ES2490616T3

ES2490616T3 - Glucoamilasas híbridas

Info

Publication number: ES2490616T3
Application number: ES10152450.2T
Authority: ES
Inventors: Torben Borchert; Steffen Danielsen; Eric Allain
Original assignee: Novozymes AS; Novozymes North America Inc
Current assignee: Novozymes AS; Novozymes North America Inc
Priority date: 2003-10-28
Filing date: 2004-10-27
Publication date: 2014-09-04
Anticipated expiration: 2024-10-27
Also published as: US7749744B2; MXPA06004463A; US20050158839A1; CN1875097A; CN103215239A; CN1875097B; CN103215239B; US7129069B2; EP1687419A4; EP2213732A1; US20060257984A1; WO2005045018A1; PL1687419T3; JP2007509630A; DK2213732T3; EP1687419B1; ES2340390T3; ATE457034T1; US20080241901A1; DE602004025419D1

Abstract

Enzima híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico de origen fúngico que tiene actividad glucoamilasa y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos, donde: - la secuencia de aminoácidos del módulo catalítico tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias mostradas en SEC ID nº: 24, 25 o 26; - la secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias mostradas en SEC ID nº: 2 o 18; o difiere de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC 10 ID nº: 20 en no más de posiciones de aminoácidos.

Description

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DESCRIPCIÓN

Glucoamilasas híbridas

REFERENCIA A UN LISTADO DE SECUENCIAS

5 [0001] Esta aplicación contiene un Listado de Secuencias en forma legible para el ordenador.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

10 Campo de la invención

[0002] La presente invención se refiere, entre otras cosas, a un híbrido entre al menos un módulo de unión a carbohidratos ("CBM") y al menos el módulo catalítico (CM) de una glucoamilasa; una secuencia de ADN que codifica una enzima híbrida de la invención; un constructor de ADN que comprende una secuencia de ADN de la

15 invención; un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN de la invención; una célula huésped transformada con un vector de la invención; y el uso de una enzima híbrida de la invención.

Descripción de la técnica relacionada

20 [0003] Se ha descrito un gran número de procesos para convertir almidón en hidrolizados de almidón, tales como maltosa, glucosa o jarabes especializados, ya sea para usarse como edulcorantes o como precursores para otros sacáridos tales como fructosa. La glucosa también puede fermentarse a etanol u otros productos de fermentación.

[0004] El almidón es un polímero de alto peso molecular que consiste en cadenas de unidades de glucosa.

25 Normalmente consiste en aproximadamente un 80 % de amilopectina y un 20 % de amilosa. La amilopectina es un polisacárido ramificado en el cual las cadenas lineales de residuos de alfa-1,4-D-glucosa se unen por enlaces alfa1,6-glucosídicos.

[0005] La amilosa es un polisacárido lineal formado por unidades D-glucopiranosa enlazadas juntas por enlaces alfa

30 1,4-glucosídicos. En el caso de convertir almidón en un hidrolizado de almidón soluble, el almidón se despolimeriza. El proceso de despolimerización convencional consiste en una etapa de gelatinización y dos etapas de proceso consecutivas, llámense un proceso de licuefacción y un proceso de sacarificación.

[0006] El almidón granulado consiste en gránulos microscópicos, los cuales son insolubles en agua a temperatura

35 ambiente. Cuando una suspensión de almidón acuosa se calienta, los gránulos se hinchan y eventualmente estallan, dispersando las moléculas de almidón en la solución. Durante este proceso de "gelatinización" se da un dramático incremento en la viscosidad. Ya que el nivel de sólidos es del 30-40 % en un proceso industrial típico, el almidón tiene que adelgazarse o "licuarse" para que se pueda manejar. Esta reducción en la viscosidad se obtiene actualmente en gran parte por la degradación enzimática. Durante la etapa de licuefacción, el almidón de cadena

40 larga se degrada en unidades ramificadas y lineales más pequeñas (maltrodextrinas) por una alfa-amilasa. El proceso de licuefacción se lleva a cabo típicamente a aproximadamente 105-110° C durante aproximadamente 5 a 10 minutos seguido por aproximadamente 1-2 horas a una temperatura de aproximadamente 95° C. La temperatura se baja después a 60° C, se agregan una glucoamilasa o una beta-amilasa y opcionalmente una enzima de desramificación, tal como una isoamilasa o una pululanasa, y el proceso de sacarificación procede durante

45 aproximadamente 24 a 72 horas.

[0007] Los procesos de conversión de almidón convencionales consumen mucha energía debido a los diferentes requerimientos en términos de temperatura durante las diferentes etapas. Es entonces deseable poder seleccionar y/o diseñar enzimas usadas en el proceso de tal forma que el proceso total pueda llevarse a cabo sin tener que

50 gelatinizar el almidón.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0008] La invención proporciona en un primer aspecto una enzima híbrida que comprende una secuencia de

55 aminoácidos de un módulo catalítico de origen fúngico que tiene actividad glucoamilasa y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos, donde:

-la secuencia de aminoácidos del módulo catalítico tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias mostradas en SEC ID nº: 24, 25 o 26;

60 -la secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias mostradas en SEC ID nº: 2 o 18; o difiere de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº: 20 en no más de 10 posiciones de aminoácidos.

El módulo catalítico puede ser preferentemente de origen fúngico, bacteriano o vegetal. 65

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[0009] En otros aspectos la invención proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la enzima híbrida del primer aspecto, un constructo de ADN que comprende la secuencia de ADN que codifica la enzima híbrida del primer aspecto, un vector de expresión que comprende la secuencia de ADN que codifica la enzima híbrida del primer aspecto, y una célula huésped transformada con un vector; dicha célula huésped siendo capaz de expresar la secuencia de ADN que codifica la enzima híbrida del primer aspecto.

[0010] En un aspecto final la invención se refiere al uso de una enzima híbrida de la invención para producir productos de fermentación, tales como etanol o jarabe.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0011] La figura 1 compara el rendimiento de etanol por gramo de DS de dos híbridos glucomilasa-SBM (Módulo de Unión a Almidón) (TEAN-1 y TEAN-3) que comprenden el dominio catalítico de T. emersonii y el SBM de A. niger con la glucoamilasa de Talaromyces emersonii de tipo silvestre.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0012] El término "almidón granulado" se entiende como almidón crudo no cocido, es decir, almidón que no se ha sometido a una gelatinización. El almidón se forma en plantas como pequeños gránulos insolubles en agua. Estos gránulos se conservan en almidones a temperaturas inferiores a la temperatura de gelatinización inicial. Cuando se ponen en agua fría, los gránulos pueden absorber una pequeña cantidad de líquido. Hasta 50º C a 70º C el hinchamiento es reversible, dependiendo el grado de reversibilidad del almidón particular. Con temperaturas más altas comienza un hinchamiento irreversible llamado gelatinización.

[0013] El término "temperatura de gelatinización inicial" se entiende como la temperatura mínima a la que comienza la gelatinización del almidón. El almidón calentado en agua se empieza a gelatinizar entre 50º C y 75º C; la temperatura exacta de gelatinización depende del almidón específico y se puede determinar fácilmente por el experto en la materia. Así, la temperatura de gelatinización inicial puede variar según la especie vegetal, la variedad particular de la especie vegetal así como con las condiciones de crecimiento. En el contexto de esta invención la temperatura de gelatinización inicial de un almidón dado es la temperatura a la cual la birrefringencia se pierde en un 5 % de los gránulos de almidón usando el método descrito por Gorinstein. S. y Lii. C., Starch/Stärke, Vol. 44 (12) págs. 461-466 (1992).

[0014] El término "hidrolizado de almidón soluble" se entiende como los productos solubles del proceso de la invención y pueden comprender mono-, di-, y oligosacáridos, tales como glucosa, maltosa, maltodextrinas, ciclodextrinas y cualquier mezcla de éstas. Preferiblemente al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o al menos el 99 % de los sólidos secos del almidón granulado se convierten en un hidrolizado de almidón soluble.

[0015] El término "homología" de polipéptidos se entiende como el grado de identidad entre dos secuencias que indican una derivación de la primera secuencia a partir de la segunda. La homología puede determinarse adecuadamente mediante programas informáticos conocidos en la técnica tales como GAP proporcionado en el paquete de programas GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versión 8, 10 de agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EEUU 53711) (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453. Se usan los ajustes siguientes para comparar las secuencias de aminoácidos: penalización de creación GAP de 3.0 y penalización de extensión GAP de 0.1.

