CN103069014B - 皮和兽皮的酶法脱毛 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及将兽皮或皮加工成皮革的方法,其包括在浸泡步骤中用糖酶处理兽皮或皮。本发明可实现最优的纤维打开,导致较短时间期间,并同时不导致松弛的粒面,且同时最大程度减少污染或对环境的影响。
Description
涉及序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表。所述计算机可读形式通过提述并入本文。
技术领域
本发明涉及使用谷氨酰内肽酶(glutamylendopeptidase)使兽皮和皮(hidesandskins)上的毛发变松的方法。此外,其涉及更加迅速和环保的皮革准备(beamhouse)方法。
发明背景
传统的皮革准备工艺或湿加工清洁兽皮或皮,使其适于进一步加工如复鞣(retanning),油湿化(fatliquoring),染色(dyeing)和涂饰(finishing)。皮革准备工艺包括浸湿(去除污物和重新氢化)、脱毛(去除毛发,传统为浸灰(liming)工艺的一部分),石灰化(去除毛发和释放脂肪和蛋白质,以及溶胀胶原结构),去肉(fleshing)(去除脂肪组织),剖皮(splitting)(水平切割为粒面剖层皮(grainsplit)和肉面剖层皮(fleshsplit)),脱灰(deliming)(释放石灰并降低pH),酵解软化(bating)(去除蛋白质,无用物质(scut)去除,和打开纤维),酸洗(pickling)(将pH值降低至3左右)和制革(皮或兽皮基质的稳定化)的步骤。该工艺的产物通常称作蓝湿皮(wet-blue)。
在皮革工业中,已经使用酶约100年(Uhlig,IndustrialEnzymesandtheirapplication1998第5.9节,JohnWeiley&Sons出版)。目前,在浸湿、脱毛、酵解软化和去油脂中,酶的使用已经获得相对成功(Thanikaivelan等,2004,TrendinBiotechnology22,181-187)。
从外表面和毛囊适当去除毛发对于确保软和平滑表面的粒面(grain)以及确保皮革颜色的均匀性而言非常重要。最常实践的兽皮和皮的脱毛方法是使用石灰和硫化钠的化学工艺。估计少于2%的皮革准备工厂(beamhouse)使用酶进行脱毛。硫化物主要通过切割角蛋白分子的二硫键而起作用。该作用受氢氧化钙(石灰)辅助,后者通过泡胀和释放纤维间的非胶原蛋白来弱化(loosen)胶原结构。该工艺为常规的溶毛(hair-burn)或制浆(pulping)系统。
已知酶脱毛方法为常规化学工艺的环保替代品。酶脱毛的实例描述于US3,840,433,US4,636,222,WO1994/06942,US5,834,299和WO2008/093353。酶消化毛球的基细胞以及马尔比基氏(malphigian)层(表皮最内侧的两层)的细胞。接着,以对最外侧的鞘进行的攻击和后续的内根鞘(innerrootsheath)和部分未完全角质化的毛发的分解使毛发松弛。用于脱毛的酶一般为蛋白水解性的,其催化蛋白质的降解。可使用的蛋白酶的实例为或多或少较粗的、细菌或真菌来源的、含有不同肽酶活性的蛋白酶提取物,以及更纯的蛋白酶如弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。然而,因为兽皮和皮主要由胶原构成,其易受蛋白酶的降解,因此当使用蛋白酶时存在对皮或兽皮粒面破坏的风险。此外,蛋白酶可能无法完全去除毛发,留下不期望的残梗(stubble),以及潜在地在皮或兽皮上留下不均匀的颜色。
需要继续努力设计理想的用于脱毛的酶,其提供充分的毛发去除和对皮革的最小破坏。此外,亦期望得到更加环境友好的皮革准备工艺。
发明详述
本发明的一个方面是使用谷氨酰内肽酶以使皮和/或兽皮上的毛发松弛,这导致皮革中改善的毛发、毛发根和毛乳头的去除。
本发明一个进一步的方面是修饰的毛发准备工艺,其包括谷氨酰内肽酶脱毛步骤。该修饰的工艺减少了加工时间,而且还允许减少或避免污染性化学品如硫化物和石灰。
定义
术语“谷氨酰内肽酶”意指一种肽酶,优选为一种丝氨酸内肽酶,其在谷氨酸残基(取决于缓冲液,在一定程度上在天冬氨酸残基)的羧基端侧切割。归类为EC3.4.21.19酶或EC3.4.21.82酶的肽酶为谷氨酰内肽酶。然而,归类在这些EC分类之外的酶亦可为谷氨酰内肽酶。可通过测试其相对于非Glu-|-Xaa,切割Glu-|-Xaa的偏好性来评估一种肽酶是否为谷氨酰内肽酶。用于鉴定一种丝氨酸内肽酶是否为适于本发明的谷氨酰内肽酶的筛选测定法描述于实施例1的方法。该测定法亦适于鉴定谷氨酰内肽酶活性。
术语“分离的多肽”意指相对于见于自然界的多肽通过人力纯化的多肽。在一个方面,如通过SDS-PAGE确定,所述多肽为至少1%纯,例如至少5%纯,至少10%纯,至少20%纯,至少40%纯,至少60%纯,至少80%纯,和至少90%纯。优选地,本发明的分离的多肽是分离的肽酶。
术语“LVU”或“单位”是蛋白酶活性的量度。一个LVU是在本文中设定的条件(50mg/ml溶于水的酪蛋白,pH用NaOH调整至8.2,温度37℃,pH8.2和反应时间为60分钟)下降解1.725mg酪蛋白的酶量。该反应通过添加HCl终止,并将未降解的酪蛋白用硫酸钠沉淀。在样品滤过物重新滴定中碱(NaOH)的消耗减去空白滤过物的重新滴定中碱(NaOH)的消耗,为蛋白酶活性的直接量度。受降解并因此无法沉淀的酪蛋白越多,在回滴定(backtitration)中需要的NaOH越多。(A.Küntzel:GerbereichemischesTaschenbuch,第6版,p.85,DresdenundLeipzig,Germany,1955)。
术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等之后最终形式的多肽。成熟多肽可取决于其表达的宿主而变化。在一个方面,所述成熟多肽是SEQIDNO:1的氨基酸95至316或SEQIDNO:2的氨基酸89至303或SEQIDNO:3的氨基酸94至313或SEQIDNO:4的氨基酸93至314或SEQIDNO:5的氨基酸69至288或SEQIDNO:5的氨基酸69至336,SEQIDNO:6的氨基酸121至342,SEQIDNO:7的氨基酸97至318或SEQIDNO:8的氨基酸169至355。
术语“序列同一性”用于本文中描述两个氨基酸序列之间相关性。就本发明而言,两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套组(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite),Rice等,2000,TrendsGenet.16:276-277)的Needle程序(优选为3.0.0版或之后的版本)中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定的。所用的可选参数为缺口开放罚分(gapopenpenalty)10,缺口延伸罚分(gapextensionpenalty)0.5,和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算:
(相同的残基×100)/(比对长度-比对中缺口总数)
术语“基本上纯的多肽”意指按照与其天然或重组结合的其它多肽材料的重量计含有最多10%,最多8%,最多6%,最多5%,最多4%,最多3%,最多2%,最多1%和最多0.5%的制备物。优选地,所述多肽按制备物中存在的总多肽材料的重量计为至少92%纯,例如至少94%纯,至少95%纯,至少96%纯,至少97%纯,至少98%纯,至少99%纯,至少99.5%纯,和100%纯。本发明的多肽优选为基本上纯的形式。这可通过例如,藉由公知的重组方法或藉由经典的纯化方法来制备所述多肽来实现。
谷氨酰内肽酶
本发明提供了用于使兽皮或皮上的毛发松弛的酶方法,其包括在水溶液中用谷氨酰内肽酶处理兽皮或皮。
该针对谷氨酸的特异性活性已在脱毛中证明是优点。用谷氨酰内肽酶的处理甚至在毛囊中(在此毛发一般难以用酶处理去除)亦导致有效的毛发去除。因为谷氨酸残基亦存在于胶原中,令人惊讶的是,考虑到该有效的毛发去除,仍观察到用谷氨酰内肽酶处理的皮和兽皮上非常低程度的粒面损伤(graindamage)。
毛发的松弛是脱毛工艺的一部分。一旦毛发的外侧和内侧根鞘的角蛋白结构被弱化,其会变得松弛,并更易受机械作用以及进一步的酶或化学作用。毛发是否松弛可通过手动刮擦,例如,用指甲或其它硬质材料刮擦该皮或兽皮来进行评估:若毛发脱落,则可认为其松弛。其亦可通过电子显微术来评估,即其鞘与未经处理的兽皮或皮的鞘相比是否显示破坏(breakdown)的迹象。
