MXPA01009706A - Polipeptidos que tienen actividad de alfa-amilasa alcalina y acidos nucleicos que codifican para los mismos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con polipeptidos aislados que tienen actividad de alfa- amilasa y secuencias aisladas de acido nucleico que codifican para los polipeptidos. La invencion tambien se relaciona con construcciones de acido nucleico, vectores y celulas huespedes que comprenden las secuencias de acido nucleico, asi como con metodos para producir y utilizar los polipeptidos.

Description

POLIPÉPTIDOS QUE TIENEN ACTIVIDAD DE ALFA-AMILASA ALCALINA Y ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN PARA LOS MISMOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con polipéptidos aislados que tienen actividad de alfa-amilasa y con secuencias aisladas de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos. Además, la invención se relaciona con variantes de la alfa-amilasa de la invención. La invención también se relaciona con construcciones (plásmidos recombinantes) de ácido nucleico, vectores y células huéspedes que comprenden las secuencias de ácido nucleico, así como métodos para producir y utilizar los polipéptidos. Además, la invención también se relaciona con composiciones de lavandería, de lavado de trastes o de limpieza de superficies duras, en cualquier combinación.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA Durante muchos años se han utilizado las enzimas de alfa-amilasa para diferentes propósitos diversos, uno de los más importantes es la licuefacción de almidón, descrudado textil, modificación del almidón en la industria del papel y REF: 132732 u, la pulpa y para elaboración de cerveza y horneado . Un uso adicional de las alfa-amilasas, el cual se vuelve cada vez más importante, es la remoción de manchas de almidón durante el lavado con un detergente a pH alcalino. Los ejemplos de productos de alfa-amilasa comerciales son TermamylMR, DuramylMR, NatalaseMR, BANMR y FungamylMR, todos disponibles de Novo Nordisk A/S, Dinamarca. Estos y productos similares de otras fuentes comerciales tienen un pH óptimo ácido a neutro, típicamente en el intervalo de pH 5 a pH 7.5, y no muestran actividad óptima en soluciones de detergente a pH alcalino. El documento WO 95/26397 describe una alfa-amilasa de una cepa de Bacillus . El documento WO 96/23873 describe variantes de amilasas de Bacillus con funcionamiento mejorado bajo condiciones de lavado. El documento de los Estados Unidos 5,147,796 describe una pululanasa alcalina que tienen actividad de alfa-amilasa. La figura 2b del documento muestra la actividad óptima de la amilasa a pH 8-8.5. M. Takagi et al., J. Ferment . Bioeng., vol. 81, No. 6, 557-559 (1996) describen una alfa-amilasa-pululanasa alcalifílica de Bacillus sp. La enzima tiene una actividad de amilasa óptima a pH 9, pero la actividad desciende rápidamente a pH superiores, y la actividad a pH 10 es menor que a pH 7.

* J ~ ¿*- El documento WO 97/00324 (KAO) describe un gen que codifica para una alfa-amilasa licuante o licuefante alcalina derivada de Bacillus sp. cepa KS -AP1378, con el depósito No. FERM BP-3048, adecuada para detergentes. Tsukamoto et . al., (1988), Biochem. Biophys. Res Commun. 151, p. 25-33) describen una alfa-amilasa alcalina de Bacillus sp. #707. Un objetivo de la presente invención es proporcionar alfa-amilasas novedosas con funcionamiento alterado, en particular con funcionamiento mejorado en soluciones alcalinas, especialmente en soluciones de detergente alcalino a pH aproximado de 9-11.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con polipéptidos aislados que tienen actividad de alfa-amilasa y una o más características o propiedades que se seleccionan del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual es por lo menos 96% idéntica con los aminoácidos 1 a 485 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4 ; (b) un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico la cual hibridiza bajo condiciones de rigurosidad o astringencia media con: (i) la secuencia de ácido nucleico de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3, (ii) la secuencia de ADNC de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 O la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3, (iii) una subsecuencia de los incisos (i) o (ii) de por lo menos 100 nucleótidos, o (iv) una cadena complementaria de los incisos (i) , (ii) , o (iii) , - (c) una variante alélica de los incisos (a) o (b) ; (d) un fragmento del inciso (a) , (b) o (c) que tiene actividad de alfa-amilasa; (e) un polipéptido con un pH óptimo determinado utilizando el método de Phadebas (37 °C) en el intervalo entre pH 8 y 9; (f) un polipéptido con un óptimo de temperatura determinado utilizando el método de Phadebas (pH 9.0) en el intervalo entre 55 y 65 °C; (g) un polipéptido con un pl entre 7-8 determinado por enfoque isoeléctrico (Pharmacia, Ampholine, pH 3.5-9.3); y (i) un polipéptido con un funcionamiento de lavado o lavado de trastes, o ambos, mejorado, entre pH 9-11. Debe entenderse que la alfa amilasa de la invención puede tener una o más de las características anteriores. Además, la invención se relaciona con variantes de la alfa-amilasa de la invención. La presente invención también [ | -,Xiyr^&^k^^ codifican para los polipéptidos y con construcciones de ácido nucleico, vectores y células huéspedes que comprenden las secuencias de ácido nucleico así como con métodos para producir y utilizar los polipéptidos.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra una alineación de varias alfa-amilasas de Bacillus . La figura 2 muestra el perfil de pH de la alfa-amilasa AA560 en comparación con las alfa-amilasas SP722 y SP690. El perfil de pH se mide 37 °C. La actividad se muestra en valores absolutos como Abs650/mg de enzima. La figura 3 muestra el perfil de temperatura de la alfa-amilasa AA560 en comparación con las alfa-amilasas SP722 y SP690. El perfil de temperatura se muestra como Ab650/mg de enzima. La figura 4 muestra el desempeño de lavado de la alfa-amilasa AA560 en el modelo AP de detergente 97 en comparación con SP722, SP690 y TermamylMR, respectivamente. La figura 5 muestra el desempeño de lavado de AA560 en Orno Multi Acao en comparación con SP722, SP690 y TermamylMR, respectivamente .

La figura 6 muestra el desempeño de lavado de AA560 en Orno concentrado en comparación con SP722, SP690 y TermamylMR, respectivamente . La figura 7 muestra el desempeño de lavado de AA560 en el líquido Ariel Futur, en comparación con SP722, SP690 y TermamylMR, respectivamente.

Descripción detallada de la invención Fuente microbiana La alfa-amilasa alcalina de la invención se puede derivar de una cepa de Bacillus . Las cepas preferidas son de Bacillus sp. DSM 12649 (la alfa-amilasa AA560) o Bacillus sp. DSM 12648 (la alfa-amilasa AA349) . Estas cepas se depositaron el 25 de enero de 1999 por los inventores bajo los términos del Tratado de Budapest respecto al reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para propósitos de procedimiento de patentes en Deutshe Sammmlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig DE. Las dos cepas de Escheri chia coli se denominan NN049467 y NN049470 que contiene los genes para alfa-amilasa clonados en plásmidos pLiH1274 y pTVB299, respectivamente, y también se han depositado el 7 de abril de 1999 bajo los . ,. , términos del Tratado de Budapest ante la Deutshe Sammmlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig DE, y se les proporcionaron los números de acceso DSM12761 y DSM12764, respectivamente.

Polipéptidos que tienen actividad de alfa-amilasa Las alfa-amilasas (alfa-l,4-glucan-4- glucanohidrolasas) , EC 3.2.1.1) constituyen un grupo de enzimas las cuales catalizan la hidrólisis del almidón y otros oligosacáridos y polisacáridos 1, 4-glucosídicos lineales y ramificados. Para propósitos de la presente invención, se determina la actividad de alfa-amilasa utilizando el ensayo de Phadebas o el ensayo pNPG7 descrito en lo siguiente, en la sección de "Materiales y métodos".

Homología de la enzima En una primera modalidad, la presente invención se relaciona con polipéptidos aislados que tienen una secuencia de aminoácidos la cual tiene un grado de homología con los aminoácidos 1 a 485 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4 (es decir, el polipéptido maduro) de por lo menos aproximadamente 96%, de manera preferible de por lo menos aproximadamente 97%, de :,á¿sa. t, . .Ü. manera más preferible de por lo menos aproximadamente 98%, incluso de manera más preferible de por lo menos aproximadamente 99%, los cuales tienen actividad de alfa-amilasa (a continuación "polipéptidos homólogos"). En una modalidad preferida, los polipéptidos homólogos tienen una secuencia de aminoácidos la cual difiere en cinco aminoácidos, preferiblemente en cuatro aminoácidos, de manera más preferible en tres aminoácidos, de manera incluso más preferible en dos aminoácidos y de manera mucho más preferible en un aminoácido, de los aminoácidos 1 a 485 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4. Se debe hacer notar que la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 y la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4 son idénticas. Sin embargo, las secuencias de ADN, es decir, la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 y SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3, respectivamente, codifican para la alfa-amilasa de la invención que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 y SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4, no son idénticas . Se puede determinar la homología de la secuencia de aminoácidos como el grado de homología entre las dos secuencias indicando una derivación de la primera secuencia a partir de la segunda. De manera adecuada, se puede determinar la homología por medio de programas de computadora conocidos en la técnica. Por lo tanto, se puede utilizar el programa GAP que se proporciona en GCG versión 8 (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453) para una alineación pareada de las secuencias y el cálculo del grado de identidad o grado de homología utilizando los ajustes implícitos. Los ajustes de separación pueden ser los siguientes parámetros : castigo por creación de separación de 5.0 y castigo por extensión de separación de 0.3.

Homología con alfa-amilasas conocidas de Bacillus sp.

La búsqueda de homología de secuencias conocidas muestra homología para las secuencias de la invención con diversas amilasas de Bacillus en el intervalo de 65-95% en las bases de aminoácidos, determinadas como se describe antes. Específicamente, las alfa-amilasas más homologas encontradas son SP690 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 de la patente de los Estados Unidos No. 5,856,164, la cual es aproximadamente 87% homologa) , SP722 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 de la patente de los Estados Unidos No, 5,856,164, la cual es aproximadamente 87% homologa), la parte madura (es decir, los aminoácidos No.s 31-516) de la alfa-amilasa que se obtiene de Bacillus sp. KSM-AP1378 descrita como la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 de WO 97/00324 el cual es aproximadamente 86% homólogo, y la alfa-amilasa descrita en Tsukamoto et . al., (1988), Biochem. Biophys. Res .?u Commun. 151, p. 25-33) (que se muestra como la secuencia "707 amy" en la alineación en la figura 1) , la cual es aproximadamente 95% homologa a la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 y la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4, determinada como se describe en lo anterior. Preferiblemente, los polipéptidos de la presente invención comprenden la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4, o variantes alélicas de las mismas; o fragmentos de las mismas que tienen actividad de alfa-amilasa. Las SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 y SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4 muestran la parte madura de las alfa-amilasas alcalinas de la invención. Un fragmento de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4 son polipéptidos que tienen uno o más aminoácidos suprimidos de las partes terminales amino o carboxilo, o de ambas, de esta secuencia de aminoácidos . Una variante alélica indica cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de manera natural por mutación y puede resultar en polimorfismo dentro de poblaciones . Las mutaciones de genes pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar para polipéptidos que tengan secuencias alteradas de aminoácidos. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos homólogos pueden diferir de la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4 por una inserción o supresión de uno o más residuos aminoácidos o la sustitución, o ambas cosas, de uno o más residuos aminoácidos por residuos aminoácidos diferentes. Preferiblemente, los cambios de aminoácido son de una naturaleza menor, esto es, sustituciones conservadoras de aminoácidos que no afecten de manera significativa el plegado o la actividad, o ambas, de la proteína; supresiones pequeñas, típicamente de l a aproximadamente 30 aminoácidos; extensiones pequeñas de las partes amino o carboxilo terminal, tal como un residuo metionina amino terminal; un péptido enlazador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una extensión pequeña que facilite la purificación al cambiar la carga neta u otra función, tal como una cadena de poli-histidina, un epitopo antigénico o un dominio de unión. Los ejemplos de sustituciones conservadoras están dentro del grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina) , aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico) , aminoácidos polares (glutamina y asparagina) , aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina) , aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano y tirosina) • X-y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina) . Las sustituciones de aminoácidos las cuales generalmente no alteran la actividad específica, se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York. Los cambios que se presentan de manera más común son Ala/Ser, Val/lie, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lie, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly así como estos a la inversa. En una segunda modalidad, la presente invención se relaciona con polipéptidos aislados que tienen actividad de alfa-amilasa, los cuales son codificados por secuencias de ácido nucleico las cuales hibridizan bajo condiciones de rigurosidad o astringencia media, preferiblemente condiciones de rigurosidad o astringencia media-alta y de manera más preferible bajo condiciones de rigurosidad alta, y de manera mucho más preferible bajo condiciones de rigurosidad muy alta, con una sonda de ácido nucleico la cual hibridiza bajo las mismas condiciones, con: (i) la secuencia de ácido nucleico de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 (ii) la secuencia de ADNc de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 (iii) una subsecuencia de (i) o (ii) , o (iv) , una cadena complementaria de los incisos (i) , (ii) o (iii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, y T. Maniatus, 1989, r. l, .

Molecular Cloning, A Laboratory Manual , 2a edición, Cois Spring Harbor, New York) . La subsecuencia de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 puede ser de por lo menos 100 nucleótidos, o de manera preferible de por lo menos 200 nucleótidos. Además, la subsecuencia puede codificar para un fragmento polipeptídico, el cual tiene actividad de alfa-amilasa. Los polipéptidos también pueden ser variantes alélicas o fragmentos de los polipéptidos que tienen actividad de alfa-amilasa. La secuencia de ácido nucleico de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 o una susbsecuencia de la misma, así como la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4 o un fragmento de la misma, se puede utilizar para diseñar una sonda de ácido nucleico para identificar un clon de ADN que codifica para polipéptidos que tengan actividad de alfa-amilasa de cepas o especies diferentes, de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. En particular, se puede utilizar tales sondas para hibridización con el ADN genómico o ADN de los géneros o especies de interés, siguiendo los procedimientos estándar o convencionales de transferencia Southern para identificar y aislar el gen correspondiente en el mismo. Tales sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia completa, pero deben tener por lo menos 15 y de manera preferible por lo menos 25 y de manera mucho más preferible por lo menos 35 nucleótidos de longitud. También se pueden utilizar sondas más grandes. Se pueden utilizar sondas de ADN y de ARN. Las sondas están marcadas típicamente para detectar el gen correspondiente (por ejemplo con 32P, 3H, 3SS, biotina o avidina) . Tales sondas están abarcadas por la presente invención. Por lo tanto, el ADN genómico o la biblioteca de ADNc, preparada de tales organismos adicionales se puede examinar para determinar el ADN, el cual hibridice con las sondas descritas antes y el cual codifique para un polipéptido que tenga actividad de alfa-amilasa. El ADN genómico u otro ADN de tales organismos diferentes se puede separar por electroforesis en agarosa o en gel de poliacrilamida, u otras técnicas de separación. El ADN de las bibliotecas o el ADN separado se pueden transferir e inmovilizar en nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Para identificar una clona o ADN el cual sea homólogo a la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 O SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3, o subsecuencias de las mismas, el material portador se utiliza en una transferencia Southern. Para propósitos de la presente invención, la hibridación indica que la secuencia de ácido nucleico hibridiza para una sonda de ácido nucleico que corresponde a la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 O la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3, su cadena complementaria o subsecuencias de la misma, bajo condiciones de rigurosidad media a muy alta. Las moléculas con las cuales hibridiza la sonda de ácido nucleico bajo estas condiciones se detectan utilizan película de 5 rayos X. En otra modalidad preferida, la sonda de ácido nucleico es la secuencia de ácido nucleico contenida en los plásmidos pLiH274 (AA349) o pTVB299 (AA560) las cuales están contenidas en Escherichia coli DSM12761 o Escherichia coli 10 DSM12764, respectivamente, o en la secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene actividad de alfa- amilasa acida de la invención y que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 y SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4, respectivamente. 15 Para sondas grandes de por lo menos 100 nucleótidos, las condiciones de rigurosidad media a muy alta se definen como la prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, o SDS 0.3%, 200 µg/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, formamida 35% para condiciones de rigurosidad 20 media o media-alta o formamida 50% para rigurosidad alta o muy alta, siguiendo los procedimientos convencionales de transferencia Southern. Para sondas grandes de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, el material portador finalmente se lava tres 25 veces, cada una durante 15 minutos, utilizando 2 x SSC, SDS 0.2%, de manera preferible por lo menos a 55 °C (astringencia o rigurosidad media) , preferiblemente por lo menos a 60 °C (astringencia media-alta) , y de manera más preferible por lo menos a 65°C (astringencia alta), y de manera mucho más preferible por lo menos a 70 °C (astringencia muy alta) . Para sondas cortas las cuales son de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, las condiciones de astringencia o rigurosidad se definen como la prehibridación, hibridación y lavado posterior a la hibridación de 5°C a 10 °C por debajo de la Tm calculada, utilizando el cálculo de acuerdo con Bolton y McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) en NaCl 0.9 M, Tris-HCl 0.09 M, pH 7.6, EDTA 6 mM, NP-40 0.5%, solución de Denhardt IX, pirofosfato de sodio 1 mM, fosfato monobásico de sodio 1 mM, ATP 0.1 mM y 0.2 mg de ARN de levadura por ml siguiendo los procedimientos convencionales de transferencia de Southern. Para sondas cortas, las cuales son de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, el material portador se lava una vez en 6X SSC, más DS 0.1% durante 15 minutos, y dos veces, cada uno durante 15 minutos, utilizando 6X SSC de 5°C a 10 °C por debajo la Tm calculada. En una tercera modalidad, la presente invención se relaciona con polipéptidos aislados, es decir, los polipéptidos que se muestran en las SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 O la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4, que tienen las siguientes propiedades fisicoquímicas: Un pH óptimo (véase la figura 2) determinado utilizando el método Phadebas (37 °C) que se encuentra que está en el intervalo entre pH 8 y 9, de manera más precisa a aproximadamente 8.5. Una temperatura óptima (véase la figura 3) determinada utilizando el método de Phadebas (pH 9.0) que se encuentra está en el intervalo entre 55 y 65 °C, de manera más precisa aproximadamente 60 °C. Un pl entre 7-8 (véase la Tabla 1 en el Ejemplo 6) , determinado por enfoque isoeléctrico (Pharmacia, Ampoline, pH 3.5-9.3) . Una actividad específica (véase la Tabla l del Ejemplo 6) de 35,000 NU/mg determinada utilizando el método de Phadebas y 6,000 NU/mg utilizando el método de pNPG7. Los polipéptidos de la presente invención tienen por lo menos 20%, de manera preferible por lo menos 40%, de manera más preferible por lo menos 60%, incluso de manera más preferible por lo menos 80%, incluso de manera más preferible por lo menos 90% y de manera mucho más preferible por lo menos 100% de la actividad de alfa-amilasa del polipéptido maduro que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 y SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4.