Enzimas híbridas

[0016] Los números de clasificación de enzimas (números EC) referidos en la presente descripción con las reivindicaciones están de acuerdo con las Recomendaciones (1992) del Comité de Nomenclatura de la International Union of Biochemistry and Molecular Biology, Academic Press lnc., 1992.

[0017] Las enzimas híbridas mencionadas en la presente incluyen especies que comprenden una secuencia de aminoácidos de una glucoamilasa (EC 3.2.1.3) enlazada (es decir, unida covalentemente) a una secuencia de aminoácidos que comprende un módulo de unión a carbohidratos (CBM). El término "módulo de unión a carbohidratos (CBM)" también puede referirse como un "dominio de unión a carbohidratos (CBD)".

[0018] Las enzimas híbridas que contienen CBM, así como las descripciones detalladas de la preparación y purificación de las mismas, se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, WO 90/00609, WO 94/24158 y WO 95/16782, así como Greenwood et al., Biotechnology and Bioengineering 44 (1994) págs. 1295-1305]. Por ejemplo, se pueden preparar al transformar en una célula huésped un constructo de ADN que comprenda al menos un fragmento de ADN que codifique el módulo de unión a carbohidratos ligado, con o sin un enlazador, a una secuencia de ADN que codifique la glucoamilasa de interés, con o sin su propio módulo de unión a carbohidratos nativo, y cultivando la célula huésped transformada para expresar el gen fusionado. El producto recombinante resultante

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(enzima híbrida), comúnmente referida en la técnica como una "proteína de fusión", puede describirse por la siguiente fórmula general:

A-CBM-MR-X

[0019] En la fórmula anterior, A-CBM es la región N-terminal o C-terminal de una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos el módulo de unión a carbohidratos (CBM) per se. MR es la región media (el “enlazador”), y X es la secuencia de residuos aminoácido de un polipéptido codificado por una secuencia de ADN que codifica la enzima (u otra proteína) a la cual se va a enlazar el CBM.

[0020] La porción A puede estar ausente (de tal manera que A-CBM sea un CBM per se, es decir, no comprenda residuos aminoácidos que no sean aquellos que constituyen el CBM) o puede ser una secuencia de uno o más residuos de aminoácido (que funcione como una extensión terminal del CBM per se). El enlazador (MR) puede estar ausente o ser un enlace o un grupo de enlace corto que comprenda de alrededor de 2 a aproximadamente 100 átomos de carbono, en particular de 2 a 40 átomos de carbono. Sin embargo, el MR es preferentemente una secuencia de aproximadamente 2 a alrededor de 100 residuos de aminoácido, más preferiblemente de alrededor de 2 a 40 residuos de aminoácido, así como de 2 a 15 residuos de aminoácido.

[0021] La fracción X puede constituir o bien el N-terminal o la región C-terminal de la enzima híbrida global.

[0022] Por tanto será aparente a partir de lo anterior que el CBM en una enzima híbrida del tipo en cuestión puede colocarse C-terminalmente, N-terminalmente o internamente en la enzima híbrida.

[0023] En la forma de realización donde un CBM es interno en el CBM puede enlazarse por medio de dos enlazadores.

[0024] Debe entenderse que la enzima híbrida de la invención puede tener más de un CBM, como dos o tres CBMs. La forma de realización donde se añade más de un CBM está cubierta: p. ej., construcciones en serie de dos o más CBDs N- o C-terminalmente, una construcción con un CBM N-terminal + un C-terminal.

[0025] Ejemplos de híbridos contemplados según la invención en consecuencia también incluyen un híbrido de las siguientes fórmulas generales:

A-CBM1-MR1-X-MR2-CBM2-B A-CBM1-MR1-B-CBM2-MR2-X A-CBM1-MR 1-CBM2-X-MR3-CBM3-C

[0026] El CBM1 y CBM2 pueden ser diferentes o los mismos. B y C pueden estar ausentes (de manera que, p. ej., B-CBM2 sea un CBM2 per se, es decir, no comprenda residuos de aminoácidos que no sean los que constituyen el CBM2) o puede (como A) ser una secuencia de uno o más residuos de aminoácido (que funcione como extensiones terminales del CBM2 per se). Los enlazadores pueden estar ausentes o presentes.

Secuencia enlazadora

[0027] Una secuencia enlazadora puede derivar de la glucoamilasa Athelia rolfsil, la glucoamilasa de A.niger, la glucoamilasa de Talaromyces emersonii, o la alfa-amilasa de A. kawachii . Ejemplos específicos de tales secuencias enlazadoras incluyen:

-: enlazador AMG de A. Niger:

TGGTTTTATPTGSGSVTSTSKTTATASKTSTSTSSTSA (SEC ID nº: 20),

-: enlazador de alfa-amilasa de A. kawachii:

TTTTTTAAATSTSKATTSSSSSSAAATTSSS (SEC ID nº: 21),

-: enlazador AMG de Athelia rolfsii:

STGATSPGGSSGS (SEC ID nº: 27),

Enlazador PEPT : PEPTPEPT (SEC ID nº: 22). [0028] El enlazador también pueden ser fragmentos de los enlaces anteriores.

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[0029] Una enzima híbrida de la invención tiene una secuencia enlazadora que difiere de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº: 20 en no más de 10 posiciones, no más de 9 posiciones, no más de 8 posiciones, no más de 7 posiciones, no más de 6 posiciones, no más de 5 posiciones, no más de 4 posiciones, no más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones, o incluso no más de 1 posición.

Módulos de Unión a Carbohidratos (CBM)

[0030] Un módulo de unión a carbohidratos (CBM) es una secuencia de aminoácidos polipéptidos que se une preferentemente a un poli-u oligosacárido (carbohidrato), frecuentemente, pero no necesariamente de forma exclusiva, a una forma insoluble en agua (incluyendo cristalina) de los mismos.

[0031] Los CBMs derivados a partir de enzimas de degradación de almidón comúnmente se conocen como módulos de unión a almidón o CBMs (CBMs que pueden ocurrir en determinadas enzimas amilolíticas, tal como en determinadas glucoamilasas, o en enzimas tales como ciclodextrina glucanotransferasas, o en alfa-amilasas). Asimismo, otras subclases de CBMs abrazarían, p. ej., módulos de enlace de celulosa (CBMs de enzimas celulolíticas), módulos de unión de quitina (CBMs que típicamente ocurren en quitinasas), módulos de unión de xilano (CBMs que típicamente ocurren en xilanasas), módulos de unión de manano (CBMs que típicamente ocurren en mananasas). Los SBMs se conocen frecuentemente como SBDs (Dominios de Unión a Almidón).

[0032] Los CBMs pueden encontrarse como partes integrales de polipéptidos grandes o proteínas que consisten en dos o más regiones de secuencias de aminoácidos polipéptidos, especialmente en enzimas hidrolíticas (hidrolasas) las cuales típicamente comprenden un módulo catalítico que contiene el sitio activo para la hidrólisis de sustrato y un módulo unión a carbohidratos (CBM) para unirse al sustrato de carbohidrato en cuestión. Tales enzimas pueden comprender más de un módulo catalítico y, p. ej., uno, dos o tres CBMs, y opcionalmente comprender una o más regiones de secuencias de aminoácidos polipéptidos que enlacen el/los CBM(s) con el/los módulo(s) catalítico(s), una región de éste último tipo normalmente siendo conocida como un "enlazador". Ejemplos de enzimas hidrolíticas que comprenden un CBM, algunas de las cuales se han mencionado ya arriba, son celulasas, alfa-amilasas, xilanasas, mananasas, arabinofuranosidasas, acetilesterasas y quitinasas. También se han encontrado CBMs en algas, p. ej., en el alga roja Porphyra purpurea en forma de una proteína de unión a polisacáridos no hidrolítica.

[0033] En proteínas/polipéptidos en los cuales ocurren los CBMs (p. ej. enzimas, típicamente enzimas hidrolíticas), un CBM puede localizarse en el N o C terminal o en una posición interna.

[0034] Esa parte de un polipéptido o proteína (p. ej., enzima hidrolítica) que constituye un CBM per se típicamente consiste en más de aproximadamente 30 y menos que aproximadamente 250 residuos de aminoácidos.

