JPH11500003A - 予め決められた性質を有するα−アミラーゼ変異体のデザイン方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 α−アミラーゼ活性を有し且つ親のα−アミラーゼと比較すると少なくとも１つの変更された性質を有する親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体の作製方法であって、ｉ）親のテルマミル様α−アミラーゼの構造を解析してテルマミル様α−アミラーゼ構造の少なくとも１つのアミノ酸残基または少なくとも１つの構造部分を同定し、前記アミノ酸残基または構造部分は親のテルマミル様α−アミラーゼの前記性質を変更するのに適当であると思われ（構造上または機能上の理由に基づいて判断すると）、ii）親のテルマミル様α−アミラーゼと比較すると前記性質を変更するためにｉ）において同定されたアミノ酸残基または構造部分が変更されているテルマミル様α−アミラーゼ変異体を作製し、そしてiii）得られたテルマミル様α−アミラーゼ変異体を問題の性質について試験することを含んで成る方法。

Description

【発明の詳細な説明】 予め決められた性質を有するα−アミラーゼ変異体のデザイン方法 発明の分野 本発明は、予め決められた性質を有するα−アミラーゼ変異体の新規デザイン 方法に関し、該方法は細菌α−アミラーゼの今まで未知であった三次元構造に基 づく。 発明の背景 α−アミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、EC 3.2 .1.1）は、デンプン並びに他の直鎖および枝分かれ鎖１，４−グルコシドオリゴ 糖および多糖を加水分解することができる酵素の１群を構成する。研究されたほ とんど全てのα−アミラーゼは、ほぼ同じ長さと間隔を有する数個の保存領域を 有する。それらの領域のうちの１つはカルモジュリンのCa²⁺結合部位に似ており 、その他のものは活性中心および／または基質の結合に必要であると思われる。 多数のα−アミラーゼのアミノ酸配列および一次構造が知られているけれども 、全α−アミラーゼの三次元構造を決定することは非常に難しいと判明した。三 次元構造はα−アミラーゼ結晶のＸ線結晶学解析により決定できるが、構造を実 際に解明するのに適当なα−アミラーゼ結晶を得ることは非常に困難であるとわ かった。 今まで高分解能で決定されているのは数種類類のα−アミラーゼの三次元構造 だけである。それらとしては、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae） TAKAα−アミラーゼの構造（Swift他，1991）、アスペルギルス・ニガー（Asper gillus niger ）酸アミラ ーゼの構造（Brady他，1991）、ブタ膵臓α−アミラーゼの構造（Qian他，1993 ）、および大麦α−アミラーゼの構造（Kadziola他，1994，Journal of Molecul ar Biology 239: 104-121，A．Kadziola，Thesis，Dept．of Chemistry，U．of Copenhagen，Denmark）が挙げられる。更に、バシラス・サーキュランス（Bacil lus circulans ）シクロデキストリングルコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴア ーゼ）の三次元構造が既知である（Klein他，1992）（Lawson他，1994）。ＣＧ Ｔアーゼはα−アミラーゼと同じ型の反応を触媒し、そしてα−アミラーゼとの 幾らかの構造類似性を示す。 更に、Ｂ．サチリス（B. subtilis）α−アミラーゼの結晶化と予備的Ｘ線研 究が記載されている〔Chang他（1992）およびMizuno他（1993）〕。最終的なＢ ．サチリスα−アミラーゼ構造は報告されていない。同様に、Ｂ．リヘニフォル ミス（B ．licheniformis）α−アミラーゼ結晶の調製も報告されている（Suzuki 他，1990）けれども、Ｘ線結晶学分析または三次元構造に関するその後の報告は まだない。 幾つかの研究チームが上記の既知α−アミラーゼ構造に基づいて三次元構造を 組み立てようと試みている。例えば、Vihinen他（J.Biochem．107，267-272，19 90）は、TAKAアミラーゼ構造を基にバシラス・ステアロサーモフィラス（Bacill us stearothermophilus ）α−アミラーゼの三次元構造の模型製作（またはコン ピューターシュミレーション）を開示している。この模型を使ってＢ．ステアロ サーモフィラスα−アミラーゼの様々な部位特異的突然変異の仮想的構造結果を 調査した。E.A．MacGregor（1987）は、Ａ．オリゼのTAKAα−アミラーゼの既知 構造および二次構造推定演算法を基にして大麦、ブタ膵臓およびバシラス・アミ ロリクファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）を含む異なる源からのα− アミラ ーゼ中のαヘリックスとβバレルの存在を推定している。更に、例えばＢ．アミ ロリクファシエンスα−アミラーゼ中に存在を見つけることができる可能なルー プおよびサブサイトを推定している（Ａ．オリゼ配列および構造との比較に基づ いて）。 A.E．MacGregor〔Starch/Starke 45(1993)，No.7，p.232-237〕は、α−アミ ラーゼ関連酵素の構造と活性との関係を概説している。 今まで、Ｂ．リヘニフォルミス、Ｂ．アミロリクファシエンスおよびＢ．ステ アロサーモフィラスのα−アミラーゼを包含する産業上有用なバシラスα−アミ ラーゼ（本明細書中では「テルマミル様α−アミラーゼ」と呼称する）について の三次元構造は全く入手可能でない。 発明の簡単な開示 たった今解明した。前記構造の解析に基づいて、構造上または機能上の理由から テルマミル様α−アミラーゼに様々な性質を付与するのに重要と思われる構造部 分または特定のアミノ酸残基を同定することが可能である。更に、テルマミル様 α−アミラーゼ構造を上述の真菌および哺乳類α−アミラーゼの既知構造と比較 すると、それらの構造間に幾つかの類似性が存在すること、しかしまたα−アミ ラーゼ間に幾つかの顕著であるが以前に推定されなかった構造的相違性も存在す ることを発見した。本発明はそれらの発見に基づく。 従って、第一の面では、本発明は親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体の 作製方法であって、前記変異体はα−アミラーゼ活性を有し、且つ前記親のα− アミラーゼと比較すると少なくとも１つの変更された性質を有し、 ｉ）テルマミル様α−アミラーゼ構造の少なくとも１つのアミノ 酸残基または少なくとも１つの構造部分を同定することを目指してテルマミル様 α−アミラーゼの構造を解析し、ここで前記アミノ酸残基または構造部分は親の テルマミル様α−アミラーゼの前記性質を変更するのに妥当であると思われ（構 造上または機能上の理由に基づいて判断すると）、 ii）親のテルマミル様α−アミラーゼと比較すると、前記性質を変更するため にｉ）において同定されたアミノ酸残基または構造部分が変更されているテルマ ミル様α−アミラーゼ変異体を作製し、そして iii）得られたテルマミル様α−アミラーゼ変異体を前記性質について試験す る ことを含んで成る方法に関する。 第二の面では、本発明は、親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体の作製方 法であって、前記変異体はα−アミラーゼ活性を有し、且つ前記親のα−アミラ ーゼと比較すると１または複数の変更された性質を有し、 ｉ）テルマミル様α−アミラーゼの三次元構造を非テルマミル様α−アミラー ゼの構造と比較し、 ii）非テルマミル様α−アミラーゼ構造とは異なるテルマミル様α−アミラー ゼ構造の部分を同定し、そして iii）ii）において同定されたテルマミル様α−アミラーゼの部分を変更し、 それにより１または複数の性質が親のテルマミル様α−アミラーゼとは異なるテ ルマミル様α−アミラーゼ変異体を得る ことを含んで成る方法に関する。 第三の面では、本発明は親の非テルマミル様α−アミラーゼの変異体の作製方 法であって、前記変異体はα−アミラーゼ活性を有し且つ前記親のα−アミラー ゼと比較すると１または複数の変更され た性質を有し、 ｉ）非テルマミル様α−アミラーゼの三次元構造をテルマミル様α−アミラー ゼの構造と比較し、 ii）テルマミル様α−アミラーゼ構造とは異なる非テルマミル様α−アミラー ゼ構造の部分を同定し、そして iii）ii）において同定された非テルマミル様α−アミラーゼの部分を変更し 、それにより１または複数の性質が親の非テルマミル様α−アミラーゼとは異な る非テルマミル様α−アミラーゼ変異体を得る ことを含んで成る方法に関する。 本発明の上記方法によって変更することができる性質は、例えば基質特異性、 基質結合性、基質開裂パターン、温度安定性、ｐＨ依存活性、ｐＨ依存安定性〔 特に低（例えばｐＨ＜６、特にｐＨ＜５）または高（例えばｐＨ＞９）ｐＨ値で 増加された安定性〕、酸化に対する安定性、Ca²⁺依存性、比活性、および着目の 他の性質であることができる。例えば、変更は、親のテルマミル様α−アミラー ゼに比較すると所定のｐＨで増加された比活性および／または変更された基質特 異性を有する変異体を生成することができる。 更に別の面では、本発明はテルマミル様α−アミラーゼの変異体、そのような 変異体をコードするＤＮＡ、および該変異体の調製方法に関する。最後に、本発 明は様々な産業上の目的での前記変異体の使用に関する。 発明の具体的開示テルマミル様α−アミラーゼ バシラス種により生産される多数のα−アミラーゼがアミノ酸レベルで高度に 相同であることは周知である。例えば、配列番号２に 示されるアミノ酸配列を含んで成るＢ．リヘニフォルミス 登録商標）として市販されている〕は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含 んで成るＢ．アミロリクファシエンス（B ．amyloliquefaciens）α−アミラーゼ と約89％相同であり、そして配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んで成るＢ ．ステアロサーモフィラス（B. stearothermophilus）α−アミラーゼと約79％ 相同であることがわかっている。他の相同α−アミラーゼとしては、バシラス種 NCIB 12289，NCIB 12512，NCIB 12513またはDSM 9375の株に由来するα−アミラ ーゼ（それらは全てWO 95/26397中に詳細に記載されている）およびTsukamoto他 ，1988，Biochemical and Biophysical Research Communications, 第151巻， 第１号により記載されたα−アミラーゼが挙げられる。更に別の相同α−アミラ ーゼとしては、EP 252 666中に記載されたＢ．リヘニフォルミス（B ．lichenifo rmis ）（ATCC 27811）により生産されるα−アミラーゼ、並びにWO 91/00353お よびWO 94/18314において同定されたα−アミラーゼが挙げられる。他の市販の テルマミル様Ｂ．リヘ それらのα−アミラーゼ間に見られる実質的な相同性のため、それらはα−ア ミラーゼの同一クラス、すなわち「テルマミル様α−アミラーゼ」のクラスに属 すると考えられる。 従って、本明細書中では、「テルマミル様α−アミラーゼ」とい ォルミスα−アミラーゼ、配列番号２）に対して実質的相同性を示 すα−アミラーゼを意味するためのものである。言い換えれば、テルマミル様α −アミラーゼは、本明細書中の配列番号２，４もしくは６に示されるアミノ酸配 列、またはWO 95/26937中のもしくはTsuKamoto他，1988中の配列番号１もしくは ２に示されるアミノ酸配列を有するか、またはｉ）前記アミノ酸配列の少なくと も１つと少なくとも60％、例えば少なくとも70％、例えば少なくとも75％、また は少なくとも80％、例えば少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも 95％の相同性を示し、そして／またはii）前記α−アミラーゼの少なくとも１つ に対して惹起された抗体と免疫学的交差反応性を示し、そして／またはiii）本 明細書の配列番号１，３および５から並びにWO 95/26397の配列番号４および５ から、それぞれ明らかである上記α−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列にハイ ブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされる、α−アミラーゼである。 性質ｉ）に関連する「相同性」は、任意の常用の演算法を使うことにより、好 ましくはＧＡＰペナルティーとして省略時の値を使うＧＣＧパッケージバージョ ン7.3からのＧＡＰプログラム（1993年６月）〔Genetic Computer Group（1991 ）Programme Manual for the GCG Package，version 7，575 Science Drive，Ma dison，Wisconsin USA 53711〕を使うことにより、決定することができる。 α−アミラーゼの性質ii）、即ち免疫学的交差反応性は、関連するテルマミル 様α−アミラーゼに対して惹起されたまたはそれの少なくとも１つのエピトープ と反応性である抗体を使ってアッセイすることができる。モノクローナルでもポ リクローナルでもよい抗体は、当業界で既知の方法により、例えばHudson他，19 89により記載された通りに、生産せしめることができる。免疫学的交差反応性は 当業界で既知のアッセイを使って、例えばHudson他，1989により記 載された通りに測定することができ、その例はウエスタンブロット法または放射 状免疫拡散アッセイである。この点について、それぞれ配列番号２，４および６ のアミノ酸配列を有するα−アミラーゼ間の免疫学的交差反応性が認められた。 性質iii）に従ってテルマミル様α−アミラーゼの特徴付けに使われるオリゴ ヌクレオチドプローブは、問題のα−アミラーゼの完全または部分ヌクレオチド 配列またはアミノ酸配列に基づいて適当に調製することができる。ハイブリダイ ゼーションを試験する際の適当な条件は、５×ＳＳＣ中での予備浸漬と、20％ホ ルムアミド、５×デンハーツ溶液、50mM リン酸ナトリウム，pH6.8および50μg の超音波処理済変性子ウシ胸腺ＤＮＡを含む溶液中での約40℃で１時間のプレハ イブリダイゼーション、次いで100μM ATPが補足された同一溶液中での約40℃で の18時間のハイブリダイゼーション、または例えばSambrook他，1989により記載 された別の方法を含んで成る。 本明細書中、「〜に由来する」という語は、問題の生物の株により生産される かまたは生産可能であるα−アミラーゼだけでなく、そのような株から単離され たＤＮＡ配列によりコードされそして前記ＤＮＡ配列により形質転換された宿主 生物中で生産されるα−アミラーゼも指すために使われる。最後に、この用語は 合成および／またはｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によりコードされ且つ問題のα− アミラーゼの識別特徴を有するα−アミラーゼを表すために使われる。この用語 は親のα−アミラーゼが天然に存在するα−アミラーゼの変異体、即ち天然に存 在するα−アミラーゼの１または複数のアミノ酸残基の変更（挿入、置換、削除 ）の結果である変異体であってもよいことを表すものでもある。親のハイブリッドα−アミラーゼ 親のα−アミラーゼ（テルマミル様または非テルマミル様α−アミラーゼであ る）はハイブリッドα−アミラーゼであってもよく、即ち、少なくとも２つのα −アミラーゼに由来する部分アミノ酸配列の組合せを含んで成るα−アミラーゼ であってもよい。 親のハイブリッドα−アミラーゼは、アミノ酸相同性および／または免疫学的 交差反応性および／またはＤＮＡハイブリダイゼーション（上で定義した通り） に基づいて、テルマミル様α−アミラーゼファミリーに属すると決定できるもの であってもよい。この場合、ハイブリッドα−アミラーゼは典型的には、テルマ ミル様α−アミラーゼの少なくとも１部分と、微生物（細菌または真菌）および ／または哺乳類起源のテルマミル様α−アミラーゼまたは非テルマミル様α−ア ミラーゼから選ばれた１または複数の別のα−アミラーゼの１もしくは複数の部 分とから構成される。 よって、親のハイブリッドα−アミラーゼは、少なくとも２つのテルマミル様 α−アミラーゼの組合せ、または少なくとも１つのテルマミル様α−アミラーゼ と少なくとも１つの非テルマミル様細菌α−アミラーゼの組合せ、または少なく とも１つのテルマミル様α−アミラーゼと少なくとも１つの真菌α−アミラーゼ の組合せ、を含んで成ることができる。例えば、親のα−アミラーゼは、Ｂ．リ ヘニフォルミスの株に由来するα−アミラーゼのＣ末端部分と、Ｂ．アミロリク ファシエンスの株またはＢ．ステアロサーモフィラスの株に由来するα−アミラ ーゼのＮ末端部分とを含んで成る。例えば親のα−アミラーゼは、Ｂ．リヘニフ ォルミスα−アミラーゼのＣ末端部分の少なくとも430アミノ酸残基を含んで成 り、そして例えば(a)配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＢ．アミロリ クファシエンスα−アミラーゼの37個のＮ末端アミノ酸残基に相当する アミノ酸セグメンと配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＢ．リヘニフォ ルミスα−アミラーゼの445個のＣ末端アミノ酸残基に相当するアミノ酸セグメ ント、または(b)配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＢ．ステアロサー モフィラスα−アミラーゼの68個のＮ末端アミノ酸残基に相当するアミノ酸セグ メントと配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＢ．リヘニフォルミスα− アミラーゼの415個のＣ末端アミノ酸残基に相当するアミノ酸セグメントを含ん で成ることができる。 同様に、親のハイブリッドα−アミラーゼは非テルマミル様α−アミラーゼ群 、例えばフンガミル（Fungamyl）様α−アミラーゼ群に属してもよい。この場合 、ハイブリッドは非テルマミル様α−アミラーゼ群に属するα−アミラーゼの少 なくとも１部分と共に、別のα−アミラーゼに由来する１または複数の部分を含 んで成ることができる。三次元テルマミル様α−アミラーゼ構造 本発明の基礎をなす三次元構造を解明するのに使ったテルマミル様α−アミラ ーゼは、Ｂ．アミロリクファシエンスα−アミラーゼ（配列番号４に示されるア ミノ酸配列を有する）の300個のＮ末端アミノ酸と、配列番号２のアミノ酸配列 を有するＢ．リヘニフォルミスα−アミラーゼのアミノ酸301-483とから成る。 細菌α−アミラーゼは「テルマミル様α−アミラーゼファミリー」に属し、その 構造は任意のテルマミル様α−アミラーゼの構造を代表すると考えられる。 α−アミラーゼの構造は“X-Ray Structure Determination”，Stout，G.K． およびJensen，L.H.，John Wiley & Sons，Inc.，NY，1989に記載されたＸ線結 晶学方法の原理に従って解析した。同形置換法を使った分解能2.2Åでのα−ア ミラーゼの解析結晶構造につ いての構造座標を、標準ＰＤＢフォーマット（Brookhaven Protein Data Base） において付録１に与える。 該酵素のアミノ酸残基は三文字アミノ酸記号（大文字）により表記される。 α−アミラーゼ構造は配列に関して規則正しいＡ，ＢおよびＣの３つの球状ド メインから構成され、該ドメインはＢ，Ａ，Ｃの順序で直線にほぼ沿って存在す る。それらのドメインはドメインＡが残基１〜103と206〜395、ドメインＢが残 基104〜205、ドメインＣが残基396〜483であると定義することができ、ここでア ミノ酸の番号はＢ．リヘニフォルミスα−アミラーゼに対するものである。これ は縦に伸びた分子を与え、最長の軸は約85Åである。この軸と垂直をなす最も遠 く離れた地点は約50Åであり、中央のＡドメインにかかる。Ｂ．リヘニフォルミ スα−アミラーゼ（配列番号２）の活性部位残基はD323，D231およびE261である 。 ドメインＡ ドメインＡは最大ドメインであり、活性部位を含む（酵素表面にある深い窪み （claft）の底に位置する３アミノ酸残基のクラスターから成る）。全ての既知 α−アミラーゼ構造のドメインＡが同一の全体的折り畳み、即ち８本の中心β鎖 （番号１〜８）と８つの隣接αヘリックスから成る（β／α）８バレルを有する 。βバレルはMcGregor（前掲）により限定される。