Se puede obtener un polipéptido de la presente invención a partir de microorganismos de cualquier género. Para propósitos de esta invención, el término "obtener de", como se utiliza aquí en relación a una fuente dada, significará que el 5 polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico se produce por la fuente o por una célula en la cual se ha insertado la secuencia de ácido nucleico desde la fuente. Un polipéptido de la presente invención es un polipéptido bacteriano. Por ejemplo, el polipéptido puede ser 10 un polipéptido de una bacteria gra positiva tal como un polipéptido de Bacill us, por ejemplo, un polipéptido de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacill us circulans , Bacill us coagulans, Bacill us lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus 15 megaterium, Bacillus stearothermophilus , Bacillus subtilis o Bacillus thuringiensis ; o un polipéptido de Streptomyces, por ejemplo, un polipéptido de Streptojp ces lividans o Streptomyces murinus, o un polipéptido de bacteria gramnegativa, por ejemplo un polipéptido de E. coli o de Pseudomonas sp . 20 En otra modalidad preferida, el polipéptido es un polipéptido de Bacillus sp. Una modalidad más preferida, el polipéptido es un polipéptido de Bacillus sp . DSM 12648 o de Bacillus sp. DSM 12649, por ejemplo, los polipéptidos con la secuencia de aminoácidos de las SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN rrnHße. JJ aBhrf«.y ArrJrr . í • . I I - - •- I^?-i. i NÚMERO: 2 y SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4, respectivamente . Se comprenderá que para las especies mencionadas antes, la invención abarca los estados tanto perfecto como imperfecto y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo anamorfos, sin importar el nombre de la especie por el cual se conocen. Aquéllos expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes apropiados. Las cepas de estas especies son accesibles fácilmente al público en numerosas colecciones de cultivos tales como American Type Culture Collection (ATCC) , Deutsche Sammiung von Mikoorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) , Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) . Además, tales polipéptidos se pueden identificar y obtener de otras fuentes que incluyen microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo suelo, compostas, agua, etc.) utilizando las sondas mencionada antes. Las técnicas para aislar microorganismos a partir de habitats naturales son bien conocidos en la técnica. La secuencia de ácido nucleico después se puede derivar en un examen de manera similar de una biblioteca genómica o de ADNc de otro microorganismo. Una vez que se ha detectado la secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido por medio de la sonda o sondas, se puede aislar la secuencia o se puede clonar mediante la utilización de técnicas las cuales son conocidas por aquéllos habitualmente expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al . , 1989, supra) . Como se define aquí, un polipéptido "aislado" es un polipéptido el cual está esencialmente libre de otros polipéptidos que no son de alfa-amilasa, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 20% puro, preferiblemente por lo menos aproximadamente 40% puro, de manera más preferible aproximadamente 60% puro, incluso de manera más preferible aproximadamente 80% puro y de manera más preferible aproximadamente 90% puro e incluso de manera más preferible aproximadamente 95% puro, determinado por SDS-PAGE. Los polipéptidos codificados por secuencias de ácido nucleico de la presente invención también incluyen polipéptidos fusionados o polipéptidos de fusión separables en los cuales otro polipéptido se fusiona en la parte N terminal o C terminal del polipéptido, o fragmento del mismo. Se produce un polipéptido fusionado al fusionar una secuencia de ácido nucleico (o una porción de la misma) que codifica para otro polipéptido, con una secuencia de ácido nucleico (o una porción de la misma) de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión se conocen en la técnica, e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican para los polipéptidos de manera que estén en marco y que la expresión del polipéptido fusionado esté bajo el control del mismo o los mismos promotores y terminadores. El término "funcionamiento mejorado de lavado" significa, en el contexto de la presente invención, un funcionamiento o desempeño determinado bajo las condiciones de lavado descritas en el Ejemplo 8, el cual es mayor en comparación con otra alfa-amilasa utilizada para lavado, por ejemplo SP690, SP722 y TermamylMR, o en el caso de un mutante/variante de la invención en comparación con la alfa-amilasa parental, es decir, la estructura principal no mutada, tal como la estructura principal de alfa-amilasa no sustituida.

Alfa-amilasas mutantes Propiedades alteradas de las variantes AA560 Lo siguiente discute la relación entre las mutaciones, especialmente sustituciones y supresiones, las cuales se pueden introducir en las alfa-amilasas AA560 o A349 de la invención, y las alteraciones deseables en las propiedades en relación a las de una alfa-amilasa parental. La invención también se relaciona con un mutante de las alfa-amilasas (es decir, variantes de alfa-amilasas) que se muestran en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 4. La alfa-amilasa mutante -U de la invención está caracterizada por el hecho de que uno o más de los residuos aminoácidos de metionina están intercambiados con un residuo aminoácido excepto para Cys y Met. Así, de acuerdo con la invención, los residuos aminoácidos 5 que sustituyen al residuo aminoácido metionina son los siguientes: Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val. Una modalidad preferida de la alfa-amilasa mutante de la invención está caracterizada por el hecho de que uno o 10 más de los residuos aminoácidos metionina es (son) intercambiados con un residuo aminoácido Leu, Thr, Ala, Gly, Ser, lie, o Val, preferiblemente un residuo aminoácido Leu, Thr, Ala o Gly. En esta modalidad, se obtiene un nivel de actividad y estabilidad muy satisfactorios en presencia de 15 agentes oxidantes. Específicamente, esto significa que una o más de las metioninas en la siguiente posición se puede sustituir o suprimir utilizando cualquier técnica adecuada, conocida en el arte, que incluye mutagénesis dirigida especialmente al sitio y transferencia o barajado de genes. La 20 posición contemplada, utilizando la numeración de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 son: 9, 10, 105, 116, 202, 208, 261, 309, 323, 382, 430, 440. En una modalidad preferida de la alfa-amilasa mutante de la invención, esta caracterizada por el hecho de que el 25 residuo aminoácido metionina en la posición 202 se intercambia con cualquiera de los residuos aminoácidos excepto para Cys y Met, preferiblemente con una Leu, Thr, Ala, Gly, Ser, lie o Asp. Otras mutaciones preferidas contempladas incluyen la supresión de uno, dos o más residuos de aminoácidos R181, G182, D183 o G184, K185, G186 o la sustitución de uno o más de estos residuos. Una mutación preferida es la supresión de D183-G184. Las mutaciones particularmente relevantes son sustituciones de G186 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, y Val. Una sustitución particularmente preferida es G186R. También se contempla la sustitución de N195 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val. Una sustitución particularmente interesante es N195F. Las siguientes combinaciones de las mutaciones mencionadas antes incluyen: supresión de (D183-G184) +N195F; supresión de ( 183 - Gl 84 ) +G186R ; supresión de (D183-G184)+G186R+N195F y G186R+N195F.

Termoestabilidad aumentada Las mutaciones que resultan en variantes de la invención, por ej emplo, tienen termoestabilidad aumentada, en particular a pH ácido una concentración baj a de Ca2+ que U , incluyen mutaciones en las siguientes posiciones (utilizando la numeración de alfa-amilasa AA560, es decir, la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2) : R158, N174, G186, N195, N197, H210, E212, V214, V215, V216, 5 K269, N270. En el contexto de la invención, el término "pH ácido" significa un pH inferior a 7.0, especialmente debajo de este intervalo, en el cual normalmente se realizan procesos de licuefacción de algodón industriales, el cual está entre pH 5.5 10 y 6.2. En el contexto de la presente invención, el término "concentración baja de calcio" significa una concentración por debajo de la concentración normal utilizada en la licuefacción de almidón industrial. Las concentraciones normales varían en 15 base en la concentración de Ca2+ libre en el maíz. Normalmente, se agrega una dosificación que corresponde a 1 mM (40 ppm) junto con la concentración en maíz que proporciona entre 40 y 60 ppm de Ca2+ libre. En el contexto de la invención, el término "altas 20 temperaturas" significa temperaturas entre 95 °C y 160 °C, especialmente el intervalo de temperatura en el cual normalmente se lleva a cabo el proceso de licuefacción de almidón industrial, temperatura la cual está entre 95 °C y 105°C.

Los inventores han encontrado que se puede incrementar más la termoestabilidad, en particular a pH ácido o a una concentración baja de Ca2+ o ambas, al combinar otras mutaciones que incluyen las mutaciones mencionadas antes o 1206, entre sí. Tales mutaciones "adicionales" son las siguientes (en relación a la alfa-amilasa AA560, (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2) : N195, E212, E216, K269 e 1206. Tal mutación se puede combinar además con supresiones en una, preferiblemente dos o incluso tres posiciones, como se describe en el documento WO 96/23873 (es decir, en las posiciones R181, G182, D183, G184 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en la presente) . De acuerdo con la presente invención, se contemplan variantes de una alfa-amilasa AA560 parental con actividad de alfa-amilasa que comprende mutaciones en dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete de las posiciones anteriores. Se debe enfatizar que se contemplan no solo las alfa-amilasas AA560 mencionadas antes. Además, se contemplan alfa-amilasas que tengan un grado de homología (condición idéntica) como se define en lo siguiente, para incluirlas dentro del alcance de la presente invención. Se debe mencionar aquí que los residuos aminoácidos, respectivamente, en las posiciones que corresponden a N195, 1206, E212 y E216 respectivamente, en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, constituyen residuos aminoácidos los cuales están conservados en muchas alfa-amilasas similares a Termamyl, es decir, TermamylMR (alfa-amilasa de B. 1 icheni formis) . Así, por ejemplo, las posiciones correspondientes de los residuos en AA560 y Termamyl se pueden ver en la alineación en la figura l y en la Tabla 1 y la Tabla 2, a continuación.

Tabla 1.

Alfa-amilasa similar a termamyl B hcheniformis (Termamyl) N190 1201 H205 E211 N335 AA560 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 5) N195 1206 H210 E211 ?SD Tabla 2.

Alfa-amilasa similar a termamyl SP690 R181, G182, T183, G184, K185, A185 SP722 R181, G182, T183, G184, K185, A185 AA560 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 2) R181, G182, T183, G184, K185, Al» h Las mutaciones de estos residuos aminoácidos conservados son muy importantes en relación a la alteración de las propiedades . Cuando se utiliza la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN 5 NÚMERO: 2 para numerar dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete mutaciones de acuerdo con la invención, se pueden realizar en las siguientes posiciones para alterar las propiedades, en particular, para incrementar la termoestabilidad a pH ácido o a bajas concentraciones de Ca2+, o ambas cosas (en relación a 10 la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 en la presente) : 1: R181*, G182*, D183*, G184*; 2: N195A,R,D,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; 3: I206A,R,D,N,C,E,Q,G,H,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; 4: E212A,R,D,N,C,Q,G,H, I , L, K, M, F, P, S , T, W, Y, V; 15 5: E216A,R,D,N,C,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; 6: K269A,R,D,N,C,E,Q,G,H,I,L,M,F,P,S,T,W,Y,V; 7: R181A,N,D,C,E,Q,G,H, I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V. Se contempla de acuerdo con la presente invención la combinación de tres, cuatro, cinco, seis o siete mutaciones. 20 Las mutaciones dobles específicas son de acuerdo con la invención (utilizando la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 para la numeración) : -R181*/G182*/N195A,R,D,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; -G182*/T183*/N195A,R,D,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; 25 -T183*/G184*/N195A,N,D,C,E,Q,G,H, I , L, K, M, F, P, S , T, W, Y, V; -I183*/G184*/N195A,R Q,G,H P,S,T,W,Y,V,V -R181*/G182*/V206A,R M,F,P,S,T,W,Y -R182*/G183*/V206A,R M,F,P,S,T,W,Y -T183*/G184*/V206A, R M,F,P,S,T,W,Y -R181*/G182*/E212A,R F,P,S,T,W,Y,V -R182*/T183*/E212A,R F,P,S,T,W,Y,V -R183*/G184*/E212A,R F,P,S,T,W,Y,V -R181*/G182*/E216A,R F,P,S,T,W,Y,V -R182*/G183*/E216A,R F,P,S,T,W,Y,V -T183*/G184*/E216A,R F,P,S,T,W,Y,V -R181*/G182*/K269A,R F,P,S,T,W,Y,V -R182*/T183*/K269A,R F,P,S,T,W,Y,V -R183*/G184*/K269A,R F,P,S,T,W,Y,V -N195A,R,D,C,E,Q,G,H V; /V206A,R,D,N,C,E,Q,G Y; -N195A,R,D,C,E,Q,G,H V; /E212A,R,D,N,C,Q,G,H V; -N195A,R,D,C,E,Q,G,H V; /E216A,R,D,N,C,Q,G,H V; -N195A,R,D,C,E,Q,G,H V; /K269A,R,D,N,C,E,Q,G V; -N195A,R,D,N,C,E,Q,G Y; /E212A,R,D,N,C,Q,G,H V; -V206A,R,D,N,C,E,Q,G Y; /E216A,R,D,N,C,Q,G,H V; -I206A,R/D,N,C,E,Q,G,H,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; /K269A,R,D,N,C,E,Q,G,H,I,L,M,F,P,S,T,W,Y,V; -E212A,R,D,N,C,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; /E216A,R,D,N/C,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; 5 E212A,R,D,N,C,Q,G,H,I,L,K M,F,P/S,T,W,Y,V; /K269A,R,D,N,C,E,Q,G,H,I,L,M,F,P,S,T,W,Y,V; -E216A,R,D,N,C,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; /K269A,R,D,N,C,E,Q,G,H,I,L,M,F,P,S,T,W,Y,V. En una modalidad preferida, la variante comprende las 0 siguientes mutaciones: N195F/K264S en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o en las posiciones correspondientes en las alfa-amilasas homologas 96%, como se define aquí. En otra modalidad, la variante de la invención comprende las siguientes mutaciones: R181*/G182*/N195F en la SECUENCIA DE 5 IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 , o en posiciones correspondientes en otras alfa-amilasas homologas. Tal variante puede comprender además una sustitución en la posición E216Q.

Estabilidad mejorada en Ca2+ de la variante AA560, a pH 8-10.5 0 La estabilidad mejorada en Ca2+ significa que se ha mejorado la estabilidad de la enzima bajo una supresión de Ca2+. En el contexto de la presente invención, las mutaciones de importancia (que incluyen sustituciones y supresiones de aminoácidos) , con respecto a la obtención de una estabilidad mejorada en Ca2+ a pH alto, incluye mutaciones o supresiones, o ambas, descritas antes en la sección "termoestabilidad aumentada" .

Mutaciones generales de la invención Se puede preferir que una variante de la invención comprenda una o más modificaciones además de las indicadas antes. De esta manera, puede ser ventajoso que uno o más residuos prolina presentes en la parte de la variante de alfa- amilasa la cual es modificada, sean sustituidos con un residuo que no es prolina el cual puede ser cualquiera de los residuos diferentes de prolina que se presentan de manera natural posibles, y preferiblemente el cual es una alanina, glicina, serina, treonina, valina o leucina. De manera análoga, se puede preferir que uno o más residuos cisteína presentes entre los residuos de aminoácidos con los cuales se modifica la alfa-amilasa parental estén sustituidos con un residuo que sea diferente de cisteína tal como serina, alanina, treonina, glicina, valina o leucina. Además una variante de la invención puede — ya sea como única modificación o en combinación con cualquiera de las modificaciones indicadas antes — sea modificada de manera que uno o más de Asp o Glu o ambos, presentes en un fragmento de aminoácidos corresponda al fragmento de aminoácidos 190-214 de asfalw.tM ^^wto*fea«É¿ai__ la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 esté sustituido por Asn o Gln, o ambos, respectivamente. También es de interés la sustitución, en la alfa-amilasa, de uno o más de los residuos Lys presentes en un fragmento de aminoácidos que corresponde 5 al fragmento de aminoácidos 190-214 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, por una Arg. Se comprenderá que la presente invención abarca variantes que incorporan dos o más de las modificaciones indicadas antes . 10 Además, puede ser ventajoso introducir mutaciones puntuales en cualquiera de las variantes que se describen aquí . Las mutaciones adecuadamente pueden incluir mutaciones en las siguientes posiciones: Y133, L17, M202, V214. 15 Clonación de una secuencia de ADN que codifica para una alfa- amilasa La secuencia de ADN que codifica para una alfa- amilasa parental como se define antes se puede aislar de 20 cualquier célula o microorganismo que produzca la alfa-amilasa en cuestión, utilizando varios métodos bien conocidos en la técnica. En primer lugar, se debe construir una biblioteca de ADN genómico o de ADNc o de ambos, utilizando ADN cromosómico o ARN mensajero a partir del organismo que produce la alfa- 25 amilasa que se va a estudiar. Posteriormente, si se conoce la ««aa& ÉfclifelÉ i liadSM . . . . ,: . . -• • ,.,. . .. ir-J.. . ., ¿ t ßu?é>*??lm secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa, se pueden sintetizar sondas oligonucleotídicas marcadas homologas y se pueden utilizar para identificar clones que codifican para alfa-amilasa a partir de una biblioteca genómica preparada a partir del organismo en cuestión. Alternativamente, se pueden utilizar sondas de oligonucleótidos marcados que contengan secuencias homologas a un gen conocido para alfa-amilasa, como una sonda para identificar clones que codifiquen para alfa-amilasa, utilizando condiciones de hibridación y lavado de astringencia o rigurosidad menor. Otro método adicional para identificar clones que codifiquen para alfa-amilasa puede involucrar injertar fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, bacterias alfa-amilasa negativas transformantes con la biblioteca de ADN genómico resultante y después sembrar en placa las bacterias transformadas en agar que contiene un sustrato para alfa-amilasa, por lo que se permite que se identifiquen clones que expresan alfa-amilasa. De manera alternativa, se puede preparar sintéticamente una secuencia de ADN que codifica para la enzima mediante métodos convencionales o estándar establecidos, por ejemplo el método de fosforoa idita descrito por S. L. Beaucage y M.H. Caruthers (1981) o el método descrito por Matthes et al. (1984) . En el método de fosforoamidita, se sintetizan oligonucleótidos, por ejemplo, en un sintetizador de ADN «i , automático, purificado, reasociado, ligado y clonado en vectores apropiados . Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de origen mixto, genómico y sintético, sintético mixto y de origen de ADNc o genómico mixto y de origen de ADNc, preparado al ligar fragmentos de origen sintético, genómico o de ADNc (según sea apropiado, los fragmentos corresponden a diversas partes de la secuencia completa de ADN) , de acuerdo con técnicas estándar o convencionales. La secuencia de ADN también se puede preparar por reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando cebadores específicos, por ejemplo como se describe en el documento de los Estados Unidos 4,683,202 o R.K. Saiki et al. (1988).

Mutagénesis dirigida a sitio Una vez que se ha aislado la secuencia de ADN que codifica para alfa-amilasa y que se han identificado los sitios deseables para mutación, se pueden introducir mutaciones utilizando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que flanquean a los sitios de mutación deseados; se insertan nucleótidos mutantes durante la síntesis de oligonucleótido. En un método específico, una separación de cadena única de ADN, que une la secuencia que codifica para alfa-amilasa es generada en un vector que presenta el gen para alfa-amilasa. Después, el nucleótido sintético que presenta la mutación deseada se reasocia a una porción homologa de un ADN de cadena sencilla. La separación remanente después se rellena con ADN polimerasa 1 (fragmento Klenow) y la construcción se liga utilizando ligasa T4. Un ejemplo específico de este método se describe en Morinaga et al. (1984). El documento de los Estados Unidos 4,760,025 describe la introducción de oligonucleótidos que codifican para mutaciones múltiples al realizar alteraciones menores del cásete. Sin embargo, se puede introducir una variedad incluso mayor de mutaciones en cualquier momento por el método de Morinaga, debido a que se pueden introducir una multitud de oligonucleótidos de diversas longitudes. Otro método para introducir mutaciones en secuencias de ADN que codifican para alfa-amilasa se describe en Nelson y Long (1989) . Involucra la generación en 3 etapas de un fragmento de PCR que contiene la mutación deseada introducida mediante la utilización de una cadena de ADN sintetizada químicamente como uno de los cebadores en las reacciones de PCR. A partir del fragmento generado por PCR, se puede aislar un fragmento de ADN que presente la mutación por separación con endonucleasas de restricción y se vuelve a insertar en el plásmido de expresión. ««jaS? Mutaaénesis aleatoria La mutagénesis aleatoria se realiza adecuadamente ya sea como mutagénesis localizada o aleatoria específica de 5 región en por lo menos tres partes del gen que se traducen a una secuencia de aminoácidos que se muestren en cuestión, o dentro del gen completo. La mutagénesis aleatoria de una secuencia de ADN que codifica para una alfa-amilasa parental se puede llevar a cabo 10 convenientemente mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica. En relación con lo anterior, un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con un método para generar una variante de una alfa-amilasa parental, por ejemplo en donde 15 la variante muestra estabilidad térmica alterada o aumentada en relación a la parental, el método comprende: (a) someter a mutagénesis aleatoria una secuencia de ADN que codifica para la alfa-amilasa parental; (b) expresar en una célula huésped, la secuencia de 20 ADN mutado que se obtiene en la etapa (a) , y (c) examinar en búsqueda de células huéspedes que expresen una variante de alfa-amilasa la cual tenga una propiedad alterada (por ejemplo estabilidad térmica) en relación a la alfa-amilasa parental.