[0035] El "Módulo de Unión a Carbohidratos de la Familia 20" o un módulo CBM-20 está en el contexto de esta invención definido como una secuencia de aproximadamente 100 aminoácidos que tiene al menos 45 % de homología al módulo de unión a carbohidratos (CBM) del polipéptido descrito en la figura 1 por Joergensen et al (1997) en Biotechnol. Lett. 19:1027-1031. El CBM comprende los por lo menos 102 aminoácidos del polipéptido, es decir, la subsecuencia del aminoácido 582 al aminoácido 683. La numeración de las Familias de Glicósido Hidrolasa aplicada en esta descripción sigue el concepto de Coutinho, P.M. Henrissat; , B. (1999) servidor CAZy Carbohidrate-Active en la URL: afmb.cnrs-mrs.fr/~cazy/CAZY/index.html alternativamente Coutinho, P.M. & Henrissat, B. 1999; The modular structure of cellulases and other carbohidrate-active enzymes: an integrated database approach. En "Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation"., K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita y T. Kimura eds., Uni Publishers Ca., Tokio, págs. 15-23 y Bourne, Y. & Henrissat, B. 2001; Glycoside hydrolases and glycosyltransferases: families and functional modules, Current Opinion in Structural Biology 11:593

600.

[0036] Ejemplos de enzimas que comprenden un CBM son alfa-amilasas, alfa-amilasas maltogénicas, celulasas, xilanasas, mananasas, arabinofuranosidasas, acetilesterasas y quitinasas. Otros CBMs incluyen CBMs que se derivan de glucoamilasas (EC 3.2.1.3) o de CGTasas (EC 2.4.1.19).

[0037] Los CBMs pueden derivar de fuentes fúngicas, bacterianas o vegetales. Se prefieren los CBMs de Aspergillus sp., Athelia sp., Talaromyces sp, Bacillus sp., Klebsiella sp., o Rhizopus sp. Se prefieren los CBMs de origen fúngico. A este respecto, técnicas adecuadas para aislar los genes pertinentes se conocen bien en la técnica.

[0038] Los CBMs de la Familia 20 del Módulo de Unión a Carbohidratos adecuados para la invención pueden derivarse de glucoamilasas de Aspergillus awamori (SWISSPROT Q12537), Aspergillus kawachii (SWISSPROT P23176), Aspergillus niger (SWISSPROT P04064)1 Aspergillus oryzae (SWISSPROT P36914)1 de alfa-amilasas de Aspergillus kawachii (EMBL:#ABOO8370) Aspergillus nidulans (NCBL AAF17100.1) de beta-amilasas de Bacillus cereus (SWISSPROT P36924) o de CGTasas de Bacillus circulans (SWISSPROT P43379). Se prefiere un CBM de la alfa-amilasa de Aspergillus kawachii (EMBL:#AB008370) así como CBMs que tienen al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 % o incluso por lo menos el 99 % de homología con el CBM de la alfa-amilasa de Aspergillus kawachii (EMBL:#AB008370), es decir un CBM que tiene al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 % o incluso por lo menos el 99 % de homología con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 2. Se

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prefieren también para la invención los CBMs de la Familia 20 del Módulo de Unión a Carbohidratos que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID NO: 3 (CBM de Bacillus flavorthermus), SEC ID NO: 4 (CBM de Bacillus sp.) y SEC ID NO: 5 (CBM de Alcaliphillic Bacillus). Los CBMs que más se prefieren incluyen los CBMs de la glucoamilasa de Horrnoconis sp. tal como de Homoconis resinae (Sin. Hongo Creosote o Amorphotheca resinae) tales como el CBM de SWISSPROT:Q03045 (SEC ID NO: 6), de Lentinuta sp., tal como de Lentinula edodes (hongo shiitake) tal como el CBM de SPTREMBL:Q9P4C5 (SEC ID NO: 7), de Neurospora sp. tal como de Neurospora crassa tal corno el CBM de SWISSPROT:P14804 (SEC ID NO: 8), de Talaromyces sp., tal como de Talaromyces byssochlamydioides tal como el CBM de NN005220 (SEC ID NO: 9), de Geosmithia sp., tal como de Geosmithia cylindrospora, tal como el CBM de NN48286 (SEC ID NO: 10), de Scorias sp. tal corno de Scorias spongiosa tal como el CBM de NN007096 (SEC ID NO: 11), de Eupenicillium sp. tal corno de Eupenicillium ludwigii tal como el CBM de NN005968 (SEC ID NO: 12), de Aspergillus sp., tal corno de Aspergillus japonicus tal corno el CBM de NN001136 (SEC ID NO: 13), de Penicillum sp., tal de Penicillum cf. miczynskii, tal como el CBM de NN48691 (SEC ID NO: 14), de Mz1 Penicillium sp., tal como el CBM de NN48690 (SEC ID NO: 15), de Thysanophora sp., tal corno el CBM de NN48711 (SEC ID NO: 16), y de Humicola sp., tal como de Humicola grisea var. thermoidea tal corno el CBM de SPTREMBL:Q12623 (SEC ID NO: 17). Los CBMs que más se prefieren incluyen el CBM de glucoamilasa de Aspergillus sp., tal como de Aspergillus Niger, tal como la SEC ID NO: 18, y Athelia sp., tal como de Athelia rolfsii, tal como la SEC ID NO: 19. Se prefiere también para la invención cualquier CBD que tenga al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 % o incluso por lo menos el 99 % de homología con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de CBD mencionadas arriba.

[0039] Otros CBMs adecuados de la Familia 20 del Módulo de Unión a Carbohidratos pueden encontrarse en el servidor de Enzimas Activas en Carbohidratos en la URL: afmb.cnrs-mrs.fr/-cazy/CAZY/index.html).

[0040] Otro CBM puede encontrarse en una glucoamilasa de Mucor circinelloides, Rhizopus oryzae, Arxula adeninivorans.

[0041] Una vez que una secuencia de nucleótidos que codifican la región de unión a sustrato (unión a carbohidratos) se ha identificado, ya sea como ADNc o ADN cromosómico, puede manipularse después de una variedad de formas para fusionarla a una secuencia de ADN que codifique la enzima de interés. El fragmento de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la unión a carbohidratos y el ADN que codifica la enzima de interés se ligan después con o sin un enlazador. El ADN ligado resultante puede manipularse después de una variedad de formas para lograr la expresión.

Secuencia de glucoamilasas

[0042] Las glucoamilasas que son adecuadas como la base para los híbridos CBM/glucoamilasa de la presente invención incluyen, por ejemplo, glucoamilasas derivadas de un organismo fúngico, bacteriano o vegetal. Las glucoamilasas que se prefieren son de origen fúngico o bacteriano, seleccionadas del grupo que consiste en glucoamilasas de Aspergillus, en particular las glucoamilasas G1 o G2 de A. niger (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5),

p. 1097-1102) mostradas en la SEC ID nº: 24), o variantes de las mismas, tal como se describe en WO 92/00381, WO 00/04136 y WO 01/04273 (de Novozymes, Dinamarca); las glucoamilasas de A. awamori (WO 84/02921), A. oryzae (Agric. Biol. Chem. (1991), 55 (4), p. 941-949), o variantes o fragmentos de las mismas. Otras glucoamilasas incluyen glucoamilasas de Athelia rolfsii (patente de EEUU n°. 4.727.046) mostradas en la SEC ID nº: 26, glucoamilasas de Talaromyces, en particular, derivadas de Talaromyces emersonii (WO 99/28448) mostradas en la SEC ID nº: 25), Talaromyces leycettanus (patente de EEUU nº. RE. 32.153), Talaromyces duponti, Talaromyces thermophilus (patente de EEUU n°. 4.587.215). Las glucoamilasas bacterianas contempladas incluyen glucoamilasas del género Clostridium, en particular C. thermoamylolyticum (EP 135.138), y C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831). La glucoamilasa puede estar con o sin su CBM nativo, pero comprende al menos el módulo catalítico (CM).

[0043] Una glucoamilasa preferida es la glucoamilasa de A. niger descrita en la SEC ID nº: 24, o una glucoamilasa con más del 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología (identidad) con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº: 24.

[0044] Debe entenderse que la glucoamilasa (módulo catalítico) puede ser en una forma de realización un fragmento activo que tenga actividad glucoamilasa.

[0045] Otra glucoamilasa preferida es la glucoamilasa de Athelia rolfsii mostrada en la SEC ID nº: 26, o una glucoamilasa con más del 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología (identidad) con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº: 26.

