DE3704465C2 - Flüssig-Formulierungen von Enzymen - Google Patents

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Flüssig-Formulierungen von Enzymen unter Verwendung wasserfreier organischer Lösungsmittel, vorzugsweise zusammen mit speziellen, die Rheologie beeinflussenden Additiven, die sich besonders zur Anwendung in der Lederindustrie eignen.

Stand der Technik

Die industrielle Anwendung von Enzymen kann gegenwärtig hohes Interesse beanspruchen, gilt sie doch als der Proto­ typ einer "sanften" Technologie.

Die Art und die Anzahl der industriellen Verfahren, in denen Enzyme eingesetzt werden, ist noch begrenzt. Eine Erweiterung ist jedoch zu erwarten (Vgl. Ullmann′s Encyclopädie der technischen Chemie, Band 10, S. 522- 526 ff, Verlag Chemie 1975; Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3rd Ed. Vol. 9, pp. 173-224, J. Wiley 1980).

Zu nennen sind insbesondere die Gebiete der Nahrungs- und Futtermitteltechnologie, der Waschmitteltechnologie und der Lederherstellung, auf denen die Enzymanwendung bereits eine längere Tradition hat. Darüber hinaus finden Enzyme auch für gezielte chemische Umsetzungen Anwendung (vgl. Raul Präwe, Jahrbuch Biotechnologie, 1986/87, Carl Hauser Verlag München, Wiem, S. 359-397).

Wichtige Vertreter der industriell verwendeten Enzyme (Industrial Enzymes = IE) sind u. a. γ-Aminobutyro­ transaminase, Amylase, Cellulase, Collagenase, Glucose- Oxidase, Glutaminsäure-Decarboxylase, Hemicellulase, Invertase, Katalase, Lipase, Pectinase, Penicillase, Protease, Streptokinase.

Da es sich bei den Medien, in denen die in der Natur vorge­ fundenen Enzymen wirksam sind, ganz überwiegend um wäßrige Medien handelt, wobei oft auch noch eine gewisse Abhängig­ keit vom pH-Wert und den gelösten Bestandteilen des wäßrigen Mediums registriert wird, darf das wäßrige Milieu als Standardmedium bei enzymatischen Reaktionen gelten.

Da Enzyme als Polypeptide, deren Wirksamkeit in erster Näherung von ihrer strukturellen Organisation abhängt, wie andere Proteine auch durch gewisse organische Lösungsmittel denaturiert werden können, empfahl sich von jeher Zurück­ haltung bei der Anwendung organischer Lösungsmittel zusammen mit Enzymen.

In neuerer Zeit hat man z. B. bei Untersuchungen an immobilisierten Enzymen den Einfluß von Zusätzen wasser­ löslicher organischer Solventien zum wäßrigen Medium bestimmt und festgestellt, daß mit abnehmender Dielektrizitätskonstante die Reaktionsgeschwindigkeit steigt. [Vgl. H. Weetall, P. Vann in "Enzyme Engineering Vol. 4. (Ed. G.B.Brown, et al) "NCI Monograph No. 27 (Ed. M.P. Stulberg) 1967, pp 141-152].

Aufgabe und Lösung

Bei der Handhabung, insbesondere der Dosierung von chemischen Agentien wird oft als vorteilhaft empfunden, wenn diese in flüssiger Form vorliegen. In der Regel ist das Einmischen von flüssigen Zubereitungen in flüssige Reaktionsmedien mit weniger Problemen behaftet als das Eintragen von Pulvern oder anderen Festkörpern. Dies gilt auch für Enzympräparationen.

Entsprechende Tendenzen lassen sich z. B. in der Waschmittelindustrie verfolgen. Auf der anderen Seite sieht man sich gerade bei flüssigen Enzympräparaten einer ganzen Reihe von Problemen gegenüber. An erster Stelle steht die Stabilität solcher Enzympräparate. Wie bereits angedeutet, unterliegen Enzyme in wäßrigem Medium der Beeinflussung durch die übrigen vorhandenen Bestandteile des Mediums wie Säuren, Basen, Salze, oberflächenaktive und komplexaktive Bestandteile, andere Makromoleküle, insbesondere andere Enzyme, die Substrate der Enzymwirkung u. ä.

Diese Zusätze können sowohl stabilisierend als destabili­ sierend wirken. Als stabilisierende Zusätze für bestimmte Enzyme in wäßrigen Lösungen sind beispielsweise Glykole, Polyglykole, Tenside, Proteine und Proteinhydrolysate, synthetische Polymere, Carbonsäuren, spezifische Kationen, bzw. Anionen u.ä. vorgeschlagen worden.
[Vgl. US-Patent Nr. 4 519 934;
L. Kravetz, K.F. Guin, Journal of the Am. Oil, Chem. Soc. Vol. 62, 5 (1985);
L. Gianfreda, M. Modafferri und G. Greco, Enzyme Microb. Technol. 7, 78-82 (1985);
K. Martinek, V. P. Torchilin, Enzyme Microb. Technol. Vol. 1, 74-82 (1979);
US-A 4 111 855 (1978);
US-A 4 318 818 (1982);
US-A 3 557 002 (1971);
US-A 4 169 817 (1979)].

Als eine weitere Möglichkeit, Enzyme in wäßriger Lösung zu stabilisieren, wurde die Bildung inverser Micellen im System Wasser/Tensid/organisches Lösungsmittel in Betracht gezogen (vgl. P.L. Luisi, Angew. Chem. 97, 449-460 (1985)).