β鎖１のＣ末端はループ１と 称するループによりヘリックス１に連結され、同一パターンが他のループにも見 られる。それらのループはサイズに幾らかの変動があり、或るものは非常に広範 囲であり得る。 （β／α）８バレル中の８本の中心β鎖は、様々な既知α−アミラーゼ構造間 で良く重なり、β鎖のＣ末端に位置する活性部位近くの周囲を含むこの構造部分 は、異なるアミラーゼ間で高い類似性を 示す。 β鎖とαヘリックスとをつなぐループは、α−アミラーゼ間で高い多様性を示 す。これらのループは活性部位の構造的環境を構成し、そして基質との接触の大 部分はそれらのループ中に存在するアミノ酸残基の中に認められる。基質特異性 、基質結合性、ｐＨ／活性プロフィール、デンプン開裂パターンのような重要な 特性は、これらのループ中のアミノ酸およびその位置により決定される。 本明細書中に開示されるテルマミル様α−アミラーゼ構造とフンガミル様α− アミラーゼ構造との間の実質的相違性は、ループ１，２，３および８において認 められ、これは図面において見ることができる。 ドメインＢ テルマミル様α−アミラーゼ構造はドメインＡのループ３中に特殊なドメイン 構造（ドメインＢとも呼ばれる）を含んで成ることがわかった。テルマミル様α −アミラーゼのＢドメインの構造は、既知のα−アミラーゼまたは（β／α）８ バレルタンパク質のいずれにも今まで見たことがない。 ドメインＢ構造は非常に多数の荷電残基を有する非常にコンパクトな領域であ る。ドメインＢはドメインＡの鎖３とヘリックス３の間のループの延長として存 在し（図７参照）、そして少なくとも１つの長いループを含み且つ-1，+3，-1X ，+2の結合度（Richardson，1981，Adv．Protein Chem．34，167-339）を有する ５連の非平行β−シート構造を含む。 Ｂドメインの最初の４本の鎖は一組の交差した指のように互いの周りにねじれ た２つのヘアピンループを形成する（右巻き）。主鎖は２つの小さなβシート構 造をつなぐβ鎖に折り畳まれる。１シートで１回のターンを形成した後、それが 反対に折り畳まれ、そして ドメインＡと接触した２連シートおよびα−アミラーゼ構造の内部孔を構築する 。次いで主鎖は最初の２つのシートに対してほぼ直角をなして小さなシート構造 に折り畳まれる。β鎖３の最上部にヘリックス３が入る前に、ドメインＢの最後 の約24個のアミノ酸がドメインＡへの接触領域に２つのカルシウム結合部位を形 成する。 ドメインＢは、ドメイン−ドメイン接触領域を２つに分割する２本のペプチド 鎖によりドメインＡとつながれる。ドメインＢはカルシウム結合領域と内部に埋 もれた水を含む孔によりドメインＡと接触している。様々なタイプの分子接触が 存在する。酸性アミノ酸と塩基性アミノ酸間のイオン的相互作用が可能であり、 それらの相互作用は高ｐＨでの安定性におよびカルシウム結合部位を無傷のまま 維持するのに非常に重要である。 ドメインＣ ドメインＣはアミノ酸394〜483から成るタンパク質のＣ末端部分である。ドメ インＣは、単一の８連シート構造を形成するβ鎖からもっぱら成り、それはそれ 自身の上に逆方向に折り畳まれ、従ってβサンドイッチ構造として説明すること もできる。結合度は+1，+1，+5，-3，+1，+1，-3であるが、鎖６と７はゆるくし か結合されない。βシートの一部はドメインＡとの界面を構成する。 Ca結合およびNa結合部位 テルマミル様α−アミラーゼの構造は、それが４つのカルシウム結合部位と１ つのナトリウム結合部位を示すという点で注目すべきである。言い換えれば、４ つのカルシウムイオンと１つのナトリウムイオンが構造中に存在することがわか り、ただし１つのカルシウムイオンは非常に弱い配位を示す。２つのカルシウム イオンがドメインＡとＢの接点に存在する３つのイオンの直線状クラスターの一 部を構成し、中心イオンはナトリウムだとされる。 ドメインＡとＢの間のカルシウムイオンに配位する残基は次の通りである（本 明細書中の付録１に見られるPdbファイルの中のアミノ酸残基および原子のPdbフ ァイル命名法を使用する）：活性部位に最も近いカルシウムイオン（Pdbファイ ル中のIUM 502）には、His235とAsp194からの骨格カルボニル、残基Asp194，Asn 102およびAsp200からの側鎖原子OD1、並びに１水分子WAT X3（原子OW7）。ドメ インＡとＢの間のもう１つのカルシウムイオン（IUM 502）への配位子：Asp204 とAsp159からの原子OD2、Asp183とAla181からの骨格カルボニル、Asp202からの 原子OD1、並びに１水分子WAT X7（原子 OW7）。ナトリウムイオン（IUM 505）の 場合の結合部位はAsp 194，Asp200，Asp183およびAsp159からの原子OD2、並びに Val201からの骨格カルボニルを含む。 １つのカルシウムイオンがドメインＡとＣの間に位置し、別の１つがドメイン Ｃに位置する。最もよく配位されるものでもある最初に言及したカルシウムイオ ン（IUM 503）は、Gly300，Tyr302およびHis406からのカルボニル骨格、Asp430 からの原子OD2/OD1、Asp407からの原子OD1、および１つの水分子WAT X6（原子 O W7）を配位する。他方の非常に弱く配位されるカルシウム部位（IUM 504）は、 ４つの水分子WAT X21（原子OW8）、X6（原子 OW6）、X9（原子 OW0）およびX28 （原子 OW8）、Glu447からのOE1/OE2並びにAsn444からのOD1を含んで成る。 基質結合部位 いずれかの理論に限定されることなく、現在のところ基質分子と該酵素との好 ましい相互作用（例えば水素結合および／または強力な静電気的相互作用）は、 酵素に結合した時に基質の４Åの範囲内で認められると思われる。配列番号２に 示されるアミノ酸配列を有するＢ．リヘニフォルミスα−アミラーゼの下記残基 が基質の４Å の距離内にあると予想され、従って基質との相互作用に関係していると思われる ： 基質の４Åの距離内にあると予想される別のテルマミル様α−アミラーゼのア ミノ酸残基は、配列番号２のアミノ酸配列とその別のテルマミル様α−アミラー ゼのアミノ酸配列とを整列させ、それによって上記に同定したものと同等な位置 を同定することにより、容易に同定することができる。構造の一般性 種々のテルマミル様α−アミラーゼ間に高い相同性があるために、付録１の座 標により明らかにされた解析構造は、全てのテルマミル様α−アミラーゼの構造 を代表するものであると考えられる。他のテルマミル様α−アミラーゼの模型構 造は、それぞれのアミノ酸配列間の整列を使って付録１に記載の座標を基にして 問題のα−アミラーゼに応用することにより容易に組み立てることができる。模 型構造の作製は実施例１に例示される。 上記で同定されたテルマミル様α−アミラーゼ構造の構造的に特徴のある部分 （Ca結合部位、基質結合部位、ループなど）は、関連するテルマミル様α−アミ ラーゼの模型（または解析）構造に基づいてまたは単にそれぞれの構造要素のア ミノ酸残基を同定するために本明細書中で使われるＢ．リヘニフォルミスα−ア ミラーゼのアミノ酸配列と問題のテルマミル様α−アミラーゼのアミノ酸配列と の整列に基づいて、別のテルマミル様α−アミラーゼ中に容易に同定することが できる。 更に、特定のテルマミル様α−アミラーゼの特定のアミノ酸残基の変更により 定義される本発明のテルマミル様変異体については、同等の位置（それぞれの配 列間の最良の可能なアミノ酸配列整列から決定した時）で変更された別のテルマ ミル様α−アミラーゼの変異体もその上包含されると解釈されるだろう。よって 、特定のα−アミラーゼの構造部分を限定する目的でアミノ酸残基が同定される のかまたはα−アミラーゼの変異体を同定するためにアミノ酸残基が使われるの かに関係なく、このアミノ酸残基はいずれかの他のテルマミル様α−アミラーゼ の同等アミノ酸残基を表すものと見なすべきである。 新規α−アミラーゼ変異体のデザインのための本発明の方法 本発明の第一、第二および第三の面に従った方法では、「テルマミル様α−ア ミラーゼの構造」および「テルマミル様α−アミラーゼ構造」という語は、付録 １に与えられた座標により限定された解析構造またはその解析構造を基に作られ た特定のテルマミル様α−アミラーゼ（例えばＢ．リヘニフォルミスα−アミラ ーゼ）の模型構造を意味するものである。 ほとんどの場合、本発明に従って変更する予定の親のテルマミル様α−アミラ ーゼは、実際に構造解析に使ったα−アミラーゼ（付録１）とは異なる。これは 、本発明の第一、第二または第三の面に従った方法の段階ｉ）で解析構造（付録 １）中に同定された１もしくは複数のアミノ酸残基または１もしくは複数の構造 部分を、問題の親のテルマミル様α−アミラーゼの対応する１もしくは複数のア ミノ酸残基または１もしくは複数の構造部分に置き換えなければならないことを 意味する。「置き換え（translation）」は便利には、構造解析に使ったテルマ ミル様α−アミラーゼのアミノ酸配列と問題の親のテルマミル様α−アミラーゼ のアミノ酸配列とのアミノ酸 配列整列に基づいて行われる。 本発明の第一、第二および第三の面のそれぞれに従った方法の段階ｉ）で実施 する解析または比較は、タンパク質構造を解析および／または比較することがで きる任意の適当なコンピュータープログラム、例えばBiosym Technologies，Inc ．より入手可能なコンピュータープログラムInsightを使って実施することがで きる。例えば、構造比較の基本原理は、比較しようとする三次元構造を二次構造 要素（例えばバレル中の中心の８本のβ鎖）の整列に基づいて重ね合わせ、続い て重ね合わせた構造から構造間で異なる部分を容易に決定することができるとい うものである。 本発明の第一、第二および第三の面の方法の段階ｉ）で同定される構造部分は 、１アミノ酸残基から成ってもよい。しかしながら、通常は該構造部分は複数の アミノ酸残基を含んで成り、典型的にはテルマミル様α−アミラーゼ構造の上記 部分のうちの１つ、例えばＡ，ＢまたはＣドメインのうちの１つ、それらの領域 のいずれかの界面、カルシウム結合部位、ループ構造、基質結合部位などを構成 する複数のアミノ酸残基を含んで成る。 本明細書中の「構造または機能上の理由」という言い方は、関連する構造また は構造部分の解析および酵素の機能に対するそれの予期される影響に基づいて変 更が行われることを表すつもりである。よって、現在までに明らかになっている 様々なα−アミラーゼの構造の分析を、所望によりそれらのα−アミラーゼ間の 機能的相違の分析と組み合わせて、α−アミラーゼの或る性質がα−アミラーゼ 構造の或る部分にあると指定するためにまたはそのような関係を予想するために 使うことができる。例えば、活性部位の周りのループのパターンまたは構造の相 違は、基質の活性部位への近づきやすさの相違を引き起こし、従って基質特異性 および／または開裂パター ンの相違を引き起こし得る。更に、基質結合（およびその結果として例えば特異 性／開裂パターン）、カルシウムまたはナトリウムイオン結合（例えば酵素のカ ルシウム依存性に重要である）などに関係するかまたは関係すると思われるテル マミル様α−アミラーゼの部分が同定された（下記参照）。 アミノ酸残基または構造部分の変更は、典型的には問題の親酵素をコードする ＤＮＡ配列の適当な変更により達成される。本発明の第一の面の方法の段階ii） において使われるような「変更された」という語は、次の意味を有する：アミノ 酸残基に関して使われる時、この用語は問題のアミノ酸残基から別のアミノ酸残 基への置換を意味する。構造部分に関して使われる時、この用語は前記構造部分 の１もしくは複数のアミノ酸残基の置換、前記部分への１もしくは複数のアミノ 酸残基の付加、または前記構造部分の１もしくは複数のアミノ酸残基の削除を意 味する。 着目の変異体の作製は、変異体を製造する助けとなる条件下で、該変異体をコ ードするＤＮＡ配列を含んで成る微生物を培養し、続いて所望により得られた培 養ブロスから該変異体を回収することにより達成される。これについては下記に 詳細に記載する。 本発明の第一の面 本発明の第一の面の方法の好ましい態様によれば、変更しようとする親酵素の 性質はカルシウム依存性、基質結合、開裂パターン、ｐＨ依存活性などから選択 される。親のテルマミル様α−アミラーゼの上記性質を変更する方法の特定の例 を下記に与える。 別の好ましい態様では、変更しようとする親のテルマミル様α−アミラーゼは Ｂ．リヘニフォルミスα−アミラーゼである。 本発明の第二および第三の面 本発明の第二および第三の面の方法の重要な利点の１つは、テル マミル様α−アミラーゼの構造（または構造部分）を非テルマミル様α−アミラ ーゼの構造（または構造部分）に変えることとその逆のことが可能であることで ある。例えば、非テルマミル様α−アミラーゼの特定性質の原因となるまたはそ れに寄与すると思われる非テルマミル様α−アミラーゼのループ構造を同定する ことにより、テルマミル様α−アミラーゼの対応構造を前記非テルマミル様α− アミラーゼ構造で置き換え、またはもしテルマミル様α−アミラーゼ中に対応構 造が存在しないなら、関連部分に関係する限り、結果として得られる変異体テル マミル様α−アミラーゼが非テルマミル様α−アミラーゼの対応部分に似るよう にして、テルマミル様α−アミラーゼ中に前記構造を挿入することが可能である 。非テルマミル様α−アミラーゼの対応部分に似るように親のテルマミル様α− アミラーゼの２以上の部分を変更すると、テルマミル様α−アミラーゼ変異体の 非テルマミル様α−アミラーゼへの類似性を増加させることができ、従って前記 変異体の性質を前記非テルマミル様α−アミラーゼの性質の方向に変えることが 可能である。ループの変更が下記により詳細に記載される。 典型的には、本発明の第二の面の方法の段階iii）で実施される変更は、親の α−アミラーゼの前記部分の構造を非テルマミル様α−アミラーゼの対応部分に 改造するために、変更しようとするテルマミル様α−アミラーゼの部分の１また は複数のアミノ酸残基を削除することにより；変更しようとするテルマミル様α −アミラーゼの部分の１または複数のアミノ酸残基を非テルマミル様α−アミラ ーゼ中の対応位置にあるアミノ酸残基で置換することにより；または非テルマミ ル様α−アミラーゼ中に存在する１または複数のアミノ酸残基をテルマミル様α −アミラーゼ中の対応位置に挿入することにより、達成される。第三の面の方法 については、変更はテルマミ ル様α−アミラーゼではなくて非テルマミル様α−アミラーゼに対して同様に実 施されると理解することができる。 本発明の第二または第三の面の方法の段階ii）では、同定しようとする酵素の 部分は、好ましくは折り畳まれた酵素において基質と接触する（「基質結合部位 」という項目中の上記開示を参照のこと）かまたは基質特異性および／または開 裂パターンに関係すると思われる部分、および／またはカルシウムもしくはナト リウムイオンの１つと接触している部分、および／または酵素のｐＨもしくは温 度分布に貢献している部分、またはさもなければ構造上もしくは機能上の理由か ら、テルマミル様α−アミラーゼと非テルマミル様α−アミラーゼの１もしくは 複数の性質の相違の原因であると考えられる部分である。 非テルマミル様α−アミラーゼ 本発明の第二の面の方法の段階ｉ）で比較が行われそして本発明の第三の面の 方法では親のα−アミラーゼである非テルマミル様α−アミラーゼは、テルマミ ル様α−アミラーゼ（上記で定義したような）の群に属さず、且つその結果とし て、異なる三次元構造を有する任意のα−アミラーゼであることができる。更に 、非テルマミル様α−アミラーゼは、本発明を実施する時点で、明らかであるか または予想される三次元構造を有するものであるべきである。 非テルマミル様α−アミラーゼは、例えば、真菌α−アミラーゼ、哺乳類もし くは植物α−アミラーゼ、または細菌α−アミラーゼ（テルマミル様α−アミラ ーゼとは異なる）であることができる。そのようなα−アミラーゼの特定例とし ては、アスペルギルス・オリゼTAKAα−アミラーゼ、Ａ．ニガー酸α−アミーゼ 、バシラス・サチリスα−アミラーゼ、ブタ膵臓α−アミラーゼおよび大麦α− アミラーゼが挙げられる。それらのα−アミラーゼは全て、本明細書 中に示されるようなテルマミル様α−アミラーゼの構造と明らかに異なる明瞭な 構造を有する。 上述の真菌α−アミラーゼ、すなわちＡ．ニガーおよびＡ．オリゼ由来のα− アミラーゼは、アミノ酸レベルで高度に相同であり、一般に同じ部類（ファミリ ー）のα−アミラーゼに属すると考えられる。本明細書中、この部類は「フンガ ミル様α−アミラーゼ」と れているアスペルギルス・オリゼ由来の真菌α−アミラーゼおよびＡ．ニガーα −アミラーゼに対して高い相同性、即ち70％以上、例えば80％の相同性（上記に 定義した通り）を示すα−アミラーゼを意味する。 テルマミル様α−アミラーゼのα−アミラーゼ構造の包括的説明および前記構 造とフンガミル様α−アミラーゼの構造との比較から、それら２つの構造間に大 きな相違点が存在することは明白である。本発明の方法では、フンガミル様α− アミラーゼと大きな相違を有する領域に属する親のテルマミル様α−アミラーゼ の部分を変更することが特に重要である。特に、親のα−アミラーゼの次のルー プのうちの１つまたは複数：ループ１、ループ２、ループ３および／またはルー プ８において親のテルマミル様α−アミラーゼを変更することが着目される。 本発明の第三の面の方法では、親の非テルマミル様α−アミラーゼのループ１ 、ループ２、ループ３および／またはループ８を変更してテルマミル様α−アミ ラーゼ（例えばテルマミル）の同様なループに一層類似させることが特に着目さ れる。 下記において、本発明の方法を使ってデザインした特定の形の変異体を記載す る。ループ変異 親のα−アミラーゼの基質特異性を変更するためには、ループ変異を考えるこ とが適当である。例えばテルマミル様α−アミラーゼの１または複数のループ構 造を非テルマミル様α−アミラーゼ（例えばフンガミル様α−アミラーゼ）の対 応する１または複数のループ構造とより類似したものに変更すると、基質特異性 を非テルマミル様α−アミラーゼの基質特異性の方向に変更することが可能であ ると期待される。下記に様々な型の着目のループ変異を列挙する。該変異体は変 更された基質特異性に加えて他の変更された性質を有してもよいと理解されるだ ろう。特定のテルマミル様α−アミラーゼについて同定された下記変更は別のテ ルマミル様α−アミラーゼの別の同等位置での対応する変更も包含するものであ ることは理解されるだろう。更に、ループ変異が例えばテルマミル様α−アミラ ーゼ中の完全なループ構造またはそれの実質的部分を非テルマミル様α−アミラ ーゼ中の対応するループ構造（またはそれの実質的部分）に置換することを含む ことも理解されるだろう。ループ２変異 一態様では、本発明は親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であって、配 列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸断片44〜57に相当する断片（すなわちループ ２）中に存在する親のα−アミラーゼの少なくとも１つのアミノ酸残基が削除さ れているかまたは配列番号10に示されるアミノ酸配列のアミノ酸断片66〜84に相 当する断片中に存在する１もしくは複数のアミノ酸残基により置換されているか 、あるいは鋳型として配列番号10の関連部分または別のフンガミル様α−アミラ ーゼの対応部分を使って１もしくは複数の追加のアミノ酸残基が付加されている 変異体に関する。 配列番号10に示されるアミノ酸配列は、Ａ．オリゼ（A. oryzae） α−アミラーゼ、すなわちフンガミル様α−アミラーゼのアミノ酸配列である。 別のα−アミラーゼ、特にフンガミル様α−アミラーゼ中の対応する位置に見つ かるアミノ酸残基または断片を、本発明の変異体の作製のための鋳型として使っ てもよいことは理解されよう。別の相同α−アミラーゼ中の対応部分は、それぞ れのα−アミラーゼのアミノ酸配列および／または三次元構造の比較に基づいて 容易に同定することができる。 例えば、本発明の変異体は、該変異体のアミノ酸配列を前記親のα−アミラー ゼのアミノ酸配列と最も近似するように整列した時に、配列番号４の残基Ｘから 残基Ｙまでの部分と同じ位置を占め、前記領域が配列番号10の残基Ｚから残基Ｖ までの配列番号10の部分と少なくとも90％の配列相同性を有し、ここで Ｘは配列番号４のアミノ酸残基占有位置44，45，46，47または48であり、 Ｙは配列番号４のアミノ酸残基占有位置51，52，53，54，55，56または57であり 、 Ｚは配列番号10のアミノ酸残基占有位置66，67，68，69または70であり、そして Ｖは配列番号10のアミノ酸残基占有位置78，79，80，81，82，83または84である 変異体であることができる。 言い換えれば、変異体は、配列番号４のアミノ酸断片44〜57に相当するかまた はその中に含まれる親のα−アミラーゼのアミノ酸断片Ｘ−Ｙが、配列番号10の アミノ酸配列のアミノ酸断片66〜84に相当するかまたはその中に含まれるアミノ 酸断片Ｚ−Ｖにより置き換えられている（ここでＸ，Ｙ，ＺおよびＶは上述した 意味を有する）ものであることができる。 