CN1158393C - 用具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶酶处理生皮或表皮而将其加工成皮革的方法 - Google Patents

用具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶酶处理生皮或表皮而将其加工成皮革的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种将生皮或表皮加工成皮革的方法。更具体地说，本发明涉及一种包括用具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶对生皮或表皮进行酶处理，而将生皮或表皮加工成皮革的方法。

Description

用具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶酶处理 生皮或表皮而将其加工成皮革的方法
                       技术领域
本发明涉及将生皮或表皮加工成皮革的方法。更具体地说，本发明涉及将生皮或表皮加工成皮革的方法，包括用一种具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶对生皮或表皮进行酶处理。
                       背景技术
在制造皮革过程中，酶的使用传统上是在浸泡、脱毛和软化的步骤中。在这些过程中，用蛋白酶来达到蛋白质的部分降解，从而使毛皮柔软、易曲及便于随后的鞣革。
蛋白酶作用于蛋白质并将它们切成小的可溶性链。当将生皮或表皮用蛋白酶处理时，覆盖胶原纤维的原纤维间蛋白质和蛋白葡聚糖就被除去了。
不同的蛋白酶具有不同的作用和最适条件。传统上，消化性酶类，尤其是从被屠宰的动物(通常为猪)的胰腺提取的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶被用于皮革的制造。
胰蛋白酶是理想的用于软化的蛋白酶。它是一种高度特异性的蛋白酶，仅作用于肽链的赖氨酰和精氨酰键。胰蛋白酶被认为是用于皮革制造的最安全的酶类。
制造出皮革的纤丝分子是1类和3类胶原。在生皮和表皮加工成皮革的过程中不过度地破坏这一纤维结构是很重要的。弹性蛋白是蛋白质的另一种纤维类型，它在粒面(最表面部分)及其以下区域特别丰富。它的存在赋予了皮革的刚性。在生产某些类型的皮革，如装饰用和服装用皮革时，弹性蛋白的去除具有使皮革变得更加柔软的好处。但其它类型的皮革(如鞋面皮等)必须保留一定的刚性。
已知纯胰蛋白酶不能降解天然胶原，也不能水解弹性蛋白。因而，经常优选使用具有高的胰蛋白酶含量的胰酶，从而保持鞋面皮革的刚性并赋予其被称为“成形(stand)”的性能。
胰蛋白酶是从猪胰腺的胰岛素提取中作为副产物出现的，如果胰岛素不是主要目的物，这一方法是不经济的。然而，遗传工程技术的发展使人们现已能够进行重组胰岛素的生产。这些发展导致了胰蛋白酶制品的减少及其价格上涨。
这些发展促使了人们进行在将生皮和表皮酶加工成皮革的过程中用微生物蛋白酶制剂替代胰蛋白酶制剂的研究。
本文提出的用于皮革制造的蛋白酶是从芽孢杆菌属(Bacillus)获得的来自细菌的蛋白酶和从曲霉属(Aspergillus)，链霉菌属(Streptornyces)，小孢霉属(Microsporum)，和青霉属(Penicillium)获得的来自真菌的蛋白酶。
然而，这些微生物蛋白酶中没有一种完全模仿胰蛋白酶的作用，目前，在将生皮和表皮加工成皮革的过程中还没有一种微生物蛋白酶可完全取代胰蛋白酶。
                       发明简述
本发明的一个目的是提供一种皮革制造的酶处理方法，该方法包括一种可模仿胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶的作用。
因而，首先本发明提供了一种将生皮或表皮加工成皮革的方法，包括用一种具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶酶促处理生皮或表皮。
另一方面，本发明提供了一种脱灰碱液，含有一种具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶和适当的赋形剂。
                       发明详述
本发明提供了一种将生皮或表皮加工成皮革的方法，包括用一种具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶对生皮或表皮进行酶处理。将生皮或表皮加工成皮革的过程