在本发明的方法中,所述谷氨酰内肽酶以有效量使用,其为与经受不含谷氨酰内肽酶的相同处理的皮或兽皮相比,实现毛发松弛效果的量。技术人员会理解提供毛发松弛效果所需的谷氨酰内肽酶的量可根据使用的谷氨酰内肽酶的比活性以及处理条件而变动。对于合适的条件,包括pH范围、漂洗组合物(floatcomposition)、漂洗体积(floatvolume)、其它酶活性和温育时间的建议在下文“脱毛”部分讨论。这些条件可同等地适用于松弛毛发的方法。可在这些变化条件下对谷氨酰内肽酶的有效量的鉴定进行优化,这被认为是本领域技术人员的常规工作。在本发明的一个优选实施方案中,谷氨酰内肽酶的量在5至1000mg纯酶蛋白/kg毛皮或皮的范围,更优选在10至900mg纯酶蛋白/kg毛皮或皮的范围,更优选在10至900mg纯酶蛋白/kg毛皮或皮的范围,更优选在15至800mg纯酶蛋白/kg毛皮或皮的范围,更优选在20至700mg纯酶蛋白/kg毛皮或皮的范围,更优选在25至600mg纯酶蛋白/kg毛皮或皮的范围,更优选在30至500mg纯酶蛋白/kg毛皮或皮的范围,更优选在35至400mg纯酶蛋白/kg毛皮或皮的范围,甚至更优选在40至300mg纯酶蛋白/kg毛皮或皮的范围,甚至更优选在50至200mg纯酶蛋白/kg毛皮或皮的范围,甚至更优选在60至100mg纯酶蛋白/kg毛皮或皮的范围,和最优选在40至80mg纯酶蛋白/kg毛皮或皮的范围。
具有谷氨酰内肽酶的多肽可分离或获得自任何属的微生物。就本发明而言,用于本文涉及给定的来源的术语“获得自”应意指由多核苷酸编码的多肽由该来源或由其中插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生。在一个方面,获得自给定来源的多肽分泌至胞外。在一个优选实施方案中,所述谷氨酰内肽酶是基本上纯的多肽。
所述谷氨酰内肽酶可以是细菌多肽。例如,所述谷氨酰内肽酶可为具有谷氨酰内肽酶活性的来自革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)的多肽;或具有谷氨酰内肽酶活性的来自革兰氏阴性细菌如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红小梨形菌属(Rhodopirellula)、沙门氏菌属(Salmonella)、堆囊粘细菌属(Sorangium)或脲原体属(Ureaplasma)多肽。
在一个方面,所述谷氨酰内肽酶来源于芽孢杆菌属,更优选来源于选自下组的菌种:嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、Bacillushalmapalus、堀越氏芽孢杆菌(Bacillushorikoshii)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)。或者,所述谷氨酰内肽酶可来源于选自下组的菌种:破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、Mesorhizobiumlotil、纤维堆囊粘细菌(Sorangiumcellulosum)、Rhodopirellulabaltica、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、似马链球菌(Streptococcusequisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房链球菌(Streptococcusuberis)、马链球菌兽瘟亚种(StreptococcusequiZooepidemicus)、不产色链霉菌(Streptomycesachromogenes)、除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomycescoelicolor)、弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)。
适于在本发明中使用的谷氨酰内肽酶可根据实施例1的方法鉴定。在本发明的一个优选实施方案中,所述谷氨酰内肽酶具有至少10的谷氨酰内肽酶比例。
在一个实施方案中,所述谷氨酰内肽酶是SEQIDNO:1中所示的地衣芽孢杆菌谷氨酸特异性(glu-specific)蛋白酶,优选为SEQIDNO:1的成熟谷氨酰芽孢杆菌,更优选为SEQIDNO:1的氨基酸95至316。在一个进一步的实施方案中,所述谷氨酰内肽酶与SEQIDNO:1的成熟多肽,优选与SEQIDNO:1的氨基酸95至316具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%序列同一性,其中所述多肽具有谷氨酰内肽酶活性。编码SEQIDNO:1的DNA的克隆以及SEQIDNO:1的表达描述于EP482879。来自地衣芽孢杆菌的谷氨酰内肽酶亦描述于US4,266,031和WO1991/13554。
在另一个实施方案中,所述谷氨酰内肽酶为SEQIDNO:2中所示的来自短小芽孢杆菌Ja96的谷氨酸特异性蛋白酶,优选为SEQIDNO:2的成熟谷氨酰内肽酶,更优选为SEQIDNO:2的氨基酸89至303。在一个进一步的实施方案中,所述谷氨酰内肽酶与SEQIDNO:2的成熟多肽,优选与SEQIDNO:2的氨基酸89至303具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%序列同一性,其中所述多肽具有谷氨酰内肽酶活性。编码SEQIDNO:2的DNA的克隆以及SEQIDNO:2的表达描述于WO01/16285,其中SEQIDNO:12对应于本申请的SEQIDNO:2。SEQIDNO:2亦可作为UNIPROT登录号Q2HXL7获得。Miyaji等,2006J.Jpn.Ass.FoodPreserv.Sci.32:5-11亦描述了该谷氨酰内肽酶的纯化和表征。
在另一个实施方案中,所述谷氨酰内肽酶为SEQIDNO:3中所示的来自枯草芽孢杆菌的谷氨酸特异性蛋白酶,优选为SEQIDNO:3的成熟谷氨酰内肽酶,更优选为SEQIDNO:3的氨基酸94至313。在一个进一步的实施方案中,所述谷氨酰内肽酶与SEQIDNO:3的成熟多肽,优选与SEQIDNO:3的氨基酸89至303或94至313具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%序列同一性,其中所述多肽具有谷氨酰内肽酶活性。US5,589,383的图14公开了对应于SEQIDNO:3的DNA和蛋白序列,并表征了所述多肽。此外,其克隆和表达还描述于WO2001/16285,其中SEQIDNO:14对应于本申请的SEQIDNO:3。
在另一个实施方案中,所述谷氨酰内肽酶为SEQIDNO:4中所示的来自地衣芽孢杆菌的谷氨酸特异性蛋白酶,优选为SEQIDNO:4的成熟谷氨酰内肽酶,更优选为SEQIDNO:4的氨基酸93至314。在一个进一步的实施方案中,所述谷氨酰内肽酶与SEQIDNO:4的成熟多肽,优选与SEQIDNO:4的氨基酸93至314具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%序列同一性,其中所述多肽具有谷氨酰内肽酶活性。编码SEQIDNO:4的DNA的克隆以及SEQIDNO:4的表达描述于WO01/16285,其中SEQIDNO:6对应于本申请的SEQIDNO:4。
在另一个实施方案中,所述谷氨酰内肽酶为SEQIDNO:5中所示的来自金黄色葡萄球菌的谷氨酸特异性蛋白酶,优选为SEQIDNO:5的成熟谷氨酰内肽酶,更优选为SEQIDNO:5的氨基酸69至288或SEQIDNO:5的氨基酸69至336。在一个进一步的实施方案中,所述谷氨酰内肽酶与SEQIDNO:5的成熟多肽,优选与SEQIDNO:5的氨基酸69至288或SEQIDNO:5的氨基酸69至336具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%序列同一性,其中所述多肽具有谷氨酰内肽酶活性。SEQIDNO:5的谷氨酰内肽酶可根据UNIPROT登录号P0C1U8获得,且其克隆和表达描述于JP4211370和描述于Carmona和gray,1987,NuclAcidRes,15:6757。
在另一个实施方案中,所述谷氨酰内肽酶为SEQIDNO:6中所示的来自堀越氏芽孢杆菌的谷氨酸特异性蛋白酶,优选为SEQIDNO:6的成熟谷氨酰内肽酶,更优选为SEQIDNO:6的氨基酸121至342。在一个进一步的实施方案中,所述谷氨酰内肽酶与SEQIDNO:6的成熟多肽,优选与SEQIDNO:6的氨基酸121至342具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%序列同一性,其中所述多肽具有谷氨酰内肽酶活性。编码SEQIDNO:6的DNA的克隆以及SEQIDNO:6的表达描述于WO01/16285,其中SEQIDNO:4对应于本申请的SEQIDNO:6。