この態様に従った変異体の特定例は、配列番号４のアミノ酸残基48〜51に相当 する親のα−アミラーゼのアミノ酸断片が配列番号10のアミノ酸配列のアミノ酸 残基70〜78に相当するアミノ酸断片により置き換えられている、親のテルマミル 様α−アミラーゼの変異体である。 ループ３変異−限定変更 別の態様では、本発明は、親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であって 、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸断片195〜202に相当するアミノ酸断片中 に存在する親のα−アミラーゼの少なくとも１つのアミノ酸残基が削除されてい るかまたは配列番号10に示されるアミノ酸配列のアミノ酸断片165〜177に相当す るアミノ酸断片中に存在する１もしくは複数のアミノ酸残基により置換されてい るか、あるいは鋳型として配列番号10の関連部分または別のフンガミル様α−ア ミラーゼの対応部分を使って１もしくは複数の追加のアミノ酸残基が付加されて いる変異体に関する。 例えば、本発明の変異体は、配列番号４のアミノ酸断片195〜202に相当するか またはその中に含まれる親のα−アミラーゼのアミノ酸断片Ｘ−Ｙが、配列番号 10のアミノ酸配列のアミノ酸断片165〜177に相当するかまたはその中に含まれる アミノ酸断片Ｚ−Ｖにより置き換えられており、ここで Ｘは配列番号４のアミノ酸占有位置195または196に相当するアミノ酸残基であり 、 Ｙは配列番号４のアミノ酸占有位置198，199，200，201または202に相当するア ミノ酸残基であり、 Ｚは配列番号10のアミノ酸占有位置165または166に相当するアミノ酸残基であり 、そして Ｖは配列番号10のアミノ酸占有位置173，174，175，176または177 に相当するアミノ酸残基である 変異体であることができる。 別の言い方で表現すれば、この面の変異体は、該変異体のアミノ酸配列を前記 親のテルマミル様α−アミラーゼのアミノ酸配列と最も近似するように整列した 時に、配列番号４の残基Ｘから残基Ｙまでの部分と同じ位置を占め、前記領域が 配列番号10の残基Ｚから残基Ｖまでに及ぶ配列番号10の部分と少なくとも80％、 例えば90％の配列相同性を有し、Ｘ，Ｙ，ＺおよびＶの意味は上記に定義した通 りである、ものであることができる。 この態様に従った変異体の特定例は、配列番号４のアミノ酸残基196〜198に相 当する親のα−アミラーゼのアミノ酸断片が配列番号10のアミノ酸配列のアミノ 酸残基166〜173に相当するアミノ酸断片により置き換えられている、親のテルマ ミル様α−アミラーゼの変異体である。 ループ３変異−完全ドメインＢ 更なる態様では、本発明は、親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であっ て、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸断片117〜185に相当するアミノ酸断片 中に存在する親のα−アミラーゼの少なくとも１つのアミノ酸残基が削除されて いるかまたは配列番号10に示されるアミノ酸配列のアミノ酸断片98〜210に相当 するアミノ酸断片中に存在する１もしくは複数のアミノ酸残基により置換されて いるか、あるいは鋳型として配列番号10の関連部分または別のフンガミル様α− アミラーゼの対応部分を使って１もしくは複数の追加のアミノ酸残基が付加され ている変異体に関する。 例えば、該変異体は、配列番号４のアミノ酸断片117〜185に相当するかまたは その中に含まれる親のα−アミラーゼのアミノ酸断片Ｘ−Ｙが、配列番号10のア ミノ酸配列のアミノ酸断片98〜210に 相当するかまたはその中に含まれるアミノ酸断片Ｚ−Ｖにより置き換えられてお り、ここで Ｘは配列番号４のアミノ酸占有位置117，118，119，120または121に相当するア ミノ酸残基であり、 Ｙは配列番号４のアミノ酸占有位置181，182，183，184または185に相当するア ミノ酸残基であり、 Ｚは配列番号10のアミノ酸占有位置98，99，100，101または102に相当するアミ ノ酸残基であり、そして Ｖは配列番号10のアミノ酸占有位置206，207，208，209または210に相当するア ミノ酸残基である 変異体であることができる。 この態様に従った変異体の特定例は、配列番号４のアミノ酸残基121〜181に相 当する親のα−アミラーゼのアミノ酸断片が配列番号10のアミノ酸配列のアミノ 酸残基102〜206に相当するアミノ酸断片により置き換えられている、親のテルマ ミル様α−アミラーゼの変異体である。 別の態様では、本発明は、親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であって 、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸断片117〜181に相当するアミノ酸断片中 に存在する親のα−アミラーゼの少なくとも１つのアミノ酸残基が削除されてい るかまたは配列番号10に示されるアミノ酸配列のアミノ酸断片98〜206に相当す るアミノ酸断片中に存在する１もしくは複数のアミノ酸残基により置換されてい るか、あるいは鋳型として配列番号10の関連部分または別のフンガミル様α−ア ミラーゼの対応部分を使って１もしくは複数の追加のアミノ酸残基が付加されて いる変異体に関する。 例えば、本発明の変異体は、配列番号４のアミノ酸断片117〜177に相当するか またはその中に含まれる親のα−アミラーゼのアミノ 酸断片Ｘ−Ｙが、配列番号10のアミノ酸配列のアミノ酸断片98〜202に相当する かまたはその中に含まれるアミノ酸断片Ｚ−Ｖにより置き換えられており、ここ で Ｘは配列番号４のアミノ酸占有位置117，118，119，120または121に相当するア ミノ酸残基であり、 Ｙは配列番号４のアミノ酸占有位置174，175，176または177に相当するアミノ酸 残基であり、 Ｚは配列番号10のアミノ酸占有位置98，99，100，101または102に相当するアミ ノ酸残基であり、そして Ｖは配列番号10のアミノ酸占有位置199，200，201または202に相当するアミノ酸 残基である 変異体であることができる。 この態様に従った変異体の特定例は、配列番号４のアミノ酸残基121〜174に相 当する親のα−アミラーゼのアミノ酸断片が配列番号10のアミノ酸配列のアミノ 酸残基102〜199に相当するアミノ酸断片により置き換えられている変異体である 。 ループ１変異−最少付加 更なる態様では、本発明は、親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であっ て、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸断片12〜19に相当するアミノ酸断片中 に存在する親のα−アミラーゼの少なくとも１つのアミノ酸残基が削除されてい るかまたは配列番号10のアミノ酸断片28〜42に相当するアミノ酸断片中に存在す る１もしくは複数のアミノ酸残基により置換されているか、あるいは鋳型として 配列番号10の関連部分または別のフンガミル様α−アミラーゼの対応部分を使っ て１もしくは複数の追加のアミノ酸残基が挿入されている変異体に関する。 例えば、本発明の変異体は、配列番号４のアミノ酸断片12〜19に 相当するかまたはその中に含まれる親のα−アミラーゼのアミノ酸断片Ｘ−Ｙが 、配列番号10のアミノ酸配列のアミノ酸断片28〜42に相当するかまたはその中に 含まれるアミノ酸断片Ｚ−Ｖにより置き換えられており、ここで Ｘは配列番号４のアミノ酸占有位置12，13または14に相当するアミノ酸残基であ り、 Ｙは配列番号４のアミノ酸占有位置15，16，17，18または19に相当するアミノ酸 残基であり、 Ｚは配列番号10のアミノ酸占有位置28，29，30，31または32に相当するアミノ酸 残基であり、そして Ｖは配列番号10のアミノ酸占有位置38，39，40，41または42に相当するアミノ酸 残基である 変異体であることができる。 この態様に従った変異体の特定例は、配列番号４のアミノ酸残基14〜15に相当 する親のα−アミラーゼのアミノ酸断片が配列番号10のアミノ酸配列のアミノ酸 残基32〜38に相当するアミノ酸断片により置き換えられている変異体である。 ループ１変異−完全ループ 更なる態様では、本発明は、親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であっ て、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸残基７〜23に相当するアミノ酸断片中 に存在する親のα−アミラーゼの少なくとも１つのアミノ酸残基が削除されてい るかまたは配列番号10に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基13〜45に相当する アミノ酸断片中に存在する１もしくは複数のアミノ酸残基により置換されている か、あるいは鋳型として配列番号10の関連部分または別のフンガミル様α−アミ ラーゼの対応部分を使って１もしくは複数の追加のアミノ酸残基が挿入されてい る変異体に関する。 例えば、本発明の変異体は、配列番号４のアミノ酸断片７〜23に相当するかま たはその中に含まれる親のα−アミラーゼのアミノ酸断片Ｘ−Ｙが、配列番号10 のアミノ酸配列のアミノ酸断片13〜45に相当するかまたはその中に含まれるアミ ノ酸断片Ｚ−Ｖにより置き換えられており、ここで Ｘは配列番号４のアミノ酸占有位置７または８に相当するアミノ酸残基であり、 Ｙは配列番号４のアミノ酸占有位置18，19，20，21，22または23に相当するアミ ノ酸残基であり、 Ｚは配列番号10のアミノ酸占有位置13または14に相当するアミノ酸残基であり、 そして Ｖは配列番号10のアミノ酸占有位置40，41，42，43，44または45に相当するアミ ノ酸残基である 変異体であることができる。 この態様に従った変異体の特定例は、配列番号４のアミノ酸残基８〜18に相当 する親のα−アミラーゼのアミノ酸断片が配列番号10のアミノ酸配列のアミノ酸 残基14〜40に相当するアミノ酸断片により置き換えられている変異体である。 ループ８変異 更なる態様では、本発明は、親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であっ て、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基322〜346に相当するアミノ酸断片 中に存在する親のα−アミラーゼの少なくとも１つのアミノ酸残基が削除されて いるかまたは配列番号10に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基291〜313に相当 するアミノ酸断片中に存在する１もしくは複数のアミノ酸残基により置換されて いるか、あるいは鋳型として配列番号10の関連部分または別のフンガミル様α− アミラーゼの対応部分を使って１もしくは複数の 追加のアミノ酸残基が挿入されている変異体に関する。 例えば、本発明の変異体は、配列番号２のアミノ酸断片322〜346に相当するか またはその中に含まれる親のα−アミラーゼのアミノ酸断片Ｘ−Ｙが、配列番号 10のアミノ酸配列のアミノ酸断片291〜313に相当するかまたはその中に含まれる アミノ酸断片Ｚ−Ｖにより置き換えられており、ここで Ｘは配列番号２のアミノ酸占有位置322，323，324または325に相当するアミノ酸 残基であり、 Ｙは配列番号２のアミノ酸占有位置343，344，345または346に相当するアミノ酸 残基であり、 Ｚは配列番号10のアミノ酸占有位置291，292，293または294に相当するアミノ酸 残基であり、そして Ｖは配列番号10のアミノ酸占有位置310，311，312または313に相当するアミノ酸 残基である 変異体であることができる。 本発明のこの面に係る変異体の特定例は、配列番号２のアミノ酸残基325〜345 に相当する親のα−アミラーゼのアミノ酸断片が配列番号10のアミノ酸配列のア ミノ酸残基294〜313に相当するアミノ酸断片により置き換えられている変異体で ある。Ca²⁺ 依存性 テルマミル様α−アミラーゼのCa²⁺依存性を減少できることが非常に好ましい 。従って、更なる面では、α−アミラーゼ活性を示し且つ親のα−アミラーゼに 比較して減少したCa²⁺依存性を有する親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体 に関する。減少したCa²⁺依存性は、該変異体が、親酵素に必要であるよりも低い 外来媒質中のカルシウムイオン濃度の存在下で十分なデンプン分解活性を示し、 従って例えばカルシウム錯生成剤（例えば或る種の洗剤ビルダー） を含有する媒質において得られる状態のようなカルシウムイオン涸渇状態に対し て親酵素よりも敏感でないという機能的結果を有する。 本発明の変異体の減少したCa²⁺依存性は親のテルマミル様α−アミラーゼのCa²⁺ 結合親和力を増加させることにより有利に達成することができ、言い換えれば 、酵素のCa²⁺結合が強くなればなるほどCa²⁺依存性が小さくなる。 現在のところナトリウムまたはカルシウムイオンから10Å以内に位置するアミ ノ酸残基が酵素のCa²⁺結合能に関与するかまたは重要であると思われる。 従って、本発明のこの面に係る変異体は、好ましくはテルマミル様α−アミラ ーゼ三次元構造において同定されたカルシウムおよび／またはナトリウムイオン から10Å以内に存在する１または複数のアミノ酸残基が、カルシウムに対するα −アミラーゼの親和力を増加させるように変更されているものである。 配列番号２のアミノ酸配列を有するＢ．リヘニフォルミスα−アミラーゼのCa²⁺ 結合部位から10Åの距離の範囲内に存在するアミノ酸残基は、実施例２に記載 のようにして決定され、それは次のものである： 本発明のこの面の変異体を作製するためには、最適でないカルシウム結合の提 供に関係していると考えられる上記に列挙したアミノ酸残基の少なくとも１つ（ または配列番号２により限定されるもの以外の別のテルマミル様α−アミラーゼ 中の同等位置を占有するアミノ酸残基）を、変異体酵素のCa²⁺結合親和力を改善 する他の任意のアミノ酸残基により置き換えることが望ましい。実際には、アミ ノ酸残基の同定およびその後の変更は次の方法によって実施される： ｉ）構造上または機能上の理由から最適でないカルシウムイオン相互作用の原 因であると考えられる、テルマミル様α−アミラーゼ構造のCa²⁺結合部位から10 Å以内のアミノ酸残基を同定し、 ii）前記アミノ酸残基が構造上または機能上の理由から一層高いCa²⁺結合親和 力の確立に重要であると思われる別のアミノ酸残基により置換されている変異体 を作製し、そして得られたテルマミル様α−アミラーゼ変異体のCa²⁺依存性を調 べる。 本明細書中で用いる「最適でないカルシウムイオン相互作用」という用語は、 問題のアミノ酸残基から別のものへの置換が酵素のカルシウムイオン結合相互作 用を改善することができるという前提に基づいて問題のアミノ酸残基が選ばれる ことを示すものである。例えば、問題のアミノ酸残基は、次の考えのうちの１つ または複数に基づいて選択することができる： − 酵素の表面近くに位置するアミノ酸残基（テルマミル様α−アミラーゼの 構造から同定されるような）とカルシウムイオンとの間に改善された相互作用を 得ること。例えば、問題のアミノ酸残基が周囲の溶媒に暴露されるなら、前記ア ミノ酸残基とカルシウムイオンとの間のより一層強固な相互作用に備えるように 溶媒からの前記アミノ酸残基の遮蔽を高めることが有利かもしれない。これは、 前記残基（または遮蔽に寄与する前記残基の付近にあるアミノ酸残 基）をより嵩張ったアミノ酸残基または他の形で改善された遮蔽効果をもたらす アミノ酸残基によって置き換えることにより達成することができる。 − 例えばテルマミル様α−アミラーゼの構造を安定化することにより（例え ばＡ，ＢおよびＣドメイン間の接触を安定化するかまたは１もしくは複数の前記 ドメインそれ自体を安定化することにより）、カルシウム結合部位を安定化する こと。これは、例えば、アミノ酸側鎖へのより良好な配位に備えることにより達 成することができ、例えば、カルシウム結合部位の例えば10Å以内、好ましくは ３または４Å以内にあるＮ残基をＤ残基でそして／またはＱ残基をＥ残基で置き 換えることにより得ることができる。 − 例えば、カルシウムイオンとカルシウム結合部位との間により強力な相互 作用を提供することにより、カルシウム結合部位を保護するかまたはカルシウム イオンとカルシウム結合部位との間の配位を改善すること。 実際に上記理論に従ってテルマミル様α−アミラーゼを作製する前に、テルマ ミル様α−アミラーゼ構造への、例えば親のテルマミル様α−アミラーゼの模型 構造への適応により、もくろんだアミノ酸変更を査定することが便利かもしれな い。 好ましくは変更しようとするアミノ酸残基がCa²⁺結合部位残基の８Å以内、例 えばそのような残基の５Å以内に位置する。それぞれ８Åおよび５Å以内のアミ ノ酸残基は、10Å以内のアミノ酸残基を同定するのに使ったのと同様な方法によ り容易に同定することができる（実施例２参照）。 次の変異は、テルマミル様α−アミラーゼのCa²⁺依存性を減少させることに関 して特に重要であると考えられる： Ｎ104Ｄ〔配列番号２のＢ．リヘニフォルミスα−アミラーゼの、 または別のテルマミル様α−アミラーゼ中の同等位置の同等（Ｎ→Ｄ）変異〕。 Ca²⁺依存性に適切な置換については、他の幾つかの置換も、酵素のコンホメー ション（例えば酵素の全体的安定性に貢献するドメインＡ−Ｂおよび／またはド メインＡ−Ｃ相互作用）を安定化することにおいて、それらが親のテルマミル様 α−アミラーゼ内のカルシウムもしくはナトリウム結合部位の所でのまたはその 中でのカルシウムイオンもしくはナトリウムイオンの結合または保持の強度を増 加させることができるという点から、重要であると思われる。 酵素のカルシウム安定性および／または耐熱性を増加させるためにＣドメイン を安定化することが望ましい。この点について、安定化は酵素によるカルシウム の結合の安定化、およびＣドメインとＡドメインの間の接触の改善（耐熱性にと って重要である）をもたらし得る。後者は、システイン橋の導入、塩橋の導入、 または水素的、疎水的および／または静電気的相互作用の増加により達成するこ とができる。 例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＢ．リヘニフォルミスα −アミラーゼのドメインＣを、例えば次の変異： A349C ＋ I479Cおよび／またはL346C ＋ I430Cの導入によって、ドメインＡとド メインＣの間にシステイン架橋を導入することにより安定化することができる。 次の変異の導入により塩橋を導入することもできる： N457D,E N457D,E ＋ K385R F350D,E ＋ I430R,K F350D,E ＋ I411R,K ドメインＣのカルシウム結合部位は、アミノ酸残基H408および／ またはG303を別の任意のアミノ酸残基で置換することにより安定化することかで きる。特に着目されるのは、次の変異である： H408Q,E,N,Dおよび／またはG303N,D,Q,E これは良好なカルシウム結合またはカルシウム涸渇からの保護を提供すると考え られる。 同様な変異を別のテルマミル様α−アミラーゼの同等位置に導入してもよい。 特に、カルシウム依存性を減少させることにおいて重要と思われる他の置換変 異（配列番号２のＢ．リヘニフォルミスα−アミラーゼに関して）としては、次 のものが挙げられる：R23K，H156Y，A181T，A209VおよびG310D（または別のテル マミル様α−アミラーゼ中の同等位置での同等の変異）。別のアミノ酸によるR2 14およびP345の置換もこの点で重要かもしれない。高／低ｐＨで変更された活性を有する変異体 活性部位残基のｐＫａを変えることによりテルマミル様α−アミラーゼの最適 ｐＨまたは与えられたｐＨでの酵素活性を変更することができると考えられる。 これは、例えば、変更しようとするアミノ酸残基のアミノ酸側鎖の官能基とそれ の付近の官能基との静電気的相互作用または疎水的相互作用を変えることにより 、達成することができる。これは、例えば次の方法により達成することができる ： ｉ）問題のテルマミル様α−アミラーゼの構造において、活性部位残基との静 電気的または疎水的相互作用に関与すると思われる、活性部位残基から15Å以内 、特に活性部位残基から10Å以内のアミノ酸残基を同定し、 ii）前記構造において、活性部位残基の静電気的および／または疎水的環境を 変更するアミノ酸残基により前記アミノ酸残基を置換し、そして前記構造中の該 アミノ酸残基の適応を評価し、 iii）所望により前記構造に適応するアミノ酸残基置換が同定されるまで段階 ｉ）および／またはii）を繰り返し、 iv）段階ｉ），ii）および所望によりiii）から得られたテルマミル様α−ア ミラーゼ変異体を作製し、そして着目の前記変異体のpH依存酵素活性を試験する 。 