[0046] Una tercera glucoamilasa preferida es la glucoamilasa de Talaromyces emersonii mostrada en la SEC ID nº: 25, o una glucoamilasa con más del 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología (identidad) con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº: 25.

Híbridos

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[0047] La invención se refiere a una enzima híbrida como se describe en la reivindicación 1. En una forma de realización preferida el módulo catalítico es de origen fúngico. En una forma de realización más preferida el módulo catalítico se deriva de una cepa de Talaromyces, preferiblemente Talaromyces emersonii, una cepa de Aspergillus, preferiblemente Aspergillus niger o una cepa de Athelia, preferiblemente Athelia rolfsii.

[0048] En una forma de realización preferida la enzima híbrida de la invención comprende un módulo catalítico que tiene actividad de glucoamilasa derivada de Talaromyces emersonii y un módulo de unión a carbohidratos de Aspergillus niger o Athelia rolfsii. El híbrido puede incluir en una forma de realización una secuencia enlazadora, preferiblemente de Aspergillus Niger, Athelia rolfsii, A. kawachii o Talaromyces emersonii entre el módulo catalítico y el módulo de unión a carbohidratos.

[0049] En una forma de realización preferida la enzima híbrida de la invención comprende un módulo catalítico que tiene actividad glucoamilasa derivada de Aspergillus niger y un módulo de unión a carbohidratos de Athelia rolfsii o Talaromyces emersonii. El híbrido puede incluir en una forma de realización una secuencia enlazadora, preferiblemente de Aspergillus niger, Athelia rolfsii, A. kawachii o Talaromyces emersonii entre el módulo catalítico y el módulo de unión a carbohidratos.

[0050] En otra forma de realización preferida la enzima híbrida de la invención comprende un módulo catalítico que tiene actividad glucoamilasa derivada de Athelia rolfsii y un módulo de unión a carbohidratos de Aspergillus niger o Talaromyces emersonii. El híbrido puede incluir en una forma de realización una secuencia enlazadora, preferiblemente de Aspergillus niger, Athelia rolfsii o Talaromyces emersonii entre el módulo catalítico y el módulo de unión a carbohidratos.

[0051] Las Aspergillus niger, Athelia rolfsii o Talaromyces emersonii que se prefieren son las mostradas en las SEC ID nº: 24, 25, y 26, respectivamente.

[0052] Una enzima híbrida de la invención puede comprender un CBM como se describe en la reivindicación 3.

[0053] Los híbridos específicos incluyen los siguientes:

Fusión: Nombre del híbrido CM SBM Unión de fusión (inicio de SBM-subrayado)

SEC ID NO: 29: ANTE1 AN TE SSVPGTCSATSATGPYSTATNTVWPSSGSGSST

SEC ID NO: 30: ANTE2 AN TE SSVPGTCAATSAIGTYSTATNTVWPSSGSGSST

SEC ID NO: 31: ANTE3 AN TE SSVPGTCAATSAIGTYSSVTVTSWPSSGSGSST

SEC ID NO: 32: ANAR1 AN AR SSVPGTCSTGATSPGGSSGSVEVTFDVYATTVY

SEC ID NO: 33: ANAR2 AN AR SSVPGTCAATSAIGTGSSGSVEVTFDVYATTVY

SEC ID NO: 34: ANAR3 AN AR SSVPGTCAATSAIGTYSSVTVTSWFDVYATTVY

SEC ID NO: 35: ARTE1 AR TE GVSTSCSATSATGPYSTATNTVWPSSGSGSSTT

SEC ID NO: 36: ARTE2 AR TE GVSTSCSTGATSPGYSTATNTVWPSSGSGSSTT

SEC ID NO: 37: ARTE3 AR TE GVSTSCSTGATSPGGSSGSVEVTPSSGSGSSTT

SEC ID NO: 38: ARAN1 AR AN GVSTSCAATSAIGTYSSVTVTSWPSIVATGGTT

SEC ID NO: 39: ARAN2 AR AN GVSTSCSTGATSPGYSSVTVTSWPSIVATGGTT

SEQ ID NO: 40: ARAN3 AR AN GVSTSCSTGATSPGGSSGSVEVTPSIVATGGTT

SEQ ID NO: 41: TEAN1 TE AN SVPAVCAATSAIGTYSSVTVTSWPSIVATGGTT

SEQ ID NO: 42: TEAN2 TE AN SVPAVCSATSATGPYSSVTVTSWPSIVATGGTT

SEQ ID NO: 43: TEAN3 TE AN SVPAVCSATSATGPYSTATNTVWPSIVATGGTT

SEQ ID NO: 44: TEAR1 TE AR SSVPAVCSTGATSPGGSSGSVEVTFDVYATTVY

SEQ ID NO: 45: TEAR2 TE AR SSVPAVCSATSATGPYSSGSVEVTFDVYATTVY

SEQ ID NO: 46: TEAR3 TE AR SSVPAVCSATSATGPYSTATNTVWFDVYATTVY

CM: módulo catalítico; SBM: módulo de unión a almidón; AN: Aspergillus niger, TE: Talaromyces emersonii; AR:Athelia rolfsii.

Vectores de expresión

[0054] La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que pueden comprender una secuencia de ADN que codifique la enzima híbrida, un promotor, una secuencia de péptidos de señal, y señales de detección transcripcional y traduccional. Los diferentes ADN y secuencias de control anteriormente descritos pueden unirse para producir un vector de expresión recombinante que pueda incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de ADN codificando el polipéptido en sitios de este tipo. De forma alternativa, la secuencia de ADN de la presente invención puede expresarse al insertar la secuencia de ADN o un constructo de ADN que comprende la secuencia en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia de codificación se localiza en el vector de modo que la secuencia de

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codificación se enlaza operativamente con las secuencias de control apropiadas para la expresión, y posiblemente la secreción.

[0055] El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (p. ej., un plásmido o virus), que pueda someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinantes y pueda provocar la expresión de la secuencia de ADN. La elección del vector típicamente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la cual se va a introducir el vector. Los vectores pueden ser plásmidos circulares, lineales o cerrados. El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación sea independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, un cósmido o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. De forma alternativa, el vector puede ser uno que, al introducirse en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica junto con el/los cromosoma(s) en los cuales se ha integrado. El sistema de vector puede ser un solo vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que contengan juntos el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula huésped, o un transposón.

Marcadores

[0056] Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o más marcadores seleccionables, los cuales permiten una selección fácil de células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen el producto del cual proporciona resistencia a biocidas o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos, y similares.

[0057] Ejemplos de marcadores seleccionables para su uso en una célula huésped de hongo filamentoso pueden seleccionarse del grupo que incluye, pero no se limita a, amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hygB (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato-reductasa), pyrG (orotidina-5'fosfato-descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa), trpC (antranilato sintasa), y marcadores de resistencia a glufosinato, así como equivalentes de otras especies. Se prefiere para su uso en una célula de Aspergillus los marcadores el amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el marcador bar de Streptomyces higroscopicus. Además, la selección puede realizarse mediante cotransformación, p. ej., como se describe en WO 91/17243, donde el marcador seleccionable está sobre un vector separado.

[0058] Los vectores de la presente invención contienen preferiblemente un(os) elemento(s) que permite(n) la integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma de la célula.

[0059] Los vectores de la presente invención pueden integrarse en el genoma de la célula huésped cuando se introducen en una célula huésped. Para la integración, el vector puede basarse en la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés o cualquier otro elemento del vector para la integración estable del vector en el genoma mediante recombinación homóloga o no homóloga. De forma alternativa, el vector puede contener secuencias de ADN adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped. Las secuencias de ADN adicionales permiten que el vector se integre en el genoma de la célula huésped en una(s) ubicación(es) precisa(s) en el/los cromosoma(s). Para incrementar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos de integración deberían contener preferiblemente un número suficiente de ADN, tal como de 100 a 1.500 pares de bases, preferiblemente de 400 a 1.500 pares de bases, y de la forma más preferible de 800 a

1.500 pares de bases, los cuales sean altamente homólogos a la secuencia objetivo correspondiente para intensificar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia homóloga a la secuencia objetivo en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos de integración pueden ser secuencias de ADN de codificación o no codificación. En cambio, el vector puede integrarse en el genoma de la célula huésped mediante recombinación no homóloga. Estas secuencias de ADN pueden ser cualquier secuencia homóloga con una secuencia objetivo en el genoma de la célula huésped, y, además, pueden ser secuencias de codificación o no codificación.