生皮或表皮在制革厂通常是以盐渍的或干燥的生皮或表皮的形式接收的。将生皮或表皮加工成皮革的过程包括几个不同的处理步骤，包括浸泡、脱毛和软化的步骤。这些步骤构成了湿处理(Wet processing)，并且是在浸灰间(beam house)完成的。根据本发明，酶处理可在皮革制造中的任何时间进行。然而，蛋白酶通常被使用于湿处理过程中，即在浸泡、脱毛和/或软化的过程中。
在本发明的一个具体实施方案中，用一种具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶的酶处理是在湿处理过程中进行的。
浸泡步骤的目的是恢复盐渍和干燥的表皮所失去的水份。在本发明的一个更具体的实施方案中，用一种具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶的酶处理是在浸泡过程中进行的。本发明的浸泡过程可在常规浸泡条件下进行，即pH在pH6-11的范围，优选在pH7-10的范围，温度在20-30℃的范围，优选在24-28℃的范围，反应时间在2-24小时的范围，优选在4-16小时的范围，并且如果需要，加入已知的表面活性剂和防腐剂。
软化步骤的目的是去除残留的脱毛化学剂和非制革物质。软化步骤的第一阶段被称为脱灰，这时相石灰(phase lime)及碱性化学物质被除去。软化步骤的第二阶段通常是从脱灰碱液本身的加入开始的。在另一个具体的实施方案中，该酶处理是在软化过程中进行的。在一最优选的实施方案中，该酶处理是在脱灰阶段之后的软化过程中进行的。本发明的软化过程可在常规条件下进行，即pH在pH6-9的范围，优选在pH6.5-8.5的范围，温度在20-30℃的范围，优选在25-28℃的范围，反应时间在20-90分钟的范围，优选在40-80分钟的范围。
皮革制造的过程对本领域普通技术人员来说是公知的，在例如WO94/06942，WO 90/12118，US3840433，EP-A1-505920，GB-A2233665及US3986926中均有描述。
具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶
本发明的方法包括用具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶对生皮或表皮进行酶处理。
在本发明的叙述中，具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶是一种能够模仿胰蛋白酶作用的蛋白酶，特别是在皮革制造过程的条件下作用于生皮或表皮时。本发明的具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶优选是一种赖氨酰和/或精氨酰特异性蛋白酶(肽链内切酶)，即一种能够在赖氨酸和/或精氨酸的C-端侧断裂肽键的酶。该类似于胰蛋白酶的蛋白酶活性可用一个试验确定，该试验是基于对一种胰蛋白酶底物如N-苯甲酰基-L-精氨酸-对-硝基苯胺(L-BAPA或L-BAPNA)的切割。
已知真菌来源的具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶来自于特别是座壳孢属(Aschersonia)，尤其是粉虱座壳孢(Aschersonia aleyrodis)，曲霉属(Aspergillus)，白僵菌属(Beauvaria)，尤其是Beauvariabassiana，镰孢霉属(Fusarium)，尤其是尖镰孢(Fusariumoxysporum)，节状镰孢(Fusarium merismoides)，芳香镰孢(Fusarium redolens)，接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)，腐皮镰孢(Fusarium solani)，以及Fusarium verticilloiides，绿僵菌属(Metarhizium)，尤其是Metarhizium anisopliae，链霉菌属(Streptomyces)，尤其是灰色链霉菌(Streptomyces griseus)，木霉属(Trichoderma)和轮枝孢属(Verticillium)，尤其是Verticilliumlecanii。EP335，023公开的具有胰蛋白酶作用的真菌蛋白酶来自座壳孢属，白僵菌属，绿僵菌属和轮枝孢属。
在本发明的一个优选实施方案中，该具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶来自于尖镰孢DSM2672菌株。来自于尖镰孢DSM2672的具有胰蛋白酶作用的蛋白酶描述于WO89/06270和WO 94/25583。