Die vorliegende Aufgabe sei am Beispiel der in der Leder­ herstellung angewendeten Enzyme bzw. Enzymsysteme näher erläutert.

Gerade bei der Lederherstellung hat die Flüssigdosierung gegenüber der Feststoffdosierung in jüngerer Zeit stark an Boden gewonnen, da sie in der Tat Vorteile u. a. bei der Handhabung aufweist. Das Problem bei der Herstellung flüssiger, Enzyme enthaltender Präparationen, beispiels­ weise enzymatischer Beiz- und Weichhilfsmittel liegt jedoch in der ungenügenden Stabilität solcher Produkte. Die Instabilität, insbesondere von Pankreaspräparationen, kommt keinesfalls unerwartet; man kennt sie zum Teil bereits von der Enzymaufarbeitung her. Soweit es sich um Proteasen handelt, muß speziell auch mit der selbstverdauenden Wirkung und mit der Abbauwirkung auf sonstige anwesende Enzymproteine gerechnet werden. (Vgl. K. Martinek, V.P. Torchilin, Enzyme Microb. Technol. Vol. 1, S. 74-82 (1979).

Es bleibt zu konstatieren, daß sich Flüssig-Enzympräparate in der Praxis bislang nicht durchsetzen konnten. Es bestand also nach wie vor die Aufgabe, flüssige Formulierungen für Enzyme zur Verfügung zu stellen, die a) unter Praxisbe­ dingungen hinreichend stabil sein sollten, b) bei denen die Aktivität der Enzyme möglichst nicht, bzw. nicht irrever­ sibel beeinflußt sein sollte, c) die mit den vorgesehenen Einsatzgebieten der Enzyme kompatibel sein sollten und die d) ökonomisch und ökologisch tragbar sein sollten. Die Anforderungen an ein solches sogenanntes "Flüssigenzym" für die modernen Methoden der Lederherstellung gehen dahin, daß der Aktivitätsabfall innerhalb 4 bis 6 Monaten nicht größer als 15% sein darf.

Lösung

Es wurde nun gefunden, daß die erfindungsgemäßen flüssigen Enzymformulierungen die Anforderungen der Technik über­ raschenderweise in hohem Maße erfüllen. Die Erfindung betrifft Flüssig-Formulierungen von Enzymen zur technischen Anwendung, wobei als Trägerflüssigkeit für die Enzyme mindestens ein im wesentlichen wasserfreies organisches Lösungsmittel (LM) oder Gemische von solchen eingesetzt werden. Als Lösungsmittel kommen im Einklang mit den oben dargestellten Aufgaben stehende, vorteilhaft an sich übliche, vorzugsweise umweltunbedenkliche, insbesondere wenig toxische, nicht-enzymschädigende Lösungsmittel in Frage. Die erfindungsgemäß zu verwendenden organischen Lösungsmittel LM enthalten vorzugsweise neben Kohlenstoff, Wasserstoff und gegebenenfalls Sauerstoff und weniger bevorzugt Schwefel keine weiteren Heteroatome. Bevorzugt sind Lösungsmittel der Struktur I

R₁ - X - R₂ I

worin X für Sauerstoff oder Schwefel und
worin R₁ für einen Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoff­ atomen, oder für einen Rest

wobei R₃ Wasserstoff -CH₃ oder -CH₂OH bedeutet oder für einen Rest -(CH₂-CH₂O)_n-H, wobei n eine Zahl von 1 bis 15 bedeutet und
R₂ für Wasserstoff- oder einen Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen steht oder,
worin R₁ und R₂ für einen Rest -CH₂-CH₂OH stehen oder
worin R₁ und R₂ zusammen mit dem Sauerstoff einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring bilden, wobei alle Ring­ glieder aus -CH₂-Gruppen bestehen oder ein Ring­ glied eine Carbonylgruppe darstellen, und wobei gegebenenfalls ein weiteres Ringglied aus Sauer­ stoff bestehen kann, oder
worin X für eine Carbonylgruppe -C=O steht, mit der Maß­ gabe, daß in diesem Falle R₁ und R₂ einen Alkyl­ rest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bedeutet, oder
worin X für eine COO-Gruppe steht, mit der Maßgabe, daß in diesem Fall R₁ und R₂ für einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen stehen oder R₁ für Wasser­ stoff und R₂ für einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen steht.

Weiter sind als Lösungsmittel LM solche der Struktur II brauchbar

worin R₅ für einen Rest -CH₃ oder -CH=CH₂ steht.