[0060] Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permite que el vector se replique de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. El episoma que replica al vector plásmido AMA1 descrito en WO 00/24883 puede utilizarse.

[0061] Más de una copia de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés puede insertarse en la célula huésped para amplificar la expresión de la secuencia de ADN. La amplificación estable de la secuencia de ADN puede obtenerse al integrar al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped usando métodos bien conocidos en la técnica y seleccionando los transformantes.

[0062] Los procedimientos usados para enlazar los elementos anteriormente descritos para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención se conocen por un experto en la materia (véase, p. ej., Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Células huésped

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[0063] La célula huésped puede ser de origen fúngico, tal como originaria de un hongo filamentoso o de levadura, o de origen bacteriano, tal como originario de Bacillus.

[0064] La célula huésped de la invención, que comprende un constructo de ADN o un vector de expresión que comprende la secuencia de ADN que codifica la enzima híbrida, se usa ventajosamente como una célula huésped en la producción recombinante de la enzima híbrida. La célula puede transformarse con un vector de expresión. De forma alternativa, la célula puede transformarse con el constructo de ADN de la invención que codifica la enzima híbrida, convenientemente al integrar el constructo de ADN (en una o más copias) en el cromosoma huésped. La integración del constructo de ADN en el cromosoma huésped puede realizarse según métodos convencionales, p. ej., mediante recombinación homóloga o heteróloga.

[0065] En una forma de realización preferida, la célula huésped es un hongo filamentoso representado por los grupos siguientes de Ascomycota, e incluyen, p. ej., Neurospora, Eupenicillium (=Penicillium), Emericella (=Aspergillus), Eurotium (=Aspergillus). En una forma de realización más preferida, el hongo filamentoso incluye todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define por Hawkswort et al., en, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8ª edición, 1995, CAE internacional, University Press, Cambridge, Reino Unido. Los hongos filamentosos se caracterizan por un micelio vegetativo compuesto por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es mediante alargamiento hifal y catabolismo de carbono es estrictamente aeróbico.

[0066] En una forma de realización aún más preferida, la célula huésped de hongo filamentoso es una célula de una especie de, pero no limitada a una célula seleccionada del grupo que consiste en una cepa perteneciente a una especie de Aspergillus, preferiblemente Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus kawachii, o una cepa de Fusarium, tal como una cepa de Fusarium oxisporium, Fusarium graminearum (en el estado perfecto llamada Gribberella zeae, previamente Sphaeria zeae, sinónimo de Gibberella roseum y Gibberella roseum

f. sp. cerealis), o Fusarium sulphureum (en el estado perfecto llamada Gibberella puricaris, sinónimo de Fusarium trichothecioides, Fusarium bactridioides, Fusarium sambucium, Fusarium roseum, y Fusarium roseum var. graminearum), Fusarium cerealis (sinónimo de Fusarium crookwellense), o Fusarium venenatum.

[0067] En una forma de realización más preferida, la célula huésped de hongo filamentoso es una célula de una cepa perteneciente a una especie de Aspergillus, preferiblemente Aspergillus oryzae, o Aspergillus niger.

[0068] La célula huésped puede ser una célula huésped de hongo filamentoso de tipo salvaje o una variante, un mutante o una célula huésped de hongo filamentoso modificada genéticamente. En una forma de realización preferida de la invención la célula huésped es una proteasa deficitaria o una cepa menos de proteasa. También se contemplan específicamente cepas de Aspergillus, tales como cepas de Aspergillus niger, modificadas genéticamente para romper o reducir la expresión de glucoamilasa, alfa-amilasa estable de ácido, alpha-1,6 transglucosidasa, y actividades proteasa.

[0069] En otra forma de realización preferida, la célula huésped fúngica es una célula de levadura. "Levadura" como se utiliza en este caso incluye levadura ascosporógena (Endomicetales), levadura basidiosporógena, y levadura perteneciente a los Fungi Imperfecti (Blastomicetes). Puesto que la clasificación de una levadura puede cambiar en el futuro, para los objetivos de esta invención, la levadura deberá definirse como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

[0070] En una forma de realización aún más preferida, la célula huésped de levadura es una célula Candida, Hansenula, Kluyveromices, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia.

[0071] En una forma de realización preferida, la célula huésped de levadura es una célula Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otra forma de realización más preferida, la célula huésped de levadura es una célula de Kluyveromyces lactis. En otra forma de realización más preferida, la célula huésped de levadura es una célula del Yarrowia lipolytica.

Transformación de células huéspedes fúngicas

[0072] Las células fúngicas pueden transformarse por un proceso que incluye la formación de protoplasto, la transformación de los protoplastos, y la regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Los procedimientos adecuados para la transformación de células huésped de Aspergillus se describen en EP 238 023 y Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Los métodos adecuados para transformar especies de Fusarium se describen por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 y WO 96/00787.

[0073] La levadura puede transformarse usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson,

J.N. y Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, volúmen 194,

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págs 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

Aislar y clonar una secuencia de ADN

[0074] Las técnicas usadas para aislar o clonar una secuencia de ADN codificando un polipéptido de interés se conocen en la técnica e incluyen el aislamiento de ADN genómico, la preparación a partir de ADNc, o una combinación de los mismos. La clonación de las secuencias de ADN de la presente invención a partir de este ADN genómico se pueden llevar a cabo, p. ej., usando la bien conocida reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o el tamiz de anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas. Véase, p. ej., Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nueva York. Pueden utilizarse otros procedimientos de amplificación de DNA tales como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), transcripción activada y ligada (LAT) y amplificación a base de secuencias de ADN (NASBA).

Secuencia de ADN aislada

[0075] La presente invención se refiere, entre otras cosas, a una secuencia de ADN aislada como se define en la reivindicación 5.

[0076] El término "secuencia de ADN aislada" como se utiliza en la presente se refiere a una secuencia de ADN, la cual está esencialmente libre de otras secuencias de ADN, p. ej., al menos aproximadamente un 20 % pura, preferiblemente al menos aproximadamente un 40 % pura, más preferiblemente al menos aproximadamente un 60 % pura, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 80 % pura, y de la forma más preferible al menos aproximadamente un 90 % pura como se ha determinado por electroforesis de agarosa.

[0077] Por ejemplo, una secuencia de ADN aislada puede obtenerse por procedimientos de clonación estándar usados en ingeniería genética para recolocar la secuencia de ADN de su ubicación natural a un sitio diferente donde se reproducirá. Los procedimientos de clonación pueden implicar la escisión y el aislamiento de un fragmento de ADN deseado que comprenda la secuencia de ADN que codifique el polipéptido de interés, la inserción del fragmento en una molécula del vector, y la incorporación del vector recombinante en una célula huésped donde se replicarán múltiples copias o clones de la secuencia de ADN. Una secuencia de ADN aislada puede manipularse de una variedad de maneras para proporcionar la expresión del polipéptido de interés. La manipulación de la secuencia de ADN antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar secuencias de ADN utilizando métodos de ADN recombinante se conocen bien en la técnica.

Constructo de ADN

[0078] La presente invención se refiere, entre otras cosas, a un constructo de ADN como se describe en la reivindicación 6. En una forma de realización el módulo catalítico es de origen fúngico. "Constructo de ADN" se define aquí como una molécula de ADN, ya sea mono o bicatenaria, que se aísla de un gen de origen natural o que se ha modificado para contener segmentos de ADN, que se combina y yuxtapone de tal manera, que de otro modo no existiría en la naturaleza. El término constructo de ADN es sinónimo del término casete de expresión cuando el constructo de ADN contiene todas las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia de codificación de la presente invención.

Métodos de producción

[0079] Un híbrido de la invención puede producirse usando cualquier método, por ejemplo, que comprenda (a) cultivar una célula huésped bajo condiciones propicias para la producción del híbrido; y (b) recuperar el híbrido.

[0080] En los métodos de producción, las células se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción del híbrido usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula puede cultivarse mediante cultivo en matraz de agitación, fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, intermitentes o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizadas en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan la expresión y/o el aislamiento del híbrido. El cultivo se desarrolla en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de nitrógeno y carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Medios adecuados están disponibles a través de proveedores comerciales o pueden prepararse según composiciones publicadas (p. ej., en catálogos de la Colección Americana de Tipos de Cultivo). Si el híbrido se segrega en el medio nutritivo, este puede recuperarse directamente del medio. Si el híbrido no se segrega, este puede recuperarse de los lisados de células.

