofomes, в частности, штамма Nigrofomes sp., раскрытого в WO 2012/064351 (SEQ ID NO: 2) (все ссылки таким образом включены при помощи ссылки), или штамма Penicillium, в частности, Penicillium oxalicum, раскрытого в WO2011/127802 (SEQ ID NO: 2) или WO2013/036526. Также предусмотрены глюкоамилазы, которые проявляют высокую тождественность с любой из вышеупомянутых глюкоамилаз, т. е., по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, как, например, 100% тождественность с любой из зрелых частей последовательностей ферментов, упомянутых выше.
В одном варианте осуществления глюкоамилаза получена из штамма рода Trichoderma, в частности, такого, который описан в WO2009/048487, WO2009/048488, WO2008/045489, WO2011/022465, WO2012/001139.
Коммерчески доступные композиции с глюкоамилазой включают AMG 200L; AMG 300L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U, SPIRIZYME ULTRA™, SPIRIZYME EXCEL™ и AMG™ E (от Novozymes A/S, Дания); OPTIDEX™ 300, GC480™ и GC147™ (от Genencor Int., США); AMIGASE™ и AMIGASE™ PLUS (от DSM); G-ZYME™ G900, G-ZYME™ и G990 ZR (от DuPont-Genencor).
Альфа-амилаза
Грибные альфа-амилазы включают альфа-амилазы, полученные из штамма рода Aspergillus, такие как альфа-амилазы Aspergillus oryzae, Aspergillus niger и Aspergillus kawachii.
Предпочтительные кислые грибные альфа-амилазы представляют собой подобную фунгамилу альфа-амилазу, которая получена из штамма Aspergillus oryzae. В соответствии с настоящим изобретением термин «подобная фунгамилу альфа-амилаза» означает альфа-амилазу, которая проявляет высокую тождественность, т. е. более чем 70%, более чем 75%, более чем 80%, более чем 85%, более чем 90%, более чем 95%, более чем 96%, более чем 97%, более чем 98%, более чем 99% или даже 100% тождественность со зрелой частью аминокислотной последовательности, показанной под SEQ ID NO: 10 в WO 96/23874.
Другая предпочтительная кислая альфа-амилаза получена из штамма Aspergillus niger. В предпочтительном варианте осуществления кислая грибная альфа-амилаза является таковой из A. Niger,, раскрытой как «AMYA_ASPNG» в базе данных Swiss-prot/TeEMBL под исходным номером доступа P56271 и описанной в WO 89/01969 (пример 3).
Другие предусматриваемые альфа-амилазы дикого типа включают такие, которые получены из штамма рода Rhizomucor и Meripilus, предпочтительно штамма Rhizomucor pusillus (WO 2004/055178, включенной при помощи ссылки) или Meripilus giganteus.
В предпочтительном варианте осуществления альфа-амилаза получена из Aspergillus kawachii и описана Kaneko et al., 1996, J. Ferment. Bioeng. 81: 292-298, “Molecular-cloning and determination of the nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alpha-amylase from Aspergillus kawachii"; и, помимо этого, как EMBL:№ AB008370.
Грибная альфа-амилаза также может быть ферментом дикого типа, содержащим крахмал-связывающий домен (SBD) и каталитический домен альфа-амилазы (т. е. не является гибридной), или его вариант. В одном варианте осуществления альфа-амилаза дикого типа получена из штамма Aspergillus kawachii.
Грибная гибридная альфа-амилаза
В предпочтительном варианте осуществления альфа-амилаза является грибной кислой альфа-амилазой и является гибридной альфа-амилазой. Предпочтительные примеры грибных гибридных альфа-амилаз включают такие, которые раскрыты в WO 2005/003311, или в публикации заявки на выдачу патента США № 2005/0054071 (Novozymes), или в заявке на выдачу патента США № 60/638614 (Novozymes), которые таким образом включены при помощи ссылки. Гибридная альфа-амилаза может содержать каталитический домен альфа-амилазы (CD) и углевод-связывающий домен/блок (CBM), как, например, крахмал-связывающий домен, и, при необходимости, линкер.
Конкретные примеры предусмотренных гибридных альфа-амилаз включают такие, которые раскрыты в таблицах 1-5 в примерах в заявке на выдачу патента США № 60/638614, в том числе вариант фунгамила с каталитическим доменом JA118 и SBD Athelia rolfsii (SEQ ID NO:100 в US 60/638614), альфа-амилазу Rhizomucor pusillus с линкером и SBD AMG Athelia rolfsii (SEQ ID NO:101 в US 60/638614), альфа-амилазу Rhizomucor pusillus с линкером и SBD глюкоамилазы Aspergillus niger (которая раскрыта в таблице 5 в виде комбинации аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 96 в заявке на выдачу патента США № 11/316535) или как V039 в таблице 5 в WO 2006/069290 и альфа-амилазу Meripilus giganteus с линкером и SBD глюкоамилазы Athelia rolfsii (SEQ ID NO: 102 в заявке на выдачу патента США № 60/638,614). Другие особенно предусмотренные гибридные альфа-амилазы представляют собой любую из перечисленных в таблицах 3, 4, 5 и 6 в примере 4 в заявке на выдачу патента США № 11/316535 и WO 2006/069290 (таким образом включенных при помощи ссылки).
Другие конкретные примеры предусмотренных гибридных альфа-амилаз включают такие, которые раскрыты в публикации заявки на выдачу патента № 2005/0054071, включая такие, которые раскрыты в таблице 3 на странице 15, как, например, альфа-амилаза Aspergillus niger с линкером и крахмал-связывающим доменом Aspergillus kawachii.
Также предусмотрены альфа-амилазы, которые проявляют высокую тождественность с любой из упомянутых выше альфа-амилаз, т. е. более чем 70%, более чем 75%, более чем 80%, более чем 85%, более чем 90%, более чем 95%, более чем 96%, более чем 97%, более чем 98%, более чем 99% или даже 100% тождественность с последовательностями зрелых ферментов.
Бактериальная альфа-амилаза
Бактериальные альфа-амилазы, пригодные в способах в соответствии с настоящим изобретением, включают альфа-амилазы, полученные из штамма рода Bacillus, как, например, Bacillus licheniformis и Bacillus stearothermophilus.
Коммерческие продукты на основе альфа-амилазы
Предпочтительные коммерческие композиции, содержащие альфа-амилазу, включают MYCOLASE™ (DSM), BAN™, TERMAMYL™ SC, FUNGAMYL™, LIQUOZYME™ X, LIQUOZYME™ SC и SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L (Novozymes A/S) и CLARASE™ L-40000, DEX-LO™, SPEZYME™ FRED, SPEZYME™ AA, SPEZYME™ ALPHA, SPEZYME™ DELTA AA, GC358, GC980, SPEZYME™ CL и SPEZYME™ RSL (DuPont-Genencor), FUELZYME™ (от Verenium Corp, США).
В определенном варианте осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением, содержит альфа-амилазу, глюкоамилазу (AMG) и пуллуланазу, и при этом альфа-амилаза выбрана из альфа-амилаз Aspergillus niger или Rhizomucor pusillus или их вариантов, глюкоамилаза выбрана из глюкоамилаз Aspergillus niger, Talaromyces emersonii, Trametes cingulata или Gloeophyllum trabeum или их вариантов и пуллуланаза выбрана из пуллуланаз Bacillus deramificans или Bacillus acidopullulyticus или их гибридов и/или вариантов.
В дополнительных определенных вариантах осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит глюкоамилазу, которая содержит/состоит, главным образом, из/состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:
i) аминокислотной последовательности, изложенной под любым из SEQ ID NO: 1, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15, или ее зрелого полипептида;
ii) подпоследовательности аминокислотной последовательности, изложенной под любым из SEQ ID NO: 1, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15, или ее указанного зрелого полипептида;
iii) аминокислотной последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, как, например, по меньшей мере 99,5% тождественностью последовательности с любой из аминокислотных последовательностей, изложенных в i) и ii).
В тех случаях, когда глюкоамилаза содержит подпоследовательность, определенную в ii), или аминокислотную последовательность, определенную в iii), она, предпочтительно, характеризуется по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности соответствующей аминокислотной последовательности, определенной в i), подпоследовательностью или вариантом которой она является, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU)».
В других вариантах осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением, содержит альфа-амилазу, которая содержит/состоит, главным образом, из/состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:
i) аминокислотной последовательности, изложенной под любым из SEQ ID NO: 2, 5, 19, 20, 21, 22, 23, 24 и 25, или ее зрелого полипептида;
ii) подпоследовательности аминокислотной последовательности, изложенной под любым из SEQ ID NO: 2, 5, 19, 20, 21, 22, 23, 24 и 25, или ее указанного зрелого полипептида;
iii) вариантной аминокислотной последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, как, например, по меньшей мере 99,5% тождественностью последовательности с любой из аминокислотных последовательностей, изложенных в i) и ii).
В тех случаях, когда альфа-амилаза, определенная выше, является подпоследовательностью или вариантом, она предпочтительно характеризуется по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности соответствующей альфа-амилазы, выбранной из SEQ ID NO: 2, 5, 19, 20, 21, 22, 23, 24 и 25, или ее зрелого полипептида, подпоследовательностью или вариантом которых она является, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))» или «Единиц Kilo Novo альфа-амилазы (KNU)». В контексте настоящего изобретения альфа-амилаза, содержащая аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 5 и 19, или их зрелые полипептиды, считается грибной альфа-амилазой, и ее активность тестируют как предусмотрено относительно указанного выше определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))». Альфа-амилаза, содержащая аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20-25, или их зрелые полипептиды, считается бактериальной альфа-амилазой, и ее активность тестируют как предусмотрено относительно указанного выше определения «Единиц Kilo Novo альфа-амилазы (KNU)».
В определенных вариантах осуществления альфа-амилаза, содержащая или состоящая из аминокислотной последовательности, определенной в iii), представляет собой вариант альфа-амилазы, содержащей или состоящей из аминокислотной последовательности, определенной под SEQ ID NO: 20, или ее зрелого полипептида, в которой были осуществлены следующие мутации: I181*/G182*/N193F (с использованием нумерации аминокислот из SEQ ID NO: 20).
В соответствии с другими вариантами осуществления альфа-амилаза, содержащая или состоящая из аминокислотной последовательности, определенной в iii), представляет собой вариант альфа-амилазы, содержащей или состоящей из аминокислотной последовательности, определенной под SEQ ID NO: 23, или ее зрелого полипептида, в которой были осуществлены следующие мутации: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (с использованием нумерации аминокислот из SEQ ID NO: 21).
В еще дополнительных вариантах осуществления альфа-амилаза, содержащая или состоящая из аминокислотной последовательности, определенной в iii), представляет собой вариант альфа-амилазы, содержащей или состоящей из аминокислотной последовательности, определенной под SEQ ID NO: 23, или ее зрелого полипептида, в которой были осуществлены следующие мутации: G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S (с использованием нумерации аминокислот из SEQ ID NO: 21).
В еще других вариантах осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит пуллуланазу, которая содержит/состоит, главным образом, из/состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:
i) аминокислотной последовательности, изложенной под любым из SEQ ID NO: 3, 16, 17 и 18, или ее зрелого полипептида;
ii) подпоследовательности аминокислотной последовательности, изложенной под любым из SEQ ID NO: 3, 16, 17 и 18, или ее указанного зрелого полипептида;
iii) аминокислотной последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, как, например, по меньшей мере 99,5% тождественностью последовательности с любой из аминокислотных последовательностей, изложенных в i) и ii).
В тех случаях, когда пуллуланаза содержит подпоследовательность, определенную в ii), или вариантную аминокислотную последовательность, определенную в iii), она, предпочтительно, характеризуется по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% пуллуланазной активности соответствующей аминокислотной последовательности, определенной в i), подпоследовательностью или вариантом которой она является, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».
В пределах объема настоящего изобретения находятся варианты осуществления, где глюкоамилаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:
i) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида;
ii) подпоследовательности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4, или ее указанного зрелого полипептида и
iii) вариантной аминокислотной последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, как, например, по меньшей мере 99,5% тождественностью последовательности с любой из аминокислотных последовательностей, изложенных в i) и ii);
где пуллуланаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:
iv) аминокислотной последовательности, изложенной под любым из SEQ ID NO: 3, 16, 17 и 18, или ее зрелого полипептида;
v) подпоследовательности аминокислотной последовательности, изложенной под любым из SEQ ID NO: 3, 16, 17 и 18, или ее указанного зрелого полипептида и
vi) вариантной аминокислотной последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, как, например, по меньшей мере 99,5% тождественностью последовательности с любой из аминокислотных последовательностей, изложенных в iv) и v); и
где альфа-амилаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:
vii) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида;
viii) подпоследовательности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 5, или ее указанного зрелого полипептида и
ix) вариантной аминокислотной последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, как, например, по меньшей мере 99,5% тождественностью последовательности с любой аминокислотной последовательностью, изложенной в vii) и viii).
В тех случаях, когда указанная глюкоамилаза является подпоследовательностью или вариантной аминокислотной последовательностью, определенной выше, она, предпочтительно, характеризуется по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности соответствующей аминокислотной последовательности (например, аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида), подпоследовательностью или вариантом которой она является, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU)».
В тех случаях, когда указанная пуллуланаза является подпоследовательностью или вариантной аминокислотной последовательностью, определенной выше, она предпочтительно характеризуется по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% пуллуланазной активности соответствующей аминокислотной последовательности (например, аминокислотной последовательности, изложенной под любым из SEQ ID NO: 3, 16, 17 и 18, или ее зрелого полипептида), подпоследовательностью или вариантом которой она является, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».
В тех случаях, когда альфа-амилаза, определенная выше, является подпоследовательностью или вариантом, она предпочтительно характеризуется по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности соответствующей альфа-амилазы, выбранной из SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида, подпоследовательностью или вариантом которой она является, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))».
В определенном варианте осуществления глюкоамилаза выбрана из глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 1, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности с полипептидом SEQ ID NO: 1 или ее зрелого полипептида, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, которая обладает глюкоамилазной активностью; например по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 1, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU)».
В другом определенном варианте осуществления глюкоамилаза выбрана из глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 4 или ее зрелого полипептида, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, которая обладает глюкоамилазной активностью; например по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU)».
В определенном варианте осуществления альфа-амилаза выбрана из альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или альфа-амилазы с тождественностью последовательности с полипептидом SEQ ID NO: 2 или ее зрелого полипептида, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))». В другом определенном варианте осуществления альфа-амилаза выбрана из альфа-амилаз, раскрытых под SEQ ID NO: 5, или альфа-амилазы с тождественностью последовательности с полипептидом SEQ ID NO: 5 или ее зрелого полипептида, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))».
В определенном варианте осуществления пуллуланаза выбрана из пуллуланазы, раскрытой под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида и пуллуланазы с тождественностью последовательности с полипептидом SEQ ID NO: 3 или ее зрелого полипептида, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, которая обладает пуллуланазной активностью; например по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% пуллуланазной активности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».
В дополнительном конкретном варианте осуществления композиция содержит
i) глюкоамилазу, выбранную из глюкоамилаз, раскрытых под SEQ ID NO: 1, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, которая обладает глюкоамилазной активностью; например по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности глюкоамилаз, раскрытых под SEQ ID NO: 1, или их зрелых полипептидов, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU);
ii) альфа-амилазу, выбранную из альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или ее зрелого полипептида и альфа-амилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))»; и
iii) пуллуланазу, выбранную из пуллуланазы, раскрытой под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида и пуллуланазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, которая обладает пуллуланазной активностью; например по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% пуллуланазной активности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».
В частности, композиция может содержать:
i) глюкоамилазу, выбранную из глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 1, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 или ее зрелого полипептида, составляющей по меньшей мере 90%, которая обладает глюкоамилазной активностью; например по меньшей мере 90% глюкоамилазной активности глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 1, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU);
ii) альфа-амилазу, выбранную из альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или ее зрелого полипептида и альфа-амилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 или ее зрелого полипептида, составляющей по меньшей мере 90%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 90% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))»; и
iii) пуллуланазу, выбранную из пуллуланазы, раскрытой под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида и пуллуланазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3 или ее зрелого полипептида, составляющей по меньшей мере 90%, которая обладает пуллуланазной активностью; например по меньшей мере 90% пуллуланазной активности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».
В частности, композиция может содержать:
i) глюкоамилазу, выбранную из глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 1, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности с глюкоамилазой из SEQ ID NO: 1 или ее зрелого полипептида, составляющей по меньшей мере 95%, которая обладает глюкоамилазной активностью; например по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности глюкоамилаз, раскрытых под SEQ ID NO: 1, или их зрелых полипептидов, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU);
ii) альфа-амилазу, выбранную из альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или ее зрелого полипептида и альфа-амилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2, составляющей по меньшей мере 95%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))»;
iii) и пуллуланазу, выбранную из пуллуланазы, раскрытой под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида и пуллуланазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3, составляющей по меньшей мере 95%, которая обладает пуллуланазной активностью; например по меньшей мере 95% пуллуланазной активности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».
В частности, композиция может содержать:
i) глюкоамилазу, выбранную из глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 1, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1, составляющей по меньшей мере 97%, которая обладает глюкоамилазной активностью; например по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности глюкоамилаз, раскрытых под SEQ ID NO: 1, или их зрелых полипептидов, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU);
ii) альфа-амилазу, выбранную из альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или ее зрелого полипептида и альфа-амилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2, составляющей по меньшей мере 97%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))»;
iii) и пуллуланазу, выбранную из пуллуланазы, раскрытой под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида и пуллуланазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3, составляющей по меньшей мере 97%, которая обладает пуллуланазной активностью; например по меньшей мере 95% пуллуланазной активности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».
В частности, композиция может содержать:
i) глюкоамилазу, выбранную из глюкоамилаз, раскрытых в SEQ ID NO: 1, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1, составляющей по меньшей мере 99%, которая обладает глюкоамилазной активностью; например по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 1, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU);
ii) альфа-амилазу, выбранную из альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или ее зрелого полипептида и альфа-амилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2, составляющей по меньшей мере 99%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))»;
iii) и пуллуланазу, выбранную из пуллуланазы, раскрытой под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида и пуллуланазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3, составляющей по меньшей мере 99%, которая обладает пуллуланазной активностью; например по меньшей мере 95% пуллуланазной активности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».
В дополнительном конкретном варианте осуществления композиция содержит:
i) глюкоамилазу, выбранную из глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 4, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, которая обладает глюкоамилазной активностью; например по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU);
ii) альфа-амилазу, выбранную из альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида и альфа-амилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 5, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))», и
iii) пуллуланазу, выбранную из пуллуланазы, раскрытой под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида и пуллуланазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, которая обладает пуллуланазной активностью; например по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% пуллуланазной активности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».
В частности, композиция может содержать:
i) глюкоамилазу, выбранную из глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 4, составляющей по меньшей мере 90%, которая обладает глюкоамилазной активностью, например по меньшей мере 90% глюкоамилазной активности глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU);
ii) альфа-амилазу, выбранную из альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида и альфа-амилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 5, составляющей по меньшей мере 90%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))»; и
iii) пуллуланазу, выбранную из пуллуланазы, раскрытой под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида и пуллуланазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3, составляющей по меньшей мере 90%, которая обладает пуллуланазной активностью, например по меньшей мере 90% пуллуланазной активности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».
В частности, композиция может содержать:
i) глюкоамилазу, выбранную из глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 4, составляющей по меньшей мере 95%, которая обладает глюкоамилазной активностью, например по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU);
ii) альфа-амилазу, выбранную из альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида и альфа-амилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 5, составляющей по меньшей мере 95%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))»; и
iii) пуллуланазу, выбранную из пуллуланазы, раскрытой под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида и пуллуланазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3, составляющей по меньшей мере 95%, которая обладает пуллуланазной активностью; например по меньшей мере 95% пуллуланазной активности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».
В частности, композиция может содержать:
i) глюкоамилазу, выбранную из глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 4, составляющей по меньшей мере 97%, которая обладает глюкоамилазной активностью, например по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU);
ii) альфа-амилазу, выбранную из альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида и альфа-амилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 5, составляющей по меньшей мере 97%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))»; и
iii) пуллуланазу, выбранную из пуллуланазы, раскрытой под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида и пуллуланазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3, составляющей по меньшей мере 97%, которая обладает пуллуланазной активностью, например по меньшей мере 95% пуллуланазной активности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».
В частности, композиция может содержать:
i) глюкоамилазу, выбранную из глюкоамилаз, раскрытых в SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 4, составляющей по меньшей мере 99%, которая обладает глюкоамилазной активностью, например по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU);
ii) альфа-амилазу, выбранную из альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида и альфа-амилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 5, составляющей по меньшей мере 99%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))»;
iii) и пуллуланазу, выбранную из пуллуланазы, раскрытой под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида и пуллуланазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3, составляющей по меньшей мере 99%, которая обладает пуллуланазной активностью; например по меньшей мере 95% пуллуланазной активности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».
Композиции можно получить в соответствии со способами, известными из уровня техники, и они могут быть в форме жидкой или сухой композиции. Композиции могут быть стабилизированы в соответствии со способами, известными из уровня техники.
Пути применения
Композицию в соответствии с настоящим изобретением можно использовать в способе осахаривания для получения глюкозного сиропа. Таким образом, в дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения глюкозного сиропа из ожиженного крахмала, включающему приведение ожиженного крахмала в контакт с композицией в соответствии с настоящим изобретением.
Настоящее изобретение дополнительно описано при помощи следующих примеров, которые не следует толковать как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Примеры
Материалы и способы
Глюкоамилазная активность
Глюкоамилазная активность (AGU)
Единицу глюкоамилазы (AGU) определяли как количество фермента, которое гидролизует 1 микромоль мальтозы за минуту при стандартных условиях (37°C, pH 4,3, субстрат: мальтоза 100 мМ, буфер: ацетатный 0,1 М, время реакции 6 минут, как определено ниже для инкубирования с глюкоамилазой), образуя при этом глюкозу.
Инкубирование с глюкоамилазой:
Субстрат: мальтоза 100 мМ
Буфер: ацетатный 0,1 М
pH: 4,30 ± 0,05
Температура инкубации: 37°C ± 1
Время реакции: 6 минут
Рабочий диапазон для фермента: 0,5-4,0 AGU/мл
Принцип анализа представлен 3 стадиями реакции.
Стадия 1 представляет собой ферментативную реакцию.
Глюкоамилаза (AMG), EC 3.2.1.3 (экзо-альфа-1,4-глюкан-глюкогидролаза), гидролизует мальтозу с образованием альфа-D-глюкозы. После инкубирования реакцию останавливали при помощи NaOH.
Стадии 2 и 3 приводят к реакции, по которой оцениваются конечные показатели.
Глюкоза фосфорилируется ATP в реакции, катализируемой гексокиназой. Образованный глюкозо-6-фосфат окисляется до 6-фосфоглюконата глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназой. В этой же реакции эквимолярное количество NAD+ восстанавливается до NADH с получаемым в результате этого повышением поглощения при 340 нм. Можно использовать систему с автоматическим анализатором, такую как Konelab 30 Analyzer (Thermo Fisher Scientific).
Цветная реакция
Трис примерно 35 мМ
ATP 0,7 мМ
NAD+ 0,7 мМ
Mg2+ 1,8 мМ
Гексокиназа > 850 ед./л
Глюкозо-6-P-DH > 850 ед./л
pH примерно 7,8
Температура 37,0°C ± 1,0°C
Время реакции 420 с
Длина волны 340 нм
Активность кислой альфа-амилазы
При применении в соответствии с настоящим изобретением активность любой кислой альфа-амилазы можно измерить в FAU(A) (единицах кислой грибной альфа-амилазы).
Активность кислой альфа-амилазы (FAU(A))
Активность кислой альфа-амилазы можно измерить в FAU(A) (единицах кислой грибной альфа-амилазы). 1 FAU(A) определяли как количество фермента, которое расщепляет 5,260 мг сухой массы крахмала за час при стандартных условиях.
Кислая альфа-амилаза, эндо-альфа-амилаза (1,4-альфа-D-глюкан-глюканогидролаза, E.C. 3.2.1.1), гидролизует альфа-1,4-глюкозидные связи во внутренних участках молекулы крахмала с образованием декстринов и олигосахаридов с различными длинами цепей. Интенсивность цвета, образуемого с йодом, прямо пропорциональна концентрации крахмала. Амилазную активность определяли с использованием обратной колориметрии как снижение концентрации крахмала при определенных аналитических условиях.
FAU(A), активность кислой альфа-амилазы определяли в соответствии с нижеследующим описанием и измеряли относительно стандарта Novozymes, который предоставляется по запросу компанией Novozymes A/S, Дания. Принцип реакции основан на двух стадиях. На первой стадии фермент кислая альфа-амилаза гидролизует крахмал до различных олигосахаридов. На второй стадии йод образует комплекс синего цвета с крахмалом, а не с продуктами расщепления.
Интенсивность цвета тем самым прямо пропорциональна концентрации крахмала. Активность определяли с использованием обратной колориметрии как снижение концентрации крахмала при определенных аналитических условиях.
Первая реакция, расщепление крахмала
Субстрат Крахмал, примерно 0,3 г/л
Буфер Цитратный, примерно 0,05 M
CaCl2, 1,85 мМ
pH 2,50 ± 0,05
Температура инкубации 37°C
Время реакции 180 секунд
Рабочий диапазон для фермента 0,01-0,04 FAU(A)/мл
Вторая реакция, комплекс крахмал-йод
Йод 0,0432 г/л
Температура инкубации 37°C
Время реакции 60 секунд
Длина волны 600 нм
В случае необходимости дополнительные подробности можно найти в EB-SM-0510.02, предоставляемом по запросу компанией Novozymes A/S, Дания, и включенном при помощи ссылки.
Пуллуланазная активность
Эндо-пуллуланазы гидролизуют α-1,6-гликозидные связи в пуллулане (-BH4-восстановленные для восстановления фоновых восстанавливающих сахаров), высвобождая мальтотриозные единицы с восстанавливающими углеводными концами. Пуллуланаза является пуллулан-6-глюкано-гидролазой с номером классификации ферментов E.C.3.2.1.41.
NPUN (новая единица Novozymes пуллуланазы) является единицей эндопуллуланазной активности, измеренной при помощи нижеследующей процедуры, и ее измеряют относительно стандарта Novozymes, который предоставляется по запросу компанией Novozymes A/S, Дания
1 NPUN = одну единицу пуллуланазы (NPUN) определяют как количество фермента, которое высвобождает восстанавливающие концы, соответствующие 0,35 мкмолям глюкозы, за минуту при стандартных условиях.
При первой реакции субстрат одинаково присутствует как в анализируемом образце, так и в холостой пробе. Однако реакцию с анализируемым образцом осуществляют при pH 5,0, в то время как реакция в холостой пробе отсутствует при pH 9,6, где ни пуллуланазы, ни амилоглюкозидазы (глюкоамилаза) не являются активными как ферменты.
Первая реакция, расщепление пуллулана
Субстрат BH4-восстановленный пуллулан, 5,3 г/л
Буфер (анализируемого образца) Ацетатный, примерно 0,1 M
EDTA, 5,3 мМ
Акарбоза, 0,018% (если образец содержит глюкоамилазу)
pH (анализируемого образца) 5,0
Буфер (холостой пробы) CHES, 42 мМ
ацетатный, 17 мМ
EDTA, 5,3 мМ
pH (холостой пробы) 9,6
Температура инкубации 50°C
Время реакции 540 секунд
Рабочий диапазон для фермента 0,03-0,15 NPUN/мл
При второй реакции pH доводили до примерно 9,6 и глюкоза в образце фосфорилировалась до невосстанавливающего D-глюкозо-6-фосфата глюкокиназой, которая обладает наилучшей активностью и стабильностью в данном диапазоне и является специфичной по отношению к глюкозе при pH 9 (см. Goward, Biochem. J. 1986, 237, pp 415-420). Данная стадия зависит от одинакового pH в анализируемом образце и холостой пробе для удаления равных количеств глюкозы в обоих.
Вторая реакция, удаление фоновой глюкозы
Субстрат глюкоза в образце, после первой реакции
Буфер CHES, 58 мМ (анализируемый образец) или 76 мМ (холостая проба)
ацетатный, 43 мМ (анализируемый образец) или 7,2 мМ (холостая проба)
EDTA, 2,2 мМ
ATP, 1,11 мг/мл
MgCl2, 4,4 мМ
Глюкокиназа 0,11 ед./мл
pH примерно 9,6
Температура инкубации 50°C
Время реакции 720 секунд
Вторую реакцию останавливали при помощи щелочного реагента > pH 11, содержащего PAHBAH (гидразид п-гидроксибензойной кислоты) и висмут, который образовывал комплекс с восстанавливающими сахарами с получением цвета, определяемого при 405 нм. Полученный цвет пропорционален пуллуланазной активности.
Третья реакция, реакция с PAHBAH-Bi
Субстрат мальтотриоза, образованная пуллуланазой после второй реакции
PAHBAH 56 мМ
Тартрат 75 мМ
Bi 3+ 6,0 мМ
NaOH 195 мМ
pH щелочной
Температура инкубации 50°C
Время реакции 1000 секунд
Длина волны 405 нм
В случае необходимости дополнительные подробности можно найти в 2010-28835-02, предоставляемом по запросу компанией Novozymes A/S, Дания, и включенном при помощи ссылки.
Пример 1.
Мальтодекстрин, декстрозный эквивалент (DE) которого доводили до 11, получали в результате обычного способа ожижения крахмала с использованием кукурузного крахмала и высушивали распылением для данного эксперимента. Порошок мальтодекстрина растворяли в воде milliQ и pH доводили при помощи HCl/NaOH так, чтобы он составлял 4,3 при 60°C, и затем твердые вещества доводили до 33% сухого твердого вещества (DS) при помощи измерения показателя преломления (RI) сиропа. Осахаривание начинали путем смешивания 18 г раствора мальтодекстрина и 2 мл смеси ферментов, содержащей глюкоамилазу Aspergillus niger (SEQ ID NO: 1), пуллуланазу (Promozyme D2®) (SEQ ID NO: 3) и кислую альфа-амилазу Aspergillus niger (SEQ ID NO: 2) в разных дозах. Образцы инкубировали при 60°C с перемешиванием и отбирали через разные временные интервалы для определения компонента, представляющего собой сахар. Дозы ферментов и композиции DP1-DP4+ в момент времени, на который фракция DP1 доведена до максимальной величины, показаны в таблице 1.
Глюкоамилаза A. niger (SEQ ID NO: 1) Альфа-амилаза A. niger (SEQ ID NO: 2) Promozyme D2® (SEQ ID NO: 3) Время максимума DP1 DP2 DP3 DP4+ Комментарий
AGU/г DS FAU(A)/
г DS		 NPUN/г DS NPUN/
FAU(A)		 часы % % % %
0,18 0,045 0,34 7,56 48 95,6 2,4 0,5 1,4 Dextrozyme DX®
0,18 0,011 0,34 30,22 72 95,3 2,8 0,4 1,5
0,18 0,023 0,34 15,11 60 95,4 2,6 0,5 1,5
0,18 0,045 0,34 7,56 48 95,5 2,4 0,6 1,5
0,18 0,09 0,34 3,78 48 95,4 2,4 0,7 1,5
0,18 0,18 0,34 1,89 48 95,4 2,4 0,7 1,5
0,18 0,011 1,01 89,78 36 95,9 2,1 0,6 1,4
0,18 0,023 1,01 44,89 48 95,8 2,4 0,6 1,3
0,18 0,045 1,01 22,44 36 95,6 2,2 0,8 1,5
0,18 0,09 1,01 11,22 60 95,5 2,6 0,6 1,3
0,18 0,18 1,01 5,61 48 95,5 2,4 0,8 1,4
В таблице 1 показано, что смеси ферментов с соотношением NPUN/FAU(A) выше 44,89 демонстрировали более высокую фракцию DP1, чем Dextrozyme DX®. Даже при активности NPUN в 3 раза выше (1,01 NPUN/г DS), чем при Dextrozyme DX, максимальная DP1 не была такой же высокой, как Dextrozyme DX при активности FAU(A) более высокой, чем 0,045.
Пример 2.
Осахаривание с использованием разных смесей ферментов
Порошок мальтодекстрина, полученного в результате ожижения кукурузного крахмала, растворяли в воде в процессе нагревания с получением суспензии с 34,4% сухих твердых веществ. Содержание сухих веществ в суспензии измеряли при помощи измерения показателя преломления, показавшего 1,39271. Суспензию доводили до pH 4,3 при помощи 1 M раствора хлористоводородной кислоты. 18 грамм аликвот данной суспензии добавляли в 18 стеклянных реакционных сцинтилляционных флаконов с крышками с диафрагмами и вставляли в нагревательный блок для нагрева до температуры в 61°C. В каждый флакон вносили дозу ферментов, исходя из таблицы, приведенной ниже, и дополнительное количество воды добавляли в каждый флакон для достижения требуемого количества сухого твердого вещества 33%. Смесь ферментов содержала глюкоамилазу, полученную из Gloeophyllum trabeum (SEQ ID NO: 4), альфа-амилазу, полученную из Rhizomucor pusillus (SED ID NO: 5) и пуллуланазу, полученную из Bacillus deramificans (SEQ ID NO: 3). Образцы по 1,5 мл отбирали иголками через диафрагму из каждого флакона в разные моменты времени (36 часов, 42 часа, 48 часов, 54 часа и 60 часов) и деактивировали при 105°C в течение 5 минут. 1 мл каждого деактивированного образца разводили 4 мл деионизированной воды. Разведенные образцы оценивали при помощи способа HPLC для DP1-4 для измерения декстрозной чистоты (% DP1 или % DX).
По результатам из таблицы 2 видно чем выше соотношение NPUN/FAU(A), тем выше процентное содержание декстрозы.
Таблица 2.
Доза GA SEQ ID NO: 4 (AGU/г DS) Доза AA SEQ ID NO: 5 (FAU(A)/г DS) Доза PUL SEQ ID NO: 3 (NPUN/г DS) Соотношение
NPUN/
FAU(A) 		% DX, 36 ч % DX, 42 ч % DX, 48 ч % DX, 54 ч % DX, 60 ч
0,18 0 0,72 н/д 92,2 93,5 94,6 95,3 95,8
0,18 0 1,08 н/д 93,5 94,8 95,6 96,1 96,5
0,18 0,008 0,9 112,5 94,1 95,2 95,5 95,8 95,8
0,18 0,008 0,9 112,5 94,4 95,3 95,7 95,9 96,0
0,18 0,015 0,72 48 93,6 94,8 95,3 95,5 95,6
0,18 0,015 1,08 72 94,0 94,9 95,3 95,5 95,6
0,23 0 0,9 н/д 94,1 95,0 95,6 96,0 96,3
0,23 0,008 0,72 90 95,5 95,8 96,0 96,0 96,0
0,23 0,008 0,9 112,5 95,5 95,8 95,9 96,0 96,0
0,23 0,008 1,08 135 95,7 96,0 96,0 96,0 96,1
0,23 0,008 1,08 135 95,7 95,9 96,0 96,1 96,0
0,23 0,015 0,9 60 95,3 95,7 95,8 95,8 95,9
0,23 0,015 0,9 60 95,0 95,5 95,6 95,8 95,7
0,28 0 0,72 н/д 94,6 95,5 95,8 96,1 96,1