在另一个实施方案中,所述谷氨酰内肽酶为SEQIDNO:7中所示的来自地衣芽孢杆菌的谷氨酸特异性蛋白酶,优选为SEQIDNO:7的成熟谷氨酰内肽酶,更优选为SEQIDNO:7的氨基酸97至318。在一个进一步的实施方案中,所述谷氨酰内肽酶与SEQIDNO:7的成熟多肽,优选与SEQIDNO:7的氨基酸97至318具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%序列同一性,其中所述多肽具有谷氨酰内肽酶活性。编码SEQIDNO:7的DNA的克隆以及SEQIDNO:7的表达描述于WO2001/16285,其中SEQIDNO:10对应于本申请的SEQIDNO:7。
在另一个实施方案中,所述谷氨酰内肽酶为SEQIDNO:8中所示的来自灰色链霉菌的谷氨酸特异性蛋白酶,优选为SEQIDNO:8的成熟谷氨酰内肽酶,更优选为SEQIDNO:8的氨基酸169至355。在一个进一步的实施方案中,所述谷氨酰内肽酶与SEQIDNO:8的成熟多肽,优选与SEQIDNO:8的氨基酸169至355具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%序列同一性,其中所述多肽具有谷氨酰内肽酶活性。编码对应于SEQIDNO:8的蛋白序列的基因的克隆和表征公开于SidhuS.S.,Kalmar,G.B,BorgfordT.J.:Characterizationofthegeneencodingtheglutamic-acid-specificproteaseofStreptomycesgriseus.Biochem.Cell.Biol.71:454-461(1993)。
SEQIDNO:1至8的谷氨酰内肽酶彼此之间的序列同一性如下所示:
ID1 | ID2 | ID3 | ID4 | ID5 | ID6 | ID7 | ID8 | |
ID1 | 100.00 | 35.15 | 47.62 | 80.19 | 30.04 | 37.28 | 83.12 | 33.33 |
ID2 | 35.15 | 100.00 | 35.48 | 38.73 | 29.23 | 39.72 | 40.21 | 31.18 |
ID3 | 47.62 | 35.48 | 100.00 | 46.60 | 31.15 | 34.06 | 46.98 | 29.54 |
ID4 | 80.19 | 38.73 | 46.60 | 100.00 | 32.30 | 36.93 | 85.94 | 30.94 |
ID5 | 30.04 | 29.23 | 31.15 | 32.30 | 100.00 | 30.26 | 28.84 | 28.40 |
ID6 | 37.28 | 39.72 | 34.06 | 36.93 | 30.26 | 100.00 | 39.86 | 25.11 |
ID7 | 83.12 | 40.21 | 46.98 | 85.94 | 28.84 | 39.86 | 100.00 | 31.10 |
ID8 | 33.33 | 31.18 | 29.54 | 30.94 | 28.40 | 25.11 | 31.10 | 100.00 |
在一个优选实施方案中,用于本发明的谷氨酰内肽酶是基本上纯的。
可将谷氨酰内肽酶,或一种或多种谷氨酰内肽酶添加至传统皮革准备工艺,如实施例2中所述的工艺,或其变型。所述谷氨酰内肽酶可例如添加于常规浸泡中,优选在浸泡的最后1至4个小时。或者,其可作为单独步骤在常规浸灰步骤之前或之后添加。
在本发明的一个优选实施方案中,将谷氨酰内肽酶或一种或多种谷氨酰内肽酶,例如选自由SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7和8的谷氨酰内肽酶或成熟谷氨酰内肽酶组成的组的一种或多种,施于如下文“皮革准备工艺”部分中所述的修饰的皮革准备工艺。
皮革准备工艺
可将本发明的工艺施用于任何常规用于皮革制造的皮或兽皮。具体而言,本发明的工艺可施用于绵羊皮、猪皮、牛皮或山羊皮。
在下文中所述的工艺步骤中,除非另行指明,百分比为基于兽皮、皮或毛皮(pelt)的重量。
浸泡(soaking)
当盐腌的皮或兽皮进入毛皮准备工厂时,对其进行污物浸泡以去除盐和污物。其持续时间可根据皮革准备工艺调适,并可自1小时至12小时,优选1至2小时变动。常规污物浸泡是不加酶进行的。在本发明的一个优选实施方案中,所述污物浸泡不添加酶进行。在一个备选实施方案中,可施加酶,优选为丝氨酸蛋白酶,更优选枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶-样蛋白酶或胰凝乳蛋白酶,所述蛋白酶可以以6000LVU/kg兽皮至130000LVU/kg兽皮,优选12000LVU/kg兽皮至75000LVU/kg兽皮,更优选24000LVU/kg兽皮至48000LVU/kg兽皮的量施用。合适的蛋白酶描述于“皮革加工酶”部分。一般而言,浸泡漂洗物(soakfloat)在浸泡完成时丢弃。
污物浸泡之后一般进行更长的浸泡,其常规上为8至72小时。该浸泡的作用是使皮或兽皮重新水化(rehydrate),并开始打开纤维结构。在本发明的一个优选实施方案中,浸泡时间减少至1至6个小时,优选1.5至5个小时,甚至更优选2至4个小时,且最优选2至3个小时。浸泡步骤可包含有效量的α-淀粉酶添加至所述浸泡步骤。合适的α-淀粉酶描述于“皮革加工酶”部分。有效量可由本领域技术人员评估,优选其为1mg至1000mg酶蛋白/kg皮或兽皮,优选5mg至500mg酶蛋白/kg皮或兽皮,更优选7mg至250mg酶蛋白/kg皮或兽皮,更优选10mg至150mg酶蛋白/kg皮或兽皮,最优选12mg至75mg酶蛋白/kg皮或兽皮。除了淀粉酶之外,可将蛋白酶添加至浸泡步骤,优选丝氨酸蛋白酶,更优选枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。蛋白酶可对于兽皮或皮的重量以6000LVU/kg兽皮至130000LVU/kg兽皮,优选12000LVU/kg兽皮至75000LVU/kg兽皮,更优选24000LVU/kg兽皮至48000LVU/kg兽皮的量施用。合适的蛋白酶描述于“皮革加工酶”部分。
上述浸泡步骤通常在作为机械搅拌的桨、鼓筒或混合器中进行以加速浸泡工艺。作为原则,将兽皮以100%至400%,优选200%漂洗物浸泡于鼓筒中,而绵羊皮,特别是具有羊毛的绵羊皮以高至2000%的漂洗物浸泡于桨中。一般而言,浸泡漂洗物在浸泡完成时丢弃。
本发明的浸泡工艺可在常规浸泡条件下进行,即浸泡漂洗物的pH为pH4至12的范围,优选pH6至10的范围,最优选pH7至9的范围;温度在5℃至32℃的范围,优选15℃至30℃的范围,更优选20℃至30℃的范围,且视需要潜在地与已知的表面活性剂(tenside)和防腐剂如杀生物剂一同进行。
脱毛
如背景部分中所述,脱毛常规用硫化物和石灰进行,或者通过使用蛋白酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶进行。
本发明提供了更加环保和有效的脱毛工艺。在本发明的脱毛工艺中,使用谷氨酰内肽酶以处理经浸泡的兽皮或皮。合适的谷氨酰内肽酶描述于“谷氨酰内肽酶”部分,所述酶的有效量和优选量亦如此。
用谷氨酰内肽酶进行的处理的条件可根据选择的具体的酶或酶的组合而变动。一些可变动的参数如下所述。所述参数可单独变动或这些参数的任何组合可同时变动。
在本发明的一个方面,在对经浸泡的兽皮和皮用谷氨酰内肽酶的处理之前,进行用α-淀粉酶的处理。优选地,所述α-淀粉酶处理进行1至6小时,优选1至5小时,更优选1.5至5小时,甚至更优选2至4小时,且最优选2至3小时。所述α-淀粉酶预处理可并入如上所述的浸泡步骤,可为与下述脱毛步骤组合的处理,或可为单独的处理。α-淀粉酶的量如上文“浸泡”部分中所述。此外,所述α-淀粉酶处理可在蛋白酶,优选丝氨酸蛋白酶(EC3.4.21),更优选枯草杆菌蛋白酶的存在下进行,亦如上文“浸泡”部分中所述。
谷氨酰内肽酶处理时间可根据酶活性而调整,优选处理时间使得毛发去除充分,并且粒面损伤非常有限或没有,这可根据实施例3和4的原则来评估。在本发明的一个实施方案中,处理时间为1至5小时,优选1.5至4小时,更优选2至3小时,且最优选1.5至2.5小时。
当选择进行脱毛的pH范围时,应考虑谷氨酰内肽酶的最优pH。酶的活性可在一定程度上通过改变pH来控制,因此若期望最优活性,应将pH在该酶的最优pH(在加工温度测量)的+/-1pH单位的范围内选择。在本发明的一个实施方案中,pH在5.5至12.5的范围,优选在6至12的范围,更优选在6.5至11的范围,更优选在7至10的范围,更优选在7.5至9.5的范围,最优选在8至9的范围。若期望降低活性,例如控制粒面损伤,应选择pH使得其落在该酶的最优pH范围之外(参见,例如US4,636,222)。或者,可在谷氨酰内肽酶处理过程中改变pH,例如在脱毛过程中从最优pH至落该酶的最优pH范围外的pH。在一个实施方案中,该pH变化是变至其中该酶丧失其活性的pH。在一个进一步的实施方案中,处理在6.5至9.5的范围,更优选7至9的范围进行1至4小时,优选1至3小时,更优选1至2小时,接着pH增加至高于11,更优选至高于12。在一个优选实施方案中,所述谷氨酰内肽酶处理在5.5至10的pH范围进行,接着pH逐渐增加至高于11。pH增加在1至4小时,更优选2至3.5小时,最优选2.5至3.5小时逐渐进行。该pH的增加进一步起溶胀皮或兽皮至使得更易对其进行去肉和剖皮(split)的大小的作用。