已知细菌来源的具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶来自例如Lysobacter，尤其是Lysobacter enzymogenes，以及无色杆菌属(Achromobacter)，尤其是Achromobacter lyticus。Jekel等人〔JekelP A，Weljer WJ和Beintema J J，分析化学( Anal.Biochem.)1983 134347-354〕描述了一种来源于lysobacter的赖氨酸特异性肽内切酶。
该具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶可以是丝氨酸、硫醇、金属或天冬氨酸类型。
本发明的具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶可以皮革制造过程中常规使用的浓度使用。目前预计，尤其分别在浸泡和软化过程中，该具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶每克生皮的加入量可以是相当于0.1至100μg的活性酶蛋白，优选为每克生皮1至25μg的活性酶蛋白质。一种含有具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶的脱灰碱液。
脱灰碱液是一种含有用于浸灰间工艺，具体说用于皮革制造过程中软化步骤的化学活性成分的制剂或含酶制品。
另一方面，本发明提供了一种含有具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶及适当赋形剂的脱灰碱液。在本发明的叙述中，适当的赋形剂包括已知的和用于本领域的辅助化学品，如稀释剂、乳化剂、脱灰剂(delimers)及载体。该脱灰碱液可以已知的现有技术描述的方法配制，如GB-A 2250289描述的方法。
本发明的脱灰碱液可含有每克脱灰碱液0.00005至0.01克的活性酶蛋白质，优选每克脱灰碱液含有0.0002至0.004克的活性酶蛋白质。
在一优选的实施方案中，本发明的脱灰碱液含有一种从镰孢霉属(Fusarium)得到的具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶。在一更优选的实施方案中，本发明的脱灰碱液含有一种从尖镰孢DSM2762或其突变体得到的具胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶。
蛋白水解活性
蛋白水解活性可用变性的血红蛋白作为底物来确定。在确定蛋白水解活性的Anson-血红蛋白方法中，变性的血红蛋白被消化，没有变性的血红蛋白用三氨乙酸(TCA)沉淀。TCA可溶性产物的量用酚试剂测定，该酚试剂与酷氨酸和色氨酸产生蓝色。
一个Anson单位(AU)被定义为一定量的酶，它在标准条件(即25℃，pH7.5和10分钟反应时间)下以初始速率消化血红蛋白使得每分钟释放的TCA可溶性产物的量与酚试剂反应时与1毫当量的酪氨酸所产生的颜色相同。
确定Anson单位和由Anson单位表示的蛋白分解活性是本领域普通技术人员公知的。但是，一份更详细描述该分析方法的文件AF415可从Novo Nordisk A/S，Denmark公司索取，该文件内容引入本文作为参考。
实施例
通过下述实施例对本发明进行进一步说明，这些实施例不是对本发明权利要求范围在任何形式上的限定。
实施例1
在本实施例中，对具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶的作用在其三个不同的剂量水平进行评估。
本实施例所用的具胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶是一种尖镰孢(Fusarium oxysporum)蛋白酶，是根据WO 94/25583制取的。
将总重为81公斤的三张干燥盐渍的丹麦黑/白Friesian牛生皮用根据下面的处方进行处理。所有剂量均以盐渍干生皮重量的百分数计算。操作是在恒温的实验性鞣革桶中进行的。
处方1
剂量  温度℃ 产品 pH 时间小时，分钟
清洗
200  20-25 水三张生皮清洗 1小时
排水
浸泡
1100.10.010.3  20-25 水BaymolTMANArazitTMKF苏打10’/h 9.5-10 2小时过夜
排水
浸灰
1.01.53100 25-28 NaHSNaS石灰水3’/30’ 15分钟120分钟过夜
排水
清洗
200  20-25 水清洗 10分钟
将毛皮取出，去肉并分割。分割后，毛皮被沿脊柱分割成两半，分别称重。