[0081] El híbrido puede detectarse usando métodos conocidos en la técnica que sean específicos para el híbrido. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto

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enzimático, o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, un ensayo enzimático puede utilizarse para determinar la actividad del híbrido como se describe en este caso.

[0082] El híbrido resultante puede recuperarse mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el híbrido 5 puede recuperarse del medio nutritivo mediante procedimientos convencionales incluyendo, pero no limitándose a, centrifugado, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, o precipitación.

[0083] El híbrido de la presente invención puede purificarse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitándose a, cromatografía (p. ej., intercambio iónico, afinidad, hidrofóbica,

10 cromatoenfoque y exclusión de tamaño), procedimientos electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque preparatorio), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación de sulfato amónico), SDS-PAGE, o extracción (véase, p. ej., Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, Nueva York, 1989).

Uso de un híbrido de la invención

15 [0084] En un aspecto final la invención se refiere al uso de una enzima híbrida de la invención para producir un producto de fermentación, tal como especialmente etanol, o jarabe, preferiblemente glucosa o maltosa.

MATERIALES Y MÉTODOS

20 Levadura:

[0085] RED STAR®/Lesaffre Ethanol Red (disponible a través de Red Star/Lesaffre, EEUU)

25 Actividad alfa-amilasa estable en ácido

[0086] Cuando se usa según la presente invención la actividad de cualquier alfa-amilasa estable en ácido puedemedirse en AFAU (Unidades de Alfa-amilasa Fúngica Ácida), las cuales se determinan en relación a un estándar enzimático. 1 FAU se define como la cantidad de enzima que degrada 5,260 mg de sustancia seca de almidón por

30 hora bajo las condiciones estándar mencionadas abajo.

[0087] La alfa-amilasa estable en ácido, una endo-alfa-amilasa (1,4-alfa-D-glucan-glucanohidrolasa, E.C. 3,2,1,1) hidroliza enlaces alfa-1,4-glucosídicos en las regiones internas de la molécula de almidón para formar dextrinas y oligosacáridos con longitudes de cadena diferentes. La intensidad de color formado con yodo es directamente

35 proporcional a la concentración de almidón. La actividad amilasa se determina usando colorimetría inversa como una reducción en la concentración de almidón bajo las condiciones analíticas especificas.

imagen1

40: Condiciones estándar/condiciones de reacción:

[0088]

Sustrato:: Almidón soluble, aprox. 0,17 g/L

Tampón:: Citrato, aprox. 0,03 M

Yodo (l2):: 0,03 g/L

CaCl2:: 1,85 mM

pH:: 2.50 ± 0.05

Temperatura de incubación:: 40° C

Tiempo de reacción:: 23 segundos

Longitud de onda:: 590 nm

Concentración enzimática:: 0,025 AFAU/mL

Rango de trabajo enzimático:: 0,01-0,04 AFAU/mL

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[0089] Un documento EB-SM-0259.02/01 que describe este método analítico con más detalle está disponible bajo pedido a Novozymes A/S, Dinamarca, cuyo archivo se incluye aquí por referencia.

Actividad glucoamilasa

5 [0090] La actividad glucoamilasa puede medirse en Unidades AmiloGlucosidasa (AGU). La AGU se define como la cantidad de enzima, la cual hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto bajo las condiciones estándar de 37º C, pH 4.3, sustrato: maltosa 23,2 mM, tampón: 0,1 m de acetato, 5 minutos de tiempo de reacción.

10 [0091] Puede utilizarse un sistema autoanalizador. Se añade mutarotasa al reactivo de glucosa dehidrogenasa de modo que cualquier alfa-D-glucosa presente se transforme en beta-D-glucosa. La glucosa deshidrogenasa reacciona específicamente con beta-D-glucosa en la reacción mencionada arriba, formando NADH el cual se determina usando un fotómetro a 340 nm como una medida de la concentración de glucosa original.

Incubación AMG:

Sustrato:: maltosa 23,2 mM

Tampón:: acetato 0,1 M

pH:: 4.30 ± 0.05

Temperatura de incubación:: 37° C ± 1

Tiempo de reacción:: 5 minutos

Rango de trabajo enzimático:: 0,5-4,0 AGU/mL

Reacción del color:

GlucDH:: 430 U/L

Mutarotasa:: 9 U/L

NAD:: 0,21 mM

Buffer:: fosfato 0,12 M; 0,15 M de NaCl

pH:: 7.60 ± 0.05

Temperatura de incubación:: 37° C ± 1

Tiempo de reacción:: 5 minutos

Longitud de onda:: 340 nm

[0092] Un documento (EB-SM-0131.02/01) que describe este método analítico con más detalle está disponible bajo pedido a través de Novozymes A/S, Dinamarca, cuyo archivo se incluye aquí por referencia.

20 Manipulaciones de ADN

[0093] A menos que se indique lo contrario, las manipulaciones y transformaciones de ADN se realizaron usando métodos estándar de biología molecular como se describe en Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY ; Ausubel, F. M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular

25 Biology", John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., y Cutting, S. M. (eds .).

EJEMPLOS

Ejemplo 1

30 Construcción y expresión de híbridos dominio catalítico de glucoamilasa- dominio de unión de almidón

[0094] Los plásmidos que expresan 18 híbridos de AMG diferentes (Tabla 1) se construyeron entre los dominios catalíticos (CD) y los dominios de unión de almidón (SBD) de glucoamilasa de Aspergillus niger (AN), Talaromyces

35 emersonii (TE), y Althea rolfsii (AR). Los plásmidos se transformaron en Saccharomyces cerevisiae para la expresión de proteínas recombinantes, o los híbridos de glucoamilasa construidos posteriormente se reclonaron en el vector de expresión de Aspergillus niger para la expresión de las proteínas híbridas en A. niger.

Tabla 1: Conjunciones de fusión en híbridos de glucoamilasa.

Fusión: Nombre del plásmido CD SBD Unión de fusión (inicio de SBD-subrayado)

SEC ID NO: 29: pANTE 1 AN TE SSVPGTCSATSATGPYSTATNTVWPSSGSGSST

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SEC ID NO: 30: pANTE2 AN TE SSVPGTCAATSAIGTYSTATNTVWPSSGSGSST

SEC ID NO: 31: pANTE3 AN TE SSVPGTCAATSAIGTYSSVTVTSWPSSGSGSST

SEC ID NO: 32: pANAR1 AN AR SSVPGTCSTGATSPGGSSGSVEVTFDVYATTVY

SEC ID NO: 33: pANAR2 AN AR SSVPGTCAATSAIGTGSSGSVEVTFDVYATTVY

SEC ID NO: 34: pANAR3 AN AR SSVPGTCAATSAIGTYSSVTVTSWFDVYATTVY

SEC ID NO: 35: pARTE1 AR TE GVSTSCSATSATGPYSTATNTVWPSSGSGSSTT

SEC ID NO: 36: pARTE2 AR TE GVSTSCSTGATSPGYSTATNTVWPSSGSGSSTT

SEC ID NO: 37: pARTE3 AR TE GVSTSCSTGATSPGGSSGSVEVTPSSGSGSSTT

SEC ID NO: 38.: pARAN1 AR AN GVSTSCAATSAIGTYSSVTVTSWPSIVATGGTT

SEC ID NO: 39.: pARAN2 AR AN GVSTSCSTGATSPGYSSVTVTSWPSIVATGGTT

SEC ID NO: 40.: pARAN3 AR AN GVSTSCSTGATSPGGSSGSVEVTPSIVATGGTT

SEC ID NO: 41: pTEAN1 TE AN SVPAVCAATSAIGTYSSVTVTSWPSIVATGGTT

SEC ID NO: 42: pTEAN2 TE AN SVPAVCSATSATGPYSSVTVTSWPSIVATGGTT

SEC ID NO: 43: pTEAN3 TE AN SVPAVCSATSATGPYSTATNTVWPSIVATGGTT

SEC ID NO: 44: pTEAR1 TE AR SSVPAVCSTGATSPGGSSGSVEVTFDVYATTVY

SEC ID NO: 45: pTEAR2 TE AR SSVPAVCSATSATGPYSSGSVEVTFDVYATTVY

SEC ID NO: 46: pTEAR3 TE AR SSVPAVCSATSATGPYSTATNTVWFDVYATTVY

Procedimientos experimentales

Cepas bacterianas y fúngicas y plásmidos

[0095] DH10B de E. coli (mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80dlacZM15 lacX74 deaR recA1endA1 araD139 (ara, leu)7697 galU galK, rpsL nupG), Saccharomyces cerevisiae INVSc1 (MATa, his3D1, leu2; trpl-289, ura3-52) y el vector transportador pYES2 del plásmido de E. coli/levadura se compraron de Invitrogen Inc. (San Diego, CA).