在本发明的一个方面中,所述脱毛处理可以以谷氨酰内肽酶作为唯一的酶活性的来源,或优选地作为唯一的蛋白分解活性来源进行。或者,可将其他酶活性与谷氨酰内肽酶一同添加,包括α-淀粉酶和/或蛋白酶。在一个优选实施方案中,所述脱毛在蛋白酶,优选丝氨酸蛋白酶(EC3.4.21),更优选胰蛋白酶或胰蛋白酶-样蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶的存在下进行。所述蛋白酶可以以700–3,500,000LVU/kg兽皮或皮,优选3500–2,100,000LVU/kg兽皮,更优选7000–1,400,000LVU/kg兽皮,甚至更优选35000–1,000,000LVU/kg兽皮或皮的量施用。合适的蛋白酶描述于“皮革加工酶”部分。在一个优选实施方案中,使用115。
可视需要优化或改变漂洗组合物。本领域技术人员会知道如何进行此类改变。一般而言,漂洗组合物基于水;组合物的pH可通过添加酸性或碱性化合物来调整。对于碱性pH(高于pH7),一般使用苏打灰/纯碱(sodaash)或氢氧化物,例如NaOH或Ca(OH)2来调整pH,然而本领域技术人员可容易地用其它碱性物质来替代这些。对于酸性pH(低于7),一般使用硫酸或甲酸,然而本领域技术人员可容易地用其它酸性物质来替代这些。所述漂洗物亦可含有防腐剂如杀生物剂以防止兽皮或皮在处理过程中的污损/结垢(fouling)。
脱毛处理一般与机械作用一同进行,例如使用桨、鼓筒或混合器作为机械搅拌加速过程。作为原则,将兽皮以50%至400%,优选100%至200%漂洗物在鼓筒中处理,而绵羊皮,特别是具有羊毛的绵羊皮以高至2000%的漂洗物浸在桨中处理。当脱毛处理完成时,一般丢弃漂洗物,并将毛发从系统去除。
处理可在5℃至32℃的温度范围,优选在15℃至30℃的范围,更优选在20℃至30℃的范围进行。
本发明的一个实施方案是用于将兽皮或皮脱毛的工艺,其包括下述步骤:a)在水溶液中用有效量的α-淀粉酶处理兽皮或皮;和b)在水溶液中用有效量的谷氨酰内肽酶使毛发松弛。其中步骤a)可如“浸泡”或“脱毛”部分中所述进行,而步骤b)可如“脱毛”部分中所述进行。任选地,若谷氨酰内肽酶处理的pH低于10,则在步骤b)之后添加pH增加步骤。该步骤在1至4小时的期间内将pH逐渐升高至高于11。
浸灰
浸灰步骤是在皮革准备工艺中的常规脱毛步骤,其施用硫化物以减少角蛋白分子中的二硫桥联,并施用石灰以削弱胶原结构并释放纤维间非胶原蛋白质。
在本发明的一个方面中,可忽略用硫化物和石灰或这些化学品的替代物的处理,因为通过如上所述用谷氨酰内肽酶的处理获得的脱毛本身即已足够有效。在本发明的一个实施方案中,不添加硫化物(或其它二硫键还原化学品,不包括还原二硫键的酶)即已使毛发松弛或去除,例如进行了脱毛工艺或完整的皮革准备工艺,优选整个皮革准备工艺不添加硫化物(或其它二硫键还原化学品,不包括还原二硫键的酶)进行。在另一个实施方案中,不添加浸灰剂即已使毛发松弛或去除,例如进行了脱毛工艺。在本发明的另一个实施方案中,不添加浸灰剂且不添加硫化物(或其它二硫键还原化学品,不包括还原二硫键的酶)即已使毛发松弛或去除,例如进行了脱毛工艺或完整的皮革准备工艺。不使用硫化物的一个优点是使得毛发保持完整(毛发保存(hairsaving)工艺),与通过硫化物溶解毛发相比,其对于环境要显著较佳。
在本发明的另一个方面,通过用硫化物和/或浸灰剂进行处理使得脱毛甚至更加有效。在本发明的一个优选实施方案中,对在上述脱毛步骤中步骤b)之后获得的毛皮进行硫化物处理或用其它蛋白二硫键还原化合物的处理。因此,在谷氨酰内肽酶处理之后进行硫化物处理或用其它蛋白二硫键还原化合物的处理以甚至更有效的释放毛发。在此之后,应理解的是,当使用术语硫化物时,除非另行指明,其包括其它蛋白二硫键还原化合物。本领域技术人员会知道何种硫化物适于皮革准备工艺,一些实例为Na2S、CaS、As2S3和NaHS以及其他类似的盐。其它蛋白二硫键还原化合物可为硫代乙醇酸的盐以及其它硫醇(thiol,mercaptan)R-S-H,能够催化蛋白中--S--S--的重排的酶,例如蛋白二硫键还原酶,蛋白二硫键异构酶,蛋白二硫键氧化酶,蛋白二硫键氧还酶,蛋白二硫键转氢酶,巯基氧化酶,和硫氧还蛋白。这些酶在脱毛中的使用描述于US5,834,299,其通过提述并入本文。本领域技术人员会知道如何优化硫化物的量。在一个优选实施方案中,硫化物的量为0.01%至3%,优选0.05%至2%,更优选0.1%至1.5%,甚至更优选0.15%至1%,最优选0.2%至0.5%每kg兽皮、皮或毛皮的范围。在一个优选实施方案中,所述硫化物处理不添加浸灰剂而进行。
在本发明的一个实施方案中,所述硫化物处理与浸灰剂组合进行。所述硫化机处理在用谷氨酰内肽酶处理之后进行,优选在将毛皮剖皮之后进行。本领域技术人员会知道何种浸灰剂适用于皮革准备工艺。一些实例是常规的石灰(氢氧化钙),氢氧化钠,或其它氢氧化物。在本发明的一个实施方案中,所述浸灰剂是氢氧化钠,其与石灰相比较为更加环境友好,因为其不像石灰那样产生污泥(sludge)。本领域技术人员会知道如何优化浸灰剂的量。在一个优选实施方案中,浸灰剂的量在0.01%至5%,优选0.05%至4%,更优选0.1%至2.5%,甚至更优选0.15%至1%,最优选0.2%至0.5%每kg兽皮、皮或毛皮的范围。
本发明的另一个实施方案是用于将兽皮或皮脱毛的工艺,其包括下述步骤:a)在水溶液中用有效量的α-淀粉酶处理兽皮或皮;b)在水溶液中用有效量的谷氨酰内肽酶使毛发松弛;和c)用浸灰剂和/或硫化物处理毛发。其中步骤a)可如“浸泡”或“脱毛”部分中所述进行,步骤b)可如“脱毛”部分中所述进行,而c)可如“浸灰”部分中所述进行。
去肉和剖皮
去肉是将仍在兽皮肉侧的脂肪和肌肉组织去除。剖皮是将脱毛的兽皮(毛皮)水平切割为粒面剖层皮和肉面剖层皮。粒面剖层皮用于产生面革(upperleather),而肉面剖层皮可用于剖层革(splitleather)或明胶。去肉和剖皮在皮革准备工艺中作为不同步骤进行,但为便利起见我们将其一同描述。去肉和剖皮常规地在浸灰之后进行。在本发明中,去肉和剖皮可在用谷氨酰内肽酶脱毛之后并在浸灰和/或硫化物处理之前进行。该步骤的优点在于在浸灰之前毛皮的重量显著降低。因为石灰和硫化物以每kg的兽皮、皮或毛皮给药,石灰和硫化物(其具有较高环境影响)的量,可以与皮、兽皮或毛皮重量减少的相同程度而减少。在硫化物处理之前对兽皮进行去肉和剖皮的优点在于废物流(肉、脂肪和剖层革)不含硫化物,若其被加工成例如明胶,这是一个优点。在本发明的一个优选实施方案中,在用硫化物和/或浸灰剂处理之前,对兽皮、皮或毛皮进行去肉和剖皮。
本发明的另一个实施方案是用于将兽皮或皮脱毛的工艺,其包括下述步骤:a)在水溶液中用有效量的α-淀粉酶处理兽皮或皮;b)在水溶液中用有效量的谷氨酰内肽酶使毛发松弛;c)对b)中获得的毛皮进行去肉和剖皮,和d)用浸灰剂和/或硫化物处理毛发。其中步骤a)可如“浸泡”或“脱毛”部分中所述进行,步骤b)可如“脱毛”部分中所述进行,步骤c)可如“去肉和剖皮”部分中所述进行,而步骤d)可如“浸灰”部分中所述进行。步骤d)亦可在步骤c)之前进行,尽管这将不会产生环境增益。
脱灰
在常规皮革准备工艺中,脱灰在浸灰剂之后进行,以从毛皮去除浸灰剂并将pH减少至8-9。pH的减少对于准备毛皮进行皮革准备工艺的剩余部分是重要的。
对于本发明,若该工艺使用了浸灰剂,则进行脱灰或pH减少步骤。在本发明的工艺中,甚至若未使用浸灰剂,亦仍可进行pH减少步骤,例如当谷氨酰内肽酶处理在大于9的pH进行或当pH在谷氨酰内肽酶处理过程中或之后升高的情况下。
酸洗和制革(tanning)
这些工艺是皮革准备工艺中的剩余步骤,且不会受上文中所述的修饰的步骤所影响。一些皮革准备工艺亦包括酵解软化(bating)步骤,其用来去除额外的蛋白,然而这在本发明的皮革准备工艺中是任选步骤。本领域技术人员会知道如何进行这些步骤。如何进行这些步骤的实例描述于实施例2。
修饰的皮革准备工艺
本发明的修饰的皮革准备工艺可采用不同形式。若对于皮革准备工艺在技术上是可行的,则可将这些步骤互换。在本发明的一个优选实施方案中,将皮革准备工艺减少至20-30小时,优选22-28小时,更优选24到26小时。下面阐述一些依照本发明的修饰的皮革准备工艺(这些实例并非穷举,可通过从上述描述梳理不同特征而构建的备选方案亦视作本发明的一部分)。
一种用于准备蓝湿皮的工艺,其包括下述步骤:
a)污物浸泡;
b)包含α-淀粉酶和任选的蛋白酶的浸泡;
c)在水溶液中用有效量的谷氨酰内肽酶脱毛;
d)对c)中获得的毛皮去肉和剖皮;
e)脱灰;和
f)酸洗和制革。
其中步骤a)和b)可如“浸泡”部分中所述进行,步骤c)可如“脱毛”部分中所述进行,而步骤d)可如“去肉和剖皮”部分中所述进行。