0,28 0 1,08 н/д 95,7 96,3 96,3 96,6 96,4
0,28 0,008 0,9 112,5 95,9 96,0 96,0 96,0 96,0
0,28 0,015 0,72 48 95,8 95,9 95,9 95,9 95,9
0,28 0,015 1,08 72 95,7 95,7 95,8 95,9 95,8
Результаты разных экспериментов, выполненных в соответствии с той же процедурой, что и описанная выше, показаны в таблице 3.
Таблица 3.
Доза AA SEQ ID NO: 5 AA (AFAU/г DS) Доза PUL SEQ ID NO: 3
(NPUN/г DS) 		Доза GA SEQ ID NO: 4
AMG
(AGU/г DS) 		Соотношение
NPUN/AFAU 		% DX на момент времени
36 ч 		% DX на момент времени
42 ч 		% DX на момент времени
48 ч 		% DX на момент времени
60 ч
0,0 0,96 0,25 н/д 96,2 96,6 96,7 96,8
0,001 0,96 0,25 960 96,8 96,7 96,7 96,6
0,002 0,96 0,25 480 96,6 96,6 96,6 96,5
0,003 0,96 0,25 320 96,3 96,4 96,5 96,3
0,005 0,96 0,25 191 96,2 96,3 96,2 96,2
Объем описанного и заявленного в данном документе изобретения не должен ограничиваться конкретными аспектами, раскрытыми в данном документе, поскольку эти аспекты предполагаются как иллюстрации некоторых аспектов настоящего изобретения. Предполагается, что любые эквивалентные аспекты находятся в пределах объема настоящего изобретения. Действительно, различные модификации настоящего изобретения в дополнение к продемонстрированным и описанным в данном документе станут очевидны специалистам в данной области из вышеприведенного описания. Предполагается, что такие модификации также входят в объем прилагаемой формулы изобретения. В случае противоречия настоящее раскрытие, в том числе определения, будет иметь преобладающую силу.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Novozymes A/S
<120> КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОЗНЫХ СИРОПОВ
<130> 12581-WO-PCT
<160> 25
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 616
<212> Белок
<213> Aspergillus niger
<400> 1
Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr
1 5 10 15
Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala
20 25 30
Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr
35 40 45
Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val
50 55 60
Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn
65 70 75 80
Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly
85 90 95
Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp
100 105 110
Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro
115 120 125
Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp
130 135 140
Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg
145 150 155 160
Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp
165 170 175
Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln
180 185 190
His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser
195 200 205
Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu
210 215 220
Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser
225 230 235 240
Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe
245 250 255
Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro
260 265 270
Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile
275 280 285
Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly
290 295 300
Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys
305 310 315 320
Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp
325 330 335
Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys
340 345 350
Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser
355 360 365
Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe
370 375 380
Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu
385 390 395 400
Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr
405 410 415
Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val
420 425 430
Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr
435 440 445
Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr
450 455 460
Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr
465 470 475 480
Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr
485 490 495
Ala Ser Lys Thr Ser Thr Ser Thr Ser Ser Thr Ser Cys Thr Thr Pro
500 505 510
Thr Ala Val Ala Val Thr Phe Asp Leu Thr Ala Thr Thr Thr Tyr Gly
515 520 525
Glu Asn Ile Tyr Leu Val Gly Ser Ile Ser Gln Leu Gly Asp Trp Glu
530 535 540
Thr Ser Asp Gly Ile Ala Leu Ser Ala Asp Lys Tyr Thr Ser Ser Asp
545 550 555 560
Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val Thr Leu Pro Ala Gly Glu Ser Phe Glu
565 570 575
Tyr Lys Phe Ile Arg Ile Glu Ser Asp Asp Ser Val Glu Trp Glu Ser
580 585 590
Asp Pro Asn Arg Glu Tyr Thr Val Pro Gln Ala Cys Gly Thr Ser Thr
595 600 605
Ala Thr Val Thr Asp Thr Trp Arg
610 615
<210> 2
<211> 484
<212> Белок
<213> Aspergillus niger
<400> 2
Leu Ser Ala Ala Glu Trp Arg Thr Gln Ser Ile Tyr Phe Leu Leu Thr
1 5 10 15
Asp Arg Phe Gly Arg Thr Asp Asn Ser Thr Thr Ala Thr Cys Asp Thr
20 25 30
Gly Asp Gln Ile Tyr Cys Gly Gly Ser Trp Gln Gly Ile Ile Asn His
35 40 45
Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp Ile Ser Pro
50 55 60
Ile Thr Glu Gln Leu Pro Gln Asp Thr Ala Asp Gly Glu Ala Tyr His
65 70 75 80
Gly Tyr Trp Gln Gln Lys Ile Tyr Asp Val Asn Ser Asn Phe Gly Thr
85 90 95
Ala Asp Asp Leu Lys Ser Leu Ser Asp Ala Leu His Ala Arg Gly Met
100 105 110
Tyr Leu Met Val Asp Val Val Pro Asn His Met Gly Tyr Ala Gly Asn
115 120 125
Gly Asn Asp Val Asp Tyr Ser Val Phe Asp Pro Phe Asp Ser Ser Ser
130 135 140
Tyr Phe His Pro Tyr Cys Leu Ile Thr Asp Trp Asp Asn Leu Thr Met
145 150 155 160
Val Gln Asp Cys Trp Glu Gly Asp Thr Ile Val Ser Leu Pro Asp Leu
165 170 175
Asn Thr Thr Glu Thr Ala Val Arg Thr Ile Trp Tyr Asp Trp Val Ala
180 185 190
Asp Leu Val Ser Asn Tyr Ser Val Asp Gly Leu Arg Ile Asp Ser Val
195 200 205
Leu Glu Val Glu Pro Asp Phe Phe Pro Gly Tyr Gln Glu Ala Ala Gly
210 215 220
Val Tyr Cys Val Gly Glu Val Asp Asn Gly Asn Pro Ala Leu Asp Cys
225 230 235 240
Pro Tyr Gln Lys Val Leu Asp Gly Val Leu Asn Tyr Pro Ile Tyr Trp
245 250 255
Gln Leu Leu Tyr Ala Phe Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ile Ser Asn Leu
260 265 270
Tyr Asn Met Ile Lys Ser Val Ala Ser Asp Cys Ser Asp Pro Thr Leu
275 280 285
Leu Gly Asn Phe Ile Glu Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Ala Ser Tyr
290 295 300
Thr Ser Asp Tyr Ser Gln Ala Lys Asn Val Leu Ser Tyr Ile Phe Leu
305 310 315 320
Ser Asp Gly Ile Pro Ile Val Tyr Ala Gly Glu Glu Gln His Tyr Ser
325 330 335
Gly Gly Lys Val Pro Tyr Asn Arg Glu Ala Thr Trp Leu Ser Gly Tyr
340 345 350
Asp Thr Ser Ala Glu Leu Tyr Thr Trp Ile Ala Thr Thr Asn Ala Ile
355 360 365
Arg Lys Leu Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ala Tyr Ile Thr Tyr Ala Asn
370 375 380
Asp Ala Phe Tyr Thr Asp Ser Asn Thr Ile Ala Met Arg Lys Gly Thr
385 390 395 400
Ser Gly Ser Gln Val Ile Thr Val Leu Ser Asn Lys Gly Ser Ser Gly
405 410 415
Ser Ser Tyr Thr Leu Thr Leu Ser Gly Ser Gly Tyr Thr Ser Gly Thr
420 425 430
Lys Leu Ile Glu Ala Tyr Thr Cys Thr Ser Val Thr Val Asp Ser Ser
435 440 445
Gly Asp Ile Pro Val Pro Met Ala Ser Gly Leu Pro Arg Val Leu Leu
450 455 460
Pro Ala Ser Val Val Asp Ser Ser Ser Leu Cys Gly Gly Ser Gly Arg
465 470 475 480
Leu Tyr Val Glu
<210> 3
<211> 928
<212> Белок
<213> Bacillus deramificans
<400> 3
Asp Gly Asn Thr Thr Thr Ile Ile Val His Tyr Phe Arg Pro Ala Gly
1 5 10 15
Asp Tyr Gln Pro Trp Ser Leu Trp Met Trp Pro Lys Asp Gly Gly Gly
20 25 30
Ala Glu Tyr Asp Phe Asn Gln Pro Ala Asp Ser Phe Gly Ala Val Ala
35 40 45
Ser Ala Asp Ile Pro Gly Asn Pro Ser Gln Val Gly Ile Ile Val Arg
50 55 60
Thr Gln Asp Trp Thr Lys Asp Val Ser Ala Asp Arg Tyr Ile Asp Leu
65 70 75 80
Ser Lys Gly Asn Glu Val Trp Leu Val Glu Gly Asn Ser Gln Ile Phe
85 90 95
Tyr Asn Glu Lys Asp Ala Glu Asp Ala Ala Lys Pro Ala Val Ser Asn
100 105 110
Ala Tyr Leu Asp Ala Ser Asn Gln Val Leu Val Lys Leu Ser Gln Pro
115 120 125
Leu Thr Leu Gly Glu Gly Ala Ser Gly Phe Thr Val His Asp Asp Thr
130 135 140
Ala Asn Lys Asp Ile Pro Val Thr Ser Val Lys Asp Ala Ser Leu Gly
145 150 155 160
Gln Asp Val Thr Ala Val Leu Ala Gly Thr Phe Gln His Ile Phe Gly
165 170 175
Gly Ser Asp Trp Ala Pro Asp Asn His Ser Thr Leu Leu Lys Lys Val
180 185 190
Thr Asn Asn Leu Tyr Gln Phe Ser Gly Asp Leu Pro Glu Gly Asn Tyr
195 200 205
Gln Tyr Lys Val Ala Leu Asn Asp Ser Trp Asn Asn Pro Ser Tyr Pro
210 215 220
Ser Asp Asn Ile Asn Leu Thr Val Pro Ala Gly Gly Ala His Val Thr
225 230 235 240
Phe Ser Tyr Ile Pro Ser Thr His Ala Val Tyr Asp Thr Ile Asn Asn
245 250 255
Pro Asn Ala Asp Leu Gln Val Glu Ser Gly Val Lys Thr Asp Leu Val
260 265 270
Thr Val Thr Leu Gly Glu Asp Pro Asp Val Ser His Thr Leu Ser Ile
275 280 285
Gln Thr Asp Gly Tyr Gln Ala Lys Gln Val Ile Pro Arg Asn Val Leu
290 295 300
Asn Ser Ser Gln Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asp Asp Leu Gly Asn Thr Tyr
305 310 315 320
Thr Gln Lys Ala Thr Thr Phe Lys Val Trp Ala Pro Thr Ser Thr Gln
325 330 335
Val Asn Val Leu Leu Tyr Asp Ser Ala Thr Gly Ser Val Thr Lys Ile
340 345 350
Val Pro Met Thr Ala Ser Gly His Gly Val Trp Glu Ala Thr Val Asn
355 360 365
Gln Asn Leu Glu Asn Trp Tyr Tyr Met Tyr Glu Val Thr Gly Gln Gly
370 375 380
Ser Thr Arg Thr Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Ile Ala Pro Asn
385 390 395 400
Gly Thr Arg Gly Met Ile Val Asp Leu Ala Lys Thr Asp Pro Ala Gly
405 410 415
Trp Asn Ser Asp Lys His Ile Thr Pro Lys Asn Ile Glu Asp Glu Val
420 425 430
Ile Tyr Glu Met Asp Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp Pro Asn Ser Gly
435 440 445
Met Lys Asn Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu Lys Gly Thr Lys
450 455 460
Gly Pro Asp Asn Val Lys Thr Gly Ile Asp Ser Leu Lys Gln Leu Gly
465 470 475 480
Ile Thr His Val Gln Leu Met Pro Val Phe Ala Ser Asn Ser Val Asp
485 490 495
Glu Thr Asp Pro Thr Gln Asp Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr
500 505 510
Asp Val Pro Glu Gly Gln Tyr Ala Thr Asn Ala Asn Gly Asn Ala Arg
515 520 525
Ile Lys Glu Phe Lys Glu Met Val Leu Ser Leu His Arg Glu His Ile
530 535 540
Gly Val Asn Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Ala Thr Gln Ile
545 550 555 560
Ser Asp Phe Asp Lys Ile Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp Asp
565 570 575
Ala Gly Asn Tyr Thr Asn Gly Ser Gly Thr Gly Asn Glu Ile Ala Ala
580 585 590
Glu Arg Pro Met Val Gln Lys Phe Ile Ile Asp Ser Leu Lys Tyr Trp
595 600 605
Val Asn Glu Tyr His Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu
610 615 620
Leu Gly Lys Asp Thr Met Ser Lys Ala Ala Ser Glu Leu His Ala Ile
625 630 635 640
Asn Pro Gly Ile Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser
645 650 655
Ala Leu Pro Asp Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gln Lys Gly Met
660 665 670
Gly Val Ala Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu Asp Gly Asn
675 680 685
Val Phe Asp Ser Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu
690 695 700
Thr Asp Ala Ile Lys Asn Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe Thr
705 710 715 720
Ser Ser Pro Gly Glu Thr Ile Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Asn Tyr
725 730 735
Thr Leu Trp Asp Lys Ile Ala Leu Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu Ala
740 745 750
Asp Arg Ile Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val Val Met Thr Ser
755 760 765
Gln Gly Val Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr Lys
770 775 780
Gly Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Ala Val Asn Glu Phe
785 790 795 800
Asp Trp Ser Arg Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe Asn Tyr Tyr Ser
805 810 815
Gly Leu Ile His Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr
820 825 830
Ala Asn Glu Ile Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asn Ser Pro Glu Asn
835 840 845
Thr Val Ala Tyr Glu Leu Thr Asp His Val Asn Lys Asp Lys Trp Gly
850 855 860
Asn Ile Ile Val Val Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Val Ala Thr Ile Asn
865 870 875 880
Leu Pro Ser Gly Lys Trp Ala Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys Val Gly
885 890 895
Glu Ser Thr Leu Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro Gly Ile
900 905 910
Ser Met Met Ile Leu His Gln Glu Val Ser Pro Asp His Gly Lys Lys
915 920 925
<210> 4
<211> 559
<212> Белок
<213> Gloeophyllum trabeum
<400> 4
Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Gly Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys Ala
1 5 10 15
Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly Ala
20 25 30
Ala Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Lys Ser Asp Pro Asp Tyr
35 40 45
Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu Ile
50 55 60
Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Ser Leu
65 70 75 80
Ile Asp Ser Phe Val Ile Ala Glu Ala Asn Ile Gln Gln Val Pro Asn
85 90 95
Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn
100 105 110
Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Pro Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp
115 120 125
Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp Leu
130 135 140
Leu Ser Asn Gly Asn Thr Thr Trp Val Thr Ser Thr Leu Trp Pro Ile
145 150 155 160
Ile Gln Asn Asp Leu Asn Tyr Val Val Gln Tyr Trp Asn Gln Thr Thr
165 170 175
Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala
180 185 190
Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Lys Ile
195 200 205
Gly Gln Thr Ser Ser Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Ala Asn Leu
210 215 220
Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Ile Thr
225 230 235 240
Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu Leu
245 250 255
Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Thr Thr
260 265 270
Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr Val
275 280 285
Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser Asn
290 295 300
Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly Gly
305 310 315 320
Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr Asp
325 330 335
Ala Leu Asn Val Trp Ala Ala Gln Gly Ser Leu Asn Val Thr Ser Ile
340 345 350
Ser Leu Pro Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Ser Val Thr Ala Gly Thr
355 360 365
Tyr Ala Ser Ser Ser Thr Thr Tyr Thr Thr Leu Thr Ser Ala Ile Lys
370 375 380
Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Gln Tyr Thr Pro Ser
385 390 395 400
Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Phe Ser Arg Ser Asn Gly Ala Pro Val
405 410 415
Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala Phe
420 425 430
Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Val Gly Leu
435 440 445
Thr Val Pro Thr Ser Cys Ser Ser Asn Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Thr Val Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Gln Thr Val Trp Gly Glu
465 470 475 480
Asn Ile Tyr Ile Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Ser Asn Trp Ser Pro
485 490 495
Asp Asn Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile
500 505 510
Thr Val Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Gln Tyr Lys Tyr Ile Arg
515 520 525
Lys Asn Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile
530 535 540
Thr Thr Pro Ala Ser Gly Ser Val Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg
545 550 555
<210> 5
<211> 583
<212> Белок
<213> Rhizomucor pusillus
<400> 5
Ala Thr Ser Asp Asp Trp Lys Gly Lys Ala Ile Tyr Gln Leu Leu Thr
1 5 10 15
Asp Arg Phe Gly Arg Ala Asp Asp Ser Thr Ser Asn Cys Ser Asn Leu
20 25 30
Ser Asn Tyr Cys Gly Gly Thr Tyr Glu Gly Ile Thr Lys His Leu Asp
35 40 45
Tyr Ile Ser Gly Met Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile Pro
50 55 60
Lys Asn Ser Asp Gly Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ala Thr Asp Phe Tyr
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Asn Phe Gly Asp Glu Ser Gln Leu Lys Ala Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Ala His Glu Arg Asp Met Tyr Val Met Leu Asp Val Val Ala
100 105 110
Asn His Ala Gly Pro Thr Ser Asn Gly Tyr Ser Gly Tyr Thr Phe Asp
115 120 125
Asp Ala Ser Leu Tyr His Pro Lys Cys Thr Ile Asp Tyr Asn Asn Gln
130 135 140
Thr Ser Ile Glu Gln Cys Trp Val Ala Asp Glu Leu Pro Asp Ile Asp
145 150 155 160
Thr Glu Asn Ser Asp Asn Val Ala Ile Leu Asn Asp Ile Val Ser Gly
165 170 175
Trp Val Gly Asn Tyr Ser Phe Asp Gly Ile Arg Ile Asp Thr Val Lys
180 185 190
His Ile Arg Lys Asp Phe Trp Thr Gly Tyr Ala Glu Ala Ala Gly Val
195 200 205
Phe Ala Thr Gly Glu Val Phe Asn Gly Asp Pro Ala Tyr Val Gly Pro
210 215 220
Tyr Gln Lys Tyr Leu Pro Ser Leu Ile Asn Tyr Pro Met Tyr Tyr Ala
225 230 235 240
Leu Asn Asp Val Phe Val Ser Lys Ser Lys Gly Phe Ser Arg Ile Ser
245 250 255
Glu Met Leu Gly Ser Asn Arg Asn Ala Phe Glu Asp Thr Ser Val Leu
260 265 270
Thr Thr Phe Val Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Leu Asn Ser Gln
275 280 285
Ser Asp Lys Ala Leu Phe Lys Asn Ala Leu Thr Tyr Val Leu Leu Gly
290 295 300
Glu Gly Ile Pro Ile Val Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Gly Phe Ser Gly
305 310 315 320
Gly Ala Asp Pro Ala Asn Arg Glu Val Leu Trp Thr Thr Asn Tyr Asp
325 330 335
Thr Ser Ser Asp Leu Tyr Gln Phe Ile Lys Thr Val Asn Ser Val Arg
340 345 350
Met Lys Ser Asn Lys Ala Val Tyr Met Asp Ile Tyr Val Gly Asp Asn
355 360 365
Ala Tyr Ala Phe Lys His Gly Asp Ala Leu Val Val Leu Asn Asn Tyr
370 375 380
Gly Ser Gly Ser Thr Asn Gln Val Ser Phe Ser Val Ser Gly Lys Phe
385 390 395 400
Asp Ser Gly Ala Ser Leu Met Asp Ile Val Ser Asn Ile Thr Thr Thr
405 410 415
Val Ser Ser Asp Gly Thr Val Thr Phe Asn Leu Lys Asp Gly Leu Pro
420 425 430
Ala Ile Phe Thr Ser Ala Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro
435 440 445
Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala
450 455 460
Ser Lys Thr Ser Thr Ser Thr Ser Ser Thr Ser Cys Thr Thr Pro Thr
465 470 475 480
Ala Val Ala Val Thr Phe Asp Leu Thr Ala Thr Thr Thr Tyr Gly Glu
485 490 495
Asn Ile Tyr Leu Val Gly Ser Ile Ser Gln Leu Gly Asp Trp Glu Thr
500 505 510
Ser Asp Gly Ile Ala Leu Ser Ala Asp Lys Tyr Thr Ser Ser Asp Pro
515 520 525
Leu Trp Tyr Val Thr Val Thr Leu Pro Ala Gly Glu Ser Phe Glu Tyr
530 535 540
Lys Phe Ile Arg Ile Glu Ser Asp Asp Ser Val Glu Trp Glu Ser Asp
545 550 555 560
Pro Asn Arg Glu Tyr Thr Val Pro Gln Ala Cys Gly Thr Ser Thr Ala
565 570 575
Thr Val Thr Asp Thr Trp Arg
580
<210> 6
<211> 573
<212> Белок
<213> Gloeophyllum sepiarium
<400> 6
Met Tyr Arg Phe Leu Val Cys Ala Leu Gly Leu Ala Ala Ser Val Leu
1 5 10 15
Ala Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Ser Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys
20 25 30
Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Ala Ser Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asp Pro Asp
50 55 60
Tyr Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu
65 70 75 80
Ile Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Thr
85 90 95
Leu Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Glu Ala Asn Leu Gln Gln Val Ser
100 105 110
Asn Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe
115 120 125
Asn Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg
130 135 140
Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp
145 150 155 160
Leu Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ser Tyr Val Thr Ser Asn Leu Trp Pro
165 170 175
Ile Ile Gln Asn Asp Leu Gly Tyr Val Val Ser Tyr Trp Asn Gln Ser
180 185 190
Thr Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr
195 200 205
Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Ala
210 215 220
Ile Gly Gln Thr Ser Gln Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn
225 230 235 240
Leu Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Ile
245 250 255
Thr Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu
260 265 270
Leu Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Ala
275 280 285
Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr
290 295 300
Val Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Val Ala Ser
305 310 315 320
Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly
325 330 335
Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr
340 345 350
Asp Ala Leu Asn Val Trp Glu Ser Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Ser
355 360 365
Thr Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Ala Gly
370 375 380
Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Ala Ile
385 390 395 400
Lys Asn Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Lys Tyr Thr Pro
405 410 415
Ser Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Lys Ser Asp Gly Ser Pro
420 425 430
Leu Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala
435 440 445
Phe Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Ala Gly
450 455 460
Leu Thr Val Pro Ser Ser Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Pro Thr Val
465 470 475 480
Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Glu Thr Val Trp Gly Glu Asn Ile
485 490 495
Tyr Leu Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Glu Asn Trp Ser Ala Asp Asn
500 505 510
Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val
515 520 525
Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Asn
530 535 540
Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr
545 550 555 560
Pro Ala Ser Gly Ser Thr Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg
565 570
<210> 7
<211> 573
<212> Белок
<213> Gloeophyllym sepiarium
<400> 7
Met Tyr Arg Phe Leu Val Cys Ala Leu Gly Leu Ala Ala Ser Val Leu
1 5 10 15
Ala Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Ser Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys
20 25 30
Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Ala Ser Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asp Pro Asp
50 55 60
Tyr Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu
65 70 75 80
Ile Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Thr
85 90 95
Leu Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Glu Ala Asn Leu Gln Gln Val Ser
100 105 110
Asn Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe
115 120 125
Asn Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg
130 135 140
Asp Gly Ser Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp
145 150 155 160
Leu Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ser Tyr Val Thr Ser Lys Leu Trp Pro
165 170 175
Ile Ile Gln Asn Asp Leu Gly Tyr Val Val Ser Tyr Trp Asn Gln Ser
180 185 190
Thr Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr
195 200 205
Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Ala
210 215 220
Ile Gly Gln Thr Ser Gln Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn
225 230 235 240
Leu Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Ile
245 250 255
Thr Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu
260 265 270
Leu Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Ala
275 280 285
Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr
290 295 300
Val Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser
305 310 315 320
Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly
325 330 335
Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr
340 345 350
Asp Ala Leu Asn Val Trp Glu Ser Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Ser
355 360 365
Thr Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Ala Gly
370 375 380
Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Ala Ile
385 390 395 400
Lys Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Thr Ile Asn Ala Lys Tyr Thr Pro
405 410 415
Ser Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Lys Ser Asp Gly Ser Pro
420 425 430
Leu Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala
435 440 445
Phe Glu Ala Arg Asn Asp Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Ala Gly
450 455 460
Leu Thr Val Pro Ser Ser Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Pro Thr Val
465 470 475 480
Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Glu Thr Val Trp Gly Glu Asn Ile
485 490 495
Tyr Leu Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Glu Asn Trp Ser Ala Asp Asn
500 505 510
Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val
515 520 525
Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Asn
530 535 540
Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr
545 550 555 560
Pro Ala Ser Gly Ser Thr Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg
565 570
<210> 8
<211> 573
<212> Белок
<213> Gloeophyllum trabeum
<400> 8
Met Tyr Arg Phe Leu Val Cys Ala Leu Gly Leu Ala Ala Thr Val Leu
1 5 10 15
Ala Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Ser Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys
20 25 30
Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Ala Ser Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asp Pro Asp
50 55 60
Tyr Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu
65 70 75 80
Ile Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Thr
85 90 95
Leu Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Glu Ala Asn Leu Gln Gln Val Ser
100 105 110
Asn Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe
115 120 125
Asn Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg
130 135 140
Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp
145 150 155 160
Leu Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ser Tyr Val Thr Ser Ile Leu Trp Pro
165 170 175
Ile Ile Gln Asn Asp Leu Gly Tyr Val Val Ser Tyr Trp Asn Gln Ser
180 185 190
Thr Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr
195 200 205
Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Ala
210 215 220
Ile Gly Gln Thr Ser Gln Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn
225 230 235 240
Leu Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Ile
245 250 255
Thr Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu
260 265 270
Leu Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Ala
275 280 285
Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr
290 295 300
Phe Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Val Ala Ser
305 310 315 320
Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly
325 330 335
Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr
340 345 350
Asp Ala Leu Asn Val Trp Glu Ser Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Ser
355 360 365
Thr Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Ala Gly
370 375 380
Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Ala Ile
385 390 395 400
Lys Asn Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Lys Tyr Thr Pro
405 410 415
Ser Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Lys Ser Asp Gly Ser Pro
420 425 430
Leu Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala
435 440 445
Phe Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Ala Gly
450 455 460
Leu Thr Val Pro Ser Ser Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Pro Thr Val
465 470 475 480
Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Glu Thr Val Trp Gly Glu Asn Ile
485 490 495
Tyr Leu Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Glu Asn Trp Ser Ala Asp Asn
500 505 510
Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val
515 520 525
Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Asn
530 535 540
Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr
545 550 555 560
Pro Ala Ser Gly Ser Thr Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg
565 570
<210> 9
<211> 573
<212> Белок
<213> Gloeophyllum sepiarium
<400> 9
Met Tyr Arg Phe Leu Val Cys Ala Leu Gly Leu Ala Ala Ser Val Leu
1 5 10 15
Ala Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Ser Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys
20 25 30
Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Ala Ser Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asp Pro Asp
50 55 60
Tyr Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu
65 70 75 80
Ile Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Thr
85 90 95
Leu Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Glu Ala Asn Leu Gln Gln Val Ser
100 105 110
Asn Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe
115 120 125
Asn Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg
130 135 140
Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp
145 150 155 160
Leu Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ser Tyr Val Thr Ser Asn Leu Trp Pro
165 170 175
Ile Ile Gln Asn Asp Leu Gly Tyr Val Val Ser Tyr Trp Asn Gln Ser
180 185 190
Thr Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr
195 200 205
Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Ala
210 215 220
Ile Gly Gln Thr Ser Gln Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn
225 230 235 240
Leu Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Ile
245 250 255
Thr Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu
260 265 270
Leu Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Ala
275 280 285
Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr
290 295 300
Val Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser
305 310 315 320
Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly
325 330 335
Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr
340 345 350
Asp Ala Leu Asn Val Trp Glu Leu Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Ser
355 360 365
Thr Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Ala Gly
370 375 380
Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Ala Ile
385 390 395 400
Lys Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Lys Tyr Thr Pro
405 410 415
Ser Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Lys Ser Asp Gly Ser Pro
420 425 430
Leu Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala
435 440 445
Phe Glu Ala Arg Asn Asp Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Ala Ser
450 455 460
Leu Thr Val Pro Ser Ser Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Pro Thr Val
465 470 475 480
Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Glu Thr Val Trp Gly Glu Asn Ile
485 490 495
Tyr Leu Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Glu Asn Trp Ser Ala Asp Asn
500 505 510
Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val
515 520 525
Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Asn
530 535 540
Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr
545 550 555 560
Pro Ala Ser Gly Ser Thr Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg
565 570
<210> 10
<211> 573
<212> Белок
<213> Gloeophyllum sepiarium
<400> 10
Met Tyr Arg Phe Leu Val Cys Ala Leu Gly Leu Ala Ala Thr Val Leu
1 5 10 15
Ala Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Ser Ser Glu Gly Pro Val Ala Lys
20 25 30
Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Ala Ser Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asp Pro Asp
50 55 60
Tyr Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu
65 70 75 80
Ile Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Thr
85 90 95
Leu Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Glu Ala Asn Leu Gln Gln Val Ser
100 105 110
Asn Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe
115 120 125
Asn Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg
130 135 140
Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp
145 150 155 160
Leu Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ser Tyr Val Thr Ser Asn Leu Trp Pro
165 170 175
Ile Ile Gln Asn Asp Leu Gly Tyr Val Val Ser Tyr Trp Asn Gln Ser
180 185 190
Thr Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr
195 200 205
Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Ala
210 215 220
Ile Gly Gln Thr Ser Gln Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn
225 230 235 240
Leu Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Ile
245 250 255
Thr Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu
260 265 270
Leu Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Ala
275 280 285
Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr
290 295 300
Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser
305 310 315 320
Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly
325 330 335
Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr
340 345 350
Asp Ala Leu Asn Val Trp Glu Ser Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Ser
355 360 365
Thr Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Ala Gly
370 375 380
Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Ala Ile
385 390 395 400
Lys Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Lys Tyr Thr Pro
405 410 415
Ser Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Lys Ser Asp Gly Ser Pro
420 425 430
Leu Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala
435 440 445
Phe Glu Ala Arg Asn Asp Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Ala Gly
450 455 460
Leu Thr Val Pro Ser Ser Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Pro Thr Val
465 470 475 480
Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Glu Thr Val Trp Gly Glu Asn Ile
485 490 495
Tyr Leu Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Glu Asn Trp Ser Ala Asp Asn
500 505 510
Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val
515 520 525
Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Asn
530 535 540
Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr
545 550 555 560
Pro Ala Ser Gly Ser Thr Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg
565 570
<210> 11
<211> 573
<212> Белок
<213> Gloeophyllum sp
<400> 11
Met Tyr Arg Phe Leu Val Cys Ala Leu Gly Leu Ala Ala Thr Val Leu
1 5 10 15
Ala Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Ser Ser Glu Gly Pro Val Ala Lys
20 25 30
Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Ala Ser Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asp Pro Asp
50 55 60
Tyr Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu
65 70 75 80
Ile Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Thr
85 90 95
Leu Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Glu Ala Asn Leu Gln Gln Val Ser
100 105 110
Asn Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe
115 120 125
Asn Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg
130 135 140
Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp
145 150 155 160
Leu Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ser Tyr Val Thr Ser Asn Leu Trp Pro
165 170 175
Ile Ile Gln Asn Asp Leu Gly Tyr Val Val Ser Tyr Trp Asn Gln Ser
180 185 190
Thr Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr
195 200 205
Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Ala
210 215 220
Ile Gly Gln Thr Ser Gln Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn
225 230 235 240
Leu Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Ile
245 250 255
Thr Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu
260 265 270
Leu Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Ala
275 280 285
Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr
290 295 300
Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser
305 310 315 320
Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly
325 330 335
Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr
340 345 350
Asp Ala Leu Asn Val Trp Glu Ser Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Ser
355 360 365
Thr Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Ala Gly
370 375 380
Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Ala Ile
385 390 395 400
Lys Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Lys Tyr Thr Pro
405 410 415
Ser Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Lys Ser Asp Gly Ser Pro
420 425 430
Leu Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala
435 440 445
Phe Glu Ala Arg Asn Asp Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Ala Gly
450 455 460
Leu Thr Val Pro Ser Ser Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Pro Thr Val
465 470 475 480
Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Glu Thr Val Trp Gly Glu Asn Ile
485 490 495
Tyr Leu Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Glu Asn Trp Ser Ala Asp Asn
500 505 510
Ala Leu Leu Leu Ser Ser Val Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val
515 520 525
Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Asn
530 535 540
Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr
545 550 555 560
Pro Ala Ser Gly Ser Thr Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg
565 570
<210> 12
<211> 573
<212> Белок
<213> Gloeophyllum trabeum
<400> 12
Met Tyr Arg Phe Leu Val Cys Ala Leu Gly Leu Ala Ala Ser Val Leu
1 5 10 15
Ala Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Ser Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys
20 25 30
Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Ala Ser Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asp Pro Asp
50 55 60
Tyr Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu
65 70 75 80
Ile Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Gly Thr Ser Ser Leu Arg Thr
85 90 95
Leu Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Glu Ala Asn Leu Gln Gln Val Ser
100 105 110
Asn Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe
115 120 125
Asn Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg
130 135 140
Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp
145 150 155 160
Leu Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ser Tyr Val Thr Ser Asn Leu Trp Pro
165 170 175
Ile Ile Gln Asn Asp Leu Gly Tyr Val Val Ser Tyr Trp Asn Gln Ser
180 185 190
Thr Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr
195 200 205
Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Ala
210 215 220
Ile Gly Gln Thr Ser Gln Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn
225 230 235 240
Leu Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Ile
245 250 255
Thr Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu
260 265 270
Leu Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Ala
275 280 285
Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr
290 295 300
Val Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser
305 310 315 320
Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly
325 330 335
Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr
340 345 350
Asp Ala Leu Asn Val Trp Glu Ser Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Ser
355 360 365
Thr Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Ala Gly
370 375 380
Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Ala Ile
385 390 395 400
Lys Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Val Asn Ala Lys Tyr Thr Pro
405 410 415
Ser Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Lys Ser Asp Gly Ser Pro
420 425 430
Leu Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala
435 440 445
Phe Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Ala Gly
450 455 460
Leu Thr Val Pro Ser Ser Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Pro Thr Val
465 470 475 480
Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Glu Thr Val Trp Gly Glu Asn Ile
485 490 495
Tyr Leu Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Glu Asn Trp Ser Ala Asp Asn
500 505 510
Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val
515 520 525
Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Asn
530 535 540
Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr
545 550 555 560
Pro Ala Ser Gly Ser Thr Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg
565 570
<210> 13
<211> 576
<212> Белок
<213> Gloeophyllum trabeum
<400> 13
Met Tyr Arg Phe Leu Val Cys Ala Leu Gly Leu Leu Gly Thr Val Leu
1 5 10 15
Ala Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Gly Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys
20 25 30
Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Ala Ala Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Lys Ser Asp Pro Asp
50 55 60
Tyr Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu
65 70 75 80
Ile Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Ser
85 90 95
Leu Ile Asp Ser Phe Val Ile Ala Glu Ala Asn Ile Gln Gln Val Ser
100 105 110
Asn Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe
115 120 125
Asn Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg
130 135 140
Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp
145 150 155 160
Leu Leu Ser Asn Gly Asn Thr Thr Trp Val Thr Ser Thr Leu Trp Pro
165 170 175
Ile Ile Gln Asn Asp Leu Asn Tyr Val Val Gln Tyr Trp Asn Gln Thr
180 185 190
Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr
195 200 205
Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Lys
210 215 220
Ile Gly Gln Thr Ser Ser Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Ala Asn
225 230 235 240
Leu Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Ile
245 250 255
Thr Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu
260 265 270
Leu Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Thr
275 280 285
Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr
290 295 300
Val Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser
305 310 315 320
Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly
325 330 335
Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr
340 345 350
Asp Ala Leu Asn Val Trp Ala Ala Gln Gly Ser Leu Asn Val Thr Ser
355 360 365
Ile Ser Leu Pro Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Ser Val Thr Ala Gly
370 375 380
Thr Tyr Ala Ser Ser Ser Thr Thr Tyr Thr Thr Leu Thr Ser Ala Ile
385 390 395 400
Lys Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Gln Tyr Thr Pro
405 410 415
Ser Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Phe Ser Arg Ser Asn Gly Ser Pro
420 425 430
Val Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala
435 440 445
Phe Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Val Gly
450 455 460
Leu Thr Val Pro Thr Ser Cys Ser Ser Asn Ser Gly Gly Gly Gly Gly
465 470 475 480
Ser Thr Val Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Gln Thr Val Trp Gly
485 490 495
Glu Asn Ile Tyr Ile Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Ser Asn Trp Ser
500 505 510
Pro Asp Asn Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser
515 520 525
Ile Thr Val Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Gln Tyr Lys Tyr Ile
530 535 540
Arg Lys Asn Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser
545 550 555 560
Ile Thr Thr Pro Ala Ser Gly Ser Val Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg
565 570 575
<210> 14
<211> 576
<212> Белок
<213> Gloeophyllum trabeum
<400> 14
Met Tyr Arg Phe Leu Val Cys Ala Leu Gly Leu Leu Gly Thr Val Leu
1 5 10 15
Ala Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Gly Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys
20 25 30
Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Ala Ala Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Lys Ser Asp Pro Asp
50 55 60
Tyr Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu
65 70 75 80
Ile Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Ser
85 90 95
Leu Ile Asp Ser Phe Val Ile Ala Glu Ala Asn Ile Gln Gln Val Ser
100 105 110
Asn Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe
115 120 125
Asn Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg
130 135 140
Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp
145 150 155 160
Leu Leu Ser Asn Gly Asn Thr Thr Trp Val Thr Ser Thr Leu Trp Pro
165 170 175
Ile Ile Gln Asn Asp Leu Asn Tyr Val Val Gln Tyr Trp Asn Gln Thr
180 185 190
Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr
195 200 205
Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Lys
210 215 220
Ile Gly Gln Thr Ser Ser Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Ala Asn
225 230 235 240
Leu Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Ile
245 250 255
Thr Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu
260 265 270
Leu Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Thr
275 280 285
Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr
290 295 300
Val Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser
305 310 315 320
Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly
325 330 335
Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr
340 345 350
Asp Ala Leu Asn Val Trp Ala Ala Gln Gly Ser Leu Asn Val Thr Ser
355 360 365
Ile Ser Leu Pro Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Ser Val Thr Ala Gly
370 375 380
Thr Tyr Ala Ser Ser Ser Thr Thr Tyr Thr Thr Leu Thr Ser Ala Ile
385 390 395 400
Lys Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Gln Tyr Thr Pro
405 410 415
Ser Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Phe Ser Arg Ser Asn Gly Ala Pro
420 425 430
Val Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala
435 440 445
Phe Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Val Gly
450 455 460
Leu Thr Val Pro Thr Ser Cys Ser Ser Asn Ser Gly Gly Gly Gly Gly
465 470 475 480
Ser Thr Val Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Gln Thr Val Trp Gly
485 490 495
Glu Asn Ile Tyr Ile Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Ser Asn Trp Ser
500 505 510
Pro Asp Asn Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser
515 520 525
Ile Thr Val Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Gln Tyr Lys Tyr Ile
530 535 540
Arg Lys Asn Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser
545 550 555 560
Ile Thr Thr Pro Ala Ser Gly Ser Val Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg
565 570 575
<210> 15
<211> 618
<212> Белок
<213> Talaromyces emersonii
<400> 15
Met Ala Ser Leu Val Ala Gly Ala Leu Cys Ile Leu Gly Leu Thr Pro
1 5 10 15
Ala Ala Phe Ala Arg Ala Pro Val Ala Ala Arg Ala Thr Gly Ser Leu
20 25 30
Asp Ser Phe Leu Ala Thr Glu Thr Pro Ile Ala Leu Gln Gly Val Leu
35 40 45
Asn Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ala Asp Val Ala Gly Ala Ser Ala Gly
50 55 60
Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Arg Ser Asp Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser
65 70 75 80
Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu Thr Ala Lys Tyr Leu Val Asp Ala Phe
85 90 95
Ile Ala Gly Asn Lys Asp Leu Glu Gln Thr Ile Gln Gln Tyr Ile Ser
100 105 110
Ala Gln Ala Lys Val Gln Thr Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser
115 120 125
Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asn Glu Thr Ala Phe
130 135 140
Thr Gly Pro Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala
145 150 155 160
Thr Ala Leu Ile Ala Tyr Ala Asn Tyr Leu Ile Asp Asn Gly Glu Ala
165 170 175
Ser Thr Ala Asp Glu Ile Ile Trp Pro Ile Val Gln Asn Asp Leu Ser
180 185 190
Tyr Ile Thr Gln Tyr Trp Asn Ser Ser Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu
195 200 205
Val Glu Gly Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val Gln His Arg Ala Leu
210 215 220
Val Glu Gly Asn Ala Leu Ala Thr Arg Leu Asn His Thr Cys Ser Asn
225 230 235 240
Cys Val Ser Gln Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp
245 250 255
Thr Gly Ser Tyr Val Leu Ala Asn Phe Gly Gly Ser Gly Arg Ser Gly
260 265 270
Lys Asp Val Asn Ser Ile Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala
275 280 285
Gly Gly Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala Arg Ala Leu
290 295 300
Ala Asn His Lys Val Val Thr Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Ala Ile
305 310 315 320
Asn Ser Gly Ile Ala Glu Gly Ser Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro
325 330 335
Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Ala Thr Ala Ala
340 345 350
Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln Trp Lys Lys Ile Gly
355 360 365
Ser Ile Ser Ile Thr Asp Val Ser Leu Pro Phe Phe Gln Asp Ile Tyr
370 375 380
Pro Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Asn Ser Gly Ser Thr Thr Phe Asn
385 390 395 400
Asp Ile Ile Ser Ala Val Gln Thr Tyr Gly Asp Gly Tyr Leu Ser Ile
405 410 415
Val Glu Lys Tyr Thr Pro Ser Asp Gly Ser Leu Thr Glu Gln Phe Ser
420 425 430
Arg Thr Asp Gly Thr Pro Leu Ser Ala Ser Ala Leu Thr Trp Ser Tyr
435 440 445
Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Ala Arg Arg Gln Ser Val Val Pro Ala
450 455 460
Ser Trp Gly Glu Ser Ser Ala Ser Ser Val Pro Ala Val Cys Ser Ala
465 470 475 480
Thr Ser Ala Thr Gly Pro Tyr Ser Thr Ala Thr Asn Thr Val Trp Pro
485 490 495
Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ser Ala Pro Cys Thr
500 505 510
Thr Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Phe Asp Glu Ile Val Ser Thr Ser
515 520 525
Tyr Gly Glu Thr Ile Tyr Leu Ala Gly Ser Ile Pro Glu Leu Gly Asn
530 535 540
Trp Ser Thr Ala Ser Ala Ile Pro Leu Arg Ala Asp Ala Tyr Thr Asn
545 550 555 560
Ser Asn Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val Asn Leu Pro Pro Gly Thr Ser
565 570 575
Phe Glu Tyr Lys Phe Phe Lys Asn Gln Thr Asp Gly Thr Ile Val Trp
580 585 590
Glu Asp Asp Pro Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro Ala Tyr Cys Gly Gln
595 600 605
Thr Thr Ala Ile Leu Asp Asp Ser Trp Gln
610 615
<210> 16
<211> 828
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> гибридная пуллуланаза
<400> 16
Asp Ser Thr Ser Thr Glu Val Ile Val His Tyr His Arg Phe Asp Ser
1 5 10 15
Asn Tyr Ala Asn Trp Asp Leu Trp Met Trp Pro Tyr Gln Pro Val Asn
20 25 30
Gly Asn Gly Ala Ala Tyr Glu Phe Ser Gly Lys Asp Asp Phe Gly Val
35 40 45
Lys Ala Asp Val Gln Val Pro Gly Asp Asp Thr Gln Val Gly Leu Ile
50 55 60
Val Arg Thr Asn Asp Trp Ser Gln Lys Asn Thr Ser Asp Asp Leu His
65 70 75 80
Ile Asp Leu Thr Lys Gly His Glu Ile Trp Ile Val Gln Gly Asp Pro
85 90 95
Asn Ile Tyr Tyr Asn Leu Ser Asp Ala Gln Ala Ala Ala Thr Pro Lys
100 105 110
Val Ser Asn Ala Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Thr Val Leu Ala Lys Leu
115 120 125
Thr Asn Pro Met Thr Leu Ser Asp Gly Ser Ser Gly Phe Thr Val Thr
130 135 140
Asp Lys Thr Thr Gly Glu Gln Ile Pro Val Thr Ala Ala Thr Asn Ala
145 150 155 160
Asn Ser Ala Ser Ser Ser Glu Gln Thr Asp Leu Val Gln Leu Thr Leu
165 170 175
Ala Ser Ala Pro Asp Val Ser His Thr Ile Gln Val Gly Ala Ala Gly
180 185 190
Tyr Glu Ala Val Asn Leu Ile Pro Arg Asn Val Leu Asp Ser Ser Gln
195 200 205
Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asp Asp Leu Gly Asn Thr Tyr Thr His Lys Ala
210 215 220
Thr Thr Phe Lys Val Trp Ala Pro Thr Ser Thr Gln Val Asn Val Leu
225 230 235 240
Leu Tyr Asn Ser Ala Thr Gly Ser Val Thr Lys Thr Val Pro Met Thr
245 250 255
Ala Ser Gly His Gly Val Trp Glu Ala Thr Val Asn Gln Asn Leu Glu
260 265 270
Asn Trp Tyr Tyr Met Tyr Glu Val Thr Gly Gln Gly Ser Thr Arg Thr
275 280 285
Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Ile Ala Pro Asn Gly Thr Arg Gly
290 295 300
Met Ile Val Asp Leu Ala Lys Thr Asp Pro Ala Gly Trp Asn Ser Asp
305 310 315 320
Lys His Ile Thr Pro Lys Asn Ile Glu Asp Glu Val Ile Tyr Glu Met
325 330 335
Asp Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp Pro Asn Ser Gly Met Lys Asn Lys
340 345 350
Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu Lys Gly Thr Lys Gly Pro Asp Gly
355 360 365
Val Lys Thr Gly Ile Asp Ser Leu Lys Gln Leu Gly Ile Thr His Val
370 375 380
Gln Leu Met Pro Val Phe Ala Phe Ala Ser Val Asp Glu Thr Asp Pro
385 390 395 400
Thr Gln Asp Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr Asp Val Pro Glu
405 410 415
Gly Gln Tyr Ala Thr Asn Ala Asn Gly Thr Ala Arg Ile Lys Glu Phe
420 425 430
Lys Glu Met Val Leu Ser Leu His Arg Glu His Ile Gly Val Asn Met
435 440 445
Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Ala Thr Gln Ile Ser Asp Phe Asp
450 455 460
Lys Ile Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp Asp Ala Gly Asn Tyr
465 470 475 480
Thr Asn Gly Ser Gly Thr Gly Asn Glu Ile Ala Ser Glu Arg Pro Met
485 490 495
Val Gln Lys Phe Ile Ile Asp Ser Leu Lys Tyr Trp Val Asn Glu Tyr
500 505 510
His Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu Leu Gly Lys Asp
515 520 525
Thr Met Ser Lys Ala Ala Ser Glu Leu His Ala Ile Asn Pro Gly Ile
530 535 540
Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser Ala Leu Pro Glu
545 550 555 560
Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gln Lys Gly Met Gly Val Ala Val
565 570 575
Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu Asp Gly Asn Val Phe Asp Ser
580 585 590
Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu Thr Asp Ala Ile
595 600 605
Lys Asn Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe Thr Ser Ser Pro Gly
610 615 620
Glu Thr Ile Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Asn Tyr Thr Leu Trp Asp
625 630 635 640
Lys Ile Ala Leu Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu Ala Asp Arg Ile Lys
645 650 655
Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val Val Met Thr Ser Gln Gly Val Pro
660 665 670
Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr Lys Gly Gly Asn Asp
675 680 685
Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Thr Val Asn Glu Phe Asp Trp Ser Arg
690 695 700
Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe Asn Tyr Tyr Ser Gly Leu Ile His
705 710 715 720
Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr Ala Asn Glu Ile
725 730 735
Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asn Ser Pro Glu Asn Thr Val Ala Tyr
740 745 750
Glu Leu Thr Asp His Val Asn Lys Asp Lys Trp Gly Asn Ile Ile Val
755 760 765
Val Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Ala Ala Thr Ile Asn Leu Pro Ser Gly
770 775 780
Lys Trp Ala Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys Val Gly Glu Ser Thr Leu
785 790 795 800
Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro Gly Ile Ser Met Met Ile
805 810 815
Leu His Gln Glu Val Ser Pro Asp His Gly Lys Lys
820 825
<210> 17
<211> 928
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> гибридная пуллуланаза
<400> 17
Ala Ser Ser Thr Glu Val Ile Val His Tyr His Arg Phe Asp Ala Asn
1 5 10 15
Tyr Ala Asn Trp Asp Leu Trp Met Trp Pro Tyr Gln Pro Val Asn Gly
20 25 30
Asn Gly Ala Ala Tyr Glu Phe Ser Gly Thr Asp Glu Phe Gly Val Thr
35 40 45
Ala Asp Val Gln Val Pro Gly Asp Asn Thr Gln Val Gly Leu Ile Val
50 55 60
Arg Lys Asn Asp Trp Ser Gln Lys Asn Thr Pro Asp Asp Leu His Ile
65 70 75 80
Asp Leu Ser Lys Gly His Glu Val Trp Ile Asn Gln Gly Asp Pro Thr
85 90 95
Ile Tyr Tyr Asn Leu Asn Asp Ala Glu Ala Ala Ala Val Pro Ala Val
100 105 110
Ser Asn Ala Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Thr Val Leu Ala Lys Leu Ser
115 120 125
Ser Pro Met Thr Leu Thr Asp Gly Ala Ser Gly Phe Thr Val Thr Asp
130 135 140
Glu Thr Thr Gly Glu Gln Ile Pro Val Val Ser Ala Glu Ser Ala Asn
145 150 155 160
Pro Val Thr Ala Val Leu Val Gly Asp Phe Gln Gln Ala Leu Gly Ala
165 170 175
Ser Gly Asn Trp Ser Pro Asp Asp Asp His Thr Lys Leu Ser Lys Ile
180 185 190
Asn Ser Asn Leu Tyr Gln Phe Thr Gly Thr Leu Pro Ala Gly Thr Tyr
195 200 205
Gln Tyr Lys Val Ala Leu Asp His Ser Trp Ser Ala Ser Tyr Pro Asn
210 215 220
Asn Asn Val Asn Leu Thr Val Pro Ala Gly Gly Thr Lys Val Thr Phe
225 230 235 240
Thr Tyr Ile Pro Ser Thr His Gln Val Phe Asp Ser Ile Asn Asn Pro
245 250 255
Asp Gln Thr Phe Pro Ser Ser Ser Ala Gly Thr Gln Ser Asp Leu Val
260 265 270
Gln Leu Thr Leu Ala Ser Ala Pro Asp Ile Thr His Asp Leu Gln Val
275 280 285
Val Ala Asp Gly Tyr Lys Gly Gly Lys Ile Leu Pro Arg Asn Val Leu
290 295 300
Asn Leu Pro Arg Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asn Asp Leu Gly Asn Val Tyr
305 310 315 320
Ser Asn Lys Ala Thr Ala Phe Arg Val Trp Ala Pro Thr Ala Ser Asp
325 330 335
Val Gln Leu Leu Leu Tyr Asn Ser Glu Thr Gly Pro Val Thr Lys Gln
340 345 350
Leu Glu Met Gln Lys Ser Asp Asn Gly Thr Trp Lys Leu Lys Val Pro
355 360 365
Gly Asn Leu Lys Asn Trp Tyr Tyr Leu Tyr Gln Val Thr Val Asn Gly
370 375 380
Lys Thr Gln Thr Ala Val Asp Pro Tyr Val Arg Ala Ile Ser Val Asn
385 390 395 400
Ala Thr Arg Gly Met Ile Val Asp Leu Glu Asp Thr Asn Pro Pro Gly
405 410 415
Trp Lys Glu Asp His Gln Gln Thr Pro Ala Asn Pro Val Asp Glu Val
420 425 430
Ile Tyr Glu Val His Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp Ala Asn Ser Gly
435 440 445
Met Lys Asn Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Phe Thr Glu His Gly Thr Lys
450 455 460
Gly Pro Asp Gly Val Lys Thr Gly Ile Asp Ser Leu Lys Glu Leu Gly
465 470 475 480
Ile Asn Ala Val Gln Leu Gln Pro Ile Glu Glu Phe Ala Ser Ile Asp
485 490 495
Glu Thr Gln Pro Asn Met Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr
500 505 510
Asn Val Pro Glu Gly Ala Tyr Ala Thr Thr Pro Glu Gly Thr Ala Arg
515 520 525
Ile Thr Glu Phe Lys Gln Leu Ile Gln Ser Ile His Lys Asp Arg Ile
530 535 540
Ala Ile Asn Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Ser Thr Leu Ile
545 550 555 560
Ser Asp Phe Asp Lys Ile Val Pro Gln Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp Asp
565 570 575
Ala Gly Asn Tyr Thr Asn Gly Ser Gly Val Gly Asn Glu Phe Ala Thr
580 585 590
Glu His Pro Met Ala Arg Lys Phe Val Leu Asp Ser Leu Lys Tyr Trp
595 600 605
Val Thr Gln Tyr His Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu
610 615 620
Leu Gly Lys Asn Thr Met Ala Glu Ala Ser Lys Glu Leu His Ala Ile
625 630 635 640
Asn Pro Gly Ile Val Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser
645 650 655
Gly Ile Thr Gly Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Val Gln Lys Gly Leu
660 665 670
Gly Ile Gly Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu Asp Gly Asn
675 680 685
Val Phe Asp Ser Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu
690 695 700
Thr Asp Ala Ile Lys Arg Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe Thr
705 710 715 720
Ser Ser Pro Ser Glu Thr Ile Asn Tyr Val Ser Cys His Asp Asn Tyr
725 730 735
Thr Leu Trp Asp Lys Ile Ala Leu Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu Ala
740 745 750
Asp Arg Ile Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val Val Met Thr Ser
755 760 765
Gln Gly Val Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr Lys
770 775 780
Gly Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Thr Val Asn Glu Phe
785 790 795 800
Asp Trp Ser Arg Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe Asn Tyr Tyr Ser
805 810 815
Gly Leu Ile His Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr
820 825 830
Ala Asn Glu Ile Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asn Ser Pro Glu Asn
835 840 845
Thr Val Ala Tyr Glu Leu Thr Asp His Val Asn Lys Asp Lys Trp Gly
850 855 860
Asn Ile Ile Val Val Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Ala Ala Thr Ile Asn
865 870 875 880
Leu Pro Ser Gly Lys Trp Ala Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys Val Gly
885 890 895
Glu Ser Thr Leu Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro Gly Ile
900 905 910
Ser Met Met Ile Leu His Gln Glu Val Ser Pro Asp His Gly Lys Lys
915 920 925
<210> 18
<211> 928
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> гибридная пуллуланаза
<400> 18
Ala Ser Ser Thr Glu Val Ile Val His Tyr His Arg Phe Asp Ala Asn
1 5 10 15
Tyr Ala Asn Trp Asp Leu Trp Met Trp Pro Tyr Gln Pro Val Asn Gly
20 25 30
Asn Gly Ala Ala Tyr Glu Phe Ser Gly Thr Asp Glu Phe Gly Val Thr
35 40 45
Ala Asp Val Gln Val Pro Gly Asp Asn Thr Gln Val Gly Leu Ile Val
50 55 60
Arg Lys Asn Asp Trp Ser Gln Lys Asn Thr Pro Asp Asp Leu His Ile
65 70 75 80
Asp Leu Ser Lys Gly His Glu Val Trp Ile Asn Gln Gly Asp Pro Thr
85 90 95
Ile Tyr Tyr Asn Leu Asn Asp Ala Glu Ala Ala Ala Val Pro Ala Val
100 105 110
Ser Asn Ala Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Thr Val Leu Ala Lys Leu Ser
115 120 125
Ser Pro Met Thr Leu Thr Asp Gly Ala Ser Gly Phe Thr Val Thr Asp
130 135 140
Glu Thr Thr Gly Glu Gln Ile Pro Val Val Ser Ala Glu Ser Ala Asn
145 150 155 160
Pro Val Thr Ala Val Leu Val Gly Asp Phe Gln Gln Ala Leu Gly Ala
165 170 175
Ser Gly Asn Trp Ser Pro Asp Asp Asp His Thr Lys Leu Ser Lys Ile
180 185 190
Asn Ser Asn Leu Tyr Gln Phe Thr Gly Thr Leu Pro Ala Gly Thr Tyr
195 200 205
Gln Tyr Lys Val Ala Leu Asp His Ser Trp Ser Ala Ser Tyr Pro Asn
210 215 220
Asn Asn Val Asn Leu Thr Val Pro Ala Gly Gly Thr Lys Val Thr Phe
225 230 235 240
Thr Tyr Ile Pro Ser Thr His Gln Val Phe Asp Ser Ile Asn Asn Pro
245 250 255