Construcciones de ADN

[0096] Las manipulaciones de ADN se realizaron esencialmente como se describe en Sambrook et al., (1989) Maniatis, T., 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª Edición ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, y en Dan Burke, Dean Dawson, Tim Stearns (2000) Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Las endonucleasas de restricción y la ligasa de ADN T4 eran de New England BioLabs. La Pwo ADN polimerasa (Boehringen Mannheim) se usó esencialmente como se prescribe por el proveedor. Para las reacciones de PCR SOE aprox. 100 ng de cada fragmento deseado se purificaron en gel, mezclando y sometiendo a 25 ciclos de PCR sin añadir ningún cebador. Las reacciones se separaron por electroforesis en gel de agarosa y las bandas de ADN que migraban en los tamaños previstos se cortaron del gel, se purificaron por columnas de giro y se usaron como molde en una nueva reacción PCR usando los cebadores de flanqueo. El plásmido pSteD226 se construyó en dos etapas: primero la secuencia de codificación de la glucoamilasa de Talaromyces emersonii (SEC ID nº: 80) se clonó como un fragmento HindIII-XbaI en pYES2 para crear pSteD212. Posteriormente el fragmento AgeI-HindIII de pSteD212 conteniendo el promotor inducible por galactosa se sustituyó por un fragmento AgeI-HindIII conteniendo el promotor TPI constitutivo (Alben y Kawasaki (1982) Nucleotide sequence of the triose phosphate isomerase gene of Saccharomyces cerevisiae. J. Mol. Appl. Gen., 1:419-434) para crear pSteD226. El plásmido pLac102 se construyó clonando la secuencia de codificación de la forma G1 de la glucoamilasa de Aspergillus niger (SEC ID nº: 81) en el vector transportador pMT742 de levadura/E.coli como un fragmento de EcoRI-HindIII. Para la amplificación de CD y SBD's se emplearon los siguientes moldes de ADN: el plásmido pLAc102 portando el ADNc codificando la forma G1 de la glucoamilasa G1 de A. niger; el plásmido pSteD226 portando el ADNc codificando la forma G1 de la glucoamilasa de T. emersonii; el ADNc sintetizado de A. rolfsii conteniendo la forma G1 de la glucoamilasa de A. rolfsii.

[0097] Los oligonucleótidos utilizados para amplificar los productos de PCR de CD y SBD se catalogan en la Tabla 2 y la Tabla 3 respectivamente. Los productos de PCR SOE se purificaron mediante electroforesis en gel y columnas centrífugas Qiagen, se digirieron con HindIIIIXbaI y se ligaron en HindIIIIXbaI cortada y pSteD226 se purificó con gel. Tras las reacciones nocturnas de ligación se sometieron a electroforesis en DH10B y se pusieron sobre placas de agar LB complementadas con 100 micro g/ml de ampicilina (Sigma). Los transformantes se purificaron en la placa y los plásmidos se extrajeron para la determinación de la secuencia. La integridad del fragmento HindIII-XbaI clonado completo se verificó mediante análisis de restricción y determinación de la secuencia de ADN. Los plásmidos elegidos se transformaron después en levadura competente InvScI y se colocaron sobre medios selectivos. Los transformantes de levadura se purificaron hasta obtener colonias individuales y las partes alícuotas se almacenaron a -80º C en 15 % de glicerol.

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Tabla 2: Oligonucleóticos usados para amplificar los dominios catalíticos de glucoamilasa; sitio HinDIII localizado en el cebador fwd subrayado; iniciador ATG mostrado en negrita.

Plantilla: Cebador fwd (catalogado 5'-3') Cebador inv. Producto de PCR

pLac102: imagen2 imagen3 AN1

pLac102: imagen4 imagen5 AN2

pLac102: imagen6 imagen7 AN3

pSteD226: imagen8 imagen9 TE1

pSteD226: imagen10 imagen11 TE2

pSteD226: imagen12 imagen13 TE3

AR cDNA: imagen14 imagen15 AR1

AR cDNA: imagen16 imagen17 AR2

AR cDNA: imagen18 imagen19 AR3

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Tabla 3. Oligonucleótidos usados para amplificar los Dominios de Unión a Almidón de glucoamilasa. El sitio xbaI localizado en el extremo 5' de los cebadores inversos está subrayado.

Plantilla: Cebador fwd (catalogado 5'-3') Cebador inverso (catalogado 5'-3') Producto de PCR

pLac102: imagen20 imagen21 TEANsbd1

pLac102: imagen22 imagen23 TEANsbd2

pLac102: imagen24 imagen25 TEANsbd3

pLac102: imagen26 imagen27 ARANsbd1

pLac102: imagen28 imagen29 ARANsbd2

pLac102: imagen30 imagen31 ARANsbd3

pSteD226: imagen32 imagen33 ARTEsbd1

pSteD226: imagen34 imagen35 ARTEsbd2

pSteD226: imagen36 imagen37 ARTEsbd3

pSteD226: imagen38 imagen39 ANTEsbd1

pSteD226: imagen40 imagen41 ANTEsbd2

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pSteD226: imagen42 imagen43 ANTEsbd3

AR cDNA: imagen44 imagen45 TEARsbd1

AR cDNA: imagen46 imagen47 TEARsbd2

AR cDNA: imagen48 imagen49 TEARsbd3

AR cDNA: imagen50 imagen51 ANARsbd1

AR cDNA: imagen52 imagen53 ANARsbd2

AR cDNA: imagen54 imagen55 ANARsbd3

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Fusión de dominios catalíticos y dominios de unión a almidón mediante PCR SOE (Empalme por Extensión de Superposición).

[0098] La PCR de SOE, como se describe en los procedimientos experimentales, se empleó para generar las fusiones CD-SBD deseadas. Las combinaciones de productos de PCR usadas en las reacciones de SOE y los híbridos de SOE resultantes se catalogan en la Tabla 4.

Tabla 4: Reacciones de pcr de SOE.

Fragmento CD: Producto SBD Nombre de híbrido de SOE Híbrido de SOE

TE1: TEANsbd1 ANTE1 SEC ID NO: 82

TE2: TEANsbd2 ANTE2 SEC ID NO: 83

TE3: TEANsbd3 ANTE3 SEC ID NO: 84

AR1: ARANsbd1 ANAR1 SEC ID NO: 85

AR2: ARANsbd2 ANAR2 SEC ID NO: 86

AR3: ARANsbd3 ANAR3 SEC ID NO: 87

AR1: ARTEsbd1 ARTE1 SEC ID NO: 88

Ar2: ARTEsbd2 ARTE2 SEC ID NO: 89

AR3: ARTEsbd3 ARTE3 SEC ID NO: 90

AN1: ANTEsbd1 ARAN1 SEC ID NO: 91

AN2: ANTEsbd2 ARAN2 SEC ID NO: 92

AN3: ANTEsbd3 ARAN3 SEC ID NO: 93

TE1: TEARsbd1 TEAN1 SEC ID NO: 94

TE2: TEARsbd2 TEAN2 SEC ID NO: 95

TE3: TEARsbd3 TEAN3 SEC ID NO: 96

AN1: ANARsbd1 TEAR1 SEC ID NO: 97

AN2: ANARsbd2 TEAR2 SEC ID NO: 98

AN3: ANARsbd3 TEAR3 SEC ID NO: 99

10 Ejemplo 2

Evaluación de los híbridos glucoamilasa-SBM en fermentaciones de etanol combustible de 'una etapa'

[0099] El rendimiento relativo de los híbridos glucoamilasa-SBM (TEAN-1, TEAN-3) para glucoamilasa de 15 Talaromyces emersonii pura se evaluó mediante fermentaciones a pequeña escala. Aproximadamente 380 g de maíz molido (molido en un molino de martillos a escala piloto a través de un tamiz de 1,65 mm) se añadieron a aproximadamente 620 g de agua corriente. Esta mezcla se suplementó con 3 ml de penicilina 1 g/l. El pH de este compuesto acuoso se ajustó a 5.0 con un 40 % de H2SO4. El nivel de sólidos secos (DS) se determinó por triplicado como del 32 %. Aproximadamente 5 g de este compuesto acuoso se añadieron a tubos de 15 ml. Las enzimas 20 usadas en este estudio se detallan abajo:

Enzima

Glucoamilasa de T. emersonii purificada

TEAN-1 (híbrido de módulo catalítico de T. emersonii y SBM de A. niger)

TEAN-3 (híbrido de módulo catalítico de T. emersonii y SBM de A. niger)

[0100] Una respuesta a dosis de cuatro dosis se llevó a cabo con cada enzima. Las dosificaciones usadas fueron 0,1, 0,3, 0,6 y 1,0 AGU/g de DS. Se llevaron a cabo seis réplicas de cada tratamiento.