一种用于制备蓝湿皮的工艺,其包括下述步骤:
a)污物浸泡;
b)包含α-淀粉酶和任选的蛋白酶的浸泡;
c)在水溶液中用有效量的谷氨酰内肽酶脱毛;
d)对c)中获得的毛皮去肉和剖皮;
e)用浸灰剂和/或硫化物处理;
f)脱灰;
g)酸洗和制革。
其中步骤a)和b)可如“浸泡”部分中所述进行,步骤c)可如“脱毛”部分中所述进行,步骤d)可如“去肉和剖皮”部分中所述进行,而步骤e)可如“浸灰”部分中所述进行。
一种用于制备蓝湿皮的工艺,其包括下述步骤:
a)污物浸泡;
b)浸泡包含α-淀粉酶和任选的蛋白酶;
c)在水溶液中用有效量的谷氨酰内肽酶脱毛;
d)用浸灰剂和/或硫化物处理;
e)去肉和剖皮
f)脱灰;和
g)酸洗和制革。
其中步骤a)和b)可如“浸泡”部分中所述进行,步骤c)可如“脱毛”部分中所述进行,步骤d)可如“浸灰”部分中所述进行,步骤e)可如“脱灰”部分中所述进行,而步骤f)可如“去肉和剖皮”部分中所述进行。
皮革加工酶
蛋白酶
除了如上所述的谷氨酰内肽酶之外,可将其它蛋白酶或蛋白分解酶添加至皮革制备工艺的不同步骤,例如去除非胶原蛋白质,打开毛皮的纤维结构。
合适的蛋白酶包括那些动物、植物或微生物来源的。微生物来源是优选的。包括化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。蛋白酶可例如为金属内肽酶(EC3.4.24),半胱氨酸内肽酶(EC3.4.22),天冬氨酸内肽酶(EC3.4.23)或丝氨酸内肽酶(EC3.4.21)。丝氨酸蛋白酶的实例为胰蛋白酶(EC3.4.21.4),胰凝乳蛋白酶(EC3.4.21.1和EC3.4.21.2),枯草杆菌蛋白酶(EC3.4.21.62)。特别是来源于芽孢杆菌属的枯草杆菌蛋白酶,例如芽孢杆菌BP92蛋白酶,枯草杆菌蛋白酶BPN’,枯草杆菌蛋白酶Novo,枯草杆菌蛋白酶Carlsberg,枯草杆菌蛋白酶309,枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO89/06279)。胰蛋白酶-样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如猪或牛来源)和描述于WO89/06270和WO94/25583的镰孢属(Fusarium)蛋白酶,以及从座壳孢属(Aschersonia)、白僵菌属(Beauvaria)、绿僵菌属(Metarhizium)和轮枝孢属(Verticillium)获得的胰蛋白酶作用真菌蛋白酶(EP335,023)。
有用的丝氨酸蛋白酶的实例为WO92/19729,WO98/20115,WO98/20116,和WO98/34946中所述的变体,特别是在一个或多个下述位置具有取代的变体:27,36,57,76,87,97,101,104,120,123,167,170,194,206,218,222,224,235,和274。
半胱氨酸蛋白酶的实例是木瓜蛋白酶。
天冬氨酸内肽酶可来源于米黑毛霉(Mucormiehei),微小毛霉(Mucorpusillus)和寄生(内座壳)隐丛赤壳菌(Cryphonectria(Endothia)parasitica)。含有天冬氨酸内肽酶的商品以下述商品名出售:Rennilase,Fromase,Novoren,Marzyme,Hannilase,Marzyme和Suparen。
优选的商业上可获得的蛋白酶包括AC,NUE(NovozymesUnhearingEnzyme), 100,115,1547,S2500C,AB,AX,B, 和(NovozymesA/S), FN2TM,和FN3TM(GenencorInternationalInc.),ProAct(DSM)。
α-淀粉酶
用于本发明的工艺中的淀粉酶可为任何α-淀粉酶(EC.3.2.1.1),其催化淀粉和其它直链和支化的1,4-葡糖苷寡糖和多糖的水解。在一个优选实施方案中,当反应的最优pH条件是7-9时,所述α-淀粉酶是碱性α-淀粉酶。合适的α-淀粉酶包括那些细菌或真菌来源的。包括化学或遗传修饰的突变体(变体)。
在一个优选实施方案中,所述α-淀粉酶包括如WO05/003311中定义的糖结合模块(CBM),优选WO05/003311中定义的家族20CBM。
在一个实施方案中,所述真菌α-淀粉酶是酵母或丝状真菌来源的。优选的α-淀粉酶包括,例如可从曲霉属(Aspergillus)菌种获得的α-淀粉酶,特别是来自黑曲霉(Aspergillusniger),米曲霉(A.oryzae),泡盛曲霉(A.awamori)和川地曲霉(A.kawachii)的,如作为SWISSPROTP56271公开的,或更详细描述于WO89/01969(实施例3)的酸性α-淀粉酶。
在一个实施方案中,所述α-淀粉酶是细菌来源的。所述细菌α-淀粉酶优选来源于芽孢杆菌属的菌种,如地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或其它芽孢杆菌菌种,如芽孢杆菌菌种NCIB12289,NCIB12512(WO95/26397),NCIB12513(WO95/26397),DSM9375(WO95/26397),DSMZ12648(WO00/60060),DSMZ12649(WO00/60060),KSMAP1378(WO97/00324),KSMK36或KSMK38(EP1,022,334)。优选的是WO95/26397中分别作为SEQIDNO:1和2公开的芽孢杆菌属菌种α-淀粉酶,WO00/60060中作为SEQIDNO:2公开的AA560α-淀粉酶。优选地,地衣芽孢杆菌α-淀粉酶是如WO96/23874中公开的SEQIDNO:2。
在本发明的实施方案中,所述细菌α-淀粉酶是在WO95/26397中作为SEQIDNO:2公开的SP722α-淀粉酶或AA560α-淀粉酶。
适于浸泡的α-淀粉酶描述于WO10/043709。在WO10/043709中标为SEQIDNO:1和SEQIDNO:4的α-淀粉酶,和与这些序列具有至少80%同一性,优选90%同一性,更优选95%同一性的多肽亦对于本发明中的淀粉酶处理是感兴趣的。
商业上可获得的α-淀粉酶产品或包含α-淀粉酶的产品包括以下述商品名出售的产品:相关的商业上可获得的淀粉酶包括 StainzymePlus, TermamylUltra,和(均可从NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark获得),Bioamylase-D(G),BIOAMYLASETML(BioconIndiaLtd)和(可从DSM,Holland获得)以及PurastarOxAm,RAPIDASETMTEX和PoweraseTM(可从DaniscoA/S获得)KAM(KAO,Japan)。
实施例
本发明进一步参照下述实施例描述,其不意欲以任何方式限制如要求保护的本发明的范围。
实施例1
本实施例描述了用于评估酶制备物是否为本发明上下文中的谷氨酰内肽酶的测定法。
谷氨酰内肽酶是在谷氨酸残基(或在磷酸盐缓冲液中在天冬氨酸残基)的羧基端侧切割的丝氨酸内肽酶,即其具有对于P1位置的荷负电的氨基酸的偏好。
下述测定法用于测试一种肽酶是否为谷氨酰内肽酶。
材料:
底物:Suc-AAPA-pNA(BachemL-1775)
Suc-AAPR-pNA(BachemL-1720)
Suc-AAPE-pNA(BachemL-1710)
Suc-AAPI-pNA(BachemL-1790)
Suc-AAPL-pNA(BachemL-1390)
Suc-AAPK-pNA(BachemL-1725)
Suc-AAPM-pNA(BachemL-1395)
Suc-AAPF-pNA(BachemL-1400)
Suc-AAPV-pNA(BachemL-1770)
均可从BachemAG,Bubendorf,Schwizerland获得。
温度:室温(25℃)
测定缓冲液:100mM琥珀酸,100mMHEPES,100mMCHES,100mMCABS,
1mMCaCl2,150mMKCl,0.01%TritonX-100,pH9.0。
酶:
将酶通过层析纯化至高纯度。在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上对于每种肽酶仅观察到一条条带。
方法:
将20μl肽酶稀释液(稀释于0.01%TritonX-100)置于微滴定板的孔中。测定通过添加200μlpNA底物起始(50mg溶解于1.0mlDMSO并进一步用测定缓冲液稀释90x)。将微滴定板置于来自MolecularDevices的VERSAmax微板读数器中,且监视OD405的起始增加作为肽酶活性的量度。若未在4分钟测量时间中实现线性作图,则进一步稀释肽酶并重复测定法。
结果:
在上述测定中测试的五种蛋白酶的结果示于下表1。数据对应于每种蛋白酶对于九种不同Suc-AAPX-pNA底物的相对活性,即对特定Suc-AAPX-pNA底物的活性除以对九种底物中具有最高活性的Suc-AAPX-pNA底物的活性。在计算中考虑了肽酶的稀释。
表1