Asp Gln Thr Phe Pro Ser Ser Ser Ala Gly Thr Gln Ser Asp Leu Val
260 265 270
Gln Leu Thr Leu Ala Ser Ala Pro Asp Ile Thr His Asp Leu Gln Val
275 280 285
Val Ala Asp Gly Tyr Lys Gly Gly Lys Ile Leu Pro Arg Asn Val Leu
290 295 300
Asn Leu Pro Arg Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asn Asp Leu Gly Asn Val Tyr
305 310 315 320
Ser Asn Lys Ala Thr Ala Phe Arg Val Trp Ala Pro Thr Ala Ser Asp
325 330 335
Val Gln Leu Leu Leu Tyr Asn Ser Glu Thr Gly Pro Val Thr Lys Gln
340 345 350
Leu Glu Met Gln Lys Ser Asp Asn Gly Thr Trp Lys Leu Lys Val Pro
355 360 365
Gly Asn Leu Lys Asn Trp Tyr Tyr Leu Tyr Gln Val Thr Val Asn Gly
370 375 380
Lys Thr Gln Thr Ala Val Asp Pro Tyr Val Arg Ala Ile Ser Val Asn
385 390 395 400
Ala Thr Arg Gly Met Ile Val Asp Leu Glu Asp Thr Asn Pro Pro Gly
405 410 415
Trp Lys Glu Asp His Gln Gln Thr Pro Ala Asn Pro Val Asp Glu Val
420 425 430
Ile Tyr Glu Val His Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp Ala Asn Ser Gly
435 440 445
Met Lys Asn Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Phe Thr Glu His Gly Thr Lys
450 455 460
Gly Pro Asp Gly Val Lys Thr Gly Ile Asp Ser Leu Lys Glu Leu Gly
465 470 475 480
Ile Asn Ala Val Gln Leu Gln Pro Ile Glu Glu Phe Ala Ser Ile Asp
485 490 495
Glu Thr Gln Pro Asn Met Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr
500 505 510
Asn Val Pro Glu Gly Ala Tyr Ala Thr Thr Pro Glu Gly Thr Ala Arg
515 520 525
Ile Thr Glu Phe Lys Gln Leu Ile Gln Ser Ile His Lys Asp Arg Ile
530 535 540
Ala Ile Asn Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Ala Thr Gln Ile
545 550 555 560
Ser Asp Phe Asp Lys Ile Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp Asp
565 570 575
Ala Gly Asn Tyr Thr Asn Gly Ser Gly Thr Gly Asn Glu Ile Ala Ala
580 585 590
Glu Arg Pro Met Val Gln Lys Phe Ile Ile Asp Ser Leu Lys Tyr Trp
595 600 605
Val Asn Glu Tyr His Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu
610 615 620
Leu Gly Lys Asp Thr Met Ser Lys Ala Ala Ser Glu Leu His Ala Ile
625 630 635 640
Asn Pro Gly Ile Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser
645 650 655
Ala Leu Pro Glu Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gln Lys Gly Met
660 665 670
Gly Val Ala Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu Asp Gly Asn
675 680 685
Val Phe Asp Ser Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu
690 695 700
Thr Asp Ala Ile Lys Arg Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe Thr
705 710 715 720
Ser Ser Pro Ser Glu Thr Ile Asn Tyr Val Ser Cys His Asp Asn Tyr
725 730 735
Thr Leu Trp Asp Lys Ile Ala Leu Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu Ala
740 745 750
Asp Arg Ile Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val Val Met Thr Ser
755 760 765
Gln Gly Val Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr Lys
770 775 780
Gly Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Thr Val Asn Glu Phe
785 790 795 800
Asp Trp Ser Arg Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe Asn Tyr Tyr Ser
805 810 815
Gly Leu Ile His Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr
820 825 830
Ala Asn Glu Ile Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asn Ser Pro Glu Asn
835 840 845
Thr Val Ala Tyr Glu Leu Thr Asp His Val Asn Lys Asp Lys Trp Gly
850 855 860
Asn Ile Ile Val Val Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Ala Ala Thr Ile Asn
865 870 875 880
Leu Pro Ser Gly Lys Trp Ala Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys Val Gly
885 890 895
Glu Ser Thr Leu Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro Gly Ile
900 905 910
Ser Met Met Ile Leu His Gln Glu Val Ser Pro Asp His Gly Lys Lys
915 920 925
<210> 19
<211> 471
<212> Белок
<213> Rhizomucor pusillus
<400> 19
Met Lys Phe Ser Ile Ser Leu Ser Ala Ala Ile Val Leu Phe Ala Ala
1 5 10 15
Ala Thr Ser Leu Ala Ser Pro Leu Pro Gln Gln Gln Arg Tyr Gly Lys
20 25 30
Arg Ala Thr Ser Asp Asp Trp Lys Ser Lys Ala Ile Tyr Gln Leu Leu
35 40 45
Thr Asp Arg Phe Gly Arg Ala Asp Asp Ser Thr Ser Asn Cys Ser Asn
50 55 60
Leu Ser Asn Tyr Cys Gly Gly Thr Tyr Glu Gly Ile Thr Lys His Leu
65 70 75 80
Asp Tyr Ile Ser Gly Met Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile
85 90 95
Pro Lys Asn Ser Asp Gly Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ala Thr Asp Phe
100 105 110
Tyr Gln Leu Asn Ser Asn Phe Gly Asp Glu Ser Gln Leu Lys Ala Leu
115 120 125
Ile Gln Ala Ala His Glu Arg Asp Met Tyr Val Met Leu Asp Val Val
130 135 140
Ala Asn His Ala Gly Pro Thr Ser Asn Gly Tyr Ser Gly Tyr Thr Phe
145 150 155 160
Gly Asp Ala Ser Leu Tyr His Pro Lys Cys Thr Ile Asp Tyr Asn Asp
165 170 175
Gln Thr Ser Ile Glu Gln Cys Trp Val Ala Asp Glu Leu Pro Asp Ile
180 185 190
Asp Thr Glu Asn Ser Asp Asn Val Ala Ile Leu Asn Asp Ile Val Ser
195 200 205
Gly Trp Val Gly Asn Tyr Ser Phe Asp Gly Ile Arg Ile Asp Thr Val
210 215 220
Lys His Ile Arg Lys Asp Phe Trp Thr Gly Tyr Ala Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Val Phe Ala Thr Gly Glu Val Phe Asn Gly Asp Pro Ala Tyr Val Gly
245 250 255
Pro Tyr Gln Lys Tyr Leu Pro Ser Leu Ile Asn Tyr Pro Met Tyr Tyr
260 265 270
Ala Leu Asn Asp Val Phe Val Ser Lys Ser Lys Gly Phe Ser Arg Ile
275 280 285
Ser Glu Met Leu Gly Ser Asn Arg Asn Ala Phe Glu Asp Thr Ser Val
290 295 300
Leu Thr Thr Phe Val Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Leu Asn Ser
305 310 315 320
Gln Ser Asp Lys Ala Leu Phe Lys Asn Ala Leu Thr Tyr Val Leu Leu
325 330 335
Gly Glu Gly Ile Pro Ile Val Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Gly Phe Ser
340 345 350
Gly Gly Ala Asp Pro Ala Asn Arg Glu Val Leu Trp Thr Thr Asn Tyr
355 360 365
Asp Thr Ser Ser Asp Leu Tyr Gln Phe Ile Lys Thr Val Asn Ser Val
370 375 380
Arg Met Lys Ser Asn Lys Ala Val Tyr Met Asp Ile Tyr Val Gly Asp
385 390 395 400
Asn Ala Tyr Ala Phe Lys His Gly Asp Ala Leu Val Val Leu Asn Asn
405 410 415
Tyr Gly Ser Gly Ser Thr Asn Gln Val Ser Phe Ser Val Ser Gly Lys
420 425 430
Phe Asp Ser Gly Ala Ser Leu Met Asp Ile Val Ser Asn Ile Thr Thr
435 440 445
Thr Val Ser Ser Asp Gly Thr Val Thr Phe Asn Leu Lys Asp Gly Leu
450 455 460
Pro Ala Ile Phe Thr Ser Ala
465 470
<210> 20
<211> 514
<212> Белок
<213> B. stearothermophilus
<400> 20
Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu
1 5 10 15
Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn
20 25 30
Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys
35 40 45
Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp
50 55 60
Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Ala Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr
65 70 75 80
Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met
85 90 95
Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly
100 105 110
Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln
115 120 125
Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe
130 135 140
Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His
145 150 155 160
Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr
165 170 175
Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu
180 185 190
Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His
195 200 205
Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Ser Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn
210 215 220
Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys
225 230 235 240
Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Asp Val Arg Ser Gln Thr Gly
245 250 255
Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys
260 265 270
Leu His Asn Tyr Ile Met Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp
275 280 285
Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Thr
290 295 300
Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro
305 310 315 320
Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln
325 330 335
Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala
340 345 350
Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp
355 360 365
Tyr Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile
370 375 380
Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val
405 410 415
Thr Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val
435 440 445
Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser
450 455 460
Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp
465 470 475 480
Val Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Trp Ser Ile Thr Thr
485 490 495
Arg Pro Trp Thr Asp Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val
500 505 510
Ala Trp
<210> 21
<211> 483
<212> Белок
<213> Bacillus licheniformis
<400> 21
Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro
1 5 10 15
Asn Asp Gly Gln His Trp Arg Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu
20 25 30
Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly
35 40 45
Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu
50 55 60
Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys
65 70 75 80
Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn
85 90 95
Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr
100 105 110
Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val
115 120 125
Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro
130 135 140
Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe
145 150 155 160
Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys
165 170 175
Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn
180 185 190
Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val
195 200 205
Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln
210 215 220
Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe
225 230 235 240
Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met
245 250 255
Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn
260 265 270
Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu
275 280 285
His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met
290 295 300
Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser
305 310 315 320
Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu
325 330 335
Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu
340 345 350
Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly
355 360 365
Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile
370 375 380
Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp
405 410 415
Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr
435 440 445
Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser
450 455 460
Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr
465 470 475 480
Val Gln Arg
<210> 22
<211> 483
<212> Белок
<213> Bacillus amyloliquefaciens
<400> 22
Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp
1 5 10 15
Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp
20 25 30
Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Leu Ser
35 40 45
Gln Ser Asp Asn Gly Tyr Gly Pro Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu
50 55 60
Phe Gln Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Ser Glu
65 70 75 80
Leu Gln Asp Ala Ile Gly Ser Leu His Ser Arg Asn Val Gln Val Tyr
85 90 95
Gly Asp Val Val Leu Asn His Lys Ala Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp
100 105 110
Val Thr Ala Val Glu Val Asn Pro Ala Asn Arg Asn Gln Glu Thr Ser
115 120 125
Glu Glu Tyr Gln Ile Lys Ala Trp Thr Asp Phe Arg Phe Pro Gly Arg
130 135 140
Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp Gly
145 150 155 160
Ala Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Ile Ser Arg Ile Phe Lys Phe Arg
165 170 175
Gly Glu Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu Asn Gly Asn
180 185 190
Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Tyr Asp His Pro Asp Val
195 200 205
Val Ala Glu Thr Lys Lys Trp Gly Ile Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Ser
210 215 220
Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Ala Lys His Ile Lys Phe Ser Phe
225 230 235 240
Leu Arg Asp Trp Val Gln Ala Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Glu Met
245 250 255
Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asn Ala Gly Lys Leu Glu Asn
260 265 270
Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Phe Asn Gln Ser Val Phe Asp Val Pro Leu
275 280 285
His Phe Asn Leu Gln Ala Ala Ser Ser Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met
290 295 300
Arg Arg Leu Leu Asp Gly Thr Val Val Ser Arg His Pro Glu Lys Ala
305 310 315 320
Val Thr Phe Val Glu Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu
325 330 335
Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu
340 345 350
Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly
355 360 365
Thr Lys Gly Thr Ser Pro Lys Glu Ile Pro Ser Leu Lys Asp Asn Ile
370 375 380
Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Glu Tyr Ala Tyr Gly Pro Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Ile Asp His Pro Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp
405 410 415
Ser Ser Ala Ala Lys Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Ala Gly Leu Lys Asn Ala Gly Glu Thr
435 440 445
Trp Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Lys Ile Gly Ser
450 455 460
Asp Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Asp Gly Ser Val Ser Ile Tyr
465 470 475 480
Val Gln Lys
<210> 23
<211> 483
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Конъюгат рекомбинантной альфа-амилазы
<400> 23
Ala Ala Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro
1 5 10 15
Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu
20 25 30
Ser Asp Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly
35 40 45
Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu
50 55 60
Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys
65 70 75 80
Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn
85 90 95
Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr
100 105 110
Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val
115 120 125
Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro
130 135 140
Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe
145 150 155 160
Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys
165 170 175
Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn
180 185 190
Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val
195 200 205
Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln
210 215 220
Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe
225 230 235 240
Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met
245 250 255
Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn
260 265 270
Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu
275 280 285
His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met
290 295 300
Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser
305 310 315 320
Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu
325 330 335
Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu
340 345 350
Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly
355 360 365
Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile
370 375 380
Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp
405 410 415
Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr
435 440 445
Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser
450 455 460
Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr
465 470 475 480
Val Gln Arg
<210> 24
<211> 483
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гибридная альфа-амилаза из Bacillus
<400> 24
Ala Ala Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro
1 5 10 15
Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu
20 25 30
Ser Asp Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Ala
35 40 45
Ile Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu
50 55 60
Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys
65 70 75 80
Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn
85 90 95
Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Ala Gly Ala Asp Ala Thr
100 105 110
Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val
115 120 125
Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro
130 135 140
Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Tyr Trp Tyr His Phe
145 150 155 160
Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys
165 170 175
Phe Gln Gly Lys Thr Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Phe Gly Asn
180 185 190
Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Phe Asp Tyr Asp His Pro Asp Val
195 200 205
Val Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln
210 215 220
Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe
225 230 235 240
Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met
245 250 255
Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Ser Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn
260 265 270
Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu
275 280 285
His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met
290 295 300
Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser
305 310 315 320
Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu
325 330 335
Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu
340 345 350
Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly
355 360 365
Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile
370 375 380
Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp
405 410 415
Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr
435 440 445
Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser
450 455 460
Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr
465 470 475 480
Val Gln Arg
<210> 25
<211> 483
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариант гибридной альфа-амилазы из Bacillus
<400> 25
Ala Ala Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro
1 5 10 15
Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu
20 25 30
Ser Asp Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Ala
35 40 45
Ile Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu
50 55 60
Gly Glu Phe Trp Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys
65 70 75 80
Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn
85 90 95
Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Ala Gly Ala Asp Ala Thr
100 105 110
Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val
115 120 125
Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro
130 135 140
Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Tyr Trp Tyr His Phe
145 150 155 160
Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Leu
165 170 175
Phe Gln Gly Lys Thr Trp Asp Trp Pro Val Ser Asn Glu Phe Gly Asn
180 185 190
Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Tyr Asp Tyr Asp Tyr Pro Asp Val
195 200 205
Val Ala Glu Ile Thr Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln
210 215 220
Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe
225 230 235 240
Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met
245 250 255
Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Ser Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn
260 265 270
Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu
275 280 285
His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met
290 295 300
Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser
305 310 315 320
Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu
325 330 335
Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu
340 345 350
Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly
355 360 365
Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile
370 375 380
Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val
405 410 415
Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ala Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr
435 440 445
Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser
450 455 460
Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr
465 470 475 480
Val Gln Arg