La etapa (a) del método anterior de la invención preferiblemente se lleva a cabo utilizando cebadores alterados. Por ejemplo, se puede realizar mutagénesis aleatoria mediante el uso de un agente mutagénico físico o químico adecuado, mediante el uso de un oligonucleótido adecuado o al someter la secuencia de ADN a mutagénesis generada por PCR. Además, se puede llevar a cabo la mutagénesis aleatoria mediante el uso de cualquier combinación de estos agentes mutagénicos. El agente mutagénico puede ser, por ejemplo, uno que induzca transiciones, transversiones, inversiones, alteraciones, supresiones o inserciones. Los ejemplos de agentes mutagénicos físicos o químicos adecuados para el presente propósito incluyen irradiación ultravioleta (UV) , hidroxilamina, N-metil-N' -nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG) , O-metilhidroxilamina, ácido nitroso, etilmetanosulfonato (EMS) , bisulfito de sodio, ácido fórmico y análogos nucleotídicos . Cuando se utilizan tales agentes, la mutagénesis típicamente se lleva a cabo al incubar la secuencia de ADN que codifica para la enzima parental que se va a someter a mutagénesis, en presencia del agente mutagénico de elección bajo condiciones adecuadas para que se lleve a cabo la mutagénesis, y seleccionar ADNm utado que tenga las propiedades que se desean. Cuando la mutagénesis se realiza mediante el uso de un oligonucleótido, el oligonucleótido se puede alterar o se le pueden agregar tres nucleótidos no parentales durante la síntesis del oligonucleótido en las posiciones las cuales van a cambiar. La alteración o el agregado se puede realizar de manera que se eviten codones para aminoácidos que no se desean. El oligonucleótido alterado o agregado se puede incorporar en el ADN que codifica para la enzima alfa-amilasa por medio de cualquier técnica publicada, utilizando, por ejemplo, PCR, LCR o cualquier ADN polimerasa y ligasa que se considere apropiada. Preferiblemente, la alteración se lleva a cabo utilizando "alteración aleatoria constante", en la cual se define previamente el porcentaje de tipo silvestre y de mutación en cada posición. Además, la alteración se puede dirigir hacia una preferencia para la introducción de ciertos nucleótidos, y de esta manera se genera una preferencia para la introducción de uno o más residuos aminoácidos específicos. La alteración se puede realizar, por ejemplo, de manera que se permite la introducción de 90% de tipo silvestre y 10% de mutaciones en cada posición. Una consideración adicional en la elección de un esquema de alteración se basa en restricciones genéticas así como estructurales de proteína. El esquema de alteración se puede elaborar utilizando el programa DOPE (véase la sección de "Materiales y métodos"), el cual, por ejemplo, asegura que se evite la introducciones de codones de detención. Cuando se utiliza mutagénesis generada por PCR, ya sea un gen tratado químicamente o no tratado que codifique para una alfa-amilasa parental se somete a PCR bajo condiciones que incrementan la incorporación errónea de nucleótidos (Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol. 1, 1989, pp. 11-15). Una cepa mutadora de E. coli (Fowler et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, pp. 179-191), S. cereviseae o cualquier otro organismo microbiano se puede utilizar para la mutagénesis aleatoria del ADN que codifica para la alfa-amilasa por ejemplo, por transformación de un plásmido que contenga en la glicosilasa parental en una cepa mutadora, hacer crecer la cepa mutadora con el plásmido y aislar el plásmido mutado de la cepa mutadora. El plásmido mutado puede ser transformado subsecuentemente en el organismo de expresión. La secuencia de ADN que se va a someter a mutagénesis puede estar presente convenientemente en una biblioteca genómica o de ADNc preparada a partir de un organismo que exprese la alfa-amilasa parental. De manera alternativa, la secuencia de ADN puede estar presente en un vector adecuado tal como un plásmido o un bacteriófago, el cual puede ser incubado como tal o se puede exponer de alguna otra manera al agente mutagénico. El ADN que va a ser sometido a mutagénesis también puede estar presente en una célula huésped ya sea que se integre en el genoma de la célula o que este presente en un vector albergado en la célula. Finalmente, el ADN que se va a someter a mutagénesis puede estar en forma aislada. Se comprenderá que la secuencia de ADN que se va a someter a mutagénesis aleatoria preferiblemente es ADN o una secuencia de ADN genómico. En algunos casos puede ser conveniente amplificar la secuencia de ADN mutado para realizar la etapa de expresión b) 5 o la etapa de examen c) . Tal amplificación se puede llevar a cabo de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica, el método actualmente preferido es amplificación generada por PCR utilizando cebadores oligonucleotídicos preparados en base a la secuencia de ADN o de aminoácidos de la enzima parental. 10 Después de la incubación con, o la exposición al agente mutagénico, el ADN mutado se expresa por cultivo de una célula huésped adecuada que presente la secuencia de ADN bajo condiciones que permitan que se lleve a cabo la expresión. La célula huésped utilizada para este propósito puede ser una la 15 cual ha sido transformada con la secuencia de ADN mutada, presente de manera opcional en un vector, o una la cual ha transportado la secuencia de ADN que codifica para la enzima parental durante el tratamiento de mutagénesis. Los ejemplos de células huésped adecuadas son las siguientes : bacterias 20 grampositivas tales como Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus , Bacillus alkalophilus , Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans o Streptomyces murinus y bacteria gramnegativa tales como E. coli . La secuencia mutada de ADN puede comprender además una secuencia de ADN que codifique para fusiones que permitan la expresión de la secuencia mutada de ADN.

Mutagénesis aleatoria localizada La mutagénesis aleatoria se puede localizar ventajosamente en una parte de la alfa-amilasa parental en cuestión. Esto puede ser ventajoso, por ejemplo, cuando se han identificado ciertas regiones de la enzima como de importancia particular para una propiedad dada de la enzima, y cuando la modificación se espera que resulte en una variante que tiene propiedades mejoradas. Tales regiones normalmente se pueden identificar cuando se ha dilucidado la estructura terciaria de la enzima parental y se ha relacionado con la función de la enzima. La mutagénesis aleatoria localizada o específica de región se lleva a cabo convenientemente mediante el uso de técnicas de mutagénesis generada por PCR, como se describe en lo anterior, o cualquier otra técnica adecuada conocida en el arte. De manera alternativa, la secuencia de ADN que codifica para la parte de la secuencia de ADN que se va a modificar se puede aislar, por ejemplo, por inserción en un vector adecuado L| t -*~X ^ata^rf-Jto y tal parte se puede someter subsecuentemente a mutagénesis mediante el uso de cualquiera de los métodos de mutagénesis discutidos antes.

Métodos alternativos para proporcionar variantes de alfa- amilasa Los métodos alternativos para proporcionar variantes de la invención incluyen el método de mezclado de genes conocido en la técnica y que incluye los métodos descritos, por ejemplo, en WO 95/22625 (de Affymax Technologies N.V.) y WO 96/00343 (de Novo Nordisk A/S) .

Expresión de variantes de alfa-amilasa De acuerdo con la invención, se puede expresar una secuencia de ADN que codifica para una variante producida por los métodos descritos antes, o por métodos alternativos conocidos en la técnica, en forma de enzima, utilizando un vector de expresión el cual típicamente incluye secuencias de control que codifican para un promotor, operador, un sitio de unión de ribosoma, señal de inicio de traducción y, opcionalmente, un gen represor o varios genes activadores. El vector de expresión recombinante que presenta la secuencia de ADN que codifica para una variante de alfa-amilasa de la invención, puede ser cualquier vector el cual se pueda someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinante, la elección del vector con frecuencia dependerá de la célula huésped en la cual se va a introducir. Así, el vector puede ser un vector que se replique de manera autónoma, es decir, un vector el cual exista como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un bacteriófago o un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. De manera alternativa, el vector puede ser uno el cual, cuando se introduce en una célula huésped, se integre en el genoma de la célula huésped y se replique junto con el o los cromosomas en los cuales se ha integrado. En el vector, la secuencia de ADN se puede conectar operablemente a una secuencia promotora adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN la cual muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección y se puede derivar de genes que codifican para proteínas homologas o heterólogas a la célula huésped. Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica para la variante de alfa-amilasa de la invención, especialmente en un huésped bacteriano, son el promotor del operón lac de E. coli , los promotores del gen dagrA para agarasa de Streptomyces coelicolor, los promotores del gen para alfa-amilasa de Bacillus licheniformis ( amyL) , los promotores del i. . gen para amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus i amyM) , los promotores de alfa-amilasa de Ba ci l l u s amyloliquefaciens (amyO) , los promotores de los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis etc. Para la transcripción en un huésped micótico, los ejemplos de promotores útiles son aquéllos derivados del gen que codifica para la amilasa TAKA A . oryzae proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei alfa-amilasa neutra de A. nigrer, alfa-amilasa estable en ácido de A . niger, glucoamilasa de A . niger, lipasa de Rhizomucor mi ehei , proteasa alcalina de A . oryzae , triosa fosfato isomerasa de A . oryzae o acetamidasa de A . nidulans . El vector de expresión de la invención también puede comprender un terminador de transcripción adecuado y, en eucariotas, secuencias de poliadenilación conectadas operablemente a la secuencia de ADN que codifican para la variante de alfa-amilasa de la invención. Las secuencias de terminación y poliadenilación se pueden derivar adecuadamente de las mismas fuentes que el promotor. El vector puede comprender además una secuencia de ADN que permite al vector replicarse en la célula huésped en cuestión. Los ejemplos de tales secuencias son los orígenes de replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUBUO, pE194, pAMBl y pIJ702. El vector también puede comprender un marcador seleccionable, por ejemplo un gen cuyo producto complemente un defecto en la célula huésped, tales como los genes dal de B . subtilis o B . licheniformis o uno el cual confiere resistencia a antibióticos, tal como ampicilina, canamicina, cloramfenicol o resistencia a tetraciclina. Además, el vector puede 5 comprender marcadores de selección de Aspergillus tales como amdS, argB, niaD y sC, un marcador genera resistencia a higromicina, o la selección se puede llevar a cabo por cotransformación, por ejemplo, como se describe en el documento WO 91/17243. 10 Aunque la expresión intracelular puede ser ventajosa en algunos aspectos, por ejemplo, cuando se utilizan ciertas bacterias como células huéspedes, generalmente se prefiere que la expresión sea extracelular. En general, las alfa-amilasas de Bacillus mencionadas aquí comprenden una región previa que 15 permite la secreción de la proteasa expresada al medio de cultivo. Si es deseable, esta región previa se puede sustituir por una región previa o secuencia de señal diferente, acompañada convenientemente por sustitución de las secuencias de ADN que codifican para las regiones previas respectivas . 20 Los procedimientos utilizados para ligar la construcción (plásmido recombinante) de ADN de la invención que codifica para una variante de alfa-amilasa, los elementos promotores, terminadores y otros elementos, respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados que contienen la 25 información necesaria para replicación, son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Ed., Cold Spring Harbor, 1989) . La célula de la invención, que comprende ya sea una construcción de ADN o un vector de expresión de la invención como se define antes, se utiliza ventajosamente como una célula huésped en la producción recombinante de una variante de alfa-amilasa de la invención. La célula se puede transformar con una construcción de ADN de la invención que codifique para la variante, convenientemente por integración de la construcción de ADN (en una o más copias) en el cromosoma del huésped. Esta integración generalmente se considera como una ventaja puesto que la secuencia de ADN es más probable que se mantenga de manera estable en la célula. La integración de las construcciones de ADN en el cromosoma del huésped se pueden realizar de acuerdo con métodos convencionales, por ejemplo, por recombinación homologa o heteróloga. De manera alternativa, la célula se puede transformar con un vector de expresión como se describe en lo anterior en relación con los diferentes tipos de células huéspedes. La célula de la invención puede ser una célula de un organismo superior tal como un mamífero o un insecto, pero preferiblemente es una célula microbiana, por ejemplo una célula bacteriana o micótica (que incluye levaduras) .

- Los ejemplos de bacterias adecuadas son bacterias grampositivas tales como Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis , Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus , Bacillus alkalophilus , Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis , o Streptomyces lividans o Streptomyces murinus o bacteria gramnegativas tales como E. coli. La transformación de las bacterias se puede llevar a cabo, por ejemplo por transformación de protoplastos o mediante la utilización de células competentes de una manera conocida per se . El organismo de levadura se puede seleccionar favorablemente de una especie de Sac charomyce s o Schizosaccharomyces , por ejemplo Saccharomyces cerevisiae. Los hongos filamentosos pueden ventajosamente pertenecer a una especie de Aspergillus, por ejemplo Aspergillus oryzae o Aspergillus niger. Las células micóticas se pueden transformar por un proceso que involucra formación de protoplastos y transformación de los protoplastos, seguido por regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Un procedimiento adecuado para la transformación de células huéspedes de Aspergillus se describe en el documento EP 238 023. En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con un método para elaborar una variante de alfa-amilasa de la invención, método el cual comprende cultivar una célula huésped como se describe antes, bajo condiciones que conducen en la producción de la variante y recuperar la variante de las células o del medio de cultivo, o de ambos lugares . El medio utilizado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para hacer crecer a la célula huésped en cuestión y obtener la expresión de la variante de alfa-amilasa de la invención. Están disponibles medios adecuados de proveedores comerciales, o bien se pueden preparar de acuerdo con recetas publicadas (por ejemplo, como se describen en los catálogos de la American Type Culture Collection) . La variante de alfa-amilasa secretada de las células huéspedes se puede recuperar convenientemente del medio de cultivo por procedimientos bien conocidos, que incluyen separar las células del medio por centrifugación o filtración y precipitar los componentes proteináceos del medio, por medio de una sal tal como sulfato de amonio, seguido por el uso de procedimientos cromatográficos tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o similar.

Secuencias de ácido nucleico La presente invención también se relaciona con secuencias aisladas de ácido nucleico, las cuales codifican para un polipéptido de la presente invención. En una modalidad preferida, la secuencia de ácido nucleico se establece en las SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 O SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3. En otra modalidad más preferida, la secuencia de ácido nucleico es la secuencia contenida en el plásmido pLiH1274 o el plásmido pTVB 299 que está contenida en Escheri chia coli DSM12761 y Escheri chia coli DSM12764, respectivamente. En otra modalidad preferida, la secuencia de ácido nucleico es una región codificante para polipéptido maduro de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3. La presente invención también abarca secuencias de ácido nucleico las cuales codifican para un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 la cual difiere de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 O la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 en virtud de la degeneración del código genético. La presente invención también se relaciona con subsecuencias de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3, las cuales codifican para fragmentos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4, respectivamente, que tienen actividad de alfa-amilasa. Las subsecuencias de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 O la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 son secuencias de ácido nucleico abarcadas por las SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 O SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3, excepto que se han suprimido uno o más nucleótidos del extremo 5 ' o 3 ' o de ambos . La presente invención también se relaciona con secuencias mutantes de ácido nucleico que comprenden por lo menos una mutación en la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3, en la cual la secuencia mutante de ácido nucleico codifica para un polipéptido el cual consiste de los aminoácidos 1 a 485 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4. Las técnicas utilizadas para aislar o clonar una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido son conocidas en la técnica e incluyen el aislamiento a partir de ADN genómico, preparación a partir de ADNc o una combinación de los mismos . La clonación de las secuencias de ácido nucleico de la presente invención a partir de tal ADN genómico se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante la utilización de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) bien conocida o el examen de anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos clonados de ADN con rasgos estructurales compartidos. Véase, por ejemplo Innis et al . , 1990, PCR : A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Se pueden utilizar otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico tales como reacción en cadena de ligasa (LCR) , transcripción activada y ligada (LAT) y amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA) . La secuencia de ácido nucleico se puede clonar a partir de una cepa de Bacillus u otro organismo relacionado y por lo tanto, por ejemplo, puede ser alélica o de especies variantes de la región codificante para el polipéptido de la secuencia de ácido nucleico. El término "secuencia aislada de ácido nucleico", como se utiliza en la presente, se refiere a una secuencia de ácido nucleico la cual está esencialmente libre de otras secuencias de ácido nucleico, por ejemplo es por lo menos aproximadamente 20% pura, de manera preferible por lo menos aproximadamente 40% pura, de manera más preferible por lo menos aproximadamente 60% pura, incluso de manera más preferible por lo menos aproximadamente 80% pura, y de manera más preferible por lo menos aproximadamente 90% pura, determinado por electroforesis en agarosa. Por ejemplo, se puede obtener una secuencia aislada de ácido nucleico por procedimientos estándar o convencionales de clonación utilizados en ingeniería genética para cambiar de lugar la secuencia de ácido nucleico, de su posición natural a un sitio diferente en donde se reproducirá.

Los procedimientos de clonación pueden involucrar extirpación y aislamiento de un fragmento deseado de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido, la inserción del fragmento en una molécula vector, e incorporación del vector recombinante en una célula huésped en donde se realizarán copias múltiples o clones de la secuencia de ácido nucleico. La secuencia de ácido nucleico puede ser de origen genómico, de ADNc, ARN, semisintético o sintético, o cualquier combinación de los mismos.