Besonders genannt seien als Vertreter der Formel I Kohlen­ säureester, insbesondere cyclische Kohlensäureester, speziell Propylencarbonat. Weiter sind von Interesse mehrwertige Alkohole wie Glycerin, Ethylenglykol, Butyl­ glykol, Butyldiglykol, Diethylenglykol, Polyethylenglykole soweit sie flüssig sind, einwertige Alkanole wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, n-Butanol, Isobutanol, 2- Ethylhexanol, Cyclohexanol, Äther wie Diethylether, insbesondere cyclische Ether wie Dioxan, Tetrahydrofuran, Ketone wie Aceton, Ethylmethylketon, Ester wie Ethylacetat, Butylacetat, Lactone wie γ-Butyrolacton. Als Vertreter der Formel II seien Toluol und Styrol genannt, ferner sind Terpentin, Solventnaphtha, Lackbenzine, aliphatische Kohlenwasserstoffe und Mineralöle (Siedebereiche vorzugs­ weise zwischen 50 und 180 Grad C, speziell zwischen 70 und 150 Grad C) brauchbar. Mit Ausnahme der Polyethylenglykole handelt es sich bei den Lösungsmitteln LM in der Regel um solche mit einem Molekulargewicht < 110 und überwiegend mit Siedepunkten unter 300 Grad C bei Normaldruck. (Weitere Daten zu den Lösungsmitteln können z. B. der Monographie Gramm, Fuchs, Lösungsmittel und Weichmachungsmittel, 8. Auflage, Wissensch. Verlagsgesellschaft, Stuttgart 1980 entnommen werden). Die erfindungsgemäß zu verwendenden organischen Lösungsmittel LM sind im wesentlichen wasserfrei, d. h. sie enthalten in der Regel weniger als 1 Gew. -% Wasser, vorzugsweise nicht mehr als die übliche Haftfeuchtigkeit. Die Trocknung der Lösungsmittel LM wird in an sich üblicher Weise vorgenommen, z. B. durch Anwendung gebräuchlicher Trockenmittel, Destillation, Azeotropierung usw. (vgl. Houben Weyl. Auflage, Bd. I/2, pg 765-886, Georg Thieme-Verlag 1959).

Das Vorhandensein von Wasser in den erfindungsgemäßen Formulierungen ist im allgemeinen nicht vorgesehen, zumindest nicht in den Erfindungszweck beeinträchtigenden Mengen. Bei der Verwendung von Lösungsmitteln, welche sich nicht mit Wasser mischen, können die Enzymformulierungen zusätzlich Tenside enthalten. Bevorzugt sind hier nicht­ ionische Tenside von Typ Fettalkohol-/Alkylphenol­ ethoxylate (z. B. mit Oleocetyl- und Oleinalkohol) ferner Addukte von Polyglykolen mit 4-42 Mol Ethylenoxid neben anionischen Typen wie Alkylsulfate, Alkylethersulfate, Alkylphosphate, Alkyletherphosphate, Alkylsulfonate und Alkylarylsulfonaten. (Vgl. DE-A 33 22 840). Der Anteil an den Tensiden beträgt im allgemeinen 0,001 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise 0,005 bis 20 Gew.-% bezogen auf die Träger­ flüssigkeit. Im allgemeinen liegt der HLB-Wert der Emul­ gatoren (bez. Ö/W-Emulgierwirkung) bei 8-18, vorzugsweise 9-15. (Zu Emulgatoren und HLB-Wert. Vgl. Kirk-Othmer 3.rd. Ed. Vol.8., 910-916). Bevorzugt sind ferner die Lösungsmittel LM, die sich mit Wasser mischen, insbesondere die mit Wasser in jedem Verhältnis mischbaren Lösungs­ mittel. In erster Näherung ist davon auszugehen, daß die Enzyme in den Lösungsmitteln LM völlig ungelöst bleiben. Daher tritt die Tendenz zur Selbstverdauung bzw. zum Abbau anderer Enzyme weitestgehend zurück.

Die Menge der eingesetzten Lösungsmittel LM bemißt sich in erster Linie aus der Zweckmäßigkeit bei der Handhabung der Enzyme; sie ist nicht eigentlich kritisch. Im allgemeinen wird man aus Gründen der Handhabbarkeit ein Gewichtsver­ hältnis Enzym zu Lösungsmittel LM von 1 : 10 nicht unter­ schreiten. Im Interesse vernünftiger Konzentrationsver­ hältnisse wird die obere Grenze der Gewichtsrelation Enzym zu LM in der Regel mit 1 : 30 bis 1 : 500 anzusetzen sein.

Als Faustregel hat sich ein Verhältnis Enzym zu LM von 1 zu ca. 50 als gut brauchbar erwiesen. Geeignet sind gegebenenfalls auch Gemische aus den oben genannten Lösungsmitteln LM. Bei der Zugabe der im wesentlichen aus Protein bestehenden Enzyme zu den im wesentlichen wasserfreien Lösungsmitteln LM können Probleme auftreten wie zögernde Benetzung und/oder Verteilungsprobleme wie Absatz- oder Aufrahmerscheinungen.

Anspruchsgemäß lassen sich bei der vorliegenden Erfindung die mit der Herstellung homogener flüssiger Enzym-Formulierungen verbundenen Probleme, wie Aufrahmen und Absetzen, zumindest teilweise lösen, wenn man anorganische pulverförmige Zusätze AZ in die Lösungsmittel LM eindispergiert.

Pulverförmige Zusätze aus anorganischen Dispergatoren sind für gänzlich andere Anwendungszwecke beschrieben worden, z. B. als Dispergatoren von "Öl-in-Wasser"-Dispersionen, bzw. als Dispergatoren bei der radikalischen Perlpolymerisation (vgl. Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Band XIV/1 Makromolekulare Stoffe, S. 420- 421, Georg-Thieme-Verlag 1961). Als solche anorganischen Dispergatoren werden z. B. unlösliche Salze der Erdalkalimetalle (Carbonate, Phosphate, Sulfate, Silikate) Aluminiumhydroxid, Talkum und Betonit empfohlen. Zur Lösung der vorliegenden Aufgabe werden Tone, insbesondere Bentonit empfohlen. Kaolin und Bentonit bilden bekanntlich mit einer Reihe polarer und unpolarer organischer Flüssigkeiten thixotrope Gele. Die Thixotropie der Gele verschwindet z. B. durch Zugabe geringer Mengen längerkettiger Alkohole [vgl. Ullmanns Enzyclopädie der techn. Chemie, 4. Auflage, Bd. 23, s. 318- 326, Verlag Chemie 19; U. Hoffmann et al. Kolloid Z. 151, 97-115 (1957)].