上記方法では、グルタミン酸基の５Å以内に正電荷を有する残基を付加する（ それによってグルタミン酸基のｐＫａを約4.5から４に下げる）こと、またはグ ルタミン酸基の５Å以内に負電荷を有する残基を付加する（それによってｐＫａ を約５に増加させる）こと、またはヒスチジンの約５Åの距離以内に同様な変更 を作ること、が特に適切だろう。 別の面では、本発明は、低ｐＨで（例えば最適ｐＨに比べて）親のα−アミラ ーゼよりもより高い活性を示すテルマミル様α−アミラーゼの変異体に関する。 特に、該変異体はＢ．リヘニフォルミスα−アミラーゼ（配列番号２）の次の位 置のうちの少なくとも１つに相当するアミノ酸残基の変異を含んで成る： E336，Q333，P331，I236，V102，A232，I103，L196。 次の変異： E336R,K Q333R,K P331R,K V102R,K,A,T,S,G I236K,R,N I103K,R L196K,R A232T,S,G またはそれらの変異体の２以上の任意の組合せまたはそれらの変異 体の１もしくは複数と本明細書中に開示される別の変異体との任意の組合せ、が 特に重要である。 更に別の面では、本発明は高ｐＨで親のα−アミラーゼより高い活性を有する テルマミル様α−アミラーゼ変異体に関する。特に、該変異体はＢ．リヘニフォ ルミスα−アミラーゼ（配列番号２）の次の位置のうちの少なくとも１つに相当 するアミノ酸残基の変異を含んで成る： N236，H281，Y273。 特に、該変異体はＢ．リヘニフォルミスα−アミラーゼ（配列番号２）の次の 変異のうちの少なくとも１つに相当する変異を含んで成る： N236I,Y,F,L,V H281F,I,L Y273F,W。 またはそれらの変異体の２以上の任意の組合せまたはそれらの変異体の１もしく は複数と本明細書中に開示される別の変異体との任意の組合せを含んで成る。 本発明の変異体の比活性に関連して重要と思われる変異は、Ｂ．リヘニフォル ミスα−アミラーゼ（配列番号２）における置換S187Dに相当する変異である。高められた耐熱性および／または変更された最適温度を有する変異体 更に望ましい面では、本発明は親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であ って、高められた耐熱性の変異体を得るように親のα−アミラーゼから１もしく は複数のアミノ酸残基が削除されているか、置換されているかまたは付加されて いる変異体に関する。 テルマミル様α−アミラーゼ構造は水を含むことがある多数のユ ニークな内部孔と多数のクレバスを含有する。α−アミラーゼの耐熱性を高める ために、例えば孔の付近または周辺に１または複数の疎水的結合を導入すること により、好ましくはより嵩張った残基を導入することにより、孔およびクレバス の数を減らす（または孔もしくはクレバスの大きさを減らす）ことが望ましいだ ろう。例えば、変更しようとするアミノ酸残基が孔の形成に関与しているもので ある。 従って、別の面では、本発明は、親のテルマミル様α−アミラーゼの耐熱性を 高めるおよび／または最適温度を変更する方法であって、 ｉ）前記α−アミラーゼの三次元構造において親のテルマミル様α−アミラー ゼの内部孔またはクレバスを同定し、 ii）該構造において、ｉ）で同定した孔またはクレバスの近隣の１または複数 のアミノ酸残基を、構造上または機能上の理由から疎水的相互作用を増加させ且 つ前記孔またはクレバスの空所を埋めるかまたは大きさを減らすと思われる別の アミノ酸残基により置き換え、 iii）段階ii）から生じるテルマミル様α−アミラーゼ変異体を作製し、そし て該変異体の耐熱性および／または最適温度を試験することを含んで成る方法に 関する。 親のテルマミル様α−アミラーゼの孔またはクレバスを同定するのに用いる構 造は、付録１に記載の構造またはそれに基づいて製作した親のテルマミル様α− アミラーゼの模型構造であることができる。 孔／クレバスが前記孔／クレバスの周辺のアミノ酸残基により同定され、そし て前記孔／クレバスを満たすかまたはその大きさを減らすのに前記アミノ酸残基 の変更が重要であることは理解されよう。 下記に言及する特定のアミノ酸残基は、結晶構造において問題の孔／クレバスに 隣接することが判明したものである。 ドメインＡとＢの間に位置する主要な孔を（完全にまたは部分的に）満たすた めに、Ｂ．リヘニフォルミスα−アミラーゼ（配列番号２）の下記残基の１また は複数に相当するアミノ酸残基から別の任意のアミノ酸残基への変異が考えられ る： L61，Y62，F67，K106，G145，I212，S151，R214，Y150，F143，R146。 特に着目されるのは、親酵素のアミノ酸残基よりも嵩張ったアミノ酸残基への 変異である。 特に着目されるのは、次の変異〔Ｂ．リヘニフォルミスα−アミラーゼ（配列 番号２）の番号付け法を使った〕に相当する変異を含んで成るテルマミル様α− アミラーゼの変異体である： L61W,V,F； Y62W； F67W； K106R,F,W ； G145F,W ； I212F,L,W,Y,R,K ； 任意の他のアミノ酸残基、特にF,W,IまたはLに置き換えられた S151； R214W ； Y150R,K ； F143W ；および／または R146W。 活性部位の近くの孔を満たすために、Ｂ．リヘニフォルミスα−アミラーゼ（ 配列番号２）の下記残基の１または複数に相当するア ミノ酸残基から別の任意のアミノ酸残基への変異が考えられる： L241，I236。 特に着目されるのは、より嵩張ったアミノ酸残基への変異である。 特に着目されるのは、Ｂ．リヘニフォルミスα−アミラーゼ中の１または複数 の下記変異に相当する変異を含んで成るテルマミル様α−アミラーゼの変異体で ある： L241I,F,Y,Wおよび／または I236L,F,W,Y。 活性部位の近くの孔を満たすために、Ｂ．リヘニフォルミスα−アミラーゼ（ 配列番号２）の下記残基の１または複数に相当するアミノ酸残基から別の任意の アミノ酸残基への変異が考えられる： L7，V259，F284。 特に着目されるのは、より嵩張ったアミノ酸残基への変異である。 特に着目されるのは、Ｂ．リヘニフォルミスα−アミラーゼ中の１または複数 の下記変異に相当する変異を含んで成るテルマミル様α−アミラーゼの変異体で ある： L7F,I,W V259F,I,L F284W。 活性部位の近くの孔を満たすために、Ｂ．リヘニフォルミスα−アミラーゼ（ 配列番号２）の下記残基の１または複数に相当するアミノ酸残基から別の任意の アミノ酸残基への変異が考えられる： F350，F343。 特に着目されるのは、より嵩張ったアミノ酸残基への変異である。 特に着目されるのは、Ｂ．リヘニフォルミスα−アミラーゼ中の１または複数 の下記変異に相当する変異を含んで成るテルマミル様α−アミラーゼの変異体で ある： F350W F343W。 活性部位の近くの孔を満たすために、Ｂ．リヘニフォルミスα−アミラーゼ（ 配列番号２）の下記残基の１または複数に相当するアミノ酸残基から別の任意の アミノ酸残基への変異が考えられる： L427，V481。 特に着目されるのは、より嵩張ったアミノ酸残基への変異である。 特に着目されるのは、Ｂ．リヘニフォルミスα−アミラーゼ中の１または複数 の下記変異に相当する変異を含んで成るテルマミル様α−アミラーゼの変異体で ある： L427F,L,W V481F,I,L,W。変更された開裂パターンを有する変異体 デンプン液化工程では、デンプン分子を短鎮オリゴ糖に分解する（通常のテル マミル様α−アミラーゼのように）よりも長鎖オリゴ糖に分解する（例えばフン ガミル様α−アミラーゼのように）ことができるα−アミラーゼを使うことが望 ましい。生成した非常に短鎖のオリゴ糖（パノース前駆体）は、液化工程におい てα−アミラーゼの後およびアミログルコシダーゼの前に使われるプルラナーゼ により適切に加水分解することができない。よって、パノース前駆体の存在下で はアミログルコアミラーゼの作用は高度の短鎖限定デキストリン、即ち三糖パノ ースで終わる。パノースの存在は糖化収率をかなり減少させるので、望ましくな い。 よって本発明の１つの目的は、同時にテルマミル様α−アミラーゼの耐熱性を 減らすことなく、テルマミル様α−アミラーゼの分解特性をフンガミル様α−ア ミラーゼのものに変更することである。 従って、別の面では、本発明は分岐点近くで基質を開裂させる能 力が減らされているテルマミル様α−アミラーゼの変異体に関する。 該変異体は、好ましくは、 ｉ）親のテルマミル様α−アミラーゼの三次元構造の模型において前記α−ア ミラーゼの基質結合領域を同定し〔例えば、基質結合部位から４Åの範囲内で（ 上記の「基質結合部位」という項目において記載されたように）〕、 ii）前記模型において、親の開裂パターンの原因であると思われるｉ）で同定 した窪みの基質結合領域の１もしくは複数のアミノ酸残基を、構造上の理由から 変更された基質開裂パターンを生じると思われる別のアミノ酸残基により置き換 え、または基質との有利な相互作用を導入すると思われる基質結合領域の１もし くは複数のアミノ酸残基を削除し、または基質との有利な相互作用を導入すると 思われる基質結合領域に１もしくは複数のアミノ酸残基を付加し、そして iii）段階ii）から得られるテルマミル様α−アミラーゼ変異体を作製し、そ して該変異体の基質開裂パターンを調べる ことを含んで成る方法により作製することができる。 本発明のこの面に関連して特に着目される残基は、Ｂ．リヘニフォルミスα− アミラーゼ（配列番号２）の次の残基に相当し： V54，D53，Y56，Q333，G57；そしてこの面に係る変異体は好ましくはそれらの残 基のうちの１または複数に変異を含んで成る。 特に、該変異体は、分岐点近くでの開裂を防ぐと予想される下記変異のうちの 少なくとも１つを含んで成る： V54L,I,F,Y,W,R,K,H,E,Q D53L,I,F,Y,W Y56W Q333W G57あらゆる可能なアミノ酸残基 A52 Aより大きいアミノ酸残基、例えばA52W,Y,L,F,I。真菌α−アミラーゼの変異体 更に別の態様では、本発明は親のフンガミル様α−アミラーゼの変異体であっ て、配列番号10のアミノ酸配列のアミノ酸残基291〜313に相当するアミノ酸断片 中に存在する親のα−アミラーゼの少なくとも１つのアミノ酸残基が削除されて いるか、または配列番号４に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基98〜210に相 当するアミノ酸断片中に存在する１もしくは複数のアミノ酸残基により置き換え られているか、または配列番号４の関連部分もしくは別のテルマミル様α−アミ ラーゼの対応部分を鋳型として使って１もしくは複数の追加のアミノ酸残基が挿 入されている変異体に関する。 例えば、該変異体は、配列番号10のアミノ酸断片117〜185に相当するかまたは その中に含まれる親のα−アミラーゼのアミノ酸断片Ｘ−Ｙが、配列番号４のア ミノ酸配列のアミノ酸断片98〜210に相当するかまたはその中に含まれるアミノ 酸断片Ｚ−Ｖにより置き換えられており、ここで Ｘは配列番号10のアミノ酸占有位置117，118，119，120または121に相当するア ミノ酸残基であり、 Ｙは配列番号10のアミノ酸占有位置181，182，183，184または185に相当するア ミノ酸残基であり、 Ｚは配列番号４のアミノ酸占有位置98，99，100，101または102に相当するアミ ノ酸残基であり、そして Ｖは配列番号４のアミノ酸占有位置206，207，208，209または210に相当するア ミノ酸残基である 変異体であることができる。 本発明のこの面に係る変異体の特定例は、配列番号10のアミノ酸残基121〜181 に相当する親のα−アミラーゼのアミノ酸断片が配列番号４のアミノ酸配列のア ミノ酸残基102〜206に相当するアミノ酸断片により置き換えられている変異体で ある。 本発明のこの面に係る変異体の別の例は、配列番号10のアミノ酸残基121〜174 に相当する親のα−アミラーゼのアミノ酸断片が配列番号４のアミノ酸配列のア ミノ酸残基102〜199に相当するアミノ酸断片により置き換えられている変異体で ある。 更なる態様では、本発明は配列番号10に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基 181〜184に相当するアミノ酸断片が削除されている、親のフンガミル様α−アミ ラーゼの変異体に関する。 本発明の変異体における一般変異 本発明の変異体または本発明の方法に従って調製した変異体が上記に概説した ものに加えて１または複数の変更を含んで成ることは好ましいだろう。よって、 α−アミラーゼ変異体の一部分に存在する１もしくは複数のプロリン残基が修飾 されているかまたは非プロリン残基（これは天然に存在する可能な非プロリン残 基のいずれであってもよく、好ましくはアラニン、グリシン、セリン、スレオニ ン、バリンまたはロイシンである）により置換されていることが有利かもしれな い。 同様に、親のα−アミラーゼ中のアミノ酸残基中に存在する１または複数のシ ステイン残基が修飾されているかまたは非システイン残基、例えばセリン、アラ ニン、スレオニン、グリシン、バリンもしくはロイシンにより置き換えられてい ることが好ましいかもしれない。 更に、本発明の変異体は、唯一の変更としてまたは上述の変更のいずれかとの 組合せとして、配列番号８のアミノ酸残基185〜209 に相当するアミノ酸断片中に存在する１もしくは複数のAspおよび／またはGluが それぞれAsnおよび／またはGlnにより置き換えられるように変更されてもよい。 同じく着目されるのは、テルマミル様α−アミラーゼ中に存在する１または複数 のLys残基が、配列番号８のアミノ酸残基185〜209に相当するアミノ酸断片中に 存在するArgにより置き換えられる変異である。 本発明に従って、上述した変異の２個以上を有する変異体を調製することがで きると理解されるだろう。例えば、ループ１とループ２領域中の変異、ループ２ と限定されたループ３中の変異、ループ１，ループ２，ループ３およびループ８ 中の変異、などを含んで成る変異体を調製することができる。 更に、上述した変異体のいずれかに点変異を導入することが有利かもしれない 。α−アミラーゼ変異体の調製方法 遺伝子中に変異を導入する方法は当業界において幾つか知られている。α−ア ミラーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニングの簡単な説明の後で、α−アミ ラーゼコード配列中の特定部位に変異を作製する方法を記載することにする。α−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニング 親のα−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列は、当業界で周知である様々な方 法を使って、該α−アミラーゼを産生する任意の細胞または微生物から単離する ことができる。まず、研究しようとするα−アミラーゼを産生する生物体から染 色体ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡを使ってゲノムＤＮＡおよび／またはｃ ＤＮＡライブラリーを作製する。次いで、該α−アミラーゼのアミノ酸配列が既 知であるなら、相同の標識オリゴヌクレオチドプローブを合成し、それを使って 問題の生物体から調製したゲノムライブラリーからα −アミラーゼをコードするクローンを同定することができる。あるいは、既知の α−アミラーゼ遺伝子に相同の標識オリゴヌクレオチドプローブ含有配列をプロ ーブとして使って、低緊縮性のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、α −アミラーゼをコードするクローンを同定することができる。 α−アミラーゼをコードするクローンを同定する別の方法は、ゲノムＤＮＡの 断片を発現ベクター、例えばプラスミド中に挿入し、得られたゲノムＤＮＡライ ブラリーを用いてα−アミラーゼ陰性細菌を形質転換せしめ、次いで形質転換さ れた細菌をα−アミラーゼ基質を含む寒天上に塗布し、それによって該α−アミ ラーゼを発現するクローンの同定を可能にすることを含んで成るだろう。 あるいは、該酵素をコードするＤＮＡ配列を、確立された方法、例えばS.L．B eaucageおよびM.H．Caruthers（1981）により記載されたホスホロアミダイト法 、またはMatthes他（1984）により記載された方法により、合成的に製造するこ とができる。ホスホロアミダイト法では、例えば自動ＤＮＡ合成装置中で、オリ ゴヌクレオチドを合成し、精製し、アニーリングし、連結させ、そして適当なベ クター中でクローニングする。 最後に、ＤＮＡ配列は、標準技術に従って合成起源、ゲノム起源またはｃＤＮ Ａ起源の断片（適当なら、完全なＤＮＡ配列の種々の部分に相当する断片）を連 結せしめることにより調製された、ゲノム起源と合成起源の混成、合成起源とｃ ＤＮＡ起源の混成、またはゲノム起源とｃＤＮＡ起源の混成であることができる 。該ＤＮＡ配列は、例えば米国特許第4,683,202号明細書またはR.K．Saiki他（1 988）により記載された通り、特異的プライマーを使ったポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）によって調製することもできる。部位特異的突然変異誘発 一度α−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列が単離され、そして望ましい変異 部位が同定されれば、合成オリゴヌクレオチドを使って変異を導入することがで きる。それらのオリゴヌクレオチドは所望の変異部位に隣接するヌクレオチド配 列を含み；変異ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成中に挿入される。特別な 方法では、α−アミラーゼコード配列をブリッジする一本鎖のＤＮＡギャップを 、α−アミラーゼ遺伝子を担持するベクター中で作製する。次いで、所望の変異 を有する合成ヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡの相同部分にアニーリングせしめる。 次いで残りのギャップをＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）を使ってフィル インし、Ｔ４リガーゼを使って構成物を連結せしめる。この方法の特定例はMori naga他（1984）に記載されている。米国特許第4,760,025号明細書は、カセット のわずかな変更を行うことによる多重変異をコードするオリゴヌクレオチドの導 入を開示している。しかしながら、様々な長さを有する多数のオリゴヌクレオチ ドを導入することができるため、もっと多様な変異を何時でもMorinaga法により 導入することができる。 α−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列中に変異を導入する別の方法はNelson およびLong（1989）において記載されている。この方法は、化学合成したＤＮＡ 鎖をＰＣＲ反応においてプライマーの１つとして使うことにより導入された所望 の変異を含有するＰＣＲ断片の３段階作製を含む。このＰＣＲ生成断片から、制 限エンドヌクレアーゼでの開裂により変異を含むＤＮＡ断片を単離し、そして発 現プラスミド中に再び挿入することができる。ランダム変異誘発 ランダム変異誘発は、問題のアミノ酸配列に翻訳する遺伝子の少なくとも３部 分での限局化されたもしくは領域特異的なランダム変異誘発として、または全遺 伝子内で実施される。 親のテルマミル様α−アミラーゼの耐熱性を高めることを目指した領域特異的 ランダム変異誘発のために、好ましくは、Ｂ．リヘニフォルミスα−アミラーゼ （配列番号２）の下記アミノ酸残基に相当するコドン位置を目標に定めることが できる：ドメインＡとＣの間のカルシウム部位の安定性を改善するため I428〜A435 T297〜L308 F403〜V409ドメインＡとＢの間の安定性を改善するため D180〜D204 H156〜T163 A232〜F238 テルマミル様α−アミラーゼ変異体による改善された基質結合（すなわち炭水 化物種、例えばアミロースまたはアミロペクチンの改善された結合）、変更され た（例えばより高い）基質特異性および／または基質の開裂（加水分解）に関す る変更された（例えばより高い）特異性を得ることを目指して、特に適当には、 配列番号２に示されるアミノ酸配列の下記のコドン位置（または本発明の範囲内 の別の親のテルマミル様α−アミラーゼの同等のコドン位置）を目標に定めるこ とができる： 13〜18 50〜56 70〜76 102〜109 163〜172 189〜199 229〜235 360〜364 327〜335 上記方法の段階ａ）に従って実施することができる親のα−アミラーゼをコー ドするＤＮＡ配列のランダム変異誘発は、便利には当業界で既知である任意の方 法を使って実施することができる。 