Homología de la secuencia de ADN gue codifica para la enzima La presente invención también se relaciona con secuencias de ácido nucleico las cuales tienen grado de homología con la secuencia codificante para el polipéptido maduro de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 (es decir, nucleótidos 1 a 1458) o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 (es decir, nucleótidos 1 a 1458) con por lo menos aproximadamente 96% de homología a nivel de ADN, preferiblemente con por lo menos aproximadamente 97%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 98%, de manera más preferible, por lo menos aproximadamente 99% de homología, los cuales codifican para un polipéptido activo. La homología de secuencia de ADN se puede determinar como el grado de identidad entre las dos secuencias indicando . •;aaa¡te ¡l.^fe una derivación de la primera secuencia a partir de la segunda. La homología se puede determinar adecuadamente por medio de programas de computadora conocidos en la técnica tales como GAP que se proporciona en el paquete de programa GCG (descrito antes) . Por lo tanto, se puede utilizar Gap GCGvd con los siguientes parámetros implícitos: castigo por creación de GAP (separación) de 5.0 y castigo por extensión de GAP de 0.3, matriz de calificación implícita. GAP utiliza el método de Needleman/Wunsch/Sellers para realizar alineaciones. La modificación de una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la presente invención puede ser necesario para la síntesis de polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. El término "sustancialmente similar" al polipéptido, se refiere a formas que se presentan de manera natural del polipéptido. Estos polipéptidos pueden diferir de alguna manera sometida a ingeniería del polipéptido aislado de su fuente nativa, por ejemplo las variantes que difieren en actividad específica, termoestabilidad, pH óptimo o similar. La secuencia variante se puede construir en base en la secuencia de ácido nucleico presentada como polipéptido que codifica parte de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3, por ejemplo, una subsecuencia de la misma, o bien por introducción de sustituciones de nucleótidos las cuales no generan otra secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico, pero las cuales corresponden a la utilización de codones del organismo huésped en donde se pretende la producción de la enzima, o por introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden generar una secuencia diferente de aminoácidos. Para una descripción general de sustitución de nucleótidos véase, por ejemplo Ford, et al . , 1991, Protein Expression and Purification 2 : 95-107. Será evidente para aquéllos expertos en la técnica que tales sustituciones se pueden realizar fuera de las regiones críticas para la función de la molécula y aún resultar en un polipéptido activo. Los residuos aminoácidos esenciales para la actividad del polipéptido codificado por la secuencia aislada de ácido nucleico de la invención, y por lo tanto preferiblemente no se someten a sustitución, se pueden identificar de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de exploración con alanina (véase, por ejemplo, Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última técnica, se introducen mutaciones en cada residuo cargado positivamente en la molécula y la molécula mutante resultante se prueba para determinar su actividad [enzimática] para identificar los residuos aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. También se pueden determinar los sitios de interacción sustrato-enzima por análisis de la estructura tridimensional, determinado por técnicas tales como análisis por resonancia magnética nuclear, cristalografía o etiquetado de fotoafinidad (véase, por ejemplo; de Vos et al . , 1992, Science 255: 306-312; Smith et al . , 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al . , 1992, FEBS Letters 309: 59-64) . La presente invención también se relaciona con secuencias aisladas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido de la presente invención, el cual hibridiza bajo condiciones de astringencia o rigurosidad media, preferiblemente bajo condiciones de astringencia media-alta, de manera más preferible bajo condiciones de astringencia alta y de manera mucho más preferible bajo condiciones de muy alta astringencia, con una sonda de ácido nucleico la cual hibridiza bajo las mismas condiciones con la secuencia de ácido nucleico de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3, o su cadena complementaria; o variantes alélicas y subsecuencias de las mismas (Sambrook et al . , 1989, supra) , como se define aquí. La presente invención también se relaciona con secuencias aisladas de ácido nucleico producidas al (a) hibridizar un ADN bajo condiciones de astringencia o rigurosidad medias, medias-altas, altas o muy altas, con la secuencia de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3, o sus cadenas complementarias, o una subsecuencia de las mismas; y (b) aislar , \w .^ i -.Áxt * ¿ * ^_3g?^^£5feM la secuencia de ácido nucleico. La subsecuencia preferiblemente es una secuencia de por lo menos 100 nucleótidos tal como una secuencia, la cual codifica para un fragmento polipeptídico, el cual tiene actividad de alfa-amilasa. 5 Métodos para elaborar secuencias mutantes de ácido nucleico La presente invención se relaciona además con métodos para producir una secuencia mutante de ácido nucleico que 10 comprende introducir por lo menos una mutación en la secuencia codificante para el polipéptido maduro de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 O la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3, o una subsecuencia de la misma, en donde la secuencia mutante de ácido nucleico codifica para un 15 polipéptido el cual consiste de 1 a 485 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4 , o un fragmento de la misma, la cual tiene actividad de alfa-amilasa. La introducción de una mutación en la secuencia de 20 ácido nucleico para cambiar un nucleótido por otro nucleótido se puede llevar a cabo por mutagénesis dirigida al sitio utilizando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Un procedimiento particularmente útil es aquél que utiliza un vector de ADN de cadena doble, superenrollado con una inserción 25 de interés y dos cebadores sintéticos que contienen la mutación jgaMfej&ti?BlaÉ t- fti ??' &Ér¡< - . s- >-*- « « ' » •. r \Á . - *. i ^ s^^^&k que se desea. Los cebadores oligonucleotídicos, cada uno complementario a cadenas opuestas del vector, se extienden durante los ciclos de temperatura por medio de ADN polimerasa Pfu . Cuando se incorporan los cebadores, se genera un plásmido mutado que contiene las mellas dispersas. Después de los ciclos de temperatura, se genera un producto con Dpnl , el cual es específico para ADN metilado y semimetilado para digerir la plantilla de ADN parental y seleccionar el ADN sintetizado que contenga la mutación. También se pueden utilizar otros procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos adicionales incluyen mezclado o barajado de genes, por ejemplo, como se describe en WO 95/22625 (de Affymax Technologies N.V.) y WO 96/00343 (de Novo Nordisk A/S) .

Construcciones de ácido nucleico La presente invención también se relaciona con construcciones (plásmidos recombinantes) de ácido nucleico que comprenden una secuencia de ácido nucleico de la presente invención unida operablemente a una o más secuencias de control, las cuales dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control . Se comprenderá que el término expresión incluye cualquier etapa involucrada en la producción del polipéptido y que incluye, pero que no se limita ,. , . a transcripción, modificación post-transcripcional, traducción, modificación post-traduccional y secreción. En la presente se define a una "construcción de ácido nucleico" como una molécula de ácido nucleico, de cadena sencilla o doble, la cual se aisla de un gen que se presenta de manera natural o el cual se ha modificado para contener fragmentos de ácido nucleico los cuales se combinan y se yuxtaponen de una manera la cual de otra manera no existen en la naturaleza. El término construcción de ácido nucleico es sinónimo con el término cásete de expresión cuando la construcción de ácido nucleico contiene la totalidad de las secuencias de control necesarias para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención. El término "secuencia codificante" se define aquí como una porción de una secuencia de ácido nucleico, la cual especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto proteínico. Los límites de la secuencia codificante generalmente se determinan por un sitio de unión de ribosomas (procariotas) o por el codón de inicio ATG (eucariotas) que se localiza justo hacia el extremo 5' del marco de lectura abierta, en el extremo 5' del ARNm y una secuencia terminadora de transcripción que se localiza justo corriente abajo del marco de lectura abierta en el extremo 3' del ARNm. Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a ADN, ADNc y secuencias recombinantes de ácido nucleico.

Una secuencia aislada de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la presente invención se puede manipular de diversas maneras para proporcionar la expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia de ácido nucleico antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria, en base en el vector de expresión. Las técnicas para modificar secuencias de ácido nucleico utilizando métodos de ADN recombinante son bien conocidas en la técnica. El término "secuencias de control" se define aquí para incluir todos los componentes, los cuales son necesarios o ventajosos para la expresión de un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña a la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido. Tales secuencias de control incluyen, pero no se limitan a un líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptido, promotor, una secuencia de péptido señal y un terminador de transcripción. En un mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de transcripción y de detención de traducción. Las secuencias de control se pueden proporcionar con enlazadores con el propósito de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la ligación de las secuencias de control con la región codificante de la secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido. El término "unido operablemente" se define en la presente como una configuración en la cual se coloca apropiadamente una secuencia de control en una posición en relación a la secuencia codificante de la secuencia de ADN de manera que la secuencia de control dirige la expresión de un polipéptido.

Secuencia promotora La secuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, una secuencia de ácido nucleico, la cual es reconocida por una célula huésped para expresión de la secuencia de ácido nucleico. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcionales, las cuales median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico la cual muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, y se puede obtener de genes que codifican para polipéptidos extracelulares o intracelulares, ya sea homólogos o heterólogos para la célula huésped. Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones (plásmidos recombinantes) de ácido nucleico de la presente invención, especialmente en una célula huésped bacteriana, son los promotores que se obtienen del operón lac de E. coli , el gen para agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA) , el gen para levansucrasa de . . . - . . ¡. I 1 ^ rr . . ife^abfaf^a Bacillus subtilis (sac3) , el gen para alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL) , el gen para amilasa maltogénica de Bacillus etearo thermophilus (amyM) , el gen para alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ) , el gen para penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP) , los genes xylA y xilB de Bacillus subtilis y el gen para beta-lactamasa procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25) . Se describen promotores adicionales en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra.

Secuencia Terminadora La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está unida operablemente a la parte 31 terminal de la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido. En la presente invención se puede utilizar cualquier terminador, el cual sea funcional en la célula huésped de elección.

X -~ ^u..^fc«.^"- Péptido Señal La secuencia de control también puede ser una región codificante para el péptido señal que codifica para una secuencia de aminoácidos unida a la parte amino terminal del polipéptido y que dirige al polipéptido codificado a la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante de la secuencia de ácido nucleico puede contener inherentemente una región codificante para el péptido señal unida naturalmente en un marco de lectura de traducción con el segmento de la región codificante, la cual codifica para el polipéptido secretado. De manera alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante para el péptido señal, la cual es extraña a la secuencia codificante. La región codificante para el péptido señal extraña se puede requerir cuando la secuencia codificante no contiene de manera natural una región codificante para el péptido señal. De manera alternativa, la región codificante para el péptido señal extraña puede sustituir simplemente a la región codificante del péptido señal natural con el fin de mejorar la secreción del polipéptido. Sin embargo, en la presente invención se puede utilizar cualquier región codificante para péptido señal la cual dirija al polipéptido expresado a la vía secretora de una célula huésped de elección.

Las regiones codificantes para el péptido señal efectivas para las células huéspedes bacterianas son las regiones codificantes para péptido señal que se obtienen de los genes de amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacill us li cheniformis , beta-lactamasa de Bacill us li cheni formis , proteasas neutras ( np r T , np r S , nprM) de B a c i l l u s stearothermophilus y prsA de Bacillus subtilis . Se describen péptidos de señal adicionales por Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

Sistema Regulador También puede ser deseable agregar secuencias reguladoras las cuales permitan la regulación de la expresión del polipéptido en relación al crecimiento de la célula huésped. Los ejemplos de sistemas reguladores son aquellos los cuales provocan la expresión del gen que se va a activar o inactivar en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en sistemas procarióticos incluyen los sistemas operadores lac, tac y trp. En levadura, se puede utilizar el sistema ADH2 o el sistema GAL1. Los hongos filamentosos, el promotor de alfa-amilasa TAKA, el promotor de glucoamilasas de Aspergillus niger y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus . *ú¡ a^aaá& oryzae se pueden utilizar como secuencias reguladores. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas las cuales permiten la amplificación del gen. En sistemas eucarióticos, estos incluyen al gen para dihidrofolato reductasa, el cual se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneina los cuales son amplificados como metales pesados. En estos casos, la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido se puede unir operablemente a la secuencia reguladora.

Vectores de Expresión La presente invención también se relaciona con vectores de expresión recombinantes que comprenden una secuencia de ácido nucleico de la presente invención, un promotor y señales de detención transcripcionales y traduccionales. Las diversas secuencias de ácido nucleico y de control descritos antes se pueden unir para producir un vector de expresión recombinante el cual puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido en tales sitios. De manera alternativa, la secuencia de ácido nucleico de la presente invención se puede expresar al insertar una secuencia de ácido nucleico o una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia, en un vector apropiado para expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de manera que la secuencia codificante se une operablemente con las secuencias de control apropiadas, para su expresión. El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo un plásmido o un virus) el cual se somete convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y puede llevar a cabo la expresión de la secuencia de ácido nucleico. La elección del vector dependerá típicamente de lo compatible del vector con la célula huésped en la cual se va a introducir el vector. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados. El vector puede ser un vector que se replique de manera autónoma, es decir, un vector el cual existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. De manera alternativa, el vector puede ser uno el cual, cuando se introduce en la célula huésped, se integra al genoma y se replica junto con el o los cromosomas en el cual se han integrado. Además, se puede utilizar un solo vector o plásmido, o dos o más vectores o plásmidos, los cuales, juntos, contienen el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula huésped, o se puede utilizar un transposón. Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o más marcadores seleccionables los cuales permiten la selección fácil de las células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o viral, resistencia a metales pesados, prototrofía a auxótrofos, y similares. Los ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son los genes dal de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis , o marcadores los cuales confieren en resistencia a antibióticos tales como ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o resistencia a tetraciclina. Los marcadores adecuados para células huéspedes de levadura son ADE2, HIS3, LEU2 , LYS2, MET3 , TRP1 y URA3. Un marcador seleccionable para uso en una célula huésped micótica filamentosa se puede seleccionar del grupo que incluye, pero que no se limita a amdS (acetamidasa) , argB (ornitina carbamoiltransferasa) , bar (fosfinotricinoacetiltransferasa) , hygB (higromicina fosfotransferasa) , niaD (nitrato reductasa) , pyrG (orotidina- 5 ' -fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) , trpC (antranilato sintasa) así como equivalentes de los mismos. Las que se consideran de uso preferido en una célula Aspergillus son los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen ±>ar de Streptomyces hygroscopicus .

•* Li.

Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o varios elementos que permiten la integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del 5 genoma de la célula. Para integración en el genoma de la célula huésped, el vector se puede basar en la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido o para cualquier otro elemento del vector para integración estable del vector en el genoma por 10 recombinación homologa o no homologa. Alternativamente, el vector puede contener secuencias adicionales de ácido nucleico para dirigir la integración por recombinación homologa en el genoma de la célula huésped. Las secuencias adicionales de ácido nucleico permiten que el vector se integre en el genoma 15 de la célula huésped en una o varias posiciones precisas en el o los cromosomas. Para incrementar la probabilidad de integración en una posición precisa, los elementos integracionales preferiblemente deben contener una cantidad suficiente de ácidos nucleicos, tales como 100 a 1,500 pares 20 de bases, preferiblemente 400 a 1,500 pares de bases, y de manera más preferible 800 a 1,500 pares de bases, las cuales sean altamente homologas con la secuencia objetivo correspondiente para aumentar la probabilidad de recombinación homologa. Los elementos integracionales pueden ser cualquier 25 secuencia que sea homologa con la secuencia objetivo en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden ser secuencias de ácido nucleico no codificantes o codificantes. Por otra parte, el vector se puede integrar en el genoma de la célula huésped por recombinación no homologa. Para replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permite al vector replicarse autónomamente en la célula huésped en cuestión. Los ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli y pUBllO, pE194, pTA1060 y pAMßl que permiten la replicación en Bacillus . Los ejemplos de orígenes de replicación para uso en una célula huésped de levadura son el origen de replicación 2 micronn, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3 y la combinación de ARS4 y CEN6. El origen de replicación puede ser uno que tenga una mutación la cual vuelva su funcionamiento sensible a la temperatura en la célula huésped (véase, por ejemplo Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433). Se pueden insertar más de una copia de una secuencia de ácido nucleico de la presente invención en la célula huésped para incrementar la producción del producto del gen. Se puede obtener un incremento en el número de copias de la secuencia de ácido nucleico al integrar por lo menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o al incluir un gen marcador seleccionable amplificable con la secuencia de ácido nucleico en donde las células que contienen las copias amplificadas del gen marcador seleccionable y por lo tanto 5 copias adicionales de la secuencia de ácido nucleico se pueden seleccionar al cultivar las células en presencia de un agente seleccionable apropiado. Los procedimientos utilizados para ligar los elementos que se describen antes para construir los vectores 10 de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra) .

Células Huéspedes 15 La presente invención también se relaciona con células huéspedes recombinantes, que comprenden una secuencia de ácido nucleico de la invención, la cual se utiliza ventajosamente en la producción recombinante de los 20 polipéptidos. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de la presente invención se introduce en una célula huésped de manera que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante, como se describe anteriormente. El término "célula huésped" 25 abarca cualquier progenie de una célula parental que no es idéntica a la célula parental debido a mutaciones que se producen durante la replicación. La elección de una célula huésped en mayor grado dependerá del gen que codifica para el polipéptido y su fuente. La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, por ejemplo una procariota, o un microorganismo no unicelular, por ejemplo una eucariota. Las células unicelulares útiles son células bacterianas tales como bacterias grampositivas que incluyen pero que no se limitan a células de Bacillus, por ejemplo Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans , Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis ; o una célula de Streptomyces, por ejemplo Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o una bacteria gramnegativa tal como E. coli y Pseudomonas sp. En una modalidad preferida, la célula huésped bacteriana es una célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus o Bacillus subtilis. En otra modalidad preferida, la célula de Bacillus es una célula de Bacillus alcalofílica. La introducción de un vector en una célula huésped bacteriana se puede llevar a cabo, por ejemplo por transformación con protoplastos (véase, por ejemplo, Chang and Cohén, 1979, Mol ecular General Gene ti cs 168: 111-115), utilizando células competentes (véase, por ejemplo, Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56 : 209-221) , electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa y Dower 1988, Biotecíinigues 6: 742-751), o conjugación (véase, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278) .

Métodos de Producción La presente invención también se relaciona con métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende: (a) cultivar una cepa, la cual es una forma de tipo silvestre que es capaz de producir el polipéptido, para producir un sobrenadante que comprende al polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. Preferiblemente, la cepa del género Bacillus sp. La presente invención también se relaciona con métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende: (a) cultivar una célula huésped bajo condiciones que generen la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. La presente invención también se relaciona con métodos para producir un polipéptido de la presente invención que, comprende: (a) cultivar una célula huésped bajo condiciones que llevan a la producción del polipéptido, en donde la célula huésped comprende una secuencia mutante de ácido nucleico que tiene por lo menos una mutación en la región codificante del polipéptido maduro de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 O SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3, en donde la secuencia mutante de ácido nucleico codifica para un polipéptido el cual consiste de los aminoácidos 1 a 485 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 O SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4, y (b) recuperar el polipéptido.

Composiciones En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con composiciones que comprenden una alfa-amilasa o una variante de la misma, de la presente invención.

Preferiblemente, las composiciones están enriquecidas con una alfa-amilasa o una variante de la misma, de la presente invención. En el presente contexto, el término "enriquecido" indica que se ha incrementado la actividad de la alfa-amilasa de la composición, por ejemplo con un factor de enriquecimiento de 1.1. La composición puede comprender un polipéptido de la invención como un componente enzimático principal, por ejemplo una composición de un monocomponente. De manera alternativa, la composición puede comprender actividades enzimáticas múltiples tales como una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicociltransferasa, desoxirribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, pitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa. La o las enzimas adicionales se pueden elaborar por medio de un microorganismo que pertenezca al género, Aspergill us, preferiblemente Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori , Aspergillus niger o Aspergillus oryzae, o Trichoderma, Himucola preferiblemente Humicola insolens o Furarium, preferiblemente Fusari um ba c tri di oi des , Fusari um cereal i s , Fusari um crookwellense , Fusari um culmorum, Fusari um graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi , Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusari um sambu cinum , Fusari um sarcochroum , Fusari um sulpuhureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides o Fusarium venenatum. Las composiciones de polipéptido se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de un líquido o una composición seca. Por ejemplo, la composición de polipéptido puede estar en forma de un granulado -* --«¿ o un microgranulado. El polipéptido que se va a incluir en la composición se puede estabilizar de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Los ejemplos se proporcionan a continuación de usos preferidos de las composiciones de polipéptido de la invención. La dosificación de la composición del polipéptido de la invención y otras codiciones bajo las cuales se utiliza la composición, se pueden determinar en base a los métodos conocidos en la técnica.

Aplicaciones Industriales Debido a su actividad a valores de pH alcalino, las alfa-amilasas de la invención son muy adecuadas para uso en diversos procesos industriales, en particular, la enzima encuentra aplicaciones potenciales como un componente en detergentes, por ejemplo lavandería, lavado de trastes y composiciones de detergente de limpieza de superficies duras, pero también puede ser útil para descrudado de textiles, telas y prendas de vestir, elaboración de cervezas o elaboración de mosto, en la producción de pulpa y papel y además en la producción de edulcorantes y etanol, tales como etanol combustible, potable e industrial, para almidón o granos completos .

Conversión de Almidón Los procesos convencionales de conversión de almidón, tales como licuefacción y procesos de sacarificación se describen, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos Número 3,912,590 y en las publicaciones de patente del EP números 252,730 y 63,909, incorporadas en la presente como referencia.