Unter Tonen seien die üblichen Aluminiumsilikate, unter Bentonit die hauptsächlich aus Montmorillonit (Al₂O₃·4·SiO₂·H₂O) bestehenden, handelsüblichen Präparationen verstanden. Von besonderem Interesse sind organisch aktivierte Bentonite, z. B. die durch Umsetzung von Na-Montmorillonit mit quartären Alkylammoniumverbin­ dungen entstandenen. Durch Kationenaustausch bilden sich sogenannte organophile Bentonite, die in organischen Flüssigkeiten quellen (Vgl. Ullmann loc.cit. S. 323). Im allgemeinen können die Lieferformen des Handels (Plättchen, Teilchengrößen im Bereich 0,5-5 µm) eingesetzt werden, wobei zweckmäßigerweise aber eine Behandlung unter Scherbeanspruchung in dem gewählten Lösungsmittel LM erfolgen soll. Im allgemeinen beträgt der Gehalt der Lösungsmittel LM an anorganischen Zusätzen AZ 0,1 bis 3 Gew.-% bezogen auf das Lösungsmittel, vorzugsweise 0,3 bis 1 Gew.-%. Als besonders vorteilhaft hat sich erwiesen, den anorganischen Zusatz des Enzymkonzentrats zusammen mit dem Lösungsmittel LM mittels eines geeigneten Aggregats, insbesondere eines Dispergators der Scherwirkung zu unterwerfen. Als Dispergatoren kommen handelsübliche Geräte in Frage (Vgl. Ullmanns Encyclopädie der technischen Chemie, 4. Auflage, Bd. 1, S. 239, Verlag Chemie 1972).

Die Drehzahlen bzw. die anzuwendenden Bearbeitungszeiten sind in erster Linie von der Art des Aggregats abhängig. Als Anhalt für die Einwirkung handelsüblicher dispergier­ wirksamer Aggregate auf Bentonit in einem der erfindungs­ gemäß zu verwendenden Lösungsmittel LM seien 2 bis 60 Minuten genannt bei einer Umfangsgeschwindigkeit von 4-36 m/sec.

Als besonders geeignet hat sich das Lösungsmittel Propylen­ carbonat insbesondere in Kombination mit Bentonit herausge­ stellt.

Die erfindungsgemäßen Formulierungen unterliegen in Bezug auf die Enzymkomponente keinen erkennbar gewordenen Be­ schränkungen (es sei denn im Hinblick auf die Stabilität der Enzyme selbst gegenüber organischen Lösungsmitteln wie Alkoholen). Vorausgesetzt werden soll, daß die Lösungs­ mittelkomponente LM mit der endgültigen Verwendung der Enzyme kompatibel ist. Zur Steigerung des Anti-Absetz- bzw. Antiaufrahmeffekts können den Trägerflüssigkeiten, insbe­ sondere, wenn es sich um polare Lösungsmittel, etwa vom Typ der Formel I handelt, noch wenig polare Lösungsmittel zuge­ setzt werden. So kann es vorteilhaft sein, daß die Träger­ flüssigkeit 1-10 Gew. -% Kohlenwasserstoffe, insbesondere verzweigte oder geradkettige Aliphaten mit 5 bis 20 Kohlen­ stoffatomen enthält. Genannt seien z. B. Petroleumfrak­ tionen etwa im Siedebereich 50-180 Grad C (Vgl. auch vor­ stehende Definition von LM). Als Enzyme seien insbesondere die bereits industriell oder in sonstigen Anwendungsfeldern genutzten hervorgehoben (vgl. Stand der Technik, oben)