毛皮1的第一半处理时没有酶，第二半处理时每克毛皮用3.6μg的活性类似于胰蛋白酶的酶蛋白质。
毛皮2的第一半处理时每克毛皮用3.6μg的活性类似于胰蛋白酶的酶蛋白质，而第二半处理时每克毛皮用21μg的活性类似于胰蛋白酶的蛋白质。
毛皮3的第一半处理时每克毛皮用21μg的活性类似于胰蛋白酶的酶蛋白质，而第二半处理时没有酶。
该处理系统可在同一块毛皮上进行剂量比较。
根据下面处方将分开的半张毛皮进行两个两个一起的处理。
处方2
剂量％ 温度℃ 产品 pH 时间小时，分钟
清洗
200 30 水 10分钟
排水
200 35 水 10分钟
排水
脱灰
1501.10.5 35 水DecaltalTMES Fl.DecaltalTMR 用酚酞检查pH7.5 30分钟
150 30 水
如文中所述 酶 1小时
排水
200 30 水 10分钟
排水
200 30 水 10分钟
排水
将生皮放入一个具有浸酸浮囊的桶中终止软化
软化后，将生皮放入一个具有浸酸浮囊的桶(a drum with a picklefloat)中，所有软化全部完成后，将毛皮用下面处方一起处理。
处方3
酸浸
7080.251.53.52.4 30 水盐HCOOH(96％)H2SO4(96％)检查生皮的pHChromosalTMBBaychromTMCP 酸 15分钟10分钟1小时15分钟过夜
检查pH排水并清洗 约4次
将所得产物(被称为“湿铬鞣革(wet blue)”)挤压，除去多余水分，随后修整至1.1至1.2mm的厚度。
将该湿铬鞣革进一步加工成坯革(crust leather)，如下所述。
处方4
剂量％ 温度℃ 产物 pH 时间小时，分钟
湿铬鞣革
200 40 水 10分钟
排水
1502.02.0 40 水ChromosalTMBNeutriganTMF 4.3 60分钟
2.00.65 EskatanTMGLHNeutriganTMMO 30分钟
2.0 BasyntanTMANF 5.0 60分钟过夜
6.3
排水并清洗
200 40 水 10分钟
排水
1003.0 40 水TamolTMPM 10分钟
3.0 Avalan beigeTMLGG 45分钟
涂油
100以上 55 水CautpolTMTIS 45分钟
4.0  BasyntanTMANF 6.4 45分钟
6.5 HCOOH(20％) 15分钟
6.5 HCOOH(20％) 30分钟
排水并用冷水清洗
将皮革空气干燥。
干燥后对该棕灰色的坯革进行肉眼检查表明，与没有处理的一边相比，用类似于胰蛋白酶的酶处理的一边具有更为清洁和浅色的粒面及较少皱折。用酶处理的一边由于皮革更为松驰及较少皱折，比没有处理的一边长6-10％。根据DIN53329分析，用该类似于胰蛋白酶的酶处理与没有处理相比撕裂强度(tear strength)提高了20-25％。
用MinoltaTM Chroma Meter进行的颜色检测表明，在这些生皮内比较，用该类似于胰蛋白酶的酶处理的一边比没有处理的一边颜色显著较浅(较高的L-星值(L-Star value))，这是由于处理的一边比没有处理的一边较为清洁的结果。在该两个酶剂量之间没有发现显著差异。
用肉眼和用显微镜进行的检测没有发现对粒面有任何破坏，甚至在高达21μg的处理也是这样。
实施例2
在本实施例中，将从镰孢霉属(Fusarium)得到的类似于胰蛋白酶的蛋白酶的作用在软化过程中分别与一种纯的胰蛋白酶脱灰碱液(PTNTM Crystalline，得自Novo Nordisk A/S，Denmark)和一种胰酶脱灰碱液(DTNTM3.0S，得自Novo Nordisk A/S，Denmark)的作用进行比较。
用于本实施例的类似于胰蛋白酶的微生物蛋白酶是一种尖镰孢(Fusarium oxysporum)蛋白酶，根据WO 94/25583制得。
在本实施例中使用了两张黑白Friesian牛生皮，进行两个系列。将这些生皮放在一起在一试验性桶中用实施例1的处方1进行处理。在软化前，将每张皮切成两半，并用下述处方5进行处理。将这些分开的半张皮分开进行如下软化(酶处理前它们已被脱灰)：
表1
毛皮编号         第一半(A)                第二半(B)
1           0.0541％类胰蛋白酶    0.00044％PTNTM Crystalline
2           0.2937％类胰蛋白酶    0.0086％PTNTM 3.0S
在同一张毛皮上实施不同的处理，以保证进行效果比较的可能性。所有剂量均是以浸灰的、去肉的和分割的毛皮的重量百分比计算的。施用于毛皮1的蛋白酶剂量等于每克毛皮3μg活性酶蛋白质，施用于毛皮2的蛋白酶剂量等于每克毛皮3.1×10-4Anson单位。