根据这些结果可见来自地衣芽孢杆菌的谷氨酰内肽酶和来自微小芽孢杆菌JA96的谷氨酰内肽酶对pNA底物Suc-AAPE-pNA具有最高的活性,而它们对于其它底物具有相当低的相对活性。因此,将这两种蛋白酶视为谷氨酰内肽酶。
为了评估一种肽酶是否为谷氨酰内肽酶,我们定义了谷氨酰内肽酶比例(GR),其如下所示计算:
GR=对Suc-AAPE-pNA的活性/对Suc-AAP非(E)-pNA的最高活性
当谷氨酰内肽酶比例为10或更高时,对于任何8种其它Suc-AAP非(E)-pNA底物的活性少于对于Suc-AAPE-pNA底物的活性的10%。
根据本发明谷氨酰内肽酶定义为具有高于10的GR的肽酶。
Alcalase、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶,其均已用于皮革加工,根据本发明不视为谷氨酰内肽酶。
实施例2
该实施例阐述了从浸泡至制革的标准皮革准备工艺。该皮革准备工艺可随着制革厂的不同而变动,并因此仅为实例,而非通用的制法。
皮革产生的原材料在下文中记载为经盐腌的(salted)兽皮。剂量作为兽皮/毛皮的重量百分比指明。
污物浸泡
将盐腌的兽皮与200%漂洗物(水)(10-25℃)加载入制革厂鼓筒,并运行鼓筒(drum)1-2小时以去除盐和污物。然后排去漂洗物。
浸泡
为了使兽皮重新水化,并起始打开纤维结构,将10-25℃的150%漂洗物(水)注入含有来自污物浸泡的兽皮的鼓筒。通过添加苏打灰/纯碱(约0.5%)调整pH以获得pH9.0-9.5。为了抑制细菌生长,通常亦添加杀菌剂。在4小时之后,检查漂洗物中的pH和盐含量。若不引入洗涤步骤,则盐应给出2至3的Bé。使鼓筒过夜,每小时运行10分钟。翌日清晨将漂洗物从鼓筒排去。
浸灰
将1.5%Na2S(固体中65%)添加至湿兽皮,并使鼓筒运行30分钟,同时硫化物溶解并灼烧(溶解)毛发。然后添加30%水,继以2%石灰。连续运行鼓筒3至4小时,接着每小时运行5分钟过夜。
去肉和剖皮
翌日清晨,将脱毛、泡胀的毛皮从鼓筒取出进行去肉以去除脂肪组织,接着进行剖皮以获得足够厚度的粒层。将毛皮(未经脱毛的毛皮的粒层部分)置回鼓筒进行脱灰。
所有后续的剂量为基于经剖皮的毛皮的重量的百分比(pct)。
脱灰
在将毛皮加载入鼓筒之后,将其在200%水中在10至25℃洗涤15分钟。将水排去,并用35%水20-25℃,3%(NH4)2SO4和0.5%NaHSO3(工业级(technicalgrade))构建新的漂洗物。将鼓筒运行1小时,然后通过切割毛皮并在切块中施以酚酞来检查pH。在毛皮横切的全部部分中,反应均必需是无色的,否则则延长运行直至切块为无色。
酵解软化
为了去除非胶原蛋白质,可进行酵解软化步骤。向脱灰漂洗物添加0.01%的8000LVU/g酵解物(蛋白酶)(商业性酵解软化产品可见于Thanikaivelan等,2004,TrendinBiotechnology22,181-187的表1)。维持温度,同时运行鼓筒30分钟至1小时,然后排去漂洗物。通过添加200%水10-25℃洗涤一次,并运行鼓筒30分钟。排干。
酸洗
通过添加60%水18℃和6%NaCl对经酵解软化的毛皮构建酸洗漂洗物。运行15分钟并检查Bé是否达到>6,若否则进一步添加NaCl。然后添加0.7%甲酸并运行10分钟。然后添加0.3%H2SO4(浓缩的)并运行鼓筒30分钟,然后再添加0.3%H2SO4。允许鼓筒运行1.5至3小时。
在经酸洗的毛皮中通过切割毛皮并施以百里酚蓝来测量pH。若百里酚蓝为红色,其为pH2至3;若否,进一步添加H2SO4。
铬鞣(Chrometannage)
向酸洗漂洗物添加7.5%TanchromeAB(SisecamChemicalsGroup,Istanbul,Turkey)并运行1.5小时。然后添加铬固定剂0.4%Kromofix(SisecamChemicalsGroup,Istanbul,Turkey)并运行7小时。在制革工艺之后,获得所谓的蓝湿皮,其为稳定化的湿皮革形式,其可照原样(assuch)进行后续加工。
实施例3
本发明的目的是衡量在修饰的皮革准备工艺中,来自地衣芽孢杆菌的谷氨酰内肽酶(具有SEQIDNO:1)去除毛发并提供纤维打开而不损伤粒面的能力。
所有提及的百分比为基于兽皮/毛皮的重量。
污物浸泡
将盐腌的苏格兰棕白色奶牛的碎块在25℃在中试(pilot)制革鼓筒中浸泡于含有0.1NovocorS2500C(枯草杆菌蛋白酶,NovozymesA/S)的200%漂洗物(水)。在1小时之后,去除漂洗物。
修饰的浸泡
将25℃的200%新鲜的漂洗物(水)添加至兽皮。将杀生物剂(0.01%Myacide)与13mg酶蛋白/kg兽皮的α-淀粉酶和0.4%NovocorS2500C(枯草杆菌蛋白酶,NovozymesA/S)一同添加。将鼓筒连续旋转4小时。然后去除漂洗物。
脱毛
将50%漂洗物(水)在25℃添加,并用1%NaHCO3或1%甲酸溶液调整pH以吻合下述值:7.5、8.5或9.5。亦添加杀生物剂(0.01%Myacide)。将鼓筒旋转30分钟以允许调整pH。将来自地衣芽孢杆菌的谷氨酰内肽酶(以0至400mg纯酶/kg兽皮的范围)与基于胰蛋白酶的蛋白酶如115(0.01%)一同添加。将鼓筒连续旋转4小时。去除漂洗物,并从系统去除毛发。
浸灰
基于25℃的150%水以及1.5%硫化钠(固体中65%)构建新的漂洗物。将鼓筒运行30分钟,接着添加2%熟石灰(slakedlime)。化学处理进行过夜,同时鼓筒每半小时运行1分钟。
脱灰
翌日清晨,去除漂洗物,并将毛皮在200%漂洗物(水)25℃中洗涤,在10分钟过程中洗涤两次。然后通过添加25℃的50%水,3.5%(NH4)2SO4和0.3%Na2S2O5构建脱灰漂洗物,运行90分钟,然后切割并检查毛皮中的pH(如实施例2中所述)。
然后将毛皮碎块保存于福尔马林,并针对毛发去除、纤维打开和粒面损伤进行分析。
通过扫描电子显微术(SEM)评估粒面损伤
该分析评估皮革样品表面上任何粒面损伤的存在。
在分析之前,将如上获得的蓝湿皮冻干以去除所有水分。
使用外科手术刀切割出小样品(大约5mmx5mm),并使用粘性碳条(adhesivecarbontab)加载于SEM铝桩(alluminiumstub)上。
在使用SEM分析之前,将样品用金包覆。
将粒面表面以x100和x500放大率评估寻找粒面损伤的证据,如开放的粒面纤维粒面扭曲。
通过扫描电子显微术(SEM)评估纤维结构
该分析评估皮革/皮切面的纤维打开。
在分析之前,将如上获得的蓝湿皮冻干以去除所有水分。
使用外科手术刀片切割出切片(大约10mm长和2mm厚),并使用粘性碳条加载于铝SEM桩上。
在使用SEM分析之前,将样品用金包覆。
纤维结构的评估使用从样品横切面的中心以x150放大率摄取的图像来进行。
在评估中,使用特征如纤维束(fiberbundels)和小纤维(fibrils)的分离以及纤维纺织(fiberweave)的角度。
用于通过光学显微术评估毛发去除的样品准备
该分析评估皮切面内任何剩余毛发的存在。
将如上产生的蓝湿皮在蒸馏水中洗涤,然后在冷冻切片机中以60μm切片。
将薄切片加载于显微镜载玻片上以供分析。
分析使用光学显微术从x100至x1000放大率进行。
观察特征如毛干和毛根中残留的毛发。
结果总结于表2。
表2
*EP=纯酶蛋白
A=毛发去除÷=不可接受
B=纤维打开+=达到或超过常规方法
C=粒面损伤++=意料不到的良好结果
根据这些结果可见,在pH8.5,20mg酶蛋白/kg兽皮以及在pH8.5和pH9.5用40mgEP/kg兽皮的酶剂量可获得意料不到的良好毛发去除。
实施例4
本发明的目的是衡量在修饰的皮革准备工艺中,来自地衣芽孢杆菌的谷氨酰内肽酶(具有SEQIDNO:1)去除毛发并提供纤维打开而不损伤粒面的能力。
所有提及的百分比为基于兽皮/毛皮的重量。
污物浸泡
将二十kg盐腌的荷兰黑白色小牛在20℃在制革鼓筒中浸泡于含有0.1NovocorS2500C(枯草杆菌蛋白酶,NovozymesA/S)和杀生物剂(0.01%Busan30WB)的200%漂洗物(水)。在1小时之后,去除漂洗物。
修饰的浸泡
将25℃的200%新鲜的漂洗物(水)添加至兽皮。将杀生物剂(0.01%Busan30WB)与13mg酶蛋白/kg兽皮的α-淀粉酶和0.4%NovocorS2500C(枯草杆菌蛋白酶,NovozymesA/S)一同添加。将鼓筒连续旋转4小时。然后去除漂洗物。
脱毛
将100%漂洗物(水)与0.3%苏打灰/纯碱(或更多以获得pH9.0至9.5)和杀生物剂(0.01%Busan30WB)一同在25℃添加,将鼓筒旋转30分钟以允许调整pH。将来自地衣芽孢杆菌的谷氨酰内肽酶(以0至200mg纯酶蛋白/kg兽皮的范围)与基于胰蛋白酶的蛋白酶如115(0.01%)一同添加。将鼓筒连续旋转4小时。在添加谷氨酰内肽酶之后1至1.5小时已经观察到毛发松弛。去除漂洗物,并从系统去除毛发。
浸灰
基于25℃的150%水以及1.5%硫化钠(固体中65%)和2%熟石灰构建新的漂洗物。化学处理进行过夜,同时鼓筒每小时运行5分钟。
去肉和剖皮