例えば、ランダム変異誘発は、適当な物理的もしくは化学的変異誘発剤の使用 により、適当なオリゴヌクレオチドの使用により、またはＤＮＡ配列をＰＣＲ生 成変異誘発にかけることにより、実施することができる。更に、ランダム変異誘 発はそれらの変異誘発剤の任意の組合せの使用により実施することができる。 変異誘発剤は、例えば、塩基転位、塩基転換、挿入、混乱（スクランブリング ）、欠失および／または挿入を誘導するものであることができる。 当該目的に適当な物理的または化学的変異誘発剤の例としては、紫外線（ＵＶ ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ ジン（MNNG）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネ ート（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸およびヌクレオチド類似体が挙げ られる。 そのような剤を使う時、変異誘発は、典型的には、変異せしめようとする親酵 素をコードするＤＮＡ配列を、特定の変異誘発剤の存在下で、変異誘発が起こる のに適当な条件下でインキュベーションし、そして所望の性質を有する変異ＤＮ Ａについて選択することにより実施される。 オリゴヌクレオチドを使って変異誘発を行う時、該オリゴヌクレオチドの合成 中に３種類の親でないヌクレオチドを使って、オリゴヌクレオチドの変更しよう とする位置のところをドープまたはスパイクすることができる。ドープまたはス パイクされたオリゴヌクレ オチドを、例えばＰＣＲ，ＬＣＲまたは任意のＤＮＡポリメラーゼとリガーゼを 使った発表された任意技術により、デンプン分解酵素をコードするＤＮＡの中に 組み込むことができる。 ＰＣＲ変異誘発を使う時、親のα−アミラーゼ酵素をコードする化学的処理済 のまたは未処理の遺伝子を、ヌクレオチドの取込み違い（mis-incorporation） を増加させる条件下で（Deshler 1992; Leung他，Technique,第１巻，1989，11 〜15頁）ＰＣＲにかける。 Ｅ．コリ（Fowler他，Molec．Gen．Genet.，133，1974，179-191頁）、Ｓ．セ レビシエまたは任意の他の微生物のミューテーター株は、例えば親酵素を含むプ ラスミドを用いてミューテーター株を形質転換せしめ、該プラスミドを有するミ ューテーター株を増殖させ、そして該ミューテーター株から変異型プラスミドを 単離することにより、デンプン分解酵素をコードするＤＮＡのランダム変異誘発 に用いることができる。 変異誘発せしめようとするＤＮＡ配列は、便利には、親のデンプン分解酵素を 発現する生物から調製したゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー中に存在すること ができる。あるいは、該ＤＮＡ配列は、プラスミドまたはバクテリオファージの ような適当なベクター上に存在することができ、該ベクターそれ自体を変異誘発 剤と共にインキュベートすることができまたは他の方法で変異誘発剤に暴露せし めることができる。変異誘発せしめようとするＤＮＡは、前記細胞のゲノム中に 組み込まれるかまたは細胞中に含まれるベクター上に存在するかのいずれかによ り宿主細胞中に存在することもできる。最後に、変異誘発せしめようとするＤＮ Ａは単離された形であってもよい。ランダム変異誘発にかけるＤＮＡ配列は、好 ましくはｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列である。 場合によっては、発現段階(b)またはスクリーニング段階(c)を実施 する前に変異型ＤＮＡ配列を増幅せしめることが好都合かもしれない。そのよう な増幅は当業界で既知の方法に従って実施することができるが、現在好ましい方 法は親酵素のＤＮＡ配列またはアミノ酸配列に基づいて調製したオリゴヌクレオ チドプライマーを使ったＰＣＲ増幅である。 変異誘発剤とのインキュベーションまたは変異誘発剤への暴露に続いて、該Ｄ ＮＡ配列を含む適当な宿主細胞を、発現が起こるような条件下で培養することに より、変異型ＤＮＡを発現させる。この目的で使われる宿主細胞は、所望により ベクター上に存在する変異型ＤＮＡ配列により形質転換されているもの、または 変異誘発処理の間、親酵素をコードするＤＮＡ配列を担持していたものであるこ とができる。適当な宿主細胞の例は次のものである： グラム陽性菌、例えばバシラス・サチリス（Bacillus subtilis）、バシラス・ リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・レンタス（Bacillus lentus ）、バシラス・ブレビス（Bacillus brevis）、バシラス・ステアロサ ーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バシラス・アルカロフィラス （Bacillus alkalophilus）、バシラス・アミロリクファシエンス（Bacillus a myloliquefaciens ）、バシラス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バシ ラス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バシラス・ロータス（Bacillus lautus ）、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシラス・ス リンジエンシス（Bacillus thuringiensis）、ストレプトマイセス・リビダンス （Streptomyces lividans）またはストレプトマイセス・ムリナス（Streptomyc es murinus ）；およびグラム陰性菌、例えばＥ．コリ（E. coli）。 変異型ＤＮＡ配列は、該変異型ＤＮＡ配列の発現を可能にする機 能をコードするＤＮＡ配列を更に含んでもよい。限局化ランダム変異誘発 ：ランダム変異誘発は、有利には問題の親のα−アミラ ーゼの一部に限局化することができる。これは、例えば、酵素の或る領域が酵素 の所定の性質に特に重要であると同定されている時、および変更すると改善され た性質を有する変異体をもたらすと期待される時に有利であり得る。そのような 領域は通常、親酵素の三次元構造が明らかにされそして該酵素の機能に関連づけ られている時に同定することができる。 限局化ランダム変異誘発は、便利には、上述したようなＰＣＲ変異誘発技術ま たは当業界で既知である他の任意の技術を使って実施される。 あるいは、変更しようとするＤＮＡ配列の部分をコードするＤＮＡ配列を例え ば適当なベクター中に挿入することにより単離することができ、そして続いて前 記部分を上述の変異誘発法のいずれかを使った変異誘発にかけることができる。 上述した本発明の方法のスクリーニング段階については、便利には次の原理に 基づいたａａフィルターアッセイの使用によりこれを実施することができる： 着目の変異型デンプン分解酵素を発現することができる微生物を、該酵素を分 泌させるのに適当な培地上で且つ適当な条件下でインキュベートし、ここで前記 培地には第一のタンパク質結合性フィルターと、その上に置かれた低タンパク質 結合力を有する第二のフィルターとを含んで成る二重フィルターが用意される。 微生物は第二のフィルター上に置かれる。インキュベーション後、微生物から分 泌された酵素を含んで成る第一のフィルターを、微生物を含んで成る第二のフィ ルターから分離する。第一のフィルターを所望の酵素活性についてのスクリーニ ングにかけ、そして第二のフィルター上に 存在する対応する微生物コロニーを同定する。 酵素活性を結合させるのに使うフィルターは、任意のタンパク質結合性フィル ター、例えばナイロンまたはニトロセルロースであることができる。発現生物の コロニーを含有する上側のフィルターは、タンパク質を結合する親和力が無いか または低い任意のフィルター、例えば酢酸セルロースまたはDurapore^TMであるこ とができる。該フィルターは、スクリーニングに使用する条件のいずれかで予備 処理してもよく、または酵素活性の検出中に処理してもよい。 酵素活性は色素、蛍光、沈澱、ｐＨ指示薬、ＩＲ吸光度、または他の既知の酵 素活性検出技術により検出することができる。 検出する化合物は、任意の固定化剤、例えばアガロース、寒天、ゼラチン、ポ リアクリルアミド、デンプン、濾紙、布により；または固定化剤の任意組合せに より固定化することができる。 α−アミラーゼ活性は、アガロース上に固定化されたCibacron Red標識アミロ ペクチンにより検出される。増加された耐熱性および高pH安定性を有する変異体 についてスクリーニングするために、結合したα−アミラーゼ変異体を有するフ ィルターを特定時間に渡りpH10.5および60℃または65℃の緩衝液中でインキュベ ートし、脱イオン水中で手短に濯ぎ、そして活性検出用のアミロペクチン−アガ ロース母材上に置く。残余活性はアミロペクチン分解によるCibacron Redの溶解 として検出される。検出条件は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するα −アミラーゼによる活性がほとんど検出できないように選択される。安定化され た変異体は、同一条件下で、Cibacron Redの放出の増加のために増強された色強 度を示す。 低い温度でおよび／またはより広範な温度領域に渡り最適活性を有する変異体 についてスクリーニングするために、結合した変異体 を有するフィルターを直接アミロペクチン−Cibacron Red基質プレート上に置き 、そして所望の温度（例えは４℃、10℃または30℃）で一定時間の間インキュベ ートする。この時間の後、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するα−アミ ラーゼによる活性はほとんど検出できず、一方、より低温で最適活性を有する変 異体は増加されたアミロペクチン溶解を示すだろう。アミロペクチン母材上での インキュベーション前に、問題の変異体の変更された依存性についてまたは問題 の変異体とそのような添加剤との反応についてスクリーニングするために、様々 な種類の所望の媒質―例えばCa²⁺、界面活性剤、EDTAまたは他の関連添加剤を含 有する溶液―中でインキュベーションを実施することができる。本発明の変異体の試験 本発明の変異体の試験は、適当には、例えばテンプン含有アガロース平板上で 変異体をコードするＤＮＡ配列により形質転換された宿主細胞を増殖させ、そし てテンプン分解性宿主細胞を同定することによって該変異体のテンプン分解活性 を決定することにより、実施することができる。変更された性質（比活性、基質 特異性、開裂パターン、熱活性化、最適ｐＨ、ｐＨ依存性、最適温度および他の 任意のパラメーターを含む）に関する追加の試験は、当業界で既知の方法に従っ て実施することができる。α−アミラーゼ変異体の発現 本発明によれば、上述の方法によりまたは当業界で既知の任意の別法により生 産される変異体をコードするＤＮＡ配列は、典型的にはプロモーター、オペレー ター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、および場合により、リプレッサ ー遺伝子または様々なアクチベーター遺伝子をコードする調節配列を含有する発 現ベクターを使って、酵素形態で発現せしめることができる。 本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を含有する組換え発現 ベクターは、便利には組換えＤＮＡ操作にかけることができる任意のベクターで あることができ、ベクターの選択はそれを導入する予定である宿主細胞にしばし ば依存するだろう。よって、該ベクターは自己複製ベクター、すなわちその複製 が染色体複製とは無関係である染色体外存在物として存在するベクター、例えば プラスミド、バクテリオファージまたは染色体外要素、例えばミニ染色体または 人工染色体であることができる。あるいは、ベクターは宿主細胞中に導入される と宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた１または複数の染色体 と一緒に複製されるものであってもよい。 ベクター中、ＤＮＡ配列は適当なプロモーター配列に作用可能に連結されるべ きである。プロモーターは、特定の宿主細胞中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配 列であることができ、宿主細胞にとって相同または非相同のタンパク質をコード する遺伝子から誘導することができる。特に細菌宿主中での、本発明のα−アミ ラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列の転写を指令するのに適当なプロモーター の例は、Ｅ．コリのlacオペロンのプロモーター、ストレプトマイセス・ケリコ ロール（Streptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子dagAプロモーター、バシ ラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子（am yL）のプロモーター、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearoth ermophilus ）麦芽生成アミラーゼ遺伝子（amyM）のプロモーター、バシラス・ア ミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）α−アミラーゼ遺伝子 （amyQ）のプロモーター、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）xylAおよ びxylB遺伝子のプロモーターなどである。真菌宿主中での転写に有用なプロ モーターの例は、Ａ．オリゼ（A. oryzae）のTAKAアミラーゼ、リゾムーコル・ ミーヘイ（Phizomucor miehei）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガー （A ．niger）の中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーの酸安定α−アミラーゼ、Ａ． ニガーのグルコアミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイのリパーゼ、Ａ．オリゼの アルカリ性プロテアーゼ、Ａ．オリゼのトリオースリン酸イソメラーゼまたはＡ ．ニデュランス（A. nidulans）のアセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来 するものである。 本発明の発現ベクターは、適当な転写ターミネーターを含んで成ってもよく、 そして真核生物では、本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列に 作用可能に連結されたポリアデニル化配列を含んで成ってもよい。転写終結配列 およびポリアデニル化配列は適当にはプロモーターと同じ源に由来するものであ ろう。 ベクターは問題の宿主細胞中で該ベクターを複製できるようにするＤＮＡ配列 を更に含んで成ることができる。そのような配列の例はプラスミドpUC19，pACYC 177，pUB110，pE194，pAMB1およびpIJ702の複製開始点である。 ベクターは選択マーカー、例えば生成物が宿主細胞の欠陥を補完する遺伝子、 例えばＢ．サチリスもしくはＢ．リヘニフォルミスからのdal遺伝子、または抗 生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしく はテトラサイクリン耐性を付与するものを含んでもよい。更にベクターはアスペ ルギルス選択マーカー、例えばamdS，argB，niaDおよびsC（ヒグロマイシン耐性 をもたらすマーカー）を含んでもよく、または例えばWO 91/17243に記載された ように同時形質転換により選択を成し遂げてもよい。 ある面では、例えば宿主細胞としてある種の細菌を使う時には、細胞内発現が 有利かもしれないが、発現は細胞外であることが通常 好ましい。一般に、本明細書中に言及するバシラス菌α−アミラーゼは、培地中 への発現されたプロテアーゼの分泌を可能にするプレ領域を含んで成る。所望で あれば、このプレ領域を別のプレ領域やシグナル配列により置き換えることがで き、これは便利には各々のプレ領域をコードするＤＮＡ配列の置換により達成さ れる。 α−アミラーゼ変異体、プロモーター、ターミネーターおよび他の要素をコー ドする本発明のＤＮＡ構成物をそれぞれ連結せしめ、そしてそれらの構成物を複 製に必要な情報を含む適当なベクター中に挿入するのに用いる手順は当業者に周 知である〔例えばSambrook他（1989）を参照のこと〕。 上記に定義したような本発明のＤＮＡ構成物または発現ベクターのいずれかを 含んで成る本発明の細胞は、本発明のα−アミラーゼ変異体の組換え生産におい て宿主細胞として有利に使われる。便利にはＤＮＡ構成物（１または複数のコピ ー）を宿主染色体中に組み込むことにより、変異体をコードする本発明のＤＮＡ 構成物を用いて細胞を形質転換せしめることができる。この組み込みは、おそら くＤＮＡ配列が細胞中に安定に維持されるだろうから、一般に有利であると考え られる。宿主染色体中へのＤＮＡ構成物の組み込みは、常法に従って、例えば相 同または非相同組換えにより、実施することができる。あるいは、異なる型の宿 主細胞に関連して上述したように発現ベクターを用いて細胞を形質転換せしめて もよい。 本発明の細胞は高等生物、例えば哺乳類または昆虫の細胞であってもよいが、 好ましくは微生物細胞、例えば細菌または真菌（酵母を含む）細胞である。 適当な細菌の例は、グラム陽性菌、例えばバシラス・サチリス（Bacillus su btilis ）、バシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス ・レンタス（Bacillus lentus）、バ シラス・ブレビス（Bacillus brevis）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus ）、バシラス・アルカロフィラス（Bacillus al kalophilus ）、バシラス・アミロリクファシエンス（Bacillus amyloliquefacie ns ）、バシラス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バシラス・サーキュ ランス（Bacillus circulans）、バシラス・ロータス（Bacillus lautus）、バ シラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシラス・スリンジエンシス （Bacillus thuringiensis）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans ）もしくはストレプトマイセス・ムリナス（Streptomyces murinus） 、またはグラム陰性菌、例えばＥ．コリ（E. coli）である。細菌の形質転換は 、例えば、プロトプラスト形質転換によりまたはそれ自体既知の方法でコンピテ ント細胞を使うことにより、行うことができる。 酵母生物は好ましくはサッカロミセス（Saccharomyces）またはシゾサッカロ ミセス（Schizosaccharomyces）の種、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Sac charomyces cerevisiae ）から選択することができる。糸状菌は有利にはアスペ ルギルス（Aspergillus）種、例えばアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus ory zae ）またはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）に属し得る。真菌 細胞は、プロトプラスト形成および該プロトプラストの形質転換、次いでそれ自 体既知の方法での細胞壁の再生を含む方法により形質転換せしめることができる 。アスペルギルス宿主細胞の適当な形質転換方法はEP 238 023に記載されている 。 更に別の面では、本発明は本発明のα−アミラーゼ変異体の生産方法であって 、上述した宿主細胞を変異体の生産の助けとなる条件下で培養し、そして細胞お よび／または培地から変異体を回収することを含んで成る方法に関する。 細胞を培養するのに使う培地は、問題の宿主細胞を増殖させそして本発明のα −アミラーゼ変異体の発現を得るのに適当な任意の常用培地であることができる 。