处方5
剂量％ 温度℃ 产物 pH 时间
清洗 小时，分钟
200 30 水 10分钟
排水
200 35 水 10分钟
排水
脱灰
150 35 水
2.0 PurgaminTMGSB Neu 7.5用酚酞检查 45分钟
软化
150 30 水
如上文所述 酶 1小时
排水
70 20 水
9 氯化钠 5分钟
0.25 HCOOH(96％)
1.5 H2SO4(96％) 2.5 1小时
3.5 ChromosalTMB
2.4 BaychromeTMCP 过夜
将所得湿铬鞣革挤压，以除去多余水分，然后修整至1.1至1.2mm的厚度。然后，将该湿铬鞣革用实施例1中处方4加工成坯革。
然后将皮革空气干燥。
对软化的毛皮和湿铬鞣革进行评估的结果没有揭示在不同的处理间有任何显著差别。用肉眼评估该坯革我们也没有发现在不同蛋白酶之间有任何系统差异。这些分开的两半非常相象。
切出皮革样品，分别进行撕裂强度检测(DIN 53329)，抗拉强度检测(DIN 53328)，崩裂检测(lastometer test)(DIN 53325)及挠曲检测(flexometer test)(DIN 53351)。结果示于下文表2和3。
得出粒面裂纹和破裂数值(grain crack and burst figures)的崩裂检测是一种粒面可延伸性检测。它是用一种装置测定的，其中用一个圆头绳索施力于该材料的隔膜的中心，直至产生裂纹并破裂。测定用力的大小和伸展量。
抗拉强度是以断裂时的力量和伸展量测定的，撕裂强度是以皮革中纤维走向垂直和平行方向撕裂皮革所用的力。
挠曲检测测定的是皮革对弯曲力的响应(与崩裂检测一样，该检测特别用于鞋面皮革的检测)。将皮革以一定的方式进行折叠并在Bally挠曲检测仪中重复地来回曲折。但是，挠曲检测的结果在下表中没有示出，因为在50,000次干拐折(dry flexes)后在这些皮革的任何一个上均观察不到裂缝。
表2
类胰蛋白酶(1A)与PTNTM Crystalline(1B)对比：
生皮部分 粒面裂纹负荷公斤 粒面崩裂负荷公斤 抗拉强度N/mm2 断裂时伸展率 撕裂强度
1A 14 24 12 78 46
1B 14 26 15 97 65
差别 0％ 8％ 25％ 24％ 41％
表3
类胰蛋白酶(2A)与PTNTM 3.0S(2B)对比：
生皮部分 粒面裂纹负荷公斤 粒面崩裂负荷公斤 抗拉强度N/mm2 断裂时伸展率 撕裂强度
2A 10 21 10 79 36
2B 14 24 8 76 34
差别 40％ 14％ -20％ -4％ -6％
为解释表2-3中的数据，必须不单独看每一个单个数值，而应对数据进行总体观察。首先，生皮与生皮之间有很大差异，但即使皮革样品取自同一边皮革相同或类似的区域，在同一张生皮中皮革的一边与另一边之间仍然存在一些自然差别。
基于这些考虑，PTNTM Crystalline好象具有最好的总体性能，而PTNTM 3.0S与本发明的类似于胰蛋白酶的蛋白酶相近似。
本实施例表明，根据本发明的具有胰蛋白酶作用的蛋白酶是高度纯化的胰酶和胰蛋白酶脱灰碱液优良的微生物来源的替换物。

Claims (9)

1.一种将生皮加工成皮革的方法，包括用一种具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶对生皮或表皮进行酶处理，其中所述蛋白酶来源于尖镰孢(Fusarium oxysporum)菌株。
2.根据权利要求1的方法，其中该具有胰蛋白酶作用的蛋白酶来自尖镰孢DSM 2672菌株。
3.根据权利要求1-2中任意一项的方法，其中该具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。
4.根据权利要求1-2中任意一项的方法，其中该具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶是Lys和/或Arg特异性蛋白酶。
5.根据权利要求1-2中任意一项的方法，其中该酶处理是在一个或多个湿加工步骤中完成的。
6.根据权利要求5的方法，其中该酶处理是在浸泡步骤中完成的。
7.根据权利要求5的方法，其中该酶处理是在软化步骤中完成的。
8.一种脱灰碱液，含有一种具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶和适当的赋形剂，其中所述蛋白酶来源于尖镰孢菌株。
9.根据权利要求8的脱灰碱液，其中该具有胰蛋白酶作用的蛋白酶来自尖镰孢DSM 2672菌株。
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