Producción de Pulpa y Papel La alfa-amilasa alcalina de la invención también se puede utilizar en la producción de materiales lignocelulósicos tales como pulpa, papel y cartón, a partir de papel de desperdicio reforzado con almidón y cartón, especialmente cuando se produce la formación nuevamente de la pulpa a un pH superior a 7 y cuando las amilasas facilitan la desintegración del material de desecho mediante degradación del almidón de refuerzo. La alfa-amilasa de la invención es especialmente útil en un proceso para elaborar una pulpa de elaboración de papel a partir de papel impreso recubierto con almidón. El proceso se puede llevar a cabo como se describe en el documento WO 95/14807, que comprende las siguientes etapas: a) desintegrar el papel para producir la pulpa, b) tratar con una enzima degradadora de almidón antes, durante o después de la etapa a) , y c) separar partículas de tinta de la pulpa después de las etapas a) y b) . Las alfa-amilasas de la invención también deben ser muy útiles para modificar el almidón cuando se utiliza almidón modificado enzimáticamente en la elaboración del papel junto con materiales de relleno alcalinos, tales como carbonato de calcio, caolín y arcillas. Con las alfa-amilasas alcalinas de la invención se vuelve posible modificar el almidón en presencia del material de relleno y por lo tanto se permite un proceso integrado más sencillo.

Descrudado de Textiles. Telas y Prendas de Vestir Una alfa-amilasa de la invención también puede ser muy útil en descrudado textil, de telas o prendas de vestir. En la industria de procesamiento textil, tradicionalmente se utilizan las alfa-amilasas como auxiliares en el proceso de descrudado para facilitar la remoción de apresto que contiene almidón, el cual ha servido como un recubrimiento protector de los hilos de trama durante el tejido. Es importante la remoción completa del recubrimiento de apresto después del tejido para asegurar resultados óptimos en los procesos subsecuentes, en los cuales la tela es lavada, blanqueada y teñida. Se prefiere la descomposición enzimática del almidón debido a que no involucra un efecto dañino sobre el material de la fibra. Para reducir los costos de procesamiento e incrementar el rendimiento de la fábrica de tejidos o batán, el proceso de descrudado algunas veces se combina con las etapas de lavado y blanqueado. En tales casos, típicamente se utilizan auxiliares enzimáticos tales como agentes alcalinos o de oxidación para descomponer en almidón, durante las alfa-amilasas tradicionales no son muy compatibles con las concentraciones de pH alto y los agentes blanqueadores. La descomposición no enzimática del apresto de almidón lleva a ciertos daños a la fibra debido a las sustancias químicas más bien corrosivas. En consecuencia, sería deseable utilizar las alfa-amilasas de la invención debido a que tienen un desempeño mejorado en soluciones alcalinas. Las alfa-amilasas se pueden utilizar solas o en combinación con una celulasa cuando descrudan telas o materiales textiles que contienen celulosa. Los procesos de descrudado y blanqueado son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, tales procesos se describen en el documento WO 95/21247, patente de los Estados Unidos 4,647,736, EP 119,920 incorporados en la presente como referencia. Los productos disponibles comercialmente para descrudado incluyen AquazymeMR y AquazymeMR Ultra de Novo Nordisk A/S.

Elaboración de Cerveza Las alfa-amilasas de la invención también pueden ser muy útiles en procesos de elaboración de cerveza; típicamente se agregarán alfa-amilasas durante el proceso de braceado.

Composiciones de Detergente La enzima de la invención también se puede agregar y por lo tanto se puede volver un componente de una composición de detergente . La composición de detergente de la invención se puede formular, por ejemplo, como una composición de detergente manual o para máquina lavadora que incluye una composición de aditivo de lavandería adecuado para tratamiento previo de tales teñidas y una composición suavizante de tela agregada en el enjuague, o se pueden formular como una composición de detergente para uso y en operaciones de limpieza de superficies duras caseras en general, o se puede formular para operaciones de lavado de trastes manual o en máquina. En un aspecto específico, la invención proporciona un aditivo de detergente que comprende la enzima de la invención. El aditivo de detergente así como la composición de detergente pueden comprender una o más enzimas tales como una proteasa, una lipasa, una cutinasa, una amilasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pec inasa, una mananasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, por ejemplo una lactosa o una peroxidasa, o ambas. En general, las propiedades de la o las enzimas elegidas pueden ser compatibles con el detergente seleccionado (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc) , y la o las enzimas pueden estar presentes en cantidades efectivas. Proteasas: Las proteasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. Se prefiere el origen microbiano. Se incluyen mutantes modificados químicamente o sometidos a ingeniería proteínica. La proteasa puede ser una serina proteasa o una metaloproteasa, preferiblemente una proteasa microbiana alcalina o una proteasa similar a tripsina. Los ejemplos de proteasas alcalinas son subtilisinas, especialmente aquellas derivadas de Bacillus , por ejemplo subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descrita en el documento WO 89/06279) . Los ejemplos de proteasas similares a tripsina son tripsina (por ejemplo, de origen porcino o bovino) , y la proteasa de Fusarium descrita en los documentos WO 89/06270 y WO 94/25583. Los ejemplos de proteasas útiles son las variantes que se describen en los documentos WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 y WO 98/34946, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones; 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 y 274. Las enzimas de proteasas disponibles comercialmente incluyen AlcalaseMR, SavinaseR, PrimaseMR, DuralaseMR, EsperaseMR y KannaseMR (Novo Nordisk A/S), MaxataseMR, Maxacal, MaxapemMR, ProperaseMR, PurafectMR, Purafect OxPMR, FN2"R y FNMR (Genencor International Inc.). Lipasas: Las lipasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o micótico. Se incluyen los mutantes modificados químicamente o sometidos a ingeniería de proteínas.

Los ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humicola (sinónimo, Thermomyces) , por ejemplo de H. lanuginoea ( T. lanuginosus) , como se describe en EP 258 068 y EP 305 216 o a partir de H. insolens, como se describe en WO 96/13580, una lipasa de Pseudomonas, por ejemplo de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP 218 272) , P. cepacia (EP 331 376) , P. stuzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012) , una lipasa de Bacillus, por ejemplo de B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360) , B. stearothermophilus (JP 64/744992) o B. pumilus (WO 91/16422) . Otros ejemplos son variantes de lipasa tales como los descritos en WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202. Las enzimas de lipasa disponibles comercialmente preferidas incluyen LipolaseMR y Lipolase UltraMR (Novo Nordisk 5 A/S) . Amilasas: Las amilasas adecuadas (alfa o beta) incluyen las de origen bacteriano o micótico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o sometidos a ingeniería de proteínas. Las amilasas incluyen, por ejemplo, alfa-amilasas 10 que se obtienen de Bacillus, por ejemplo una cepa especial de B. licheniformis , descrita con mayor detalle en el documento GB 1,296,839. Los ejemplos de alfa-amilasas útiles son las variantes descritas en WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873 y WO 97/43424, especialmente las variantes con sustituciones 15 en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408 y 444. Las amilasas disponibles comercialmente son DuramylMR, TermamylMR, FungamylMR y BAN"R (Novo Nordisk A/S) , RapidaseMR y 20 PurastarMR (de Genencor International Inc.). Celulasas: Las celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o micótico. Se incluyen los mutantes modificados químicamente o sometidos a ingeniería proteínica. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas de los géneros 25 Bacill us , Pseudomonas , Humi cola , Fusari um , Thi el avia , a&aai?aÉttliato&ttAi?» . . . . . . , .* .i- i . , -. - - * . i • **¿*ft¡*£s.ji Acremonium, por ejemplo, las células micóticas producidas de Humicola insolens, Myceliophtora thermophila y Fusarium oxysporum descritas en US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 y WO 89/09259. Las celulasas adecuadas especialmente son las celulasas alcalinas o neutras que tienen beneficios para el cuidado del color. Los ejemplos de tales celulasas son celulasas que se describen en los documentos EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulosa tales como los descritos en WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 y PCT/DK98/00299. Las celulasas disponibles comercialmente incluyen CelluzymeR y CarezymeHR (Novo Nordisk A/S) , Clazinase"R, y Puradax HAMR (Genencor International Inc.), y KAC-500(B)MR (Kao Corporation) . Peroxidasas/Oxidasas . Las peroxidadas/oxidadas adecuadas incluyen aquellas de origen vegetal, bacteriano o micótico. Se incluyen mutantes modificados químicamente sometidos a ingeniería proteínica. Los ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidadas de Coprinus, por ejemplo de C. cinereus y variantes de las mismas como las que se describen en los documentos WO 93/24618, WO 95/10602 y WO 98/15257. Las peroxidasas disponibles comercialmente incluyen GuardzymeMR (Novo Nordisk A/S) .

Las enzimas de detergentes se pueden incluir en una composición de detergente al agregar aditivos separados que contengan una o más enzimas, o al agregar un aditivo combinado que comprende la totalidad de estas enzimas. Se puede formular un aditivo de detergente de la invención, es decir, un aditivo separado o un aditivo combinado, por ejemplo como un granulado, como un líquido, como una suspensión, etc. Las formulaciones preferidas de aditivo de detergente son granulados, en particular granulados que no generan polvos, líquidos, en particular líquidos estabilizados o suspensiones. Se pueden elaborar granulados que no produzcan polvo, por ejemplo, como se describe en los documentos US 4,106,991 y 4,661,452 y opcionalmente se pueden recubrir por métodos conocidos en la técnica. Los ejemplos de materiales de recubrimiento ceroso son productos de poli (óxido de etileno) (polietilenglicol, PEG) con pesos moleculares medios de 1000 a 20000; nonilfenoles etoxilados que tienen 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grados etoxilados en los cuales el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en el cual existen 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y monoglicéridos y diglicéridos y triglicéridos de ácidos grasos. Los ejemplos de recubrimientos formadores de película adecuados para aplicación por técnicas de lecho fluido se proporcionan en el documento GB 1483591. Las preparaciones de enzima líquida pueden ser estabilizadas, por ejemplo, al agregar un poliol tal como propilenglicol o un azúcar o un alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico, de acuerdo con los métodos establecidos. Las enzimas protegidas se pueden preparar de acuerdo con el método descrito en EP 238,216. La composición de detergente de la invención puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo una barra, una tableta, un polvo, un granulo, una pasta o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, típicamente que contenga hasta 70% de agua y 0-30% de solvente orgánico, o bien no acuosa. La composición de detergente comprende uno o más tensoactivos los cuales pueden ser no iónicos y que incluyen semipolares, aniónicos, catiónicos o zwiteriónicos. Los tensoactivos típicamente están presentes a una concentración de 0.1% a 60% en peso. Cuando se incluyen en la presente, el detergente habitualmente contendrá de aproximadamente 1% a aproximadamente 40% de un tensoactivo aniónico tal como alquilbencensulfonato lineal, alfa-olefinsulfonato, sulfato de alquilo (sulfato de alcohol graso), etoxisulfato de alcohol, alcanosulfonato secundario, éster metílico de ácido alfa-sulfo graso, ácido alquil o alquenilsuccínico o jabón. Cuando se incluyen en la presente, los detergentes habitualmente contendrán de aproximadamente 0.2% a aproximadamente 40% de un tensoactivo no iónico tal como etoxilado de alcohol, etoxilato de nonil-fenol, alquilpoliglicósido, alquildimetilamina-óxido, ácido graso etoxilado monoetanol- amida, ácido graso monoetanolamida, amida de ácido polihidroxialquil graso o derivados N-acilo, N-alquilo de glucosamina ("glucamidas"). El detergente puede contener 0-65% de un mejorador de detergencia o un agente formador de complejo tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilendiaminotetraacético, ácido d i e t i 1 en t r i ami nopen t aa c é t i c o , ácido alquil- o alquenil succínico , silicatos solubles o silicatos estratificados (por ejemplo SKS-6 de Hoechst) . El detergente puede comprender uno o más polímeros. Los ejemplos son carboximetilcelulosa, poli (vinil -pirrolidona) , poli (etilenglicol) , poli (alcohol vinílico), poli (vinilpiridino-N-óxido) , poli (vinilimidazol) , policarboxilatos tales como poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico y copolímeros de metacrilato de laurilo/ácido acrílico. El detergente puede contener un sistema blanqueador el cual puede comprender una fuente de H202 tal como un perborato o percarbonato el cual se puede modificar con un activador de blanqueador formador de perácido como tetraacetiletilendiamina o nonanoiloxibencensulfonato. Alternativamente, el sistema de blanqueado puede comprender peroxiácidos, por ejemplo, del tipo amida, imida o sulfona.

La o las enzimas de la composición de detergente de la invención se pueden estabilizar utilizando agentes estabilizantes convencionales, por ejemplo un poliol tal como propilenglicol o glicerol, un azúcar tal como alcohol, ácido láctico, ácido bórico o un derivado de ácido bórico, por ejemplo, un éster de borato aromático o un derivado de ácido fenilborónico tal como ácido 4-formilfenilborónico, y la composición se puede formular como se describe, por ejemplo, en WO 92/19709 y WO 92/19708. El detergente también puede contener otros ingredientes convencionales de detergente tales como, por ejemplo, acondicionadores de tela que incluyen arcillas, refuerzos de espuma, supresores de lodo, agentes anticorrosión, agentes que suspenden la mugre, agentes que impiden la deposición nuevamente de mugre, colorantes, bactericidas, abrillantadores ópticos, hidrotropos, inhibidores de óxido o perfumes . También se contempla en la presente que en las composiciones de detergente se pueda agregar cualquier enzima, en particular la enzima de la invención, en una cantidad correspondiente a 0.01-100 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavado, preferiblemente 0.05-5 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavado, en particular 0.1-1 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavado.

La enzima de la invención adicionalmente se puede incorporar en las formulaciones de detergente que se describen en el documento WO 97/07202, el cual se incorpora en la presente como referencia.

Composiciones de Detergente para Lavado de Trastes La enzima de la invención también se puede utilizar en composiciones de detergente para lavado de trastes, que incluyen lo siguiente: 1) COMPOSICIÓN EN POLVO PARA MÁQUINA DE LAVAR TRASTES AUTOMÁTICA Tensoactivo no iónico 0.4 - 2.5% Metasilicato de sodio 0 - 20% Disilicato de sodio 3 - 20% Trifosfato de sodio 20 - 40% Carbonato de sodio 0 - 20% Perborato de sodio 2 - 9% Tetraacetiletilendiamina 1 - 4% (TAED) ,, ,«... k 2) COMPOSICIÓN EN POLVO PARA MAQUINA DE LAVAR TRASTES AUTOMÁTICA Tensoactivo no iónico (por 1 - 2% ejemplo etoxilato de alcohol) Disilicato de sodio 2 - 30% Carbonato de sodio 10 - 50% Fosfonato de sodio 0 - 5% Citrato trisódico dihidratado 9 - 30% Acetato de nitrilo trisodio 0 - 20% (NTA) Perborato de sodio 5 - 10% monohidratado Tetraacetiletilendiamina 1 - 2% (TAED) 3) COMPOSICIÓN EN POLVO PARA MAQUINA DE LAVAR TRASTES AUTOMÁTICA Tensoactivo no iónico 0.5 - 2.0% Disilicato de sodio 25 - 40% Citrato de sodio 30 - 55% Carbonato de sodio 0 - 29% Bicarbonato de sodio 0 - 20% Perborato de sodio monohidratado 0 - 15% Tetraacetiletilendiamina (TAED) 0 - 6% Copolímero de ácido maleico/ácido 0 - 5% acrílico Arcilla 1 - 3% ¿'4 rr 4) COMPOSICIÓN EN POLVO PARA MAQUINA PARA LAVAR TRASTES AUTOMÁTICA rk i í k ?-. í-l I 5) COMPOSICIÓN EN POLVO PARA MAQUINA DE LAVAR TRASTES AUTOMÁTICA Tensoactivo no iónico 1 - 7% Disilicato de sodio 18 - 30% Citrato trisódico 10 - 24% Carbonato de sodio 12 - 20% Monopersulfato (2 KHS05.KHS04.K2S04) 15 - 21% Estabilizador de blanqueador 0.1 - 2% Copolímero de ácido maleico/ácido 0 - 6% acrílico Sal pentasódica de dietilen- 0 - 2.5% triaminopentaacetato Enzimas 0.0001 - 0.1% Sulfato de sodio, agua Resto ) COMPOSICIÓN EN POLVO Y LÍQUIDA PARA LAVAR TRASTES, ON SISTEMA DE TENSOACTIVO LIMPIADOR Alcohol etoxilado de 3 a 15 átomos 0 - 5% de carbono con un grado promedio de etoxilación de 12 Una combinación de alcoholes 0 - 6.5% etoxilados de 12 a 15 átomos de carbono con un grado promedio de etoxilación de 9 Una combinación de alcoholes 0 - 4% etoxilados de 13 a 15 átomos de carbono con un grado promedio de etoxilación de 30 Disilicato de sodio 0 - 33% Tripolifosfato de sodio 0 - 46% Citrato de sodio 0 - 28% Ácido cítrico 0 - 29% Carbonato de sodio 0 - 20% Perborato de sodio monohidratado 0 - 11.5% Tetraacetiletilendiamina (TAED) 0 - 4% Copolímero de ácido maleico/ácido 0 - 7.5% acrílico 7) COMPOSICIÓN DE LÍQUIDO NO ACUOSO PARA MÁQUINA DE LAVAR TRASTES AUTOMÁTICA 8) COMPOSICIÓN DE LÍQUIDO NO ACUOSO PARA LAVADO DE TRATES Tensoactivo no iónico líquido (por 2.0 - 10.0% ejemplo etoxilatos de alcohol) Silicato de sodio 3.0 - 15.0% Carbonato de metal alcalino 7.0 - 20.0% Citrato de sodio 0.0 - 1.5% Sistema estabilizante (por ejemplo 0.5 - 7.0% 10 mezclas de silicona finamente dividida y éteres de poliglicol de dialquilo de peso molecular bajo) Polímero de poliacrilato de peso 5.0 - 15.0% molecular bajo 15 Espesante de gel de arcilla (por 0.0 - 10.0% ejemplo bentonita) Polímero de hidroxipropilcelulosa 0.0 - 0.6% Enzimas 0.0001 - 0.1% fcd¿aaájfe¿«?»-黿É?¡M Xi Portador líquido que se selecciona resto de glicoles superiores, poliglicoles, polióxidos y éteres de glicol 9) COMPOSICIÓN LIQUIDA TIXOTROPICA PARA LAVADORA DE TRASTES AUTOMÁTICA Ácido graso de 12 a 14 átomos de 0 - 0.5% carbono Tensoactivo de copolímero de bloque 1.5 - 15.0% Citrato de sodio 0 - 12% Tripolifosfato de sodio 0 - 15% Carbonato de sodio 0 - 8% triestearato de aluminio 0 - 0.1% Sulfonato de cumeno y sodio 0 - 1.7% Espesante de poliacrilato 1.32 - 2.5% Poliacrilato de sodio 2.4 - 6.0% Ácido bórico 0 - 4.0% Formiato de sodio 0 - 0.45% Formiato de calcio 0 - 0.2% Disulfonato de óxido de n- 0 - 4.0% decildifenil de sodio Monoetanolamina (MEA) 0 - 1.86% Hidróxido de sodio (50%) 1.0 - 9.3% 1 , 2 -propanodiol 0 - 9.4% Enzimas 0.0001 - 0.1% Supresor de espuma, colorante, Resto perfumes , agua 10 ) COMPOS I C I ÓN L I QUIDA PARA LAVADORA DE TRASTE S AUTOMÁTICA Etoxilato de alcohol 0 - 20% Sulfonato de éster de ácido graso 0 - 30% Dodeciisulfato de sodio 0 - 20% Poliglicósido de alquilo 0 - 21% Ácido oleico 0 - 10% Disilicato de sodio monohidratado 18 - 33% Citrato de sodio dihidratado 18 - 33% 11 ) COMPOS I C I ÓN L I QUIDA PARA LAVADORA DE TRASTE S AUTOMÁTICA QUE CONTIENE PARTÍCULAS DE BLANQUEADOR PROTEGIDAS Silicato de sodio 5 - 10% Pirofosfato de tetrapotasio 15 - 25% Trifosfato de sodio 0 - 2% Carbonato de potasio 4 - 8% Partículas blanqueadoras protegidas, 5 - 10% por ejemplo cloro Espesante polimérico 0.7 - 1.5% Hidróxido de potasio 0 - 2% Enzimas 0.0001 - 0.1% ft»*- - ^ a - 11) Las composiciones para lavadora de trastes automática como se describen en 1) , 2) , 3) , 4) , 6) y 10) , en donde el perborato se sustituye por percarbonato. 12) Composiciones para lavadora de trates automática, como se describe en l)-6) lo cual adicionalmente contiene un catalizador de manganeso. El catalizador de manganeso puede ser, por ejemplo, uno de los compuestos descritos en "Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching", Nature 369, 1994, pp. 637-639.