• A) Proteasen (E.C. 3.4; Kirk-Othmer, loc.cit. Vol. 9, K. Aunstrup in B. Spencer Ed. Industrial Aspects of Bio­ chemistry, Vol. 30 (I), pp 23-46, North Holland 1974.)
• a) tierischen Ursprungs, wie beispielsweise
• α) Rennin (E.C. 3.4.23.4)
• β) Pankreas-Proteasen
  Pancreatin, insbesondere Trypsin, Chymotrypsin (pH-Wirkungsbereich ca. 7-10)
  Pepsin (E.C. 3.4.23.1) (pH-Wirkungs­ bereich ca. 1,5-4,0)
  Kathepsin (E.C.3.4.23.5) (pH- Wirkungsbereich ca. 4,0-5,0)
• b) pflanzlichen Ursprungs
• α) Papain (E.C.3.4.22.1) pH-Wirkungsbereich ca. 5,0-8,0
• β) Ficin (E.C.3.4.22.3) pH-Wirkungsbereich ca. 4,0-9,0
• γ) Bromelain (E.C. 3.4.22.4 und 3.4.22.5) pH- Wirkungsbereich ca. 5,0-7,0
• c) mikrobiellen Ursprungs (Vgl. L. Keay in "Process Biochemistry", 1971, 17-21.
• α) aus Bacillus-Arten
  wie B. subtilis, B. licheniformis, B. alkalophilus, B. cereus, B. natto, B. vulgatus, B. mycoides.
• β) aus Streptococcus-Arten
• γ) aus Streptomyces-Arten
  wie Streptomyces fradiae, S. griseus, S.rectus
• δ) aus Aspergillus-Arten
  wie Aspergillus flavus-oryzae, A. niger, A. saitoi, A. usamii
• ε) aus Mucor- und Rhizopus-Arten
  wie Mucor pusillus, M. mietrei
• ζ) Endothia-Arten
  wie Endothia parasitica
• η) aus Trametes-Arten
  wie Trametes sanguinea.
• Außer der Unterscheidung nach der Herkunft findet auch die Unterscheidung gemäß dem Angriffsort (Exo-versus Endo-Enzyme) und aufgrund der "Active Site" der Proteasen (Serin-Proteasen, die durch DFP gehemmt werden, Sulfhydryl-Enzyme) Anwendung.
• Weiter ist von erheblicher praktischer Bedeutung die pH-Abhängigkeit der Enzymaktivität.
• Man unterscheidet daher vor allem unter praktischen Gesichtspunkten
• i) Alkalische Proteasen, mit Wirkungsoptimum etwa im Bereich von pH 7,5 bis 13,
  insbesondere alkalische Bakterienproteasen (E.C.3.4.21.) (die zumeist dem Serin-typ angehören) und alkal. Pilzproteasen
• ii) Neutrale Proteasen, mit Wirkungsoptimum im Bereich von pH 6,0-9,0
  insbesondere neutrale Bakterienprotease (E.C.3.4.24.) (die zu den Metalloenzymen gehören) und Pilzproteasen, beispielsweise Bacillus- Proteasen, Pseudomonas-Proteasen, Streptomyces- Proteasen, Aspergillus-Proteasen.
• iii) Saure Proteasen mit Wirkungsoptimum im Bereich von pH 2,0-5,0 (E.C. 3.4.23)
  insbesondere saure Pilzproteasen, z. B. aus Rhizopus spp., Aspergillus spp., Pennicillium spp., Mucor spp., und Impex lacteus und Endothitia parasitica
  Proteasen finden u. a. bei der Lederherstellung, in Waschmitteln und bei der Reinigung, in der Entschlichtung, bei der Käseherstellung, beim Fleisch­ abbau und bei der Stabilisierung von Bier industrielle Anwendung.
• Genannt seien als alkalische Proteasen insbesondere die Subtilisine, alkalische Bakterienproteinasen vom Serin- Typ, die im pH-Bereich 9-10 stabil und gegen Perborat einigermaßen unempfindlich sind.
• Die proteolytische Wirksamkeit von Enzymen wird gebräuchlicherweise nach der Anson-Haemoglobin-Methode (M.L. Anson J. Gen. Physiol. 22, 79 (1939) bzw. nach der Löhlein-Volhard-Methode (die Löhlein-Volhard′sche Methode zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität. Gerbereichem. Taschenbuch. Dresden-Leipzig, 1955) als "LVE" (Löhlein-Volhard-Einheit) bestimmt.
• Unter einer Löhlein-Volhard-Einheit ist diejenige Enzymmenge zu verstehen, die unter den spezifischen Bedingungen der Methode 1,725 mg Casein verdaut. Weiter werden im folgenden für die Aktivitätsbestimmung der im sauren Bereich wirksamen Enzyme Einheiten verwendet, die aus der Anson-Methode abgeleitet sind. Diese werden als "Proteinase-Units (Haemoglobin)" U_HB bezeichnet. Eine U_Hb entspricht der Enzymmenge, welche die Frei­ setzung von trichloressigsäure-löslichen Bruchstücken aus Haemoglobin äquivalent 1 µMol Tyrosin pro Minute bei 37 Grad C (gemessen bei 280 nm) katalysiert. (1 mU_Hb = 10^-3 U_Hb.)
• B) Amylasen (E.C. 3.2, Vgl. Ullmann, loc.cit Bd. 10, S. 506-510, und B. Spencer, Industrial Aspects of Biochemistry loc.cit, pp 143-144, 175).
• α) Endo-Amylasen
• α₁) α-Amylasen (α-1,4-Glucanhydrolasen) (E.C.3.2.1.1)
• α₂) α-1,6-Glucanhydrolasen
• β) Exo-Amylasen (saccharogene Amylasen)
• β₁) β-Amylasen (α-1,4-Glucanmaltohydrolasen) (E.C. 3.2.1.2)
• β₂) Glucamylasen (α-1,4-Glucan-Glucohydrolasen) (E.C.3.2.1.3)
• α-Amylasen kommen bekanntlich u. a. in Pflanzen zusammen mit β-Amylasen vor. Die technische Gewinnung erfolgt z. B. aus Pankreasdrüsen und aus Bakterien- und Pilzkulturen.
• Besonders günstig ist die Herstellung aus Bacillus- Arten wie B. subtilis, B. mesentericus, B. polymixa, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, ferner aus Pilzen, insbesondere Aspergillus-Arten wie A. niger, A. phoenicis, A. oryzae, A. awamori, Mucor-Arten wie M. rouxianus, Rhizopus-Arten wie R. delemar, R. oryzae, R. Japonicus, und Endomyces-Arten wie E. fibuliger. Das pH-Optimum der α-Amylasen liegt überwiegend im Bereich von 4,7 bis 7,2. Amylasen finden u. a. Anwendung auf dem Ernährungssektor [Vgl. H.-J. Rehm & G. Reed Ed. "Biotechnology" Vol. 5, Verlag Chemie 1983; B. Spencer, Ed. Industrial Aspects of Biochemistry; Vol. 30, part I, pp. 139-186, 213-260, Elseviers (1973)] in der Stärkeverflüssigung, Malzgewinnung, in der Ethanolge­ winnung, Entschlichtung, in der Lederherstellung u.ä. Die Aktivität von α-Amylasen unter Verwendung von Stärke als Substrat kann nach der Methode von Sandstedt, Kneen & Blish (Cereal Chem. 16, 172 (1939) und Technical Bulletin Nr. 1024, U.S. Dept. of Agriculture) bestimmt werden. Dabei ist 1 Amylasen­ einheit (= 1 SKB-Einheit) diejenige Enzymmenge, die bei 30 Grad C und den im übrigen gegebenen Reaktionsbe­ dingungen instande ist, 1 g lösliche Stärke im Laufe von 1 Stunde zu dextrinieren.
• Ferner wird die Methode von Willstätter zur Bestimmung der Aktivität der Pankreas-Amylase herangezogen (Hoppe- Seylers, Z. physiol. Chem. 126, 143 (1923). Dabei wird eine Willstätter-Amylase-Einheit als das Hundertfache derjenigen Enzymmenge definiert, die unter den gegebenen Versuchsbedingungen die Stärke mit einer solchen Geschwindigkeit spaltet, daß die monomolekulare Reaktionskonstante gleich 0,01 ist.
• C) Lipasen (E.C.3.1.1.3)
  Als Lipasen werden bekanntlich Carboxylesterasen bezeichnet, die Glycerinester in wäßriger Emulsion spalten. Sie unterscheiden sich insofern von anderen Carboxylesterasen, die das Substrat in wäßriger Lösung spalten.
• α) Pankreas-Lipasen
  Der pankreatische Enzymkomplex enthält neben Lipasen meist Esterasen sowie Proteasen und Amylasen als technisch wichtige Begleitenzyme. Das pH-Optimum (gegenüber Olivenöl) liegt im Bereich 7-8,5 der Aktivitätsbereich liegt bei pH 6,5-9,5.
• Lipasen sind i.a. sehr instabil, insbesondere gegenüber proteolytischem Abbau durch Begleit­ proteasen.
• β) Mikrobiologische Lipasen
  z. B. aus Pseudomonas fragi, Aspergillus sp. (z. B. A. luchuensis) Candida cylindracea, Geotrichum candidum, Humicola lanuginosa, Mucor pusillus, Penicillium sp. (z. B. chrysogenum, P. oxalicum, Rhizopus sp. (R. nigricans, R. oryzae)
  Diese Lipasen weisen in der Regel mindestens ein pH- Optimum bei pH < 7,0. Lipasen finden, soweit ihre Instabilität dies zuläßt, Verwendung u. a. in der Abfallbeseitigung, Lederindustrie und in der Ernährungsbranche.
• D) Katalasen/Hydroperoxidasen (E.C. 1.11.1.6)
• α) aus tierischem Gewebe z. B. aus Leber
• β) aus Pflanzen z. B. aus Meerrettich
• γ) aus Mikroorganismen z. B. aus Micrococcus lysodeicticus
  Katalasen finden Anwendung zur Peroxid-Bleichung und in der Milchindustrie.
• E) Cellulasen [E.C. 3.2.1.4] (Vgl. Ullmann loc.cit, pp. 510-511)
• Cellulase ist bekanntlich ein Enzymkomplex, dessen Komponenten sukzessive am Abbau der nativen Cellulose beteiligt sind.
• Cellulasen finden sich in Insekten, Mollusken und Mikroorganismen (Bakterien/Schimmelpilzen) Kommerziell genutzte Quellen für Cellulasen sind insbesondere Aspergillus-, Neurospora-, Rhizopus-, Trichoderma- und Trametes-Arten.
• Das Wirkungsoptimum technischer Präparate liegt zwischen pH 4-6. Cellulasepräparate des Standes der Technik verlieren bei kühler und trockner Lagerung ca. 10-20% ihrer Aktivität pro Jahr.
• Cellulasen finden technisch Anwendung in der Nahrungs­ mittelindustrie zur Umwandlung cellulosehaltiger Abfallstoffe u. a.