適当な培地は商品販売業者から入手可能であるかまたは発表された作製法に従 って（例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載 されたように）調製することができる。 宿主細胞から分泌されたα−アミラーゼ変異体は、便利には、遠心分離または 濾過により培地から細胞を分離し、硫酸アンモニウムのような塩を使って培地の タンパク様成分を沈澱させ、次いでイオン交換クロマトグラフィー、アフィニテ ィークロマトグラフィー等のようなクロマトグラフィー手法により精製すること を含む周知の手順により、培地から回収することができる。工業的用途 本発明のα−アミラーゼ変異体は、様々な工業的用途に備えた価値ある性質を 有する。特に該酵素変異体は、洗剤、食器洗い用洗剤、および硬質面洗浄用洗剤 組成物中の一成分として潜在的用途があるが、それはデンプンからの甘味料およ びエタノールの製造において並びに織物製織にも有用である。従来のデンプン転 化工程並びに液化および／または糖化工程の条件は、例えば米国特許第3,912,59 0号並びに欧州特許公開第252,730号および同第63,909号明細書に記載されている 。デンプンからの甘味料の製造 ：デンプンから果糖シロップへの「伝統的な」転化 工程は、通常３つの連続した酵素処理工程、即ち液化工程の後の糖化工程と同化 工程から成る。液化工程中に、デンプンは5.5〜6.2のpH値で且つ95〜160℃の温 度で約２時間に渡りα−アミラーゼによりデキストリンに分解される。これらの 条件下での最適な酵素安定性を確保するために、１mMのカルシウムが添加され る（40ppmの遊離カルシウムイオン）。 液化工程の後、グルコアミラーゼ（例えばＡＭＧ^TM）と枝切り酵素〔例えばイ ソアミラーゼまたはプルラナーゼ（例えばPromozyme^TM）〕の添加によりデキス トリンはデキストロース（ブドウ糖）に変換される。この段階の前に、高温を維 持しながら（約95℃）、pHを4.5以下の値に下げ、そして液化用α−アミラーゼ 活性を変性させる。温度を60℃に下げ、そしてグルコアミラーゼと枝切り酵素を 添加する。糖化工程は24〜72時間続けられる。 糖化工程の後、pHを６〜８の範囲の値、好ましくはpH7.5に増加させ、そして イオン交換によりカルシウムを除去する。ブドウ糖シロップは、次いで例えば固 定化グルコースイソメラーゼ（例えばSweetzyme^TM）を使って、高果糖シロップ に転化される。 この方法の少なくとも３つの酵素的改善を得ることができた。３つの改善はい ずれも個別的な恩恵として認めることができたが、任意の組合せ（例えば１＋２ 、１＋３、２＋３または１＋２＋３）を使うことも可能であった：改善1. 液化用α−アミラーゼのカルシウム依存性の減少 α−アミラーゼの高安定性を適切に確保するためには遊離カルシウムの付加が 必要であるけれども、遊離カルシウムはグルコースイソメラーゼの活性を強く阻 害するので、費用のかかる単位操作を使って、遊離カルシウムのレベルが３〜５ ppm以下になる程度まで除去する必要がある。そのような操作が回避でき、そし て液化工程が遊離カルシウムイオンの添加なしに実施できれば、コストの削減が 得られるだろう。 それを達成するために、低濃度の遊離カルシウム（＜40ppm）で安定であり且 つ高活性である低カルシウム依存性テルマミル様α−アミラーゼが要求される。 そのようなテルマミル様α−アミラーゼ は、4.5〜6.5のpH域、好ましくは4.5〜5.5のpH域に最適pHを有するだろう。改善2. 不用なマイラード生成物の形成の減少 液化工程中の不用なマイラード生成物の形成の程度はpHに依存する。マイラー ド生成物の形成の減少には低pHが好ましい。よって、該工程のpHをpH6.0付近か らpH4.5付近の値に下げることができることが望ましいだろう。不運にも、一般 に既知である全ての耐熱性テルマミル様α−アミラーゼが低pH（即ちpH＜6.0） においてあまり安定でなく、そしてそれらの比活性は一般に低い。 上述した目標の達成は、4.5〜5.5の範囲の低pHでおよび0〜40ppmの範囲の遊離 カルシウム濃度で安定であり、且つ高い比活性を維持しているテルマミル様α− アミラーゼを必要とする。改善3. Ａ．ニガー（A ．niger）のグルコアミラーゼとＢ．アシドプルリチカス（B ．a cidopullulyticus ）のプルラナーゼを使って糖化すると、糖化工程の前にα−ア ミラーゼを不活性化しなければ液化工程からの残余α−アミラーゼ活性の存在が デキストロースの低収率を引き起こし得ることは以前に報告されている（米国特 許第5,234,823号）。この不活性化は、典型的には糖化のために温度を60℃に下 げる前に、95℃でpHを4.3以下に調製することにより行うことができる。 デキストロース収率に対するこの負の効果の理由は完全に解明されていないが 、液化用α−アミラーゼ（例えばＢ．リヘニフォルミスからのテルマミル^TM120L ）が、アミロペクチン中の分岐点近くのおよびその両側の１，４−α−グルコシ ド結合を加水分解することにより、「リミットデキストリン」（Ｂ．アシドプル リチカスのプルラナーゼにとって良くない基質である）を生成すると推測され る。グルコアミラーゼによるそれらのリミットデキストリンの加水分解は、三糖 類パノースの生成をもたらし、これはグルコアミラーゼによって遅くしか加水分 解されない。 この欠点を持たない耐熱性α−アミラーゼの開発は、別の不活性化段階が全く 必要とされないだろうから、意味のある工程改善であろう。 テルマミル様の低pH安定性のα−アミラーゼが開発されれば、特異性の変化は 、低pHでの増加された安定性と共に要望される利点となるだろう。 本発明の方法論および原理は、上記に概説したような必要な性質を有する本発 明の変異体をデザインしそして製造することを可能にする。洗剤組成物 本発明によれば、α−アミラーゼは典型的には洗剤組成物の一成分である。そ のような場合、それは無粉塵性顆粒、安定化された液体または保護された酵素の 形で洗剤組成物中に含めることができる。無粉塵性顆粒は、例えば米国特許第4, 106,991号と同第4,661,452号（共にNovo Industri A/S）に開示されたようにし て製造することができ、そして場合により既知の方法でコーティングすることが できる。蝋状コーティング材料の例は、1000〜20000の平均分子量を有するポリ （エチレンオキシド）生成物（ポリエチレングリコール、PEG）；16〜50エチレ ンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール; アルコールが12〜20個 の炭素原子を含みそして15〜80エチレンオキシド単位が存在するエトキシル化脂 肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ−、ジ−およびト リグリセリドである。流動床技術による使用に適当な皮膜形成コーティング材料 の例は英国特許第1483591号に与えられている。液体 酵素製剤は、例えば、確立された方法に従って、プロピレングリコールのような ポリオール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸を添加することにより安 定化することができる。他の酵素安定剤は当業界で公知である。保護された酵素 は欧州特許第238,216号に開示された方法に従って調製することができる。 本発明の洗剤組成物は任意の便利な形態、例えば粉末、顆粒、ペーストまたは 液体であることができる。液体洗剤は、典型的には水70％までと有機溶剤０〜30 ％を含有する水性であってもよく、または非水性であってもよい。 洗剤組成物は１または複数の界面活性剤を含んで成り、その各々がアニオン性 、非イオン性、カチオン性または両イオン性であることができる。洗剤は一般に 、０〜50％のアニオン性界面活性剤、例えば直鎖アルキルベンゼンスルホネート （LAS）、α−オレフィンスルホネート（AOS）、アルキルスルフェート（脂肪ア ルコールスルフェート）（AS）、アルコールエトキシスルフェート（AEOSまたは AES）、第二級アルカンスルホネート（SAS）、α−スルホ脂肪酸メチルエステル 、アルキル−もしくはアルケニル−コハク酸、または石鹸を含むだろう。それは ０〜40％の非イオン性界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート（AEOまた はAE）、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシ レート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ ル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、またはポリヒ ドロキシアルキル脂肪酸アミド（例えばWO 92/06154中に記載されたような）を 含有してもよい。 洗剤組成物は、１または複数の別の酵素、例えばリパーゼ、クチナーゼ、プロ テアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、例えばラッカーゼを更に含んでもよ い。 洗剤は１〜65％の洗剤ビルダーまたは錯生成剤、例えばゼオライト、ジホスフ ェート、トリホスフェート、ホスホネート、シトレート、ニトリロ三酢酸（NTA ）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミン五酢酸（DTMPA） 、アルキル−もしくはアルケニル−コハク酸、可溶性シリケートまたは積層シリ ケート（例えばHoechstからのSKS-6）を含んでもよい。洗剤はビルダー無添加（ unbuilt）であってもよく、即ち洗剤ビルダーを本質的に含まなくてもよい。 洗剤は１または複数のポリマーを含んでもよい。ポリマーの例はカルボキシメ チルセルロース(CMC)、ポリ（ビニルピロリドン）(PVP)、ポリエチレングリコー ル(PEG)、ポリ（ビニルアルコール）(PVA)、ポリカルボキシレート、例えばポリ アクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、およびラウリルメタクリレ ート／アクリル酸コポリマーである。 洗剤は漂白系を含んでもよい。前記漂白系は、過酸を形成する漂白促進剤〔例 えばテトラアセチルエチレンジアミン（TAED）またはノナノイルオキシベンゼン スルホネート（NOBS）〕と組み合わせることができるH₂O₂源（例えば過ホウ酸塩 または過炭酸塩）を含んで成ることができる。あるいは、漂白系が例えばアミド 、イミドまたはスルホン型のペルオキシ酸を含んで成ってもよい。 本発明の洗剤組成物の酵素は、常用の安定剤、例えばポリオール、例えばプロ ピレングリコールまたはグリセロール、糖または糖アルコール、乳酸、ホウ酸ま たはホウ酸誘導体、例えば芳香族ホウ酸エステルを使って安定化することができ 、該組成物は例えばWO 92/19709およびWO 92/19708に記載されたようにして配合 することができる。 洗剤は他の常用の洗剤成分、例えば織物コンディショナー（クレ ーを含む）、起泡増進剤、泡止め剤、防錆剤、汚れ懸濁剤、汚れ再付着防止剤、 色素、殺菌剤、蛍光増白剤、または香料を含んでもよい。 ｐＨ（使用濃度の水溶液中で測定した時の）は通常は中性またはアルカリ性、 例えば７〜11であろう。 本発明の範囲内の洗剤組成物の特定形態としては下記のものが挙げられる： １）下記の成分を含んで成る少なくとも600g/ｌの嵩密度を有する顆粒として製 剤化された洗剤組成物 ２）下記の成分を含んで成る少なくとも600g/ｌの嵩密度を有する顆粒として製 剤化された洗剤組成物 ３）下記の成分を含んで成る少なくとも600g/ｌの嵩密度を有する顆粒として製 剤化された洗剤組成物 ４）下記の成分を含んで成る少なくとも600g/ｌの嵩密度を有する顆粒として製 剤化された洗剤組成物 ５）下記の成分を含んで成る水性液体洗剤組成物 ６）下記の成分を含んで成る水性液体洗剤組成物 ７）下記の成分を含んで成る少なくとも600g/ｌの嵩密度を有する顆粒として製 剤化された洗剤組成物 ８）下記の成分を含んで成る顆粒として製剤化された洗剤組成物 ９）下記の成分を含んで成る顆粒として製剤化された洗剤組成物 10）下記の成分を含んで成る水性液体洗剤組成物 11）下記の成分を含んで成る水性液体洗剤組成物 12）下記の成分を含んで成る少なくとも600g/ｌの嵩密度を有する顆粒として製 剤化された洗剤組成物 13）直鎖アルキルベンゼンスルホネートの全部または一部が（Ｃ₁₂〜Ｃ₁₈）アル キルスルフェートにより置き換えられている、１）〜12）に記載の洗剤組成物。 14）下記の成分を含んで成る少なくとも600g/ｌの嵩密度を有する顆粒として製 剤化された洗剤組成物 15）下記の成分を含んで成る少なくとも600g/ｌの嵩密度を有する顆粒として製 剤化された洗剤組成物 16）追加の成分としてまたは明記してある漂白系の代替物として、安定化された またはカプセル化された過酸を含有する、１）〜15）に記載の洗剤組成物。 17）過ホウ酸塩が過炭酸塩に置き換えられている、１），３），７），９）およ び12）に記載の洗剤組成物。 18）マンガン触媒を更に含有する、１），３），７），９），12），14）および 15）に記載の洗剤組成物。マンガン触媒は、例えば“Efficient manganese cata lysts for low-temperature bleaching”,Nature，369, 637-639，1994に記載の 化合物の１つであることができる。 19）液体非イオン性界面活性剤（例えば直鎖アルコキシル化第一級 アルコール）、ビルダー系（例えばホスフェート）、酵素およびアルカリを含ん で成る非水性液体洗剤として製剤化された洗剤組成物。この洗剤はアニオン性界 面活性剤および／または漂白系を含んでもよい。 本発明のα−アミラーゼ変異体は、洗剤に汎用される濃度で配合することがで きる。本発明の洗剤組成物では、α−アミラーゼ0.00001〜１mg（純粋な酵素タ ンパク質として計算）／ｌ洗液に相当する量でα−アミラーゼを添加することが できると現在のところ期待される。食器洗い用組成物 食器洗い洗剤組成物は、アニオン性、非イオン性、カチオン性、両性またはそ れらの型の混合物であることができる界面活性剤を含んで成る。該洗剤は０〜90 ％の非イオン性界面活性剤、例えば低〜無発泡性エトキシル化プロポキシル化直 鎖アルコールを含有するだろう。 この洗剤組成物は、無機型および／または有機型の洗剤ビルダー塩を含有して もよい。そのような洗剤ビルダーは、含リン型と無リン型に細分することができ る。洗剤組成物は一般に洗剤ビルダーを１〜90％含有する。 含リン無機アルカリ洗剤ビルダーの例としては、存在する場合、水溶性塩、特 にアルカリ金属ピロリン酸塩、オルトリン酸塩およびポリリン酸塩が挙げられる 。含リン有機アルカリ洗剤ビルダーの例としては、存在する場合、ホスホネート の水溶性塩が挙げられる。無リン無機ビルダーの例としては、存在する場合、水 溶性アルカリ金属炭酸塩、ホウ酸塩および珪酸塩並びに様々な型の水不溶性結晶 質または非晶質アルミノシリケートが挙げられる。その中でゼオライトが最もよ く知られた代表例である。 適当な有機ビルダーの例としては、クエン酸、コハク酸、マロン酸、脂肪酸ス ルホネート、カルボキシメトキシスクシネート、ポリ酢酸、カルボン酸、ポリカ ルボン酸、アミノポリカルボン酸、ポリアセチルカルボン酸およびポリヒドロキ シスルホン酸、のアルカリ金属塩、アンモニウム塩および置換アンモニウム塩が 挙げられる。 別の適当な有機ビルダーとしては、ビルダー性質を有することが知られている 高分子量ポリマーおよびコポリマー、例えば適当なポリアクリル酸、ポリマレイ ン酸およびポリアクリル酸／ポリマレイン酸コポリマー並びにそれらの塩が挙げ られる。 食器洗い洗剤組成物は、塩素／臭素型または酸素型の漂白剤を含んでもよい。 無機塩素／臭素型漂白剤の例は、次亜塩素酸および次亜臭素酸リチウム、ナトリ ウムまたはカルシウム、並びに塩素化リン酸三ナトリウムである。有機塩素／臭 素型漂白剤の例は、複素環式Ｎ−ブロモおよびＮ−クロロイミド、例えばトリク ロロイソシアヌル酸、トリブロモイソシアヌル酸、ジブロモイソシアヌル酸およ びジクロロイソシアヌル酸、並びにそれらと水溶解性カチオンとの塩、例えばカ リウムおよびナトリウム塩である。ヒダントイン化合物も適当である。 酸素漂白剤、例えば無機過塩の形、好ましくは漂白剤前駆体との無機過塩の形 またはペルオキシ酸化合物としての酸素漂白剤が好ましい。適当なペルオキシ漂 白化合物の典型例は、過ホウ酸アルカリ金属（四水和物と一水和物の両方）、過 炭酸アルカリ金属、過珪酸アルカリ金属および過リン酸アルカリ金属である。好 ましい促進物質はTAEDとグリセロールトリアセテートである。 本発明の食器洗い洗剤組成物は、常用の酵素安定剤、例えばポリオール、例え ばプロピレングリコール、糖もしくは糖アルコール、乳酸、ホウ酸、またはホウ 酸誘導体、例えば芳香族ホウ酸エステル、 を使って安定化することができる。 本発明の食器洗い洗剤組成物は、別の常用の洗剤成分、例えば解膠剤、充填剤 、泡止め剤（foam depressor）、防錆剤、汚れ懸濁剤、金属イオン封鎖剤、汚れ 再付着防止剤、脱水剤、色素、殺菌剤、蛍光剤、増粘剤および香料を含んでもよ い。 最後に、本発明のα−アミラーゼ変異体は従来の食器洗い洗剤、例えば次の特 許刊行物のいずれかに記載された洗剤のいずれにおいても使うことができる： 実施例 実施例１：相同性に基づくTERMの模型製作の例 他のテルマミル様α−アミラーゼに対するＢ．リヘニフォルミスα−アミラー ゼ（以下TERMと称する）の全体的相同性は高く、相似度は非常に高い。ウィスコ ンシン大学ジェネティクスコンピューターグループのＧＣＧプログラムを使って BSG（配列番号６のＢ．ステアロサーモフィラスα−アミラーゼ）およびBAN（配 列番号４のＢ．アミロリクファシエンスα−アミラーゼ）に対して計算したTERM の相似度は、それぞれ89％と78％であった。TERMはBANおよびBSGに比較して残基 G180とK181の間に２残基の欠失を有する。BSGはBANおよびTERMに比較してG371と 1372の間に３残基の欠失を有す る。更にBSGはBANおよびTERMに比較して20残基以上のＣ末端延長を有する。BAN はBSGに比較してＮ末端が２残基少なく、TERMは１残基少ない。 Ｂ．リヘニフォルミスα−アミラーゼ（TERM）およびＢ．アミロリクファシエ ンスα−アミラーゼ（BAN）のそれぞれの構造について、本明細書中の付録１に 開示される構造を基に模型を製作した。他のテルマミル様α−アミラーゼ（例え ば本明細書中に開示されるような）の構造も同様にして組み立てることができる 。 本構造を解明するのに使ったα−アミラーゼと比較して、TERMは178〜182の付 近に２残基を欠いているという点で異なる。模型構造においてこれを補うために 、BIOSYMからのHOMOLOGYプログラムを使って、欠失箇所を除いて構造中の同等位 置にある残基（構造上保存された領域だけでなく）を代用した。TERM(BAN)ではG 179(G177)とK180(K180)の間にペプチド結合を作った。解明された構造と模型構 造との間の密接な構造関係（および後者の有効性）は、ごくわずかな原子の存在 だけが模型において近づき過ぎるとわかったことにより指摘される。 この非常に大雑把なTERM構造に、解明された構造（付録１）のものと同じ座標 においてINSIGHTプログラムを使って前記解明構造から全ての水(605)とイオン（ カルシウム４とナトリウム１）を加えた。これはわずかなオーバーラップのみを 伴って、言い換えれば非常に良好な一致で、行うことができた。この模型構造を 次いで200段階のSteepest降下と600段階のConjugated傾斜（Brooks他，1983J．C omputational Chemistry 4，187-217頁参照）を使って最小化した。最小構造を 次いで、5ps加熱に続いて35ps以上だが200psまでの平衡化の分子力学にかけた。 Verlet演算法で進行するような動力学と平衡温度300Kを、湯浴へのBerendsenカ ップリングを使って 維持した（Berendsen他，1984，J．Chemical Physics 81，3684-3690）。ピコ秒 （ps）毎に回転と変換をとった。ポテンシャルエネルギーは約35ps平衡化後に安 定になった。平均動的構造を引き出し、更なる分析に使った。 実施例２：解明された構造中に存在するイオンから10Å以内の残基の決定 付録１の座標をBIOSYM Technologiesにより提供されたINSIGHTプログラム中に 読み取る。原子間の結合を示す立体座標を与える。イオンと水原子を提供する。 プログラムパッケージのサブセット作製部を使って、コマンドZONEを使って構造 中のカルシウムイオンとナトリウムイオンの周りに10Åサブセットを作る。10Å 以内に原子を有する全ての残基をコンパイルし、LIST MOLECULEコマンドにより 打ち出す。