Usos La presente invención también se dirige a métodos para utilizar los polipéptidos que tienen actividad de alfa-amilasa de la invención en detergentes, en particular composiciones de detergente para lavandería y composiciones de detergente para lavado de trastes, composiciones limpiadoras de superficies duras y en composiciones para descrudado de textiles, telas o prendas de vestir, para producción de pulpa y papel, elaboración de cerveza y procesos de conversión de almidón, como se describe antes.

La presente invención se describe adicionalmente por los siguientes ejemplos, los cuales no se deben considerar como limitantes del alcance de la invención.

Materiales y métodos Las sustancias químicas utilizadas como amortiguadores y sustratos son productos comerciales de por lo menos grado reactivo.

Materiales Enzimas SP690: alfa-amilasa descrita en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1 de la patente de los Estados Unidos no. 5, 856, 164. SP722: alfa-amilasa descrita en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 de la patente los Estados Unidos no. 5,856,164. TermamylMR: alfa-amilasa de Bacill us li cheniformie descrita en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1 de la patente de los Estados Unidos no. 5,830.837. AA560: alfa-amilasa de la invención, que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2.

BAN: alfa-amilasa derivada de Bacillus amyloliquefaciens y disponible de Novo Nordisk A/S BSG: alfa-amilasa derivada de Bacillue stearothermophilue y disponible de Novo Noridsk A/S Detergente modelo: A/P (Asia/Pacific) detergente modelo que tiene la siguiente composición: STPP (tripolifosfato de sodio) 20%, Na2S0425%, Na2C0315%, LAS (alquilbencensulfonato lineal, Nansa 80S) 20%, etoxilato de alcohol de 12 a 15 átomos de carbono (Dobanol 25-7) 5% Na2Si2Os 5%, NaCl 0.3%. Orno Multi Acao (Brasil) , Orno polvo concentrado (EU) (Unilever) Líquido ariel futur (EU) (Procter and Gamble) Depósito de material biológico Se ha depositado el siguiente material biológico bajo los términos del Tratado de Budapest ante la Deutshe Sammmlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig DE, y se les ha proporcionado los siguientes números de acceso: Depósito Número de acceso Fecha de depósito NN017557 DSM 12648 25 de enero del 99 NN017560 DSM 12649 25 de enero del 99 NN049467 DSM 12761 7 de abril del 99 NN049470 DSM 12764 7 de abril del 99 Las cepas se han depositado bajo condiciones que aseguran el acceso al cultivo el cual estará disponible durante la pendencia de esta solicitud de patente a una persona 10 determinada por el Comisionado de Patentes y Marcas intitulado para lo mismo, bajo 37 C.F.R. §1.14 y 35 U.S.C. §122. El depósito representa un cultivo sustancialmente puro de la cepa depositada. El depósito está disponible según se requiera para leyes de patentes extranjeras en países en donde se presenten 15 contra partes de la presente solicitud o su progenie. Sin embargo, debe entenderse que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para llevar a la práctica la presente invención en una derogación de los derechos de patente otorgados por acción gubernamental . 20 Organismo huésped El Bacillue eubtilie cepa SHa273 se describe en el documento WO 95/10603 E. coli cepa SJ2 (Diderichsen et al. 25 (1990)), J. Bacteriol., vol. 172, pp. 4315-4321.

^¡^^X^^^^^^^^^^^^^^^ Plásmidos : El vector gene bank pSJ1678 se describe adicionalmente en el documento WO 94/19454, el cual se 5 incorpora en la presente como referencia. El plásmido pTVBHO es un plásmido que se replica en Bacillue eubtilie mediante el uso del origen de replicación a partir de pUBllO (Gryczan, T. J. (1978) J. Bact. 134:318-329). El plásmido codifica además para el gen cat, que confiere 10 resistencia a cloramfenicol, que se obtiene del plásmido pC194 (Horinouchi, S. y Weisblum, B. (1982), J. Bact. 150: 815-825). El plásmido alberga una versión truncada del gen para alfa- amilasa de Bacillue licheniformie, amyL, de manera que están presentes el promotor amyL, la secuencia de señal y el 15 terminador de transcripción, pero el plásmido no proporciona un fenotipo amy-plus (formación de halo en agar que contiene almidón) . Plásmido pTVB299: véase la construcción en el Ejemplo 10.

MjtiÍMÜi'fflttii-?tieadi.j . i -> >- . ,» . . = . . « <?»._?_«^.at»aaá Métodos Métodos generales de biología molecular: A menos que se mencione de otra manera, las manipulaciones y transformaciones de ADN se realizan utilizando métodos convencionales o estándar de biología molecular (Sambrook et al. (1989); Ausubel et al. (1995); Harwood and Cutting (1990) .

Fermentación de alfa-amilasas y variantes La fermentación se puede llevar a cabo por métodos bien conocidos en la técnica, o como sigue. Se siembra por estrías una cepa de B. eubtilie que alberga el plásmido de expresión relacionado, en una placa de LB-agar con 10 µg/ml de kanamicina a partir de un concentrado a -80°C, y se hace crecer durante la noche a 37 °C. Las colonias se transfieren a 100 ml de medio BPX suplementado con 10 µg/ml de kanamicina en un matraz de agitación de 500 ml .

Composición del medio BPX: Almidón de papa 100 g/1 Harina de cebada 50 g/1 BAN 5000 SKB 0.1 g/1 Caseinato de sodio 10 g/1 Harina de soya 20 g/1 Na2HP04, 12 H20 9 g/1 PluronicMR 0.1 g/1 El cultivo se agita a 37 °C a 270 rpm durante 5 días. Las células y los residuos celulares se remueven del caldo de fermentación por centrifugación a 4500 rpm en 20-25 minutos. Posteriormente, el sobrenadante se filtra para obtener una solución completamente transparente. El filtrado se concentra y se lava en un filtro UF (membrana de límite 10000) y se cambia el amortiguador a acetato 20 mM, pH 5.5. El filtrado UF se aplica sobre S-sefarosa F.F. y se lleva a cabo la elución por una elución en etapas con NaCl 0.2 M en el mismo amortiguador. El eloato se dializa contra Tris 10 mM, pH 9.0 y se aplica a Q-sefarosa F.F. y se eluye con un gradiente lineal a partir de 0-0.3 M de NaCl sobre 6 volúmenes de columna. Las fracciones, las cuales contienen la actividad (medida por el ensayo Phadebas) se acumulan, se ajusta el pH 7.5 y se elimina el color remanente por tratamiento con carbón activado 0.5% peso/volumen en 5 minutos.

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Ensayos para determinar la actividad de alfa-amilasa 1. Ensayo Phadebas 5 Se determina la actividad de alfa-amilasa por el método utilizando tabletas de PhadebasMR como sustrato. Las tabletas de Phadebas (prueba de amilasa PhadebasMR, proporcionadas por Pharmacia Diagnostic) contiene un polímero de almidón de color azul insoluble reticulado, el cual se ha 10 mezclado con albúmina sérica bovina y una sustancia amortiguadora y se ha comprimido en tabletas . Para cada medición, se suspende una tableta en un tubo que contiene 5 ml de amortiguador de Britton-Robinson 50 mM (ácido acético 50 mM, ácido fosfórico 50 mM, ácido bórico 15 50 mM, CaCl2 0.1 mM, se ajusta el pH a un valor de interés, con NaOH) . La prueba se realiza en un baño de agua a una temperatura de interés. La alfa-amilasa que se va a probar se diluye en x ml de amortiguador Britton-Robinson de 50 mM. Se agrega l ml de esta solución de alfa-amilasa a 5 ml de 20 amortiguador de Britton-Robinson 50 mM. El almidón se hidroliza por la alfa-amilasa lo que proporciona fragmentos azules solubles. La absorbancia de la solución azul resultante, medida espectrofotométricamente a 620 nm, es una función de la actividad de alfa-amilasa. — ?¿l&&A*kÍBl?l.kX& ¡? r : - •> - .-I- I . - . t^ü^? ^k Es importante que la absorbancia medida a 620 nm después de 10 o 15 minutos de incubación (tiempo de prueba) esté en el intervalo de 0.2 a 2.0 unidades de absorbancia, a 620 nm. En este intervalo de absorbancia, existe linealidad entre la actividad y la absorbancia (ley de Lambert-Beer) . Por lo tanto, la dilución de la enzima se debe ajustar para que quede dentro de este criterio. Bajo un conjunto especificado de condiciones (temperatura, pH, tiempo de reacción, condiciones de amortiguador) , 1 mg de una alfa-amilasa dada hidrolizará cierta cantidad de sustrato y se producirá un color azul. La intensidad del color se mide a 620 nm. La absorbancia medida es directamente proporcional a la actividad específica (actividad/mg de proteína alfa-amilasa pura) de la alfa-amilasa en cuestión, bajo un conjunto dado de condiciones. 2. Método alternativo (ensayo de PNP-G7] Se determina la actividad de alfa-amilasa por un método que utiliza el sustrato PNP-G7. PNP-G7, que es una abreviatura para p-nitrofenil-alfa-D-maltoeptaosido es un oligosacárido bloqueado el cual se puede separar de una endoamilasa. Después de la separación, la alfa-glucosidasa incluida en el equipo digiere el sustrato para liberar la molécula de PNP libre el cual tiene un color amarillo y por lo tanto se puede medir por espectrofotometría visible a ?=405nm (400-420 nm) . Los equipos que contienen sustrato de PNP-G7 y alfa-glucosidasa se fabrican por Boehringer-Mannheim (cat. No. 1054635) . Para preparar el sustrato, se agrega una botella del sustrato (BM 1442309) a 5 ml de amortiguador (BM1442309) . Para preparar la a-glucosidasa, se agrega una botella de alfa-glucosidasa (BM 1462309) a 45 ml de amortiguador (BM1442309) . La solución de trabajo se elabora al mezclar 5 ml de solución alfa-glucosidasa con 0.5 ml del sustrato. El ensayo se realiza al transformar 20 µl de solución enzima a una placa de microtitulación de 96 pozos e incubar a 25 °C. Se agregan 200 µl de solución de trabajo, a 25 °C. La solución se mezcla y se incuba previamente 1 minuto y se mide la absorción cada 15 sec durante 3 minutos a una DO de 405 nm. La pendiente de la curva de absorción dependiente del tiempo es directamente proporcional a la actividad específica (actividad por mg de enzima) de la alfa-amilasa en cuestión, bajo un conjunto dado de condiciones.

Medición del calcio y la estabilidad dependiente de pH Un proceso de licuefacción industrial normalmente se lleva a cabo utilizando pH de 6.0-6.2 como pH de licuefacción y una adición de 40 ppm de calcio libre con el fin de mejorar la estabilidad a 95°C-105°C. Algunas de las sustituciones que se proponen aquí se han realizado con el fin de mejorar la estabilidad a 1. un pH menor de pH 6.2 , o 2. a concentraciones de calcio libres menores de 40 ppm de calcio libre, o ambas porciones. Se pueden utilizar dos métodos diferentes para medir las alteraciones en la estabilidad que se obtiene por sustituciones diferentes en alfa-amilasa AA560: Método 1. Un ensayo el cual mide la estabilidad a pH reducido, pH 5.0, en presencia de 5 ppm de calcio libre. Se incuban 10 µg de la variante bajo las siguientes condiciones: una solución de acetato 0.1 M, pH ajustado a pH 5.0 que contiene 5 ppm de calcio y 5% p/p de almidón de maíz común (libre de calcio) . La incubación se realiza en un baño de agua a 95 °C durante 30 minutos. Método 2. Un ensayo, el cual mide la estabilidad en ausencia de calcio libre y en donde se mantiene el pH a pH 6.0. Este ensayo mide la disminución en la sensibilidad de calcio: se incuban 10 µg de la variante bajo las siguientes condiciones: una solución de acetato 0.1 M se ajusta al pH a pH 6.0 que contiene 5% p/p de almidón de maíz común (libre de calcio. La incubación se realiza en un baño de agua a 95 °C durante 30 minutos.

Determinación de estabilidad Todos los ensayos de estabilidad se realizan utilizando el mismo ajuste. El método es : la enzima se incuba bajo condiciones relevantes (1-4) . Se toman muestras a los 0, 5, 10, 15 y 30 minutos y se diluyen 25 veces (misma dilución para todas las muestras tomadas) en amortiguador de ensayo (amortiguador Britton 50 mM, 0.1 M, pH 7.3) y se mide la actividad utilizando el ensayo Phadebas (Pharmacia) bajo condiciones convencionales o estándar, pH 7.3, 37 °C. La actividad medida antes de la incubación (0 minutos) se utiliza como referencia (100%) . Se calcula el por ciento de declinación como una función del tiempo de incubación. Determinación de actividad específica Se determina la actividad específica utilizando el ensayo Phadebas (Pharmacia) como actividad/mg de enzima.

Cocinado en chorro y licuefacción con AA560 y variantes Se llevan a cabo experimentos de licuefacción en un sistema de minichorro utilizando una dosificación de 50 NU/g de DS a pH 5.5 con 5 ppm de Ca++ agregado, para comparar el desempeño de la variante de alfa-amilasa formulada con la de alfa-amilasa parental. La reacción se monitorea al medir el incremento de DE (método Neocuproine) como una función del tiempo. Se prepara suspensiones de almidón de maíz al suspender aproximadamente 11.8 kg de Cerestar C*Pharm GL 03406 (89% de almidón) en agua desionizada hasta constituir 30 kg.

Se ajusta el pH 5.5 a temperatura ambiente, después de la adición de 0.55 g de CaCl2-2H20. Se agrega una cantidad de enzima correspondiente a 50 NU/g de DS y se ajusta la conductividad a 300 mS utilizando NaCl. Las condiciones convencionales o estándar son como sigue: Concentración de sustrato 35% p/p (inicial) 31.6-31.9% p/p (final) Temperatura 105 °C, 5 minutos (licuefacción primaria) 95 °C, 90 minutos (licuefacción secundaria) pH (inicial) 5.5 Después de someter al chorro, el almidón licuado se recolecta y transporta en matraces térmicos sellados desde la planta piloto al laboratorio, en donde se continúa la licuefacción secundaria a 95 °C. Se toman muestras de 10 ml a intervalos de 15 minutos durante 15-90 minutos. Se agregan 2 gotas de HCl 1 N para inactivar la enzima. A partir de estas muestras, se pesan 0.3-0.1 g (de acuerdo con la DE esperada) y se diluyen a 100 ml . Los azúcares reductores después se determinan de acuerdo con el método Neocuproine (determinación de azúcar reductor por precisión mejorada. Dygert, Li, Florida and Thomas (1965). Anal. Biochem 13, 368) y se determinan los valores de DE. Se compara el desarrollo de DE como una función del tiempo.

Materiales eliminadores de apresto: Telas estándar: TS526, textura de sarga, algodón 100%. Impregnación: 55 °C, 60 ppm CaCl2, pH 6.5 Soluciones de enzima: AA560 parental (l g/l) Dosificaciones : 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 y 2.0 g/1 de las soluciones de enzima en el licor de impregnación . Incubación: 2 h a 55 o 65°C 22 h a 30°C Lavado : 10 minutos en agua Secado: temperatura ambiente Procedimientos : evaluación de resultados de descrudado - Escala violeta (TEGEWA) .

- L Método general para mutagénesis aleatoria mediante el uso del programa DOPE Se puede llevar a cabo mutagénesis aleatoria por las siguientes etapas: 1. Seleccionar regiones de interés para modificación en la enzima parental, 2. Decidir respecto a sitios de mutación y sitios no mutados en la región seleccionada, 3. Decidir qué clase de mutaciones se pueden llevar a cabo, por ejemplo, respecto a la estabilidad o desempeño deseado, o ambas cosas, de la variante que se va a construir, 4. Seleccionar mutaciones estructuralmente razonables . 5. Ajustar los residuos seleccionados en la etapa 3 con respecto a la etapa 4. 6. Analizar mediante el uso de un algoritmo DOPE adecuado la distribución de nucleótidos . 7. Si es necesario, ajustar los residuos deseados al realismo de código genético, por ejemplo, tomando en consideración restricciones que resultan del código genético, por ejemplo, para evitar la introducción de codones de detención; una persona experta en la técnica tendrá conciencia de que algunas combinaciones de codones no se pueden utilizar en la práctica y necesitarán adaptarse. 8 . Elaborar cebadores . 9 . Realizar mutagénesis aleatoria mediante el uso de los cebadores . 10 . Sel eccionar l as variantes resul tantes de glucoamilasa mediante examen en búsqueda de las propiedades mejoradas que se desean.

Algoritmo dope Los algoritmos dope adecuados para uso en la etapa 6 son bien conocidos en la técnica. Uno de tales algoritmos se describe por Tomandl, D. et al., 1998, Journal of Computer- Aided Molecular Design 11:29-38. Otro algoritmo es DOPE (Jensen, LJ, Andersen, KV, Svendsen, A, y Kretzschmar, T (1998) Nucleic Acids Research 26:697-702).

Ensayos de examen de filtro El ensayo se puede utilizar para examinar en búsqueda de variantes de AA560 que tengan estabilidad mejorada a alto pH en comparación con la enzima parental y variantes de alfa-amilasa AA560 que tengan estabilidad mejorada a pH alto y temperatura media, en comparación con la enzima parental, en base en el intervalo de temperatura que se examine.

Ensayo de filtro de pH alto Se siembran en placas bibliotecas de Bacillue en una placa interpuesta de acetato de celulosa (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) y filtros de nitrocelulosa (Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) en placas de agar TY con 10 µg/ml de kanamicina a 37 °C durante por lo menos 21 horas. Las capas de acetato de celulosa se localiza sobre la placa de agar TY. Cada interposición de filtro se marca específicamente por una aguja después del sembrado en placa, pero antes de la incubación con el fin de poder localizar variantes positivas en el filtro y el filtro de nitrocelulosa con variantes unidas se transfiere a un recipiente con amortiguador de glicina-NaOH, pH 8.6-10.6 y se incuba a temperatura ambiente (la cual se puede alterar de 10°-60°C) durante 15 min. Los filtros de acetato de celulosa con colonias se almacenan en placas TY a temperatura ambiente hasta su uso. Después de la incubación se detecta la actividad residual en placas que contienen agarosa 1%, almidón 0.2% en amortiguador de glicina-NaOH, pH 8.6-10.6. Las placas de ensayo con filtros de nitrocelulosa se marcan de la misma manera que la interposición de filtro y se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente . Después de remover los filtros, las placas de ensayo se tiñen con una solución de lugol 10%. Se detectan las variantes de degradación de almidón .-r,»^k como puntos blancos sobre un fondo azul oscuro y después se identifican sobre las placas de almacenamiento. Se vuelven a examinar 2 veces las variantes positivas bajo las mismas condiciones que la primera pantalla.