Claims (7)

1. Композиция для получения глюкозного сиропа из ожиженного крахмала, содержащая фермент альфа-амилазу, пуллуланазу и глюкоамилазу, где альфа-амилаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 90% тождественность последовательности SEQ ID NO: 5 или ее зрелого полипептида, где пуллуланаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 90% тождественность последовательности SEQ ID NO: 3 или ее зрелого полипептида, и где глюкоамилаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 90% тождественность последовательности SEQ ID NO: 4 или ее зрелого полипептида.
2. Композиция по п. 1, где альфа-амилаза выбрана из альфа-амилаз Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Aspergillus niger или Rhizomucor pusillus, глюкоамилаза выбрана из глюкоамилаз Aspergillus niger, Talaromyces emersonii, Trametes cingulata или Gloeophyllum trabeum и пуллуланаза выбрана из пуллуланаз Bacillus deramificans или Bacillus acidopullulyticus.
3. Композиция по любому из пп. 1 или 2, где композиция содержит глюкоамилазу, выбранную из глюкоамилаз, раскрытых под SEQ ID NO: 4, или глюкоамилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 4, составляющей по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, альфа-амилазу, выбранную из альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 5, или альфа-амилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 5, составляющей по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, и пуллуланазу, выбранную из пуллуланазы, раскрытой под SEQ ID NO: 3, или пуллуланазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3, составляющей по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%.
4. Способ получения глюкозного сиропа из ожиженного крахмала, включающий приведение ожиженного крахмала в контакт с композицией по любому из пп. 1-3.
5. Способ получения глюкозного сиропа из ожиженного крахмала, включающий приведение ожиженного крахмала в контакт с глюкоамилазой, пуллуланазой и альфа-амилазой, где альфа-амилаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 90% тождественность последовательности SEQ ID NO: 5 или ее зрелого полипептида, где пуллуланаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 90% тождественность последовательности SEQ ID NO: 3 или ее зрелого полипептида, и где глюкоамилаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 90% тождественность последовательности SEQ ID NO: 4 или ее зрелого полипептида.
6. Способ по п. 5, где первоначальное содержание сухих твердых веществ (DS) в ожиженном крахмальном субстрате составляет по меньшей мере 25%, в частности, по меньшей мере 30%, конкретнее, по меньшей мере 35%, еще конкретнее, по меньшей мере 40%.
7. Способ по любому из пп. 5, 6, где время осахаривания составляет по меньшей мере 24 ч, по меньшей мере 30 ч, по меньшей мере 36 ч, по меньшей мере 48 ч, по меньшей мере 54 ч, по меньшей мере 60 ч, по меньшей мере 72 ч.
RU2016135029A 2014-02-07 2015-02-06 Композиции для получения глюкозных сиропов RU2706297C2 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14154239.9 2014-02-07
EP14154239 2014-02-07
EP14195687 2014-12-01
EP14195687.0 2014-12-01
PCT/EP2015/052545 WO2015118123A1 (en) 2014-02-07 2015-02-06 Compositions for producing glucose syrups