翌日清晨将毛皮去肉和剖皮。
然后如实施例2中所述将毛皮脱灰、酸洗并铬鞣。
将通过该工艺获得的蓝湿皮针对毛发去除、纤维打开和粒面损伤如实施例3中所述进行分析,并加上如下所述对不同性质进行评级。
通过扫描电子显微术(SEM)评估粒面损伤
样品使用1至5的级别评估:
1级–无损伤
5级–显著损伤
1至3级结果为可接受品质的皮革。
0级为理想情况。
通过扫描电子显微术(SEM)评估纤维结构
每个样品使用1至5的级别评估:
1级–无打开
5级–过分打开
2-3级为可接受的打开
理想的打开视为3至4级
用于通过光学显微术评估毛发去除的样品准备
然后每个样品使用1至5的级别评估。
1级–无脱发,毛发完全完整
5级–完全脱发,无残余毛发
3级视为可接受的脱毛。
理想的脱毛为评为4级或更高。
所有衡量在蓝湿皮的颈部、腹部和臀部部分进行,平均等级在表3中给出。
表3
*EP=纯酶蛋白
根据这些结果可见用40mg酶蛋白/kg和200mg酶蛋白/kg兽皮的酶剂量可获得非常良好的毛发去除。用60mgEP/kg和200mgEP/kg兽皮的酶剂量亦观察到毛囊中毛发的显著去除。这是重要的结果,因为常规脱毛工艺常常在毛囊中留下部分未降解的毛发。最后,可见粒面损伤和纤维打开是可接受的。
实施例5
本发明的目的是衡量在修饰的皮革准备工艺中(其中脱毛以逐渐增加的pH达成(conclude)),来自地衣芽孢杆菌的谷氨酰内肽酶(具有SEQIDNO:1)去除毛发并提供纤维打开而不损伤粒面的能力。
所有提及的百分比为基于兽皮/毛皮的重量。
污物浸泡
将四十kg盐腌的荷兰黑白色小牛在20℃在制革鼓筒中浸泡于含有杀生物剂(0.01%Busan30WB)的200%漂洗物(水)。在1小时之后,去除漂洗物。
修饰的浸泡
将25℃的200%新鲜的漂洗物(水)添加至兽皮。将杀生物剂(0.01%Busan30WB)与13mg酶蛋白/kg兽皮的α-淀粉酶一同添加。将鼓筒连续旋转4小时。然后去除漂洗物。
脱毛
将100%漂洗物(水)与0.3%苏打灰/纯碱(或更多以获得pH9.0至9.5)和杀生物剂(0.01%Busan30WB)在25℃添加,将鼓筒旋转15分钟以允许调整pH。将来自地衣芽孢杆菌的谷氨酰内肽酶作为60mg纯酶蛋白/kg兽皮添加。将鼓筒连续旋转2小时。在添加谷氨酰内肽酶之后1至1.5小时已经观察到毛发松弛。在1.5小时之后,通过添加稀释的NaOH将pH逐渐增加至>11。
在总共3小时之后,去除漂洗物,将毛发从系统去除,并将毛皮送去去肉和剖皮。机械处理去除仍然位于兽皮上的大部分松弛毛发。
浸灰
将毛皮置回25℃的50%水连同1.5%硫化钠(固体中65%)和2%熟石灰的漂洗物。将毛皮继续运行鼓筒3小时。出于实际原因,将化学处理继续进行过夜,其中鼓筒每小时运行5分钟。然而,在3小时之后毛皮已经显得不含毛发,因此原则上可在此阶段停止浸灰。
然后如实施例1中所述对毛皮进行脱灰、酸化和铬鞣。
将蓝湿皮进一步加工为粗鞣皮革(crustleather)。粗鞣皮革加工对于本领域技术人员是公知的,粗鞣皮革加工的一个实例描述于本文。
所有提及的百分比基于蓝湿皮(WB)的重量。
洗涤
将蓝湿皮在300%水连同稀释于25%的0.2%甲酸(得到325%的总漂洗物)中洗涤。洗涤在30℃进行15分钟,然后排去漂洗物。
重新铬化
将150%漂洗水与3%无机鞣剂如BayChromeFD(Lanxess,Germany)一同添加,并运行11/2小时。将漂洗物排干,并用200%水洗涤蓝湿皮10分钟并排干。
中和
用100%水连同碱化剂如2%SyntanNN555(Smit&Zoon,Netherlands)以及2%甲酸钠(SodiumFormiate)的混合物构建新的漂洗物,并运行20分钟。然后添加1%碳酸氢钠和0.5%SulphirolWS(Smit&Zoon)(其为基于羊毛脂的脂肪液)并继续该工艺11/2小时。
将漂洗物排干,并用25℃的200%水进行10分钟的短暂洗涤。
用新的漂洗物继续该工艺,所述漂洗物为70%水,2%ReluganRE(BASF,Germany)(聚合的再鞣剂(polymericretaningagent)),其在添加至漂洗物之前用25%水在30℃稀释。将该具有95%漂洗物体积的混合物运行20分钟。然后将脂肪液如1.5%SyntholWP(Smit&Zoon)与1%聚合物如DensotanA(BASF)一同添加。在添加至漂洗物之前在25%水中稀释所述脂肪液和聚合物。用120%的漂洗物体积继续该工艺20分钟。
然后将2%植物鞣剂如Quebracho与有机填充剂如5%SyntanLF187(Smit&Zoon)和3%SyntanDF585(Smit&Zoon)一同添加至漂洗物并运行15分钟,然后添加2%TanniganPR(Lanxess)(一种合成的再鞣剂)和所需量的染料。在11/2小时之后排干漂洗物。
加脂(Fatliquoring)
用5%SyntholDS(Smit&Zoon)和2%SyntholWP(Smit&Zoon)以及1%SyncotanTL(Smit&Zoon)(其为一种聚丙烯酸软化剂,在添加至漂洗物之前,与25℃水在60℃一同稀释)构建60℃的100%水的新漂洗物,得到125%的总漂洗物体积。
固定化
在1小时10分钟之后,在38℃添加稀释的甲酸(5%水中的1%甲酸)。然后在30分钟之后,添加相同量的另一剂,然后再次在30分钟之后,添加另一剂,但是这次仅用0.5%甲酸。在排干之前,将鼓筒运行30分钟。
在最终固定之前用250%水在30℃进行洗涤10分钟。
这在150%水中进行,此次用铬如3%ChromosalBD(Lanxess)进行。在排干和洗涤之前运行11/2小时。
如实施例3中所述针对毛发去除、纤维打开和粒面损伤分析通过该工艺获得的来自粗鞣皮革两半的颈部、腹部和臀部的样品(总共12个样品)。
所有样品显示非常良好水平的毛发去除,在对粒面肉眼观察和当使用光学显微术在切片中检查毛干和根时均如此。在大多数检查的样品中,毛干和根已完全去除。
对于多数样品纤维打开可以接受,但两个样品例外。
所有样品显示一些轻微粒面损伤的证据。对于两个样品,有更加严重损伤的证据。由于原材料品质上的差异这是可预期的。通过肉眼观察,给予该皮革高品质评分。
根据这些结果可见可用60mg酶蛋白/kg兽皮的酶剂量获得非常良好的毛发去除。这是重要的结果,因为常规脱毛工艺常常在毛囊中留下部分未降解的毛发。最后,可见粒面损伤和纤维打开是可接受的。
实施例6
本发明的目的是衡量在修饰的皮革准备工艺中,高剂量的来自地衣芽孢杆菌的谷氨酰内肽酶(具有SEQIDNO:1)去除毛发并提供纤维打开而不损伤粒面的能力,该皮革准备工艺处于下述生产条件下:其中脱毛以添加硫化物和石灰达成。在此试验中,在剖皮之后,将毛皮置于制革厂标准生产中。
所有提及的百分比为基于兽皮/毛皮的重量。
污物浸泡
将10,228kg盐腌的EU小牛在27℃在木质Valero鼓筒中在2x200%(漂洗物)中洗涤2次,每次运行鼓筒20分钟,不包括注满和排干鼓筒的时间。
修饰的浸泡
将27℃的200%新鲜的漂洗物(水)添加至兽皮。将杀生物剂(0.15%PreventolZL)与13mg酶蛋白/kg兽皮的α-淀粉酶一同添加。将鼓筒连续旋转40分钟(以2rpm)。然后充分去除漂洗溶液至剩余大约25%。
组合的浸泡和脱毛
对于剩余25%漂洗物(27℃)将另外的13mg酶蛋白/kg兽皮的α-淀粉酶与杀生物剂(0.15%PreventolZL)一同添加。鼓筒以2rpm旋转30分钟。然后添加来自地衣芽孢杆菌的谷氨酰内肽酶高至165mg纯酶蛋白/kg兽皮。以2rpm运行鼓筒60分钟,毛发过滤系统随着鼓筒一同启动。然后在60分钟之后,添加0.1%苛性碱溶液(50%),在30分钟之后达到pH8.9。然后添加另一剂的0.1%苛性碱,在30分钟之后达到pH9.5。鼓筒90分钟以允许高度脱毛,接着添加更多漂洗物(30%)(以改善过滤),并继续120分钟。在两小时之后检查兽皮,发现>90%的估计的脱毛。
将鼓筒充分排干(<30,27℃),并断开过滤器。然后将1.3%Na2S(67%)粉添加至毛皮,使其以2rpm灼烧剩余毛发30分钟。然后添加1.3%Ca(OH)2。允许鼓筒运行60分钟,接着添加40%水,并且在60分钟之后,再添加30%水。然后将鼓筒置于1rpm,5分钟运行/25分钟暂停的自动模式过夜。翌日清晨,卸空鼓筒,并将毛皮去肉和剖皮。
然后根据制革的标准配方将毛皮脱灰、酸洗和铬鞣。
在铬鞣之后,检查了400片蓝湿皮。所有均显示非常良好程度的毛皮去除,无毛根或干存在。
取来自酶和标准生产的WB片进行中试以变为三种不同的粗鞣皮革制品。一种为碾磨的黑鞋面革类型,一种为软的半植鞣革类型,而一种为软的正绒面革鞋(nubuck)面革类型。接着确定了经准备的制品的撕裂强度。“结论”栏表明对于产生的粗鞣皮革制品的总体评价:
表4
从这些结果可见使用酶生产方法获得了非常良好的毛发去除,且从经准备的兽皮形成了令人满意的粗鞣皮革制品。
实施例7
本实施例的目的是说明四种不同的谷氨酰内肽酶,两种来自地衣芽孢杆菌(具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:4),微小芽孢杆菌JA96(具有SEQIDNO:2)和灰色链霉菌(具有SEQIDNO:8),的脱毛性能。