Ensayo de filtro bajo en calcio Se siembra en placa una biblioteca de Bacillue sobre una interposición de acetato de celulosa (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) y filtros de nitrocelulosa (Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) en placas de agar TY con un antibiótico relacionado, por ejemplo kanamicina o cloramfenicol, a 37 °C durante por lo menos 21 horas. La capa de acetato de celulosa se localiza sobre la placa de agar TY. Cada interposición de filtro se marca específicamente con una aguja después de haberse sembrado en placa, pero antes de la incubación para poder localizar variantes positivas en el filtro, y el filtro de nitrocelulosa con variantes unidas se transfiere a un recipiente con amortiguador de carbonato/bicarbonato, pH 8.5-10 y con diferentes concentraciones de EDTA (0.001 mM - 100 mM) . Los filtros se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora. Los filtros de acetato de celulosa con colonias se almacenan en placas TY a temperatura ambiente hasta que se utilizan. Después de la incubación se detecta la actividad residual en placas que contienen agarosa 1%, almidón 0.2% en amortiguador de carbonato/bicarbonato, pH 8.5-10. Las placas de ensayo con filtros de nitrocelulosa se marcan de la misma manera que la interposición de filtro y se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de remoción de los filtros, las placas de ensayo se tiñen con solución de lugol 10%. Se detectan las variantes de degradación de almidón como puntos blancos sobre un fondo azul oscuro y después se identifican sobre placas de almacenamiento. Se examinan dos veces las variantes positivas bajo las mismas condiciones que la primera pantalla.

EJEMPLOS Ejepplo 1 Aislamiento del ADN genómico a partir de DSM 12648 y DSM 12649 Se propagan las cepas Bacillue sp . DSM 12649 (la alfa-amilasa AA560) y Bacillue ep. DSM 12648 (la alfa-amilasa AA349) en medio TY líquido (como se describe en Ausubel et al. (1995)). Después de 16 horas de incubación a 37°C y 300 rpm, las células se cosechan y el ADN genómico se aisla por el método que se describe en Pitcher et al. (1989) .

Construcción de una biblioteca genómica Se digiere parcialmente ADN genómico de la cepa DSM 12649 con la enzima de restricción Sau3A, y se somete a 5 fraccionamiento por tamaño mediante electroforesis en un gel de agarosa 0.7%. Los fragmentos con un tamaño entre 2 y 10 kb se aislan por electroforesis en papel de DEAE-celulosa (Dretzen et al. (1981) . Los fragmentos de ADN aislados se ligan a ADN de 10 plásmido pSJ1678 digerido con BamHl, y la mezcla de ligación se utiliza para transformar E. coli SJ2.

Transformación 15 Se preparan células huéspedes E. coli SJ2 y se transforman por electroporación utilizando un electroporador de genes PULSERMR de BIORAD, como se describe por el proveedor.

Identificación de un transformante positivo: 20 Se examina una biblioteca de ADN en E. coli SJ2, construida como se describe antes, sobre placas de agar LB (descrito en Ausbel et al (1995)) que contiene AZCL-amilosa 0.5% (megazime) y 10 µg/ml de cloramfenicol, y se incuba 25 durante la noche a 37 °C. Los clones que expresan actividad de amilasa aparecen con halos de difusión azul . Uno de tales clones se denomina LÍH1274. El ADN se caracteriza adicionalmente por secuenciado de ADN de parte del fragmento de ADN Sau3A clonado.

Ejemplo 2 Determinación de la secuencia de ADN del gen que codifica para alfa-amilasa a partir de la cepa DSM 12648 (AA349) La clona que constituye un fragmento cromosómico grande que contiene el gen que codifica para la actividad aminolítica insertado en el plásmido pSJ1678, pLiH1274, se utiliza como una plantilla para amplificar específicamente por PCR fragmentos de ADN internos del gen que codifica para alfa-amilasa mediante el uso de cebadores degenerados dirigidos hacia las regiones conservadas en alfa-amilasa de Bacillue conocidas . Los cebadores degenerados se dirigen hacia las siguientes regiones/secuencias de aminoácidos: For36: GITA(L/V/I)W(I/L) (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5) For97: VY (G/A) D (V/F/L) V (M/L/I/F) NH (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 6) i.? isríSl.gqss For227: DG (F/l) R (F/L/I/V) DA (A/V) KH (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7) Rev235: DG(F/I)R(F/L/I/V)DA(A/V)KH (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 8) Rev328: VTFV(D/E)NHD (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 9) Rev410: GWTREG (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 10) Las diversas combinaciones de cebadores directos (For) e inversos (Rev) se utilizan en PCR y se pueden amplificar fragmentos de ADN internos. Los fragmentos de ADN se purifican por columnas QIAquick spin (QUIGEN) y se establecen las secuencias utilizando los mismos cebadores degenerados. A partir de la secuencia, se determina la secuencia de ADN (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1) de la región codificante completa que codifica para la alfa-milasa AA349 madura (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2) por el enfoque estándar o convencional de paseo por los cebadores .

Ejemplo 3 Determinación de la secuencia de ADN del gen que codifica para alfa amilasa a partir de la cepa DSM 12649 (AA560) : Se utiliza en la preparación de ADN cromosómico de la cepa DSM 12649 (Ejemplo 1) como plantilla en un experimento similar a uno descrito antes en el Ejemplo 2 para determinar la secuencia de ADN de la alfa-amilasa AA560 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4) .

Ejemplo 4 Subclonación de la alfa-amilasa AA349 en pTVBHO. pTVBHO es un plásmido que se replica en Bacillus eubtilie mediante el uso de un origen de replicación a partir de pUBllO (Gryczan, T.J. (1978) J. Bact. 134:318-329). El plásmido codifica además para el gen cat, que confiere resistencia a cloramfenicol, que se obtiene del plásmido pCl94 (Horinouchi, S. y Weisblum, B. (1982), J. Bact. 150: 815-825). El plásmido alberga una versión truncada del gen para alfa-amilasa de Bacillue licheniformie , amyL, de manera que está presente el promotor amyL, la secuencia de señal y el terminador de transcripción para amyL, pero el plásmido no proporciona un fenotipo ami-plus (formación de halo en agar que contiene almidón) . Para expresar una gran cantidad de alfa-amilasa AA349, el gen maduro se fusiona con precisión a la secuencia 5 de señal amyL de manera que se inicia la transcripción por el promotor amyL y la translocación se dirige por las secuencias de señal amyL . Se encuentra un sitio PstI dentro de la alfa-amilasa AA349 madura. Puesto que la clonación del gen pTVBHO puede 10 utilizar el sitio PstI en pTVBHO, se destruye el sitio PstI localizado dentro del gen para alfa-amilasa AA349 durante la clonación (por introducción de una mutación silenciosa para el aminoácido alanina 88 (GCA to GCG) . Se utilizan los cebadores 188cloningN y 188 (Pst-) 15 para amplificar un fragmento de aproximadamente 280 pb por PCR en el plásmido pLiH1274 utilizando la polimerasa Pwo bajo condiciones recomendadas por el fabricante (Boehringer Mannheim) . Este fragmento se purifica a partir de gel de agarosa y se utiliza como un megacebador (G. Sarkar and S.S. 20 Sommer (1990) Biotechniques 8: 404-407) junto con el cebador 188cloningC para amplificar el gen de longitud completa que codifica para la amilasa madura en una segunda PCR. El fragmento resultante de aproximadamente 1480 bp se digiere con endonucleasas de restricción PstI y Sfil, y se liga 25 con el plásmido pTVBHO digerido con las mismas enzimas.

^ La cepa de Bacillue eubtilie a la que se le ha suprimido proteasa y amilasa SHa273 (que se menciona en WO 95/10603) se transforma con la mezcla de ligación y se verifica la secuencia de ADN de un transformante amy-plus. Este plásmido se denomina pTVB231.

Oligonucleótidos : 188 (Pst-) : 5' GGC GTT AAC CGC AGC TTG TAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 11) 188cloningC: 5' CCG AGC TCG GCC GGC TGG GCC GTC GAC TTA TTT GTT TAC CCA AAT AGA AAC (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 12) 188cloningN. 5' CAT TCT GCA GCA GCG GCG CAC CAT AAT GGT ACG AAC G (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO. 13) Ejemplo 5 Subclonación de la alfa-amilasa AA560 en pTVBHO . 5 El secuenciado de ADN muestra una alta identidad de ADN entre alfa-amilasas de las cepas DSM12648 (AA349) y DSM 12649 (AA650) . En consecuencia, se utilizan los mismos oligonucleótidos y estrategia para la clonación de alfa-amilasa AA560 en el vector de expresión pTVBllO que resulta en el 10 plásmido pTVB232, el cual después se fermenta utilizando técnicas estándar o convencionales .

Ejemplo 6 15 Purificación de la alfa-amilasa AA560 parental Se flocula el caldo de cultivo al agregar 0.01 ml de CaCl2-2H20 y 50% (p/p), 0.0125 ml de aluminato de sodio 12% (p/p), 0.025 ml de C521 10% y 0.075 ml de A130 0.1% pr. ml de 20 caldo de cultivo. Se obtiene una solución transparente después de centrifugación. A la solución de enzima se le agrega sulfato de amonio hasta una concentración final de 1.2 M y se aplica en una columna de 100 ml de Butyl Toyo Pearl previamente equilibrada en sulfato de amonio 1.2 M, Tris-HCl 10 mM, pH 7.0. 25 Se eluye la amilasa utilizando Tris-HCl 5 mM, pH 7.0 y el ?0b ¡?j?t??Í*" '"-'J aáátía- í* - . « ¡ t» I [ „ . . . . . - « ?r*U??"??t1 acumulado eluído se dializa contra Tris-HCl 5 mM durante la noche. La fracción después se somete a cromatografía de intercambio iónico utilizando 200 ml de una columna Q-safarosa previamente equilibrada en Tris-HCl 20 mM, pH 9.0. El material no unido se elimina por lavado con el amortiguador de equilibrio y se eluye la amilasa utilizando un gradiente lineal de NaCl 0 - 1 M, Tris-HCl 20 mM, pH 9.0. La pureza de la preparación de amilasa es superior a 95%, en base en SDS-PAGE.

Ejemplo 7 Caracterización de la alfa-amilasa AA560 parental Se mide la actividad de alfa-amilasa utilizando tanto el ensayo de Phadebas (37 °C, pH 7.3) como el ensayo de pNPG7 alternativo (25°C, pH 7.1) descrito antes, se elaboran perfiles de pH y de temperatura a valores seleccionados de pH y de temperatura. Se mide el perfil de pH a 37 °C y el perfil de temperatura se mide a pH 9.0. Se determina el punto isoeléctrico utilizando enfoque isoeléctrico (Pharmacia, Ampholine, pH 3.5-9.3).

Tabla 1. Actividad específica y pl . Actividad Específica Enzima NU/mg de NU(T) /mg Phadebas de pNPG7 AA560 (SECUENCIA DE 35,000 9, 000 7-8 IDENTIFICACIÓN NO: 4) SP722 (SECUENCIA DE 35,000 6,000 7-9 IDENTIFICACIÓN NO: 2 de la patente de Estados Unidos No. 5,856,164) SP690 (SECUENCIA DE 35,000 7,000 5-6 IDENTIFICACIÓN NO: 1 de la patente de los Estados Unidos no. 5,856,164) E = 3.0 cm"1 * (g/1)"1 para AA560, SP722 y SP690 El resultado de la determinación del pH-óptimo y de la determinación de temperatura óptima se muestra en la figura 2 y en la figura 3, respectivamente. - - fcs «.

Ejemplo 8 Prueba de lavado con alfa-amilasa AA560 parental Se evalúa el funcionamiento de lavado al lavar muestras de prueba ensuciadas, durante 15 y 30 minutos a 25 °C y 40 °C, respectivamente, en soluciones de detergente con la alfa-amilasa AA560 de la invención. Los detergentes utilizados se describen en la Tabla 2 siguiente. El detergente modelo A/P se describe en la sección de Materiales anterior. Los otros detergentes son detergentes disponibles comercialmente. Los detergentes comerciales que contienen alfa-amilasa se inactivan por microondas antes del lavado. La alfa-amilasa AA560 recombinante purificada del Ejemplo 6 se agrega a las soluciones de detergente a la concentración indicada en lo siguiente. Las muestras de prueba se ensucian con almidón de arroz naranja (muestras CS-28, disponibles de CFT, Center for Test Material, Holanda) . Después del lavado, se evalúan las muestras al medir la remisión a 460 nm utilizando un espectrofotómetro de remisión Elrepho. Los resultados se expresan como R = remisión de una muestra lavada con alfa-amilasa menos la remisión de una muestra lavada bajo las mismas condiciones sin la alfa-amilasa.

. Tabla 2. Detergentes y condiciones de lavado.

Los resultados se muestran en las figuras 4-7. Los resultados demuestran que la alfa-amilasa de la invención es efectiva en todos los detergentes a pH altamente alcalino y muestran que la alfa-amilasa AA560 tiene un funcionamiento mejorado de lavado en comparación con SP690 y SP722, respectivamente . aaajaa&a Ejepplo 9 Prueba de descrudado con la alfa-amilasa AA560 Se utiliza la alfa-amilasa AA560 parental para descrudar telas utilizando el método TEGEWA (método y escalas de estándar que se pueden obtener de Verband TEGEWA, Karlstrasse 21, Frankfurt a.M., Alemania). Las condiciones se describen en la sección de "materiales y métodos". La alfa-amilasa AA560 se utiliza en descrudar pruebas que se llevan a cabo a 30 y 55 °C. La enzima se dosifica de 0.05 a 2 g/1 en la solución de impregnación. El procedimiento posterior al lavado se lleva a cabo por lavado de las telas en agua -en vez de el lavado habitual con sosa caliente. El efecto se mide utilizando la escala Violet (TEGEWA) de la escala TEGEWA: 1-9. Grado 1 = sin descrudar, grado 9 = totalmente descrudado .

Ejemplo 10 Construcción del material depositado pTVB299 Se ha subclonado el gen maduro en el plásmido pzero-2 (invitrogen, Groningen, Países Bajos) . Un fragmento digerido con Pstl-Sacl de aproximadamente 1.5 kb que contiene la región madura completa de AA560 (que se obtiene de pTVB232) se liga con el vector pZero-2 digerido con las mismas endonucleasas de restricción. La mezcla de ligación se transforma en células E. coli competentes. Los transformantes se analizan por PCR para verificar la presencia del fragmento insertado y se secuencia la parte de este fragmento que codifica para la alfa-amilasa madura. El plásmido resultante, denominado pTVB299, se deposita ante DSMZ como DSM12764.

Ejemplo 11 Construcción de variantes de la alfa-amilasa AA560 El gen que codifica para la alfa-amilasa AA560 que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 se localiza en un plásmido pTVB223. La amilasa se expresa a partir del promotor amyL en esta construcción en Bacillue eubtilie .

Se construye una variante de la invención con mutaciones delta (D183-G184) por el método de mega-cebador, como se describe en Sarkar y Sommer, (1990), BioTechniques 8: 404-407. 5 Se utilizan el cebador específico para el gen Bl y un cebador mutagénico 101458 para amplificar por PCR un fragmento de ADN de aproximadamente 645 pb a partir de un plásmido pTVB223 que codifica para AA560, que se muestra en la (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 12) . 10 El fragmento de 645 pb se purifica a partir de un gel de agarosa y se utiliza como un mega-cebador junto con el cebador Y2 en una segunda PCR que se lleva a cabo en la misma plantilla. El fragmento resultante, de aproximadamente 1080 pb, 15 se digiere con enzimas de restricción BstEII y AflIII, y el fragmento de ADN resultante, de aproximadamente 510 pb, se purifica y se liga con el plásmido pTVB223 digerido con las mismas enzimas. Se transforman células competentes de Bacillue subtilie SHA273 (bajas en amilasa y proteasa) con la ligación, 20 y se verifican los transformantes resistentes a cloramfenicol por secuenciado de ADN para verificar la presencia de las mutaciones correctas en el plásmido. Cebador Bl : 51 CGA TTG CTG ACG CTG TTA TTT GCG 3' (SECUENCIA DE 25 IDENTIFICACIÓN NO: 14) ^«¿sjaBá ftiy- iiifiiíJ^Bfes ^ £ *.- J t * ft > ¿ L l ' ' ¿ a^^>a a^5fe! cebador Y2 : 5' CTT GTT CCC TTG TCA GAA CCA ATG 3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 15) cebador 101458: 5 ' GT CAT AGT TGC CGA AAT CTG TAT CGA CTT C 3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 16) El plásmido resultante que codifica para la alfa-amilasa AA560 con delta (D183-G184) +N195F se denomina pTVB232. La construcción de otras variantes de la invención se puede llevar a cabo de una manera similar.

Ejemplo 12 Prueba del funcionamiento de lavado de las variantes de AA560 El funcionamiento de lavado de las variantes de AA560 de la invención se prueba como se describe en el Ejemplo 8.

Ejemplo 13 Prueba de la actividad específica de las variantes AA560 Se determina la actividad específica de las variantes AA560, como se describe en el Ejemplo 7.

Ejepplo 14 Prueba de la estabilidad de calcio de las variantes AA560 Se prueba la estabilidad de calcio de las variantes AA560 utilizando los ensayos que se describen en la sección de "materiales y métodos". La invención que se describe y reivindica aquí no se limita en alcance por las modalidades específicas que se describen aquí, puesto que estas modalidades se consideran como ilustraciones de varios aspectos de la invención. Se pretende que cualquier modalidad equivalente esté dentro del alcance de esta invención. En realidad, diversas modificaciones de la invención, además de las que se muestran y describen aquí, serán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción precedente. La totalidad de tales modificaciones se pretende que se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. En caso de conflicto, la presente descripción que incluye las definiciones será la válida. Se mencionan en la presente diversas referencias, cuyas descripciones se incorporan como referencia en su totalidad.