座標ファイル中においてイオンに名称イウム（ium）を与えることに より、イウムと呼ばれる全ての原子の周りの10Å範囲をコンパイルする。この方 法で同定された特定残基は、「Ca²⁺依存性」という題の項目において上記に更に 与えられる。 実施例３：解明された構造における窪みの決定 解明された構造は多数の内部孔および窪みを有する。そのような窪みについて 分析する時、Connollyプログラムが一般に使われる（Lee，B．およびRichards， F.M.（1971）J．Mol．Biol．55，379-400頁）。このプログラムは、タンパク質 の外面および内面を調査するために半径範囲でプロープを使う。この方法で検出 できる最小の孔はプローブ半径を有する。 解明された構造を分析するために、INSIGHTプログラム中に組み込まれたConno llyプログラムの改良バージョンを使った。まず、解 明された構造から水分子とイオンを解除（unmerge）することによりそれらの原 子を取り除いた。コマンドMOLECULE SURFACE SOLVENTを使って、1.4Åのプロー ブ半径を使って全ての原子および残基について溶媒が接近可能な表面積を計算し 、それを解明された構造の模型と一緒にグラフィック画像上に表示した。そこで は内部孔は外面への連接が全くないドット面として見えた。 その孔を埋めるための変異体案は、本明細書中に与えられている（「高められ た耐熱性および／または変更された最適温度を有する変異体」という題の項目中 に）。相同性組立構造または／および配列整列を使うことにより、TERMおよびBS GおよびBANの相同構造に向けて変異を作ることができる。 実施例４：本発明に従ったテルマミル^TM変異体の作製 テルマミル（配列番号２）はＢ．サチリス中のpDN1528と称するプラスミドか ら発現される。このプラスミドはテルマミルをコードする完全遺伝子amyLを含み 、その発現は自身のプロモーターにより指令される。更に、このプラスミドはプ ラスミドpUB110からの複製開始点oriと、クロラムフェニコールに対する耐性を 付与するプラスミドpUC194からのcat遺伝子を含む。pDN1528は図９に示される。 配列番号１のコード領域の大部分を含む特別な変異誘発ベクターを作製した。 pJeEN1と命名したこのベクターの重要な特徴は、pUCプラスミド由来の複製開始 点、クロラムフェニコールに対する耐性を付与するcat遺伝子、およびbla遺伝子 のフレームシフト含有変異形（その野性型は一般にアンピシリンに対する耐性を 付与する；表現型amp^R）を含有する。この変異形はamp^S表現型を生じる。プラス ミドpJeEN1は図10に示され、そして該プラスミド上にＥ．コリ複製開始点ori、b la、cat、テルマミルアミラーゼ遺伝子の５′ 端が切り取られた変形、および抜粋した制限部位が示されている。 DengおよびNickoloffにより概説された制限酵素消化による選択を使う代わり に、修復されたbla遺伝子を有するプラスミドを含む形質転換されたＥ．コリ細 胞のamp^R表現型に基づいて「選択プライマー」（プライマー#6616 ；下記参照） が組み込まれているプラスミドを選択することを除いて、DengおよびNickoloff により記載された方法（1992，Anal ．Biochem．200，81-88頁）により、amyL中 に変異を導入する。変異誘発に使う薬品および酵素はStratageneからのChameleo n^TM変異誘発キット（カタログ番号200509）から入手した。 変異体プラスミド中のＤＮＡ配列の確認後、所望の変更を含む端が切り取られ た遺伝子をPstI-EcoRI断片としてpDN1528中にサブクローニングし、そして変異 体酵素を発現させるためにプロテアーゼおよびアミラーゼ欠損バシラス・サチリ ス（Bacillus subtilis）株中に形質転換せしめる。 テルマミル変異体V54Wは、次の変異誘発プライマー（左から右に向かって５′ →３′で記載）を使って作製した： PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CGC TTG テルマミル変異体A52W＋V54Wは、次の変異誘発プライマー（左から右に向かっ て５′→３′で記載）を使って作製した： PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CCA TTG GCT CG プライマー#6616（左から右に向かって５′→３′で記載；Ｐは５′−リン酸 を表す）： P CTG TGA CTG GTG AGT ACT CAA CCA AGT C 実施例５：「残余」α−アミラーゼ活性の存在下での糖化 変更された特異性を有する２つの適当なテルマミル変異体を、該 変異体アミラーゼが活性である条件下で、Ａ．ニガーのグルコアミラーゼとＢ． アシドプルリチカスのプルラナーゼを使ってDE 10（DE＝デキストロース当量） マルトデキストリン基質を糖化することにより評価した。 糖化：糖化用の基質は、汎用コーンスターチから調製したDE 10噴霧乾燥マル トデキストリン 230gを沸騰している脱イオン水460mlに溶かし、そして乾燥物質 （DS）含量を約30％(w/w)に調整することにより、調製した。pHを4.7（60℃で測 定）に調整し、そして15gの乾燥重量（乾量）に相当する基質のアリコートを50m lの青蓋付ガラスフラスコに移した。 次いでそのフラスコを60℃に平衡化した振盪水浴に入れ、酵素を添加した。必 要ならばpHを4.7に再調整した。 次の酵素を使った： グルコアミラーゼ：AMG^TM（Novo Nordisk A/S）； 用量 0.18 AG/g DS プルラナーゼ：Promozyme^TM（Novo Nordisk A/S）； 用量0.06 PUN/g DS α−アミラーゼ：Termamyl^TM（Novo Nordisk A/S）； 用量 60 NU/g DS Termamyl変異体V54W；用量60 NU/g DS Termamyl変異体V54W＋A52W；用量 60 NU/g DS ２ml試料を定期的に採取した。各試料のpHを約3.0に調整し、次いで試料を沸 騰水浴中で15分間加熱して酵素を不活性化した。冷却した後、試料をロータリー ミキサー上で約0.1gの混合床イオン交換樹脂（Bio-Rad 501-X（D））で30分間処 理し、次いで濾過した。各試料の糖組成をHPLCにより調べた。72時間後に次の結 果が得られた〔DP_nはｎグルコース単位を有するデキストロース（Ｄ−グルコ ース）オリゴマーを表す〕： 上記結果から、対照（液化中に全くα−アミラーゼ活性が存在しないもの）に 比較して、変異体V54WとV54W＋A52Wからのα−アミラーゼ活性の存在はパノース (DP₃)レベルを上昇させなかったことは明らかである。対照的に、テルマミル（T ermamyl）α−アミラーゼ活性はパノースの高収率とその後のＤ−グルコース(DP₁ )収率の低下をもたらした。 よって、α−アミラーゼ変異体V54WまたはV54W＋A52Wをデンプンの液化に使え ば、糖化の開始前に残余α−アミラーゼ活性を不活性化する必要がないだろう。 実施例６：本発明のα−アミラーゼ変異体のカルシウム結合親和力 熱または変性剤（例えば塩酸グアニジン）への暴露によりアミラーゼがほぐれ る時には蛍光の減少を伴う。カルシウムイオンの減少はほぐれ（unfolding）を 引き起こすので、緩衝液（例えば50mM HEPES，pH７）中で、各α−アミラーゼ（ 例えば10μg/mlの濃度）を様々な濃度のカルシウム（例えば１μM〜100mMの範囲 ）またはEGTA（例えば１〜1000μMの範囲）〔EGTA＝１，２−ジ（２−アミノエ トキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸〕と共に十分に 長い時間に渡って（例えば55℃で22時間）インキュベーションする前またはした 後で蛍光を測定することにより、カルシウムに対するα−アミラーゼの親和力を 測定することができる。 測定された蛍光Ｆは、酵素の折り畳まれた形態とほぐれた形態の寄与から成る 。カルシウム濃度（[Ca]）に対するＦの従属性を説明するために次の式を誘導す ることができる： 上式中、α_Nは酵素の生来の（折り畳まれた）形態の蛍光であり、β_Nはカルシウ ム濃度の対数に対するα_Nの一次従属であり（実験的に観察されるような）、α_U はほぐれた形態の蛍光であり、そしてβ_Uはカルシウム濃度の対数に対するα_Uの 一次従属である。Ｋ_dissは次のような平衡過程についての見かけ上のカルシウム 結合定数である： 実際は、折り畳みがほぐれる過程は非常にゆっくり進行し、不可逆的である。 ほぐれる速度はカルシウム濃度に依存し、与えられたα−アミラーゼについての その依存性（従属性）は酵素のカルシウム結合親和力の尺度を提供する。反応条 件の標準セットを限定することにより（例えば55℃で22時間）、異なるα−アミ ラーゼについてＫ_dissの有意義な比較を行うことができる。α−アミラーゼにつ いてのカルシウム解離曲線は一般に、上記の式に当てはめることができ、Ｋ_diss の対応値の決定を可能にする。 WO 95/26397の配列番号１のアミノ酸配列を有する親のテルマミ ル様α−アミラーゼと本発明の指摘のテルマミル様α−アミラーゼ変異体につい て次のＫ_diss値が得られた。 上記から、問題の変異体のカルシウム結合親和力が親よりも有意に強力にカル シウムを結合し、それにより親よりもかなり低いカルシウム依存性を有すること は明白である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:07） (31)優先権主張番号 １２５６／９５ (32)優先日 1995年11月10日 (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ， ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ボルシャート，トルベン ベデル デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体の作製方法であって、前記変異 体はα−アミラーゼ活性を有し且つ前記親のα−アミラーゼと比較すると少なく とも１つの変更された性質を有し、 ｉ）親のテルマミル様α−アミラーゼの構造を解析してテルマミル様α−アミ ラーゼ構造の少なくとも１つのアミノ酸残基または少なくとも１つの構造部分を 同定し、前記アミノ酸残基または構造部分は親のテルマミル様α−アミラーゼの 前記性質を変更するのに適当であると思われ（構造上または機能上の理由に基づ いて判断すると）、 ii）親のテルマミル様α−アミラーゼと比較すると、前記性質を変更するため にｉ）において同定されたアミノ酸残基または構造部分が変更されているテルマ ミル様α−アミラーゼ変異体を作製し、そして iii）得られたテルマミル様α−アミラーゼ変異体を前記性質について試験す る ことを含んで成る方法。 ２．変更しようとする前記性質が、基質特異性、基質結合、基質開裂パターン 、温度安定性、ｐＨ依存活性、ｐＨ依存安定性〔特に低（例えばｐＨ＜６）また は高（例えばｐＨ＞９）ｐＨ値で増加された安定性〕、酸化に対する安定性、Ca²⁺ 依存性および比活性から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。 ３．変更しようとする前記性質がカルシウムイオン依存性であり、そして変更 しようする構造部分がＣドメイン、ＡドメインとＢドメインの間の界面、Ａドメ インとＣドメインの間の界面、またはテルマミル様α−アミラーゼのカルシウム 結合部位への相互作用から成 る群より選択される、請求項１または２に記載の方法。 ４．変更しようとする前記性質が基質開裂パターンであり、そして変更しよう とする構造部分が基質結合部位のアミノ酸残基から10Å以内に位置する、請求項 １または２に記載の方法。 ５．親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体の作製方法であって、前記変異 体はα−アミラーゼ活性を有し且つ前記親のα−アミラーゼと比較すると１また は複数の変更された性質を有し、 ｉ）テルマミル様α−アミラーゼの三次元構造を非テルマミル様α−アミラー ゼの構造と比較し、 ii）非テルマミル様α−アミラーゼ構造とは異なり、そして構造上または機能 上の理由からテルマミル様α−アミラーゼと非テルマミル様α−アミラーゼの１ または複数の性質の相違の原因であると思われる、テルマミル様α−アミラーゼ 構造の部分を同定し、そして iii）ii）において同定されたテルマミル様α−アミラーゼの部分を変更し、 それにより１または複数の性質が親のテルマミル様α−アミラーゼとは異なるテ ルマミル様α−アミラーゼ変異体を得る ことを含んで成る方法。 ６．段階iii）において、テルマミル様α−アミラーゼの前記部分が非テルマ ミル様α−アミラーゼの対応部分に類似するように変更される、請求項６に記載 の方法。 ７．段階iii）において、前記変更が、変更しようとするテルマミル様α−ア ミラーゼの部分の１もしくは複数のアミノ酸残基を削除することにより；変更し ようとするテルマミル様α−アミラーゼの部分の１もしくは複数のアミノ酸残基 を非テルマミル様α−アミラーゼ中の対応位置を占めるアミノ酸残基で置換する ことにより；または非テルマミル様α−アミラーゼ中に存在する１もしくは複数 の アミノ酸残基をテルマミル様α−アミラーゼ中の対応位置に挿入することにより 達成される、請求項５または６に記載の方法。 ８．前記非テルマミル様α−アミラーゼ構造が、真菌α−アミラーゼまたは哺 乳類α−アミラーゼの構造である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。 ９．前記非テルマミル様α−アミラーゼが、アスペルギルス・オリゼTAKAα− アミラーゼ、Ａ．ニガー酸α−アミーゼ、バシラス・サチリスα−アミラーゼま たはブタ膵臓α−アミラーゼである、請求項８に記載の方法。 10．前記親のテルマミル様α−アミラーゼがバシラス菌株に由来する、請求項 １〜９のいずれか一項に記載の方法。 11．前記親のα−アミラーゼが、Ｂ．リヘニフォルミス、Ｂ．アミロリクファ シエンス、Ｂ．ステアロサーモフィラスの株、または好アルカリ性バシラス種か らの株、例えばNCIB 12289，NCIB 12512もしくはNCIB 12513に由来する、請求項 10に記載の方法。 12．前記親のα−アミラーゼが、１つがテルマミル様α−アミラーゼでありそ の他が例えば微生物および／または哺乳類のα−アミラーゼである、少なくとも ２つのα−アミラーゼに由来する部分アミノ酸配列の組合せを含んで成るハイブ リッドα−アミラーゼである、請求項１〜11のいずれか一項に記載の方法。 13．段階ii）において変更および同定しようとする親のテルマミル様α−アミ ラーゼの部分が、親のα−アミラーゼのループ１、ループ２、ループ３および／ またはループ８である、請求項５〜12のいずれか一項に記載の方法。 13．親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体の作製方法であって、前記変異 体は前記親に比べると減少したカルシウムイオン依存性を有し、 ｉ）構造上または機能上の理由から最適でないカルシウムイオン相互作用の原 因であると考えられる、前記α−アミラーゼの三次元構造の模型中のテルマミル 様α−アミラーゼのCa²⁺結合部位から10Å以内のアミノ酸残基を同定し、 ii）前記アミノ酸残基が、構造上または機能上の理由から一層高いCa²⁺結合親 和力の確立に重要であると思われる別のアミノ酸残基により置換されている変異 体を作製し、そして iii）得られたテルマミル様α−アミラーゼ変異体のCa²⁺依存性を調べる ことを含んで成る方法。 14．親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体の作製方法であって、前記変異 体はα−アミラーゼ活性および変更されたpH依存活性を有し、 ｉ）問題のテルマミル様α−アミラーゼの三次元構造において、活性部位残基 との静電気的または疎水的相互作用に関係すると思われる、活性部位残基から15 Å以内、特に活性部位から10Å以内のアミノ酸残基を同定し、 ii）前記構造において、活性部位残基の静電気的および／または疎水的環境を 変更するアミノ酸残基により前記アミノ酸残基を置換し、そして前記構造中の該 アミノ酸残基の適応を評価し、 iii）所望により前記構造に適応するアミノ酸残基置換が同定されるまで段階 ｉ）および／またはii）を繰り返し、 iv）段階ｉ），ii）および所望によりiii）から得られたテルマミル様α−ア ミラーゼ変異体を作製し、そして前記変異体のｐＨ依存活性を試験する ことを含んで成る方法。 15．親のテルマミル様α−アミラーゼの耐熱性を高めるおよび／ または最適温度を変更する方法であって、 ｉ）前記α−アミラーゼの三次元構造において親のテルマミル様α−アミラー ゼの内部孔またはクレバスを同定し、 ii）該構造において、ｉ）で同定した孔またはクレバスの近隣の１または複数 のアミノ酸残基を、構造上または機能上の理由から前記孔またはクレバスを埋め るかまたはその大きさを減らすと思われる別のアミノ酸残基により置き換え、 iii）段階ii）から生じるテルマミル様α−アミラーゼ変異体を作製し、そし て該変異体の耐熱性および／または最適温度を調べる ことを含んで成る方法。 16．分岐点近くで基質を開裂させる能力が減ぜられているテルマミル様α−ア ミラーゼの変異体の作製方法であって、 ｉ）親のテルマミル様α−アミラーゼの三次元構造の模型において前記親のα −アミラーゼの基質結合領域を同定し、 ii）前記模型において、親のα−アミラーゼの開裂パターンの原因であると思 われるｉ）で同定した窪みの基質結合領域の１もしくは複数のアミノ酸残基を、 構造上の理由から変更された基質開裂パターンを生じると思われる別のアミノ酸 残基により置き換え、または基質との有利な相互作用を導入すると思われる基質 結合領域の１もしくは複数のアミノ酸残基を削除し、または基質との有利な相互 作用を導入すると思われる基質結合領域に１もしくは複数のアミノ酸残基を付加 し、そして iii）段階ii）から得られるテルマミル様α−アミラーゼ変異体を作製し、そ して該変異体の基質開裂パターンを調べる ことを含んで成る方法。 17．前記α−アミラーゼ変異体が、前記変異体を生産する助けとなる条件下で 前記変異体をコードするＤＮＡ配列を含んで成る微生 物を培養し、そして所望によりそれに続いて生成した培養ブロスから前記変異体 を回収することにより得られる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。 18．親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であって、配列番号４のアミノ 酸配列のアミノ酸断片44〜57に相当する断片中に存在する親のα−アミラーゼの 少なくとも１つのアミノ酸残基が削除されているかまたは配列番号10に示される アミノ酸配列のアミノ酸断片66〜84に相当する断片中に存在する１もしくは複数 のアミノ酸残基により置換されているか、あるいは鋳型として配列番号10の関連 部分または別のフンガミル様α−アミラーゼの対応部分を使って１もしくは複数 の追加のアミノ酸残基が付加されている変異体。 19．親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であって、該変異体のアミノ酸 配列を前記親のα−アミラーゼのアミノ酸配列と最も近似するように整列した時 に、配列番号４の残基Ｘから残基Ｙまでの部分と同じ位置を占める領域を有し、 前記領域が配列番号10の残基Ｚから残基Ｖまでの配列番号10の部分と少なくとも 80％の配列相同性を有し、ここで Ｘは配列番号４のアミノ酸残基占有位置44，45，46，47または48であり、 Ｙは配列番号４のアミノ酸残基占有位置51，52，53，54，55，56または57であり 、 Ｚは配列番号10のアミノ酸残基占有位置66，67，68，69または70であり、そして Ｖは配列番号10のアミノ酸残基占有位置78，79，80，81，82，83または84である ことを特徴とする変異体。 20．Ｘが配列番号４のアミノ酸残基占有位置48であり、Ｙが配列 番号４のアミノ酸残基占有位置51であり、Ｚが配列番号10のアミノ酸残基占有位 置70であり、そしてＶが配列番号10のアミノ酸残基占有位置78である、請求項18 または19に記載の変異体。 21．親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であって、配列番号４のアミノ 酸配列のアミノ酸断片195〜202に相当するアミノ酸断片中に存在する親のα−ア ミラーゼの少なくとも１つのアミノ酸残基が削除されているかまたは配列番号10 に示されるアミノ酸配列のアミノ酸断片165〜177に相当するアミノ酸断片中に存 在する１もしくは複数のアミノ酸残基により置換されているか、あるいは鋳型と して配列番号10の関連部分または別のフンガミル様α−アミラーゼの対応部分を 使って１もしくは複数の追加のアミノ酸残基が付加されている変異体。 