Die vorliegende Erfindung sei am Beispiel der Verwendung von Enzymen in der Lederherstellung näher erläutert. Die Anwendung von Enzymen, insbesondere von proteolytischen Enzymen ist seit der Einführung der enzymatischen Beize/tryptische Verdauungsenzyme der Bauchspeicheldrüse in der OROPON®-Beize durch Dr. Otto Röhm (DE-PS 2 00 519) vor rd. 80 Jahren fester Bestandteil der Lederherstellung, insbesondere der Wasserwerkstatt:
Neben den Anwendungen in der Beize (DE-PS 9 27 464; DE-PS 9 76 107; DE-PS 9 41 811; DE-PS 9 74 813, DE-PS 9 75 095; DE-PS 9 76 928; DE-PS 11 20 066; DE-PS 11 34 474; DE-PS 12 19 620; DE-PS 12 82 837; US-PS 3 939 040; US-PS 4 273 876) finden Enzympräparate auch Anwendung in der Weiche (DE-PS 2 88 095; DE-PS 9 76 662; DE-PS 10 22 748; DE-PS 10 34 317, DE-PS 12 82 838, DE-PS 20 59 453, US-PS 4 278 432, US-PS 4 344 762) bei der Haarlockerung und dem Hautauf­ schluß (US-PS 4 294 087).