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019134734A Division RU2019134734A (ru) 2014-02-07 2015-02-06 Композиции для получения глюкозных сиропов

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2016135029A RU2016135029A (ru) 2018-03-13
RU2016135029A3 RU2016135029A3 (ru) 2018-10-16
RU2706297C2 true RU2706297C2 (ru) 2019-11-15

Family

ID=52464388

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016135029A RU2706297C2 (ru) 2014-02-07 2015-02-06 Композиции для получения глюкозных сиропов
RU2019134734A RU2019134734A (ru) 2014-02-07 2015-02-06 Композиции для получения глюкозных сиропов

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019134734A RU2019134734A (ru) 2014-02-07 2015-02-06 Композиции для получения глюкозных сиропов

Country Status (10)

Country Link
US (3) US10337041B2 (ru)
EP (2) EP3712240B1 (ru)
JP (1) JP6591993B2 (ru)
CN (1) CN105960176A (ru)
BR (1) BR112016018075B1 (ru)
CA (1) CA2937818C (ru)
HU (1) HUE064397T2 (ru)
MX (1) MX2016010031A (ru)
RU (2) RU2706297C2 (ru)
WO (1) WO2015118123A1 (ru)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3091703B1 (fr) 2019-01-11 2021-02-12 Fermentalg Procédé d’extraction de phycocyanines
FR3091640B1 (fr) 2019-01-11 2021-06-11 Fermentalg Procédé de purification de phycocyanines
FR3092586A1 (fr) 2019-02-08 2020-08-14 Fermentalg Procédé optimisé d’exploitation industrielle d’algues rouges unicellulaires
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2394101C2 (ru) * 2004-11-30 2010-07-10 Джененкор Интернэшнл, Инк. Глюкоамилаза trichoderma reesei и ее гомологи

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5534046A (en) 1978-09-01 1980-03-10 Cpc International Inc Novel glucoamyrase having excellent heat resistance and production
US4335208A (en) 1980-03-11 1982-06-15 Novo Industri A/S Saccharification of starch hydrolysates
NO840200L (no) 1983-01-28 1984-07-30 Cefus Corp Glukoamylase cdna.
US4587215A (en) 1984-06-25 1986-05-06 Uop Inc. Highly thermostable amyloglucosidase
JPS62126989A (ja) 1985-11-26 1987-06-09 Godo Shiyusei Kk コルテイシウム属担子菌の生産する酵素を用いた澱粉質の無蒸煮糖化法
JP2703598B2 (ja) 1987-09-04 1998-01-26 ノボ―ノルディスク アクティーゼルスカブ アスペルギルス菌中でのタンパク質生産物の生産方法およびアスペルギルス菌中で使用するためのプロモーター
US5162210A (en) 1990-06-29 1992-11-10 Iowa State University Research Foundation Process for enzymatic hydrolysis of starch to glucose
ES2137222T3 (es) 1992-12-28 1999-12-16 Genencor Int Polulanasa, microorganismos que la producen, procedimientos para la preparacion de la misma y utilizaciones.
ES2329528T3 (es) 1995-02-03 2009-11-26 Novozymes A/S Metodo para diseñar mutantes alfa-amilasa con propiedades determinadas.
WO1997041213A1 (en) * 1996-04-30 1997-11-06 Novo Nordisk A/S α-AMYLASE MUTANTS
EP0970193A1 (en) * 1996-07-24 2000-01-12 Iowa State University Research Foundation, Inc. PROTEIN ENGINEERING OF GLUCOAMYLASE TO INCREASE pH OPTIMUM, SUBSTRATE SPECIFICITY AND THERMOSTABILITY
AR014402A1 (es) 1997-11-26 2001-02-28 Novozymes As Glucoamilasa termoestable proceso para convertir almidon o almidon parcialmente hidrolizado en un jarabe que contiene dextrosa
WO2000004136A1 (en) 1998-07-15 2000-01-27 Novozymes A/S Glucoamylase variants
EP1200566A2 (en) 1999-07-09 2002-05-02 Novozymes A/S Glucoamylase variant
AU2002213841A1 (en) 2000-11-10 2002-05-21 Novozymes A/S Secondary liquefaction of starch in ethanol production
WO2005096804A2 (en) * 2004-03-08 2005-10-20 Syngenta Participations Ag Self-processing plants and plant parts
EP1576152B1 (en) 2002-12-17 2006-12-06 Novozymes A/S Thermostable alpha-amylases
US7618795B2 (en) * 2003-06-25 2009-11-17 Novozymes A/S Starch process
ATE510925T1 (de) * 2003-06-25 2011-06-15 Novozymes As Stärkehydrolyseverfahren
MXPA06000212A (es) 2003-06-25 2006-03-21 Novozymes As Enzimas para procesar almidon.
RU2006144096A (ru) * 2004-05-13 2008-06-20 Новозаймз Норт Америка, Инк. Способ производства ферментационного продукта
ES2621921T3 (es) 2004-12-22 2017-07-05 Novozymes A/S Enzimas para tratamiento de almidón
WO2007144393A1 (en) * 2006-06-15 2007-12-21 Novozymes, Inc. Mashing process
CA2665595A1 (en) 2006-10-10 2008-04-17 Danisco Us, Inc., Genencor Division Glucoamylase variants with altered properties
CN101049133B (zh) * 2007-04-26 2011-07-06 华南理工大学 小麦b淀粉多酶法制取发酵用含氮糖浆的方法
EP2481796B1 (en) 2007-10-09 2014-06-11 Danisco US Inc. Glucoamylase variants
BRPI0819869B1 (pt) * 2007-12-12 2019-07-16 Novozymes A/S Processo enzimático para a produção de um mosto de cervejeiro a partir de cereal não maltado, e, uso de um processo para produção de cerveja
CN101918525A (zh) 2007-12-12 2010-12-15 诺维信公司 糖化方法
CN102712915B (zh) 2009-08-19 2014-12-10 丹尼斯科美国公司 具有改良比活和/或热稳定性的葡糖淀粉酶的组合变体
BR112012003787A2 (pt) 2009-08-19 2017-07-04 Danisco variantes de glicoamilase
WO2011066576A1 (en) 2009-11-30 2011-06-03 Novozymes A/S Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
CN104169417B (zh) * 2009-12-01 2020-05-08 诺维信公司 具有葡糖淀粉酶活性的多肽及其编码多核苷酸
ES2565060T3 (es) * 2010-04-14 2016-03-31 Novozymes A/S Polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican los mismos
US9732332B2 (en) 2010-11-08 2017-08-15 Novozymes A/S Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
KR101188113B1 (ko) * 2010-12-23 2012-10-05 대상 주식회사 유동성이 향상된 쌀엿 제조방법
JP5928089B2 (ja) * 2011-04-04 2016-06-01 国立大学法人弘前大学 イソマルターゼ
IN2014CN02469A (ru) 2011-09-06 2015-06-19 Novozymes As
MX353581B (es) * 2011-10-11 2018-01-19 Novozymes North America Inc Procesos para producir productos de fermentacion.
FR2989892B1 (fr) * 2012-04-26 2014-05-16 Oreal Composition cosmetique comprenant un oligosaccharide phosphoryle et un polysaccharide
MX2015002099A (es) * 2012-08-22 2015-05-11 Dupont Nutrition Biosci Aps Variantes que tienen actividad glucoamilasa.
EP3372680B1 (en) * 2013-04-30 2020-11-11 Novozymes A/S Glucoamylase variants and polynucleotides encoding same
CA2918685C (en) * 2013-08-30 2024-01-02 Novozymes A/S Enzyme composition and uses thereof
HUE056192T2 (hu) * 2014-01-22 2022-01-28 Novozymes As Pullulanázvariánsok és azokat kódoló polinukleotidok
US10584324B2 (en) * 2014-10-23 2020-03-10 Novozymes A/S Glucoamylase variants and polynucleotides encoding same
EP3227452A1 (en) * 2014-12-01 2017-10-11 Novozymes A/S Improved production of glucose syrups

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2394101C2 (ru) * 2004-11-30 2010-07-10 Джененкор Интернэшнл, Инк. Глюкоамилаза trichoderma reesei и ее гомологи

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI Reference Sequence XP_001390530, 03.03.2011, найдено в интернет по адресу https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/XP_001390530. NCBI Reference Sequence *
NCBI Reference Sequence XP_001390530, 03.03.2011, найдено в интернет по адресу https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/XP_001390530. NCBI Reference Sequence AEV53626, 12.11.2013, найдено в интернет по адресу https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AEV53626. NCBI Reference Sequence ADX42122.1, 16.02.2011, найдено в интернет по *
найдено в интернет по адресу https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ADX42122.1. *
найдено в интернет по адресу https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AEV53626. NCBI Reference Sequence *

Also Published As

Publication number Publication date
US20170159090A1 (en) 2017-06-08
RU2019134734A (ru) 2019-11-18
US10337041B2 (en) 2019-07-02
CA2937818A1 (en) 2015-08-13
WO2015118123A1 (en) 2015-08-13
EP3102051B1 (en) 2020-04-08
CA2937818C (en) 2023-08-01
RU2016135029A3 (ru) 2018-10-16
BR112016018075A2 (pt) 2018-02-20
US11667938B2 (en) 2023-06-06
HUE064397T2 (hu) 2024-03-28
MX2016010031A (es) 2016-11-15
BR112016018075B1 (pt) 2022-01-18
RU2016135029A (ru) 2018-03-13
EP3712240A1 (en) 2020-09-23
US11136607B2 (en) 2021-10-05
JP2017505129A (ja) 2017-02-16
CN105960176A (zh) 2016-09-21
US20210395791A1 (en) 2021-12-23
JP6591993B2 (ja) 2019-10-16
EP3712240B1 (en) 2023-09-27
EP3102051A1 (en) 2016-12-14
US20190256878A1 (en) 2019-08-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8883456B2 (en) Processes of producing a fermentation product
US11667938B2 (en) Compositions for producing glucose syrups
US20110097779A1 (en) Processes for Producing Fermentation Products
US20090142818A1 (en) Process of producing a fermentation product
US20200172946A1 (en) Production of Glucose Syrups
JP2007508802A (ja) 澱粉の加水分解法
ES2594438T3 (es) Procesos para producir productos de fermentación
US20080121227A1 (en) Liquefaction and Saccharification Process
EP2673368B1 (en) Process for liquefying starch in the presence of pyridoxamine
US20160122442A1 (en) Process for Hydrolysis of Starch
CA2908733C (en) Process for preparation of sugars and syrups
WO2011100161A1 (en) Addition of alpha - glucosidase and cobalt for producing fermentation products from starch
ES2366952T3 (es) Proceso de hidrólisis del almidón.