[0101] Después de la dosificación los tubos se inocularon con 0,04 mL/g de propagado de levadura (levadura Red Star™) que se había cultivado durante 22,5 horas sobre puré de maíz. Los tubos se taparon con un tornillo en la parte superior que se había perforado con una pequeña aguja para permitir la liberación de gas y se vortexearon brevemente antes de pesarlos y de la incubación a 32º C. El progreso de fermentación se siguió por el pesado de los

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tubos con el tiempo. Los tubos fueron se vortexearon brevemente antes de pesarlos. Se dejó que las fermentaciones continuasen durante aproximadamente 200 horas. El resultado del experimento se muestra en la Figura 1.

[0102] Se puede observar en la Figura 1 que los dos híbridos TEAN-1, TEAN-3 dieron un rendimiento de etanol 5 significativamente más alto por g de DS que la glucoamilasa de T.emersonii de tipo salvaje.

Ejemplo 3

10 [0103] El rendimiento relativo de los híbridos glucoamilasa-SBM (TEAR-1, TEAR-1) a glucoamilasa de Talaromyces emersonii pura se evaluó mediante fermentaciones a pequeña escala. Aproximadamente 380 g de maíz molido (molido en un molino de martillos a escala piloto a través de un tamiz de 1,65 mm) se añadieron a aproximadamente 620 g de agua corriente. Esta mezcla se suplementó con 3 ml de penicilina de 1g/L. El pH de este compuesto

15 acuoso se ajustó a 5 con un 40 % de H2SO4. El nivel de sólidos secos (DS) se determinó por triplicado como del 32 %. Aproximadamente 5 g de este compuesto acuoso se añadieron a tubos de 15 ml. La respuesta a la dosis se llevó a cabo con cada enzima usando 0,3 AGU/g de DS. Después de la dosificación los tubos se inocularon con 0,04 mUg de puré de propagado de levadura (levadura RED STAR™) que se había cultivado durante 22,5 horas sobre puré de maíz. Los tubos se cubrieron con un tornillo sobre el cual se había perforado con una aguja pequeña para permitir la

20 liberación de gas y se vortexearon brevemente antes de pesarlos y se incubaron a 32º C. El progreso de fermentación fue seguido por el pesado de los tubos con el tiempo. Los tubos se vortexearon brevemente antes de pesarlos. Se dejó que las fermentaciones continuaran durante aproximadamente 70 horas. El resultado del experimento se muestra en la Tabla 1 abajo:

25 Tabla 1

Enzima: Actividad relativa

Glucoamilasa de T. emersonii purificada: 100 %

TEAR-1 (híbrido de módulo catalítico de T. emersonii y SBM de A. rolfii): 250 %

TEAR-2 (híbrido de módulo catalítico de T. emersonii y SBM de A. rolfii): 215 %

[0104] Se puede observar en la Tabla 1 que los dos híbridos TEAR-1, TEAR-2 tienen significativamente más alta que la glucoamilasa de T. emersonii de tipo salvaje.: una actividad relativa

30: LISTADO DE SECUENCIAS

[0105]

35: <110> Borchert, Torben V Danielsen, Steffen Allain, Eric J <120> ENZIMAS HÍBRIDAS

<130> 10554.200-US

40: <160> 99

<170> PatentIn version 3.3

45: <210> 1 <211> 396 <212> DNA <213> Aspergillus kawachii

50: <220> <221> CDS <222> (1) .. (396)

<400> 1

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<210> 2

<211> 131 ,

<212> PRT

<213> Aspergillus kawachii

<400> 2

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<210> 3

<211> 102

<212> PRT

<213> Bacillus flavothermus

<400> 3

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<210> 4

<211> 99

<212> PRT

<213> Bacillus sp.

<400> 4

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10

<210> 5

<211> 102

<212> PRT 15 <213> Alcaliphilic Bacillus

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<400> 5

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5

<210> 6

<211> 112

<212> PRT

<213> Hormoconis resinae

10

<400> 6

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<210> 7

<211> 95

<212> PRT

<213> Lentinula edodes

<400> 7

imagen62

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> Neurospora crassa

<400> 8

imagen63

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<210> 9

<211> 115

<212> PRT

<213> Talaromyces byssochlamydioides

<400> 9

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10

<210> 10

<211> 115

<212> PRT

<213> Geosmithia cylindrospora: 15

<400> 10

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<210> 11

<211> 139

<212> PRT

<213> Scorias spongiosa

<400> 11

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imagen67

<210> 12

<211> 126

<212> PRT

<213> Eupenicillium ludwigii

<400> 12

imagen68

10

<210> 13

<211> 116

<212> PRT

<213> Aspergillus japonicus 15

<400> 13

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5 <210> 14

<211> 133

<212> PRT

<213> Penicillium cf. miczynskii

10 <400> 14

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<210> 15

<211> 116

<212> PRT

<213> Mz1 Penicillium sp.

<400> 15

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<210> 16

<211> 114

<212> PRT

<213> Thysanophora sp

<400> 16

imagen72

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imagen73

<210> 17

<211> 111

<212> PRT

<213> Humicola grisea var. thermoidea

<400> 17

imagen74

10 <210> 18

<211> 108

<212> PRT

<213> Aspergillus niger

15 <400> 18

imagen75

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imagen76

<210> 19

<211> 97

<212> PRT

<213> Aspergillus rolfsii

<400> 19

imagen77

10

<210> 20

<211> 38

<212> PRT

<213> Aspergillus niger 15

<400> 20

imagen78

<210> 21

<211> 31

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<212> PRT

<213> Aspergillus kawachii

<400> 21

imagen79

<210> 22

<211> 8

<212> PRT 10 <213> Artificial

<220>

<223> Artificial

15 <400> 22

imagen80

<210> 23 20 <211> 1605

<212> ADN

<213> Aspergillus niger

<220> 25 <221> CDS

<222> (1)..(1602)

<220>

<221> sig_peptide 30 <222> (1)..(72)

<220>

<221> mat_peptide

<222> (73)..(1602) 35

<400> 23

Claims

REIVINDICACIONES

1. Enzima híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico de origen fúngico que tiene actividad glucoamilasa y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos, donde:

-la secuencia de aminoácidos del módulo catalítico tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias mostradas en SEC ID nº: 24, 25 o 26;

-la secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias mostradas en SEC ID nº: 2 o 18; o difiere de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº: 20 en no más de 10 posiciones de aminoácidos.
2.

Enzima híbrida según la reivindicación 1, donde la secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos deriva de Aspergillus sp, Athelia sp. o Talaromyces sp.
3.

Enzima híbrida según las reivindicaciones 1 o 2, donde la secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos mostrado en la SEC ID nº: 2 deriva de Aspergillus kawachii; y la secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos mostrada en la SEC ID nº: 18 deriva de Aspergillus Niger.
4.

Enzima híbrida según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el módulo catalítico mostrado en la SEC ID nº: 24 deriva de una cepa de Aspergillus Niger o Aspergillus oryzae; el módulo catalítico mostrado en la SEC ID nº: 26 deriva de Athelia rolfsii; y el módulo catalítico mostrada en la SEC ID nº: 25 deriva de Talaromyces emersonii.
5.

Secuencia de ADN que codifica la enzima híbrida de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
6.

Constructo de ADN que comprende la secuencia de ADN de la reivindicación 5.
7.

Vector de expresión que comprende la secuencia de ADN de la reivindicación 5.
8.

Célula huésped transformada con un vector de la reivindicación 7 cuya célula huésped es capaz de expresar la secuencia de ADN de la reivindicación 5.
9.

Uso de una enzima híbrida de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para producir un producto de fermentación o jarabe.
10.

Uso según la reivindicación 9 para producir etanol.

85 86

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