Zur Enthaarung (DE-PS 10 26 038, DE-PS 12 11 349, DE-PS 11 55 560, DE-PS 12 30 169, DE-PS 12 88 728, US-PS 3 623 950) und im Äscher (DE-PS 10 23 183; DE-PS 12 03 416, DE-PS 20 53 016, DE-OS 34 29 047) im Pickel (DE-PS 8 47 947, DE-PS 9 41 680) oder in einem Kompaktverfahren (US-PS 3 986 926, US-PS 3 986 926, US-PS 3 966 551),
zur Naßentfettung (DE-A 33 12 840),
zur Lockerung des Fasergefüges von Rauchwaren (US-PS 3 549 495; US-PS 3 558 430) usw. Ferner dienen Enzympräparationen zum Auflösen von Maschinenleimleder u. sonstigen Nebenprodukten der Leder­ herstellung (US-PS 4 210 721, CH-PS 631 486, US-PS 4 293 647, US-PS 4 220 723) von keratinhaltigen Rohstoffen (US-PS 4 232 123) von elastinhaltigen Präparaten (US-PS 4 179 333) zur Aufarbeitung von kollagenhaltigem Rohmaterial (US-PS 4 220 714) u.ä.

In Anlehnung an die vorstehend genannten, enzymatischen Verfahren können Enzym-Flüssig-Formulierungen entsprechend den vorliegenden Ansprüchen in den einzelnen Schritten der Lederherstellung eingesetzt werden (Vgl. Ullmanns Encyclopädie der Techn. Chemie, 3. Auflage, Bd. 11, S. 609, Urban /Schwarzenberg, Ullmanns Encyclopädie der Techn. Chemie, 4. Auflage, Bd. 16, S. 111-174, Verlag Chemie, 1978, F. Stather, Gerbereichemie und Gerbereitechnologie, 4. Auflage, Akademie-Verlag Berlin 1967)

• I) In der Weiche
• II) Bei der Haarlockerung, im Äscher und in der Enthaarung
• III) Bei der Entkälkung und in der Beize und gegebenenfalls
• IV) Im Pickel

Zu I.) Die Weiche

Die Weiche von Hautmaterial bei der die bei der Salz­ konservierung eintretende Verhärtung der Häute rückgängig gemacht wird, wird üblicherweise bei pH 7,0 bis 10,0 durchgeführt. Die Mitverwendung von Enzymen, insbesondere von proteolytischen Enzymen [siehe A)] beschleunigt die Weichwirkung durch "Verdauen" der wasserlöslichen und sonstigen Eiweißkörper, die nicht zum kollagenen Faser­ gefüge der Haut gehören.

Im allgemeinen finden in der Weiche Enzyme mit dem Wirkungsbereich (bzw. pH-Optimum der proteolytischen Wirkung) bei pH 7,0-10,0 Anwendung. Mit der Entfernung der nicht-kollagenen Eiweiße wird eine schnellere und intensivere Benetzung des Haut gewährleistet. Vorteilhafterweise wird das Weichwasser leicht alkalisch gestellt, jedoch muß der pH-Wert stets < 12 bleiben. Außerdem sind Weichhilfsmittel (wie z. B. Monoethanolamin mit Antiseptikum wie Zephyrol oder Naphthalinsulfosäure in Kombination mit substituierten Phenolen; hochsulfierter Ricinolsäurebutylester mit Methylhexalin; Fettalkohol­ sulfate mit Lösungsmittel) in den üblichen Konzentrations­ bereichen (10-1000 g/l) vorteilhaft. Als enzymatische Zusätze in den erfindungsgemäßen Enzym-Flüssig-Formulie­ rungen kommen z. B. die vorstehend unter A) genannten Proteasen insbesondere die unter A)c) genannten Proteasen in Frage: speziell mikrobielle Proteasen im Wirkungsbereich 4-9,5, insbesondere Pilzproteinasen, z. B. aus Aspergillusarten wie A. saitoi und A. usamii, insbesondere saure Proteinasen mit pH-Wirkungsbereich 2,5 bis 4,5, weiter solche aus A. oryzae mit pH-Wirkungsbereich 4,0-9,5, ferner aus A. niger und A. flavus mit pH- Wirkungsbereich 9,5-11,0.

Im allgemeinen liegt die Konzentration proteolytischer Aktivitäten der verwendeten Proteinasen im Bereich 0,1- 1,0, Anson-Einheiten bzw. 1000 bis 3000 Löhlein-Volhard- Einheiten pro l Weichbrühe.

Schließlich können die Weichbrühen noch Amylasen gemäß B) enthalten. Die Amylasen treten z. B. als Begleit­ enzyme von Pilzproteinasen auf. Sie begünstigen die Spaltung glykosidischer Bindungen bei den Proteoglykanen und Glykoproteinen der Haut.