使用实施例1中公开的方法,发现来自地衣芽孢杆菌,具有SEQIDNO:4,和来自灰色链霉菌的谷氨酰内肽酶分别具有420和65700的谷氨酰内肽酶比例。
将盐腌的荷兰牛皮在冷自来水中洗涤,并切割为20mmx300-600mm的碎块。将牛皮碎块浸泡于250mM甘氨酸-NaOH缓冲液中2小时。在该温育之后,从牛皮碎块去除脂肪和肌腱,并将牛皮碎块称重。在每次试验中,将八块不同的牛皮碎块在两个500mlErlenmeyer烧瓶中在250mM甘氨酸-NaOH缓冲液中以130rpm,pH9和26℃酶处理20小时。在该研究中使用地衣芽孢杆菌(具有SEQIDNO:1)、地衣芽孢杆菌(具有SEQIDNO:4)、微小芽孢杆菌JA96和灰色链霉菌谷氨酰内肽酶。每种谷氨酰内肽酶的性能在三次不同试验中衡量(即总共24块不同的牛皮碎块经酶处理)。阴性对照以相同方式,但不添加酶来进行处理。在20小时温育之后,通过使用弹簧秤(60,600和2500g,Kern&Sohn,GmbH,D-72336,Ballinge)来评估脱毛效率。将牛皮碎块加载于测试平板上,并使用发夹紧固来自牛皮碎块的5mmx10mm的毛发。然后将弹簧秤连接于固定的发夹,并向上拉伸。脱毛效率以克计算,并通过将测得的重量(以kg计)乘以9.81m/s2来计算所需的脱毛力。
地衣芽孢杆菌(具有SEQIDNO:1)、地衣芽孢杆菌(具有SEQIDNO:4)、微小芽孢杆菌JA96和灰色链霉菌谷氨酰内肽酶的脱毛性质示于表5。阴性对照与酶处理的牛皮碎块(0.5至0.8N)相比需要显著较高的脱毛力(13N)(表5)。用谷氨酰内肽酶处理的牛皮碎块实现了完全的毛发去除,而阴性对照的毛发常常在施加适当的力时断裂。为了达到与地衣芽孢杆菌(具有SEQIDNO:1)、地衣芽孢杆菌(具有SEQIDNO:4)、微小芽孢杆菌JA96谷氨酰内肽酶相同的脱毛效果,需要更高酶剂量的灰色链霉菌谷氨酰内肽酶(表5)。
表5:谷氨酰内肽酶处理的牛皮碎块的脱毛效率。该表显示来自三次不同实验的平均值(即来自24块牛皮的平均值)。脱毛力以牛顿(Newton)给出。
Claims (32)
1.一种用于使得兽皮或皮上的毛发松弛的方法,包括在水溶液中用有效量的谷氨酰内肽酶处理所述兽皮或皮;
其中所述谷氨酰内肽酶具有至少10的谷氨酰内肽酶比例;该谷氨酰内肽酶比例根据如下所示计算:
谷氨酰内肽酶比例=对Suc-AAPE-pNA的活性/对Suc-AAP非(E)-pNA的最高活性;
当谷氨酰内肽酶比例为至少10时,对于任何8种其它Suc-AAP非(E)-pNA底物的活性少于对于Suc-AAPE-pNA底物的活性的10%;以及其中
Suc-AAPA-pNA为BachemL-1775;
Suc-AAPR-pNA为BachemL-1720;
Suc-AAPE-pNA为BachemL-1710;
Suc-AAPI-pNA为BachemL-1790;
Suc-AAPL-pNA为BachemL-1390;
Suc-AAPK-pNA为BachemL-1725;
Suc-AAPM-pNA为BachemL-1395;
Suc-AAPF-pNA为BachemL-1400;
Suc-AAPV-pNA为BachemL-1770。
2.权利要求1的方法,其中所述溶液的pH在5.5至12.5的范围。
3.权利要求2的方法,其中所述溶液的pH在7.5至9.5的范围。
4.权利要求3的方法,其中所述溶液的pH在8至9的范围。
5.权利要求1或2的方法,其中所述谷氨酰内肽酶处理在5.5至10的pH范围进行,接着逐渐将pH增加至高于11。
6.权利要求1-4任一项所述的方法,其中所述谷氨酰内肽酶处理进行1至5小时。
7.权利要求1-4任一项所述的方法,其中所述处理在蛋白酶存在下进行。
8.权利要求7的方法,其中所述处理在丝氨酸蛋白酶(EC3.4.21)存在下进行。
9.权利要求1至4和8任一项的方法,其中所述处理用谷氨酰内肽酶作为唯一的蛋白酶活性来源进行。
10.权利要求1-4和8任一项的方法,其中所述谷氨酰内肽酶来源于芽孢杆菌属的细菌。
11.权利要求1-4和8任一项的方法,其中所述谷氨酰内肽酶选自具有谷氨酰内肽酶活性并包含与SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7或8之一的成熟多肽具有至少60%序列同一性的多肽。
12.权利要求11的方法,其中所述谷氨酰内肽酶选自具有谷氨酰内肽酶活性并包含与SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7或8之一的成熟多肽具有至少90%序列同一性的多肽。
13.一种用于将兽皮或皮脱毛的方法,其包括下述步骤:
a)在水溶液中用有效量的α-淀粉酶处理兽皮或皮;和
b)在水溶液中用有效量的谷氨酰内肽酶使毛发松弛;
其中所述谷氨酰内肽酶具有至少10的谷氨酰内肽酶比例;该谷氨酰内肽酶比例根据如下所示计算:
谷氨酰内肽酶比例=对Suc-AAPE-pNA的活性/对Suc-AAP非(E)-pNA的最高活性;
当谷氨酰内肽酶比例为至少10时,对于任何8种其它Suc-AAP非(E)-pNA底物的活性少于对于Suc-AAPE-pNA底物的活性的10%;以及其中
Suc-AAPA-pNA为BachemL-1775;
Suc-AAPR-pNA为BachemL-1720;
Suc-AAPE-pNA为BachemL-1710;
Suc-AAPI-pNA为BachemL-1790;
Suc-AAPL-pNA为BachemL-1390;
Suc-AAPK-pNA为BachemL-1725;
Suc-AAPM-pNA为BachemL-1395;
Suc-AAPF-pNA为BachemL-1400;
Suc-AAPV-pNA为BachemL-1770。
14.权利要求13的方法,其中步骤a)中的α-淀粉酶处理进行1至6小时。
15.权利要求13或14的方法,其中步骤a)中的α-淀粉酶处理是浸泡步骤。
16.权利要求15的方法,其中浸泡进行1至5小时。
17.权利要求13或14的方法,其中步骤a)中的α-淀粉酶处理在蛋白酶存在下进行。
18.权利要求17的方法,其中步骤a)中的α-淀粉酶处理在丝氨酸蛋白酶(EC3.4.21)存在下进行。
19.权利要求13或14或16或18的方法,其中步骤b)中的毛发松弛根据权利要求2至4任一项进行。
20.权利要求13或14或16或18的方法,其中对权利要求13步骤b)之后获得的毛皮进行硫化物处理。
21.权利要求20的方法,其中在用硫化物处理之前将步骤b)之后获得的毛皮去肉和剖皮。
22.权利要求20的方法,其中对权利要求14步骤b)之后获得的毛皮进行其它蛋白二硫键还原化合物处理。
23.权利要求22的方法,其中在用其它蛋白二硫键还原化合物处理之前将步骤b)之后获得的毛皮去肉和剖皮。
24.权利要求20的方法,其中硫化物以0.1%至1.5%每kg毛皮的范围使用。
25.权利要求20的方法,其中所述硫化物处理与浸灰剂组合进行。
26.权利要求25的方法,其中所述浸灰剂以0.1%至2.5%每kg毛皮的范围使用。
27.权利要求13或14或16或18或22的方法,其中所述毛发的松弛或去除不使用硫化物。
28.权利要求13或14或16或18或22的方法,其中所述毛发的松弛或去除不用浸灰剂。
29.权利要求13或14或16或18或22或24或25或26的方法,其中对权利要求13的步骤b)之后获得的毛皮进行机械毛发去除步骤。
30.一种用于制备蓝湿皮的方法,其包括下述步骤:
a)污物浸泡;
b)包含α-淀粉酶和蛋白酶的浸泡;
c)在水溶液中用有效量的谷氨酰内肽酶脱毛;
其中所述谷氨酰内肽酶具有至少10的谷氨酰内肽酶比例;该谷氨酰内肽酶比例根据如下所示计算:
谷氨酰内肽酶比例=对Suc-AAPE-pNA的活性/对Suc-AAP非(E)-pNA的最高活性;
当谷氨酰内肽酶比例为至少10时,对于任何8种其它Suc-AAP非(E)-pNA底物的活性少于对于Suc-AAPE-pNA底物的活性的10%;以及其中
Suc-AAPA-pNA为BachemL-1775;
Suc-AAPR-pNA为BachemL-1720;
Suc-AAPE-pNA为BachemL-1710;
Suc-AAPI-pNA为BachemL-1790;
Suc-AAPL-pNA为BachemL-1390;
Suc-AAPK-pNA为BachemL-1725;
Suc-AAPM-pNA为BachemL-1395;
Suc-AAPF-pNA为BachemL-1400;
Suc-AAPV-pNA为BachemL-1770;
d)对c)中获得的毛皮去肉和剖皮;
e)脱灰;和
f)酸洗和制革。
31.权利要求30的方法,其中在步骤d)之前或步骤d)之后引入用浸灰剂和/或硫化物的处理。
32.权利要求30的方法,其中在步骤d)之前或步骤d)之后引入用浸灰剂和/或其它蛋白二硫键还原化合物的处理。
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