Referencias Sambrook et al . ; Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 1989; Cold Spring Harbor Lab.; Cold Spring Harbor; NY. Ausubel, F. M. et al. (eds.); Current Protocols in Molecular Biology; 1995; John Wiley and Sons. Harwood C. R., and Cutting S. M. (eds.); Molecular Biological Methods for Bacillus; 1990; John Wiley and Sons. Diderichsen B., Wedsted U. , Hedegaard L., Jensen B. R., Sj?holm C; Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillue brevis; J . Bacteriol., 1990, vol. 172, pp. 4315-4321. Pitcher D. G., Saunders N. A., Owen R. J.; Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidiu thiocyanate; Lett . Appl . Microbiol . ; 1989; vol. 8; pp. 151-156. Dretzen G. , Bellard M. , Sassone-Corsi P. , Chambón P. ,-A reliable method for the recovery of DNA fragments from agarose and acrylamide gels; Anal . Biochem. ,• 1981; vol. 112; pp. 295-298.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Novo Nordisk A/S <120> <130> <160> 16 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1458 <212> ADN <213> Bacillus sp. <220> <221> CDS <222> (1) .. (1458) <220> <22l> mat_peptide <222> (1) .. (1458) <400> 1 cae cat aat ggt acg aac ggc acá atg atg cag tac ttt gaa tgg tat 48 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 cta cea aat gac gga aac cat tgg aat aga tta agg tet gat gca agt 96 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser 20 25 30 aac cta aaa gat aaa ggg ate tea gcg gtt tgg att ect ect gca tgg 144 Asn Leu Lys Asp Lys Gly lie Ser Ala Val Trp lie Pro Pro Ala Trp 35 40 45 aag ggt gcc tet caá aat gat gtg ggg tat ggt gct tat gat ctg tat 192 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 gat tta gga gaa ttc aat caá aaa gga acc att cgt acá aaa tat gga 240 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr lie Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 acg cgc aat cag tta caá gct gca gtt aac gcc ttg aaa agt aat gga 288 Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly 85 90 95 att caá gtg tat ggc gat gtt gta atg aat cat aaa ggg gga gca gac 336 lie Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 gct acc gaa atg gtt agg gca gtt gaa gta aac ccg aat aat aga aat 384 Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 caá gaa gtg tcc ggt gaa tat acá att gag gct tgg ata aag ttt gac 432 Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr lie Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 ttt cea gga cga ggt aat act cat tea aac ttc aaa tgg aga tgg tat 480 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr HiS Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 cae ttt gat gga gta gat tgg gat cag tea cgt aag ctg aac aat cga 528 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg 165 170 175 att tat aaa ttt aga ggt gat gga aaa ggg tgg gat tgg gaa gtc gat 576 lie Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 acá gaa aac ggt aac tat gat tac cta atg tat gca gat att gac atg 624 Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp lie Asp Met tt-¿.»¿ . ; Lu . «k^stA?a?ßti 195 200 205 gat cae cea gag gta gtg aat gag cta aga aat tgg ggt gtt tgg tat 672 Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr 210 215 220 acg aat acá tta ggc ctt gat ggt ttt aga ata gat gca gta aaa cat 720 Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg lie Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 ata aaa tac age ttt act cgt gat tgg att aat cat gtt aga agt gca 766 lie Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp lie Asn His Val Arg Ser Ala 245 250 255 act ggc aaa aat atg ttt gcg gtt gcg gaa ttt tgg aaa aat gat tta 816 Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu 260 265 270 ggt gct att gaa aac tat tta aac aaa acá aac tgg aac cat tea gtc 864 Gly Ala lie Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val 275 280 285 ttt gat gtt ccg ctg cae tat aac etc tat aat gct tea aaa age gga 912 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly 290 295 300 ^¡^^ &¡^ ggg aat tat gat atg agg caá ata ttt aat ggt acá gtc gtg caá aga 960 Gly Asn Tyr Asp Met Arg Gln lie Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg 305 310 315 320 5 cat cea atg cat gct gtt acá ttt gtt gat aat cat gat tcg caá ect 100 His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 gaa gaa gct tta gag tet ttt gtt gaa gaa tgg ttc aaa cea tta gcg 105 10 Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 tat gct ttg acá tta acá cgt gaa caá ggc tac ect tet gta ttt tat 110 Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 15 355 360 365 gga gat tat tat ggc att cea acg cat ggt gta cea gcg atg aaa tcg 115 Gly Asp Tyr Tyr Gly lie Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser 370 375 380 20 aaa att gac ccg att cta gaa gcg cgt caá aag tat gca tat gga aga 120 Lys lie Asp Pro lie Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg 385 390 395 400 25 caá aat gac tac tta gac cat cat aat ate ate ggt tgg acá cgt gaa 124 i&ki ti a&i?x e A ?rja I l .

Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn lie lie Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 ggg aat acá gca cae ccc aac tcc ggt tta gct act ate atg tcc gat 129 Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr lie Met Ser Asp 420 425 430 ggg gca gga gga aat aag tgg atg ttt gtt ggg cgt aat aaa gct ggt 134 Gly Ala Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly 435 440 445 caá gtt tgg acc gat ate act gga aat cgt gca ggt act gtt acg att 139 Gln Val Trp Thr Asp lie Thr Gly Asn Arg Ala Gly Thr Val Thr lie 450 455 460 aat gct gat gga tgg ggt aat ttt tet gta aat gga gga tea gtt tet 144 Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser 465 470 475 480 att tgg gta aac aaa taa 145 lie Trp Val Asn Lys 485 <210> 2 <211> 485 <212> PRT <213> Bacillus Sp. <400> 2 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Lys Asp Lys Gly lie Ser Ala Val Trp lie Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr lie Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly 85 90 95 He Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 ^ „ ^^ ,„a »,. -. - * %*^^te»*^ Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr He Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 5 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 10 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg 165 170 175 He Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 15 Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp He Asp Met 195 200 205 Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr 20 210 215 220 Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg He Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 25 He Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp He Asn His Val Arg Ser Ala 245 250 255 Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu 260 265 270 Gly Ala He Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val 275 280 265 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly 290 295 300 Gly Asn Tyr Asp Met Arg Gln He Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg 305 310 315 320 His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 Glu G1U Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 355 360 365 Gly Asp Tyr Tyr Gly He Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser 370 375 380 Lys He Asp Pro He Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg 385 390 395 400 Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn He He Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr He Met Ser Asp 420 425 430 Gly Ala Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly 435 440 445 Gln Val Trp Thr Asp He Thr Gly Asn Arg Ala Gly Thr Val Thr He 450 455 460 Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser 465 470 475 460 He Trp Val Asn Lys 485 <210> 3 <211> 1458 <212> ADN <213> Bacillus sp. <220> <221> CDS <222> (1) .. (1458) 5 <220> <221> mat_peptide <222> (1) .. (1458) <400> 3 10 cae cat aat ggt acg aac ggc acá atg atg cag tac ttt gaa tgg tat His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 15 cta cea aat gac gga aac cat tgg aat aga tta agg tet gat gca agt 96 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser 20 25 30 aac cta aaa gat aaa ggg ate tea gcg gtt tgg att ect ect gca tgg 144 20 Asn Leu Lys Asp Lys Gly He Ser Ala Val Trp He Pro Pro Ala Trp 35 40 45 aag ggt gcc tet caá aat gat gtg ggg tat ggt gct tat gat ctg tat 192 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 25 50 55 60 • .aaaaBfe*. r rS y *., Lt : « á^a«Atoafe gat tta gga gaa ttc aat caá aaa gga acc att cgt acá aaa tat gga 240 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr He Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 5 acg cgc aat cag tta caá gct gca gtt aac gcc ttg aaa agt aat gga 288 Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly 85 90 95 att caá gtg tat ggc gat gtt gta atg aat cat aaa ggg gga gca gac 336 10 He Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 gct acc gaa atg gtt agg gcg gtt gaa gta aac ccg aat aat aga aat 384 Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 15 115 120 125 caá gaa gtg tcc ggt gaa tat acá att gag gct tgg acá aag ttt gac 432 Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr He Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 20 ttt ect gga cga ggt aat acc cat tea aac ttc aaa tgg aga tgg tat 480 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 25 cae ttt gat gga gta gat tgg gat cag tea cgt aag ctg aac aat cga 528 ^??^ r. rlí . t r. ,. _ ">•*-<*«"">--* His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg 165 170 175 att tat aaa ttt aga ggt gat gga aaa ggg tgg gat tgg gaa gtc gat 576 He Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 acá gaa aac ggt aac tat gat tac cta atg tat gca gat att gac atg 624 Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp He Asp Met 195 200 205 gat cae cea gag gta gtg aat gag cta aga aat tgg ggt gtt tgg tat 672 Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr 210 215 220 acg aat acá tta ggc ctt gat ggt ttt aga ata gat gca gta aaa cat 720 Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg He Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 ata aaa tac age ttt act cgt gat tgg ate aat cat gtt aga agt gca 768 He Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp He Asn His Val Arg Ser Ala 245 250 255 act ggc aaa aat atg ttt gcg gtt gcg gaa ttt tgg aaa aat gat tta 816 Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu y^ >^^ &^ 260 265 270 ggt gct att gaa aac tat tta aac aaa acá aac tgg aac cat tea gtc 864 Gly Ala He Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val 5 275 280 285 ttt gat gtt ccg ctg cae tat aac etc tat aat gct tea aaa age gga 912 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly 290 295 300 10 ggg aat tat gat atg agg caá ata ttt aat ggt acá gtc gtg caá aga 960 Gly Asn Tyr Asp Met Arg Gln He Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg 305 310 315 320 15 cat cea atg cat gct gtt acá ttt gtt gat aat cat gat tcg caá ect 100 His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 gaa gaa gct tta gag tet ttt gtt gaa gaa tgg ttc aaa cea tta gcg 105 20 Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 tat gct ttg acá tta acá cgt gaa caá ggc tac ect tet gta ttt tat 110 Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 25 355 360 365 gga gat tat tat ggc att cea acg cat ggt gta cea gcg atg aaa tcg 115 Gly Asp Tyr Tyr Gly He Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser 370 375 380 5 aaa att gac ccg att cta gaa gcg cgt caá aag tat gca tat gga aga 120 Lys He Asp Pro He Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg 385 390 395 400 caá aat gac tac tta gac cat cat aat ate att ggt tgg acá cgt gaa 124 10 Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn He He Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 ggg aat acá gca cae ccc aac tet ggt tta gct act ate atg tcc gat 129 Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr He Met Ser Asp 15 420 425 430 gga gca gga gga aat aag tgg atg ttt gtt ggg cgt aat aaa gct ggt 134 Gly Ala Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly 435 440 445 20 caá gtt tgg acc gat ate act gga aat cgt gca ggt act gtt acg att 139 Gln Val Trp Thr Asp He Thr Gly Asn Arg Ala Gly Thr Val Thr He 450 455 460 25 aat gct gat gga tgg ggt aat ttt tet gta aat gga gga tea gtt tet 144 ~&Jfc& a&íí?!& ¿?i,,st- , . r. , . , t. _, j. «.Ll . J- * awaa¡>ea Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser 465 470 475 480 att tgg gta aac aaa taa 145 He Trp Val Asn Lys 485 <210> 4 <211> 485 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 4 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Lys Asp Lys Gly He Ser Ala Val Trp He Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr He Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly 5 85 90 95 He Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 10 Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr He Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 15 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg 20 165 170 175 He Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 25 Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp He Asp Met ?MsSSBÍJk ük* £&*M» i i t . . - r,tj»?br ,- i ? 195 200 205 Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr 210 215 220 5 Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg He Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 He Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp He Asn His Val Arg Ser Ala 10 245 250 255 Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu 260 265 270 15 Gly Ala He Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val 275 280 285 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly 290 295 300 20 Gly Asn Tyr Asp Met Arg Gln He Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg 305 310 315 320 His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 25 Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 355 360 365 Gly Asp Tyr Tyr Gly He Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser 370 375 380 Lys He Asp Pro He Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg 385 390 395 400 Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn He He Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr He Met Ser Asp 420 425 430 Gly Ala Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly 435 440 445 Gln Val Trp Thr Asp He Thr Gly Asn Arg Ala Gly Thr Val Thr He 450 455 460 Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser 465 470 475 480 He Trp Val Asn Lys 485 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (9) <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: región degenerada d cebador <400> 5 Gly He Thr Ala Xaa Trp Xaa 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) ... (9) <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: región degenerada d cebador <400> 6 Val Tyr Xaa Asp Xaa Val Xaa Asn His 1 5 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: región degenerada d cebador <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (10) <400> 7 Asp Gly Xaa Arg Xaa Asp Ala Xaa Lys His 1 5 10 <210> 8 <211> 1 0 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: región degenerada d cebador <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (10) <400> 8 Asp Gly Xaa Arg Xaa Asp Ala Xaa Lys His 1 5 10 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: región degenerada cebador <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (8) <400> 9 Val Thr Phe Val Xaa Asn His Asp 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: región degenerada d cebador <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (6) <400> 10 Gly Trp Thr Arg Glu Gly 1 5 <210> 11 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador 188 (Pst-) <400> 11 ggcgttaacc gcagcttgta ac 22 <210> 12 <211> 51 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador lddcloningC 1.4. i t <400> 12 ccgagctcgg ccggctgggc cgtcgactta tttgtttacc caaatagaaa c 51 <210> 13 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador 188cloningN <400> 13 cattctgcag cagcggcgca ccataatggt acgaacg 37 <210> 14 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Bl <400> 14 cgattgctga cgctgttatt tgcg 24 zJ3*j& !: í .£ - *» -i ^ *&** Lj_ <210> 15 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Y2 <400> 15 cttgttccct tgtcagaacc aatg 24 <210> 16 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador 101458 <400> 16 gtcatagttg ccgaaatctg tatcgacttc 30 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor méto 5 conocido por la solicitante para llevar a la práctica la cita invención, es el que resulta claro de la presente descripción de invención. »tfa aalM¡ ¡&AJb?mi? -• ;. , • -, - -. - ,- l

Claims (26)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un polipéptido aislado que tiene actividad de alfa-amilasa y una o más características o propiedades que se seleccionan del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 96% de identidad con los aminoácidos 1 a 485 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 4 ; (b) una variante alélica de (a) ; y (c) un fragmento de (a) o (b) , que tiene actividad de alfa-amilasa.

2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos la cuales por lo menos 96% idéntica con los aminoácidos 1 a 485 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4.

3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación l, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 4.

4. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque consiste de la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4, o un fragmento del mismo.

5. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque consiste de los aminoácidos 1 a 485 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 O SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4.

6. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es codificado por una secuencia de ácido nucleico la cual hibridiza bajo condiciones de muy alta rigurosidad o astringencia con: (i) la secuencia de ácido nucleico de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3, (ii) la secuencia de ADNc de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 O SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii) .

7. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es codificado por la secuencia de ácido nucleico contenida en el plásmido pLIHl274 o pTVB299 contenido en E. coli DSM12761 o E. coli DSM12764, respectivamente .

8. Un polipéptido, caracterizado porque tiene la misma actividad de alfa-amilasa que el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones l a 7.

9. Una secuencia aislada de ácido nucleico, caracterizada porque comprende una secuencia de ácido nucleico la cual codifica para el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Una secuencia aislada de ácido nucleico, caracterizada porque comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene por lo menos una mutación en la secuencia que codifica para el polipéptido maduro de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3, en la cual la secuencia mutante de ácido nucleico codifica para un polipéptido que consiste de los aminoácidos 1 a 485 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4.

11. La secuencia aislada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 9 ó 10, caracterizada porque se produce al: (a) hibridizar un ADN bajo condiciones de alta astringencia con: (i) la secuencia de ácido nucleico de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1, (ii) la secuencia de ADN de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1, O (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii) ; y (b) aislar la secuencia de ácido nucleico.

12. Un vector de expresión recombinante, caracterizado porque comprende la construcción de ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 9 a 11.

13. Una célula huésped recombinante, caracterizada porque comprende la construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12.

14. Un método para producir una secuencia mutante de ácido nucleico, caracterizado porque comprende: (a) introducir por lo menos una mutación en la secuencia codificante para el polipéptido maduro de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 O la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3; en donde la secuencia mutante de ácido nucleico codifica para un polipéptido que consiste de los aminoácidos 1 a 485 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4; y (b) recuperar la secuencia mutante de ácido nucleico.

15. Una secuencia mutante de ácido nucleico, caracterizada porque se produce por el método de conformidad con la reivindicación 14.

16. Un método para producir un polipéptido, caracterizado porque comprende: (a) cultivar una cepa que comprende la secuencia mutante de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15, que codifica para el polipéptido, para producir un sobrenadante que comprende el polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

17. Un método para producir el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende: (a) cultivar una cepa para producir un sobrenadante que comprende al polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

18. Un método para producir el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende: (a) cultivar una célula huésped que comprende una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido bajo las condiciones adecuadas para producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

19. Un método para producir un polipéptido, caracterizado porque comprende: (a) cultivar una célula huésped bajo condiciones que llevan a la producción del polipéptido, en donde la célula huésped comprende una secuencia mutante de ácido nucleico que tiene por lo menos una mutación en la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 O la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3, en donde la secuencia mutante de ácido nucleico codifica para un polipéptido que consiste de los aminoácidos 1 a 485 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 O la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4 y (b) recuperar el polipéptido.

20. Un mutante de un polipéptido con actividad de alfa-amilasa, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la alfa-amilasa tiene una o más mutaciones, en particular sustituciones o supresiones, en las siguientes posiciones (en relación a la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2) : 1: R181*, G182*, D183*, G184*; 2: N195A,R,D,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; 3: I206A,R,D,N,C,E/Q,G,H,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; 4: E212A,R,D,N,C,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V 5: E216A,R,D,N,C,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V 6: K269A,R,D,N,C,E,Q,G,H,I/L,M,F,P,S,T,W,Y,V 7: R181A,N,D,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V

21. E l mut ant e de c onf o rmidad c on l a reivindicación 20, caracterizado porque se selecciona del grupo de mutantes con las siguientes mutaciones : -R181*/G182*/N195A,R,D,C,E,Q,G,H, I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; 10 -G182*/T183*/N195A,R,D,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; -T183*/G184*/R181A,N,D,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; -T183*/G184*/N195A,R,D,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; -R181*/G182*/V206A,R,D,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Yi -G182*/T183*/V206A,R,D,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Yj 15 -T183*/G184*/V206A,R,D,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W, Y; -R181*/G182*/E212A,R,D,N,C,Q,G,H, I , L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; -G182*/T183*/E212A,R,D,N,C,Q,G,H, I , L, K, M, F, P, S , T, W, Y, V; -T183*/G184*/E212A,R,D,N,C,Q,G,H, I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; -R181*/G182*/E216A,R,D,N,C,Q,G,H, I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; 20 -G182*/T183*/E216A,R,D,N,C,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; -T183*/G184*/E216A,R,D,N,C,Q,G,H, I , L, K, M, F, P, S , T, W, Y, V; -R181*/G182*/K269A,R,D,N,C,E,Q,G,H,I,L,M,F,P,S,T,W, Y,V; -G182*/T183*/K269A,R,D,N,C,E,Q,G,H, I , L, M, F, P, S , T, W, Y, V; -T183*/G184*/K269A,R,D,N,C,E,Q,G,H, I , L, M, F, P, S , T, W, Y, V; 25 -N195A,R,D,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; g^kjÁ^&?ttí&^fe^^^ /V206A,R,D,N,C,E,Q,G,H, I , L, K, M, F, P, S , T, W, Y -N195A,R,D,C,E,Q,G,H,I,L K,M F,P T,W /E212A,R,D,N,C,Q,G,H, I,L K,M F,P T,W -N195A,R,D,C,E,Q,G,H,I,L K,M F,P T,W /E216A,R,D,N,C,Q,G,H,I,L K,M F,P T,W -N195A,R,D,C,E,Q,G,H,I,L K,M F,P T,W /K269A,R,D,N,C,E,Q,G,H,I L,M F,P T,W -V206A,R,D,N,C,E,Q,G,H,I L,K M,F S,T /E212A,R,D,N,C,Q,G,H,I,L K,M F,P T,W -V206A,R,D,N,C,E,Q,G,H,I L,K M,F s,t /E216A,R,D,N,C,Q,G,H,I,L K,M F,P t,w -V206A,R,D,N,C,E,Q,G,H,I L,K M,F s,t /K269A,R,D,N,C,E,Q,G,H, I L,M F,P t,w -E212A,R,D,N,C,Q,G,H,I,L K,M F,P t,w /E216A,R,D,N,C,Q,G,H,I,L K,M F,P t,w E212A,R,D,N,C,Q,G,H, I , L, K, , F, P, S , T, W, Y, V; /K269A,R,D,N,C,E,Q,G,H,I L,M F,P t,w V; -E216A,R,D,N,C,Q,G,H,I,L K,M F,P t,w V; /K269A,R,D,N,C,E,Q,G,H,I L,M F,P t,w V.

22. El mutante de conf ormidad con las reivindicaciones 20 ó 21, caracterizado porque comprende además una sustitución en la posición E216Q. ui

23. El uso del polipéptido, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una variante de las reivindicaciones 20 a 22, en una composición de detergente, en particular una composición de detergente de lavandería y una composición de detergente para lavado de trastes.

24. El uso del polipéptido, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una variante de las reivindicaciones 20 a 22, en una composición de descrudado. 10

25. El uso del polipéptido, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una variante de las reivindicaciones 20 a 22, caracterizado porque se utiliza para licuefacción de almidón. 15

26. El uso del polipéptido, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una variante de las reivindicaciones 20 a 22, caracterizado porque se utiliza para la producción de etanol . r. Aaaw>8IMM»™n« aata« _> ki