22．親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であって、該変異体のアミノ酸 配列を前記親のα−アミラーゼのアミノ酸配列と最も近似するように整列した時 に、配列番号４の残基Ｘから残基Ｙまでの部分と同じ位置を占める領域を有し、 前記領域が配列番号10の残基Ｚから残基Ｖまでの配列番号10の部分と少なくとも 80％、例えば少なくとも90％の配列相同性を有し、ここで Ｘは配列番号４のアミノ酸残基占有位置195または196であり、 Ｙは配列番号４のアミノ酸残基占有位置198，199，200，201または207であり、 Ｚは配列番号10のアミノ酸残基占有位置165または166であり、そして Ｖは配列番号10のアミノ酸残基占有位置173，174，175，176または177である ことを特徴とする変異体。 23．配列番号４のアミノ酸残基196〜198に相当する親のα−ア ミラーゼのアミノ酸断片が、配列番号10に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基 166〜173に相当するアミノ酸断片により置き換えられている、請求項21または22 に記載の変異体。 24．親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であって、配列番号４のアミノ 酸配列のアミノ酸断片117〜185に相当するアミノ酸断片中に存在する親のα−ア ミラーゼの少なくとも１つのアミノ酸残基が削除されているかまたは配列番号10 に示されるアミノ酸配列のアミノ酸断片98〜210に相当するアミノ酸断片中に存 在する１もしくは複数のアミノ酸残基により置換されているか、あるいは鋳型と して配列番号10の関連部分または別のフンガミル様α−アミラーゼの対応部分を 使って１もしくは複数の追加のアミノ酸残基が付加されている変異体。 25．親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であって、該変異体のアミノ酸 配列を前記親のα−アミラーゼのアミノ酸配列と最も近似するように整列した時 に、配列番号４の残基Ｘから残基Ｙまでの部分と同じ位置を占める領域を有し、 前記領域が配列番号10の残基Ｚから残基Ｖまでの配列番号10の部分と少なくとも 80％、例えば少なくとも90％の配列相同性を有し、ここで Ｘは配列番号４のアミノ酸占有位置117，118，119，120または121であり、 Ｙは配列番号４のアミノ酸占有位置181，182，183，184または185であり、 Ｚは配列番号10のアミノ酸占有位置98，99，100，101または102であり、そして Ｖは配列番号10のアミノ酸占有位置206，207，208，209または210である ことを特徴とする変異体。 26．配列番号４のアミノ酸残基121〜181に相当する親のα−アミラーゼのアミ ノ酸断片が配列番号10に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基102〜206に相当す るアミノ酸断片により置き換えられている、請求項24または25に記載の変異体。 27．親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であって、配列番号４のアミノ 酸配列のアミノ酸断片117〜181に相当する断片中に存在する親のα−アミラーゼ の少なくとも１つのアミノ酸残基が削除されているかまたは配列番号10に示され るアミノ酸配列のアミノ酸断片98〜206に相当するアミノ酸断片中に存在する１ もしくは複数のアミノ酸残基により置換されているか、あるいは鋳型として配列 番号10の関連部分または別のフンガミル様α−アミラーゼの対応部分を使って１ もしくは複数の追加のアミノ酸残基が付加されている変異体。 28．親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であって、該変異体のアミノ酸 配列を前記親のα−アミラーゼのアミノ酸配列と最も近似するように整列した時 に、配列番号４の残基Ｘから残基Ｙまでの部分と同じ位置を占める領域を有し、 前記領域が配列番号10の残基Ｚから残基Ｖまでの配列番号10の部分と少なくとも 80％、例えば少なくとも90％の配列相同性を有し、ここで Ｘは配列番号４のアミノ酸占有位置117，118，119，120または121であり、 Ｙは配列番号４のアミノ酸占有位置174，175，176または177であり、 Ｚは配列番号10のアミノ酸占有位置98，99，100，101または102であり、そして Ｖは配列番号10のアミノ酸占有位置199，200，201または202である ことを特徴とする変異体。 29．配列番号４のアミノ酸残基121〜174に相当する親のα−アミラーゼのアミ ノ酸断片が配列番号10に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基102〜199に相当す るアミノ酸断片により置き換えられている、請求項27または28に記載の変異体。 30．親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であって、配列番号４のアミノ 酸配列のアミノ酸断片12〜19に相当するアミノ酸断片中に存在する親のα−アミ ラーゼの少なくとも１つのアミノ酸残基が削除されているかまたは配列番号10の アミノ酸断片28〜42に相当するアミノ酸断片中に存在する１もしくは複数のアミ ノ酸残基により置換されているか、あるいは鋳型として配列番号10の関連部分ま たは別のフンガミル様α−アミラーゼの対応部分を使って１もしくは複数の追加 のアミノ酸残基が挿入されている変異体。 31．親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であって、該変異体のアミノ酸 配列を前記親のα−アミラーゼのアミノ酸配列と最も近似するように整列した時 に、配列番号４の残基Ｘから残基Ｙまでの部分と同じ位置を占める領域を有し、 前記領域が配列番号10の残基Ｚから残基Ｖまでの配列番号10の部分と少なくとも 80％、例えば少なくとも90％の配列相同性を有し、ここで Ｘは配列番号４のアミノ酸占有位置12，13または14であり、 Ｙは配列番号４のアミノ酸占有位置15，16，17，18または19であり、 Ｚは配列番号10のアミノ酸占有位置28，29，30，31または32であり、そして Ｖは配列番号10のアミノ酸占有位置38，39，40，41または42に相当するアミノ酸 残基である ことを特徴とする変異体。 32．配列番号４のアミノ酸残基14〜15に相当する親のα−アミラ ーゼのアミノ酸断片が配列番号10のアミノ酸配列のアミノ酸残基32〜38に相当す るアミノ酸断片により置き換えられている、請求項30または31に記載の変異体。 33．親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であって、配列番号４のアミノ 酸配列のアミノ酸残基７〜23に相当するアミノ酸断片中に存在する親のα−アミ ラーゼの少なくとも１つのアミノ酸残基が削除されているかまたは配列番号10に 示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基13〜45に相当するアミノ酸断片中に存在す る１もしくは複数のアミノ酸残基により置換されているか、あるいは鋳型として 配列番号10の関連部分または別のフンガミル様α−アミラーゼの対応部分を使っ て１もしくは複数の追加のアミノ酸残基が挿入されている変異体。 34．親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であって、該変異体のアミノ酸 配列を前記親のα−アミラーゼのアミノ酸配列と最も近似するように整列した時 に、配列番号４の残基Ｘから残基Ｙまでの部分と同じ位置を占める領域を有し、 前記領域が配列番号10の残基Ｚから残基Ｖまでの配列番号10の部分と少なくとも 80％、例えば少なくとも90％の配列相同性を有し、ここで Ｘは配列番号４のアミノ酸占有位置７または８であり、 Ｙは配列番号４のアミノ酸占有位置18，19，20，21，22または23であり、 Ｚは配列番号10のアミノ酸占有位置13または14であり、そして Ｖは配列番号10のアミノ酸占有位置40，41，42，43，44または45である ことを特徴とする変異体。 35．配列番号４のアミノ酸残基８〜18に相当する親のα−アミラーゼのアミノ 酸断片が配列番号10のアミノ酸配列のアミノ酸残基14 〜40に相当するアミノ酸断片により置き換えられている、請求項33または34に記 載の変異体。 36．親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であって、配列番号２のアミノ 酸配列のアミノ酸残基332〜346に相当する断片中に存在する親のα−アミラーゼ の少なくとも１つのアミノ酸残基が削除されているかまたは配列番号10に示され るアミノ酸配列のアミノ酸残基291〜313に相当するアミノ酸断片中に存在する１ もしくは複数のアミノ酸残基により置換されているか、あるいは鋳型として配列 番号10の関連部分または別のフンガミル様α−アミラーゼの対応部分を使って１ もしくは複数の追加のアミノ酸残基が挿入されている変異体。 37．親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であって、該変異体のアミノ酸 配列を前記親のテルマミル様α−アミラーゼのアミノ酸配列と最も近似するよう に整列した時に、配列番号２の残基Ｘから残基Ｙまでの部分と同じ位置を占める 領域を有し、前記領域が配列番号10の残基Ｚから残基Ｖまでの配列番号10の部分 と少なくとも80％の配列相同性を有し、ここで Ｘは配列番号２のアミノ酸占有位置322，323，324または325であり、 Ｙは配列番号２のアミノ酸占有位置343，344，345または346であり、 Ｚは配列番号10のアミノ酸占有位置291，292，293または294であり、そして Ｖは配列番号10のアミノ酸占有位置310，311，312または313である ことを特徴とする変異体。 38．配列番号２のアミノ酸残基325〜345に相当する親のα−ア ミラーゼのアミノ酸断片が配列番号10のアミノ酸配列のアミノ酸残基294〜313に 相当するアミノ酸断片により置き換えられている、請求項36または37に記載の変 異体。 39．親のフンガミル様α−アミラーゼの変異体であって、配列番号10のアミノ 酸配列のアミノ酸残基291〜313に相当するアミノ酸断片中に存在する親のα−ア ミラーゼの少なくとも１つのアミノ酸残基が削除されているかまたは配列番号４ に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基98〜210に相当するアミノ酸断片中に存 在する１もしくは複数のアミノ酸残基により置換されているか、あるいは配列番 号４の関連部分または別のテルマミル様α−アミラーゼの対応部分を鋳型として 使って１もしくは複数の追加のアミノ酸残基が挿入されている変異体。 40．親のフンガミル様α−アミラーゼの変異体であって、該変異体のアミノ酸 配列を前記親のα−アミラーゼのアミノ酸配列と最も近似するように整列した時 に、配列番号10の残基Ｘから残基Ｙまでの部分と同じ位置を占める領域を有し、 前記領域が配列番号４の残基Ｚから残基Ｖまでの配列番号４の部分と少なくとも 80％、例えば少なくとも90％の配列相同性を有し、ここで Ｘは配列番号10のアミノ酸占有位置117，118，119，120または121であり、 Ｙは配列番号10のアミノ酸占有位置181，182，183，184または185であり、 Ｚは配列番号４のアミノ酸占有位置98，99，100，101または102であり、そして Ｖは配列番号４のアミノ酸占有位置206，207，208，209または210である ことを特徴とする変異体。 41．配列番号10のアミノ酸残基121〜181に相当する親のα−アミラーゼのアミ ノ酸断片が、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸残基102〜206に相当するアミ ノ酸断片により置き換えられている、請求項39または40に記載の変異体。 42．配列番号10のアミノ酸残基121〜174に相当する親のα−アミラーゼのアミ ノ酸断片が、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸残基102〜199に相当するアミ ノ酸断片により置き換えられている、請求項39〜41のいずれか一項に記載の変異 体。 43．配列番号10のアミノ酸配列のアミノ酸残基181〜184に相当するアミノ酸断 片が削除されている、親のフンガミル様α−アミラーゼの変異体。 45．α−アミラーゼ活性を示し且つ親のα−アミラーゼに比べて減少したCa²⁺ 依存性を有する、親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体。 46．配列番号２のアミノ酸配列中の次の位置： N104，A349，I479，L346，I430，N457，K385，F350，I411，H408またはG303 のうちの少なくとも１つに相当する位置に変異を含んで成り、特に N104D ； A349C ＋ I479C； L346C ＋ I430C； N457D,E ； N457D,E ＋ K385R； F350D,E ＋ I430R,K； F350D,E ＋ I411R,K； H408Q,E,N,D ；および／または G303N,D,Q,E に相当する変異を含んで成る、請求項45に記載の変異体。 47．最適ｐＨより下で親のα−アミラーゼよりも高い活性を示す親のテルマミ ル様α−アミラーゼの変異体であって、Ｂ．リヘニフォルミス（B ．licheniform is ）α−アミラーゼ（配列番号２）の次の位置： E336，Q333，P331，I236，V102，A232，I103，L196 の少なくとも１つに相当するアミノ酸残基の変異、特に次の変異： E336R,K ； Q333R,K ； P331R,K ； V102R,K,A,T,S,G ； I236K,R,N ； I103K,R ； L196K,R ；および／または A232T,S,G の少なくとも１つを含んで成る変異体。 48．最適ｐＨより上で親のα−アミラーゼよりも高い活性を示す親のテルマミ ル様α−アミラーゼの変異体であって、Ｂ．リヘニフォルミス（B ．licheniform is ）α−アミラーゼ（配列番号２）の次の位置： N236，H281および／またはY273 の少なくとも１つに相当するアミノ酸残基の変異、特に次の変異： N236I,Y,F,L,V ； H281F,I,L ；および／または Y273F,W の少なくとも１つを含んで成る変異体。 49．α−アミラーゼ活性を示し且つ親のα−アミラーゼに比べて 高められた耐熱性および／または変更された最適温度を有する、親のテルマミル 様α−アミラーゼの変異体であって、Ｂ．リヘニフォルミスα−アミラーゼ（配 列番号２）の次の位置： L61，Y62，F67，K106，G145，I212，S151，R214，Y150，F143，R146，L241，I23 6，L7，V259，F284，F350，F343，L427および／またはV481 の少なくとも１つに相当するアミノ酸残基の変異、特に次の変異： L61W,V,F； Y62W； F67W； K106R,F,W ； G145F,W ； I212F,L,W,Y,R,K ； 任意の他のアミノ酸残基、特にF,W,IもしくはLに置き換えられた S151 ； R214W ； Y150R,K ； F143W ； R146W ； L241I,F,Y,W ； I236L,F,W,Y ； L7F,I,W, V259F,I,L F284W ； F350W ； F343W ； L427F,L,W ；および／または V481F,I,L,W の少なくとも１つを含んで成る変異体。 50．α−アミラーゼ活性を示し且つ親のα−アミラーゼに比べて分岐点近くで オリゴ糖基質を開裂させる能力が減らされている、親のテルマミル様α−アミラ ーゼの変異体であって、 Ｂ．リヘニフォルミスα−アミラーゼ（配列番号２）の次の位置： V54，D53，Y56，Q333および／または G57 の少なくとも１つに相当するアミノ酸残基の変異、特に次の変異： V54L,I,F,Y,W,R,K,H,E,Q； D53L,I,F,Y,W； Y56W； Q333W ；および／または 任意の可能なアミノ酸残基へのG57 の少なくとも１つを含んで成る変異体。 51．それを使って親のα−アミラーゼが変更される前記アミノ酸残基中に存在 する１または複数のプロリン残基が、アラニンのような非プロリン残基により置 き換えられている、請求項17〜50のいずれか一項に記載の変異体。 52．それを使って親のα−アミラーゼが変更される前記アミノ酸残基中に存在 する１または複数のシステイン残基が、アラニンのような非システイン残基によ り置き換えられている、請求項17〜51のいずれか一項に記載の変異体。 53．請求項17〜52のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ変異体をコードする ＤＮＡ配列を含んで成る、ＤＮＡ構成物。 54．請求項53に記載のＤＮＡ構成物を担持する組換え発現ベクター。 55．請求項53に記載のＤＮＡ構成物または請求項54に記載のベク ターにより形質転換される細胞。 56．微生物である、請求項55に記載の細胞。 57．細菌または真菌である、請求項56に記載の細胞。 58．グラム陽性菌、例えばバシラス・サチリス（Bacillus subtilis）、バシ ラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・レンタス（Ba cillus lentus ）、バシラス・ブレビス（Bacillus brevis）、バシラス・ステ アロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バシラス・アルカロフ ィラス（Bacillus alkalophilus）、バシラス・アミロリクファシエンス（Baci llus amyloliquefaciens ）、バシラス・コアギュランス（Bacillus coagulans） 、バシラス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バシラス・ロータス（Ba cillus lautus ）またはバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis ）である、請求項57に記載の細胞。 59．洗浄および／または食器洗いのための、請求項17〜52のいずれか一項に記 載のα−アミラーゼ変異体の使用。 60．デザイニングのための、請求項17〜52のいずれか一項に記載のα−アミラ ーゼ変異体の使用。 61．デンプン液化のための、請求項17〜52のいずれか一項に記載のα−アミラ ーゼ変異体の使用。 62．場合により無塵性粉末、安定化液体または保護酵素の形で請求項17〜52の いずれか一項に記載のα−アミラーゼ変異体を含んで成る洗剤添加剤。 63．添加剤１ｇあたり0.02〜200mgの酵素タンパク質を含有する、請求項62に 記載の洗剤添加剤。 64．別の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、別のデン プン分解酵素および／またはセルラーゼを更に含んで 成る、請求項62または63に記載の洗剤添加剤。 65．請求項17〜52のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ変異体を含んで成る 洗剤組成物。 66．別の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、別のデン プン分解酵素および／またはセルラーゼを更に含んで成る、請求項65に記載の洗 剤組成物。 67．請求項17〜52のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ変異体を含んで成る 手動または自動食器洗い用洗剤組成物。 68．別の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、別のデン プン分解酵素および／またはセルラーゼを更に含んで成る、請求項67に記載の食 器洗い用洗剤組成物。 69．請求項17〜52のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ変異体を含んで成る 手動または自動洗濯用洗剤組成物。 70．別の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、別のデン プン分解酵素および／またはセルラーゼを更に含んで成る、請求項69に記載の洗 濯用洗剤組成物。