Insbesondere eignen sich Amylasen mikrobiellen Ursprungs, besonders solche aus Aspergillus-Arten wie A. oryzae und A. niger speziell solche mit einem pH-Wirkungsbereich von 3,0-5,8, außerdem solche bakteriellen Ursprungs wie z. B. aus Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. polymixa mit einem Wirkungsbereich von 5,0-7,0.

Im allgemeinen liegen die glykolytischen Aktivitäten der Amylasen im Bereich von 500-2000 SKB.

Die Temperatur der Weichbrühen liegt vorteilhaft bei < 20 Grad C. Die Weichdauer ist möglichst kurz zu bemessen, sie liegt im allgemeinen zwischen 4 und 36 Stunden.

Zu II) Haarlockerung, Äscher, Hautaufschluß

Zur Enthaarung werden meist Äscher benutzt (Vgl. Ullmann loc.cit., 3. Auflage Bd. 11, S. 560; 4. Auflage Bd. 16, S. 118-119. Man arbeitet durchweg mit sogenannten ange­ schärften Äschern, vorzugsweise einer Kombination von Calciumhydroxid und Natriumsulfid und in Anwesenheit von puffernden, quellungshemmenden Äscherhilfsmitteln (z . B. Netzmittel, insbesondere kationenaktive Netzmittel in Kombination mit Monoethanolamin und Desinfektionsmittel wie quartäre Alkyl-dimethyl-benzylammoniumverbindungen, bzw. Dialkylamin und dessen Sulfat). Für die Haarlockerung und den Hautaufschluß können Enzyme neben den üblichen Äscher­ chemikalien verwendet werden, die in diesem pH-Bereich genügend stabil bleiben. Die Weiche und der Äscher lassen sich durch allmähliches Ansteigen des pH-Wertes und Einsatz entsprechender Enzyme zusammenfassen.

Die Anwendung der Enzyme im Zusammenhang der Äscher/Haar­ lockerungs-/Enthaarungswirkung geschieht im allgemeinen im pH-Bereich von 9-13, speziell 9-12.

Im Anschluß an die DE-A 29 17 376 bzw. US-A 4 294 687 kann die vom Konservierungssalz befreite Haut zunächst im sauren pH-Bereich mit Disulfid-brücken-spaltenden Substanzen vorbehandelt und anschließend ohne vorhergehende Weiche unter Verwendung von im alkalischen Bereich wirksamen Proteasen bei einem pH-Wert von ca. 11-13 Haarlockerung und Hautaufschluß gleichzeitig herbeigeführt werden. Es folgen dann die weiteren, in der Wasserwerkstatt üblichen Bearbeitungsschritte III) und gegebenenfalls IV). Zweckmäßigerweise werden in den Operationen der Wasser­ werkstatt unter II) alkalische Proteasen vom Typ i) (s. oben) angewendet, insbesondere alkalische Bakterienproteinasen (Serin-Proteasen), beispielsweise aus B. subtilis, B. licheniformis, B. firmus, B. alcalophilus, B. polymixa, B. mesenthericus.

Diese Proteasen haben im allgemeinen eine Aktivität die zwischen 8000 und 10 000 Löhlein-Volhard-Einheiten (LVE) pro Gramm liegt. Man verwendet sie zweckmäßig in Mengen, die bei 0,1-10 Gew.-%, vorzugsweise 1-5 Gew.-% bezogen auf das Gewicht der gesalzenen Häute und Felle (Rohgewicht) ausmachen.

Die enzymatische Reaktion bei der Haargewinnung/Hautauf­ schluß führt man bei ca. 18-28 Grad C durch, wobei die Reaktionszeiten i.a. zwischen 12 und 24 Stunden, speziell bei 12-16 Stunden liegen.

Enthaarung bzw. Entwollung kann auch mit alkalischen Pilzproteinasen vom Typ i) durchgeführt werden, beispiels­ weise mit Aspergillus-Proteasen, insbesondere aus A. niger und A. flavus mit einem Wirkungsbereich bei pH 9,5 bis 11,0.

Weiter ist das enzymatische Enthaarungsverfahren nach DE-A 34 29 047 anwendbar, demzufolge Häute und Felle in einer Flotte im pH-Bereich von 9-11 mit solchen proteolytischen Enzymen behandelt wurden, deren Wirkungs­ optimum in einem pH-Bereich von 2 bis 7,5 liegt und man die Enthaarung durchführt. Zur Anwendung kommen somit Proteasen vom Typ iii) (s. oben) insbesondere aus A. oryzae, A. saitoi, A. parasiticus, A. usamii, A. awamori, aus Paelomyces sp. aus Penicillium sp. auch Rhizopus sp. und/oder aus Mucor pusillus, sowie die sauren Proteasen unter A)a) und A)b) (s. oben).

Am allgemeinen werden 0,5 bis 6 Gew.-% vorzugsweise 1,0 bis 3 Gew. -% bezogen auf das Gewicht der gesalzenen Häute oder Felle angewendet. Dabei liegt die Aktivität im allgemeinen im Bereich von 50 bis 200 mU_Hb.

Zu III)

Bei der Entkälkung und in der Beize finden bevorzugt Enzyme Anwendung. Die Entkälkung dient dazu, die Alkalität der Blößen von pH-Werten von 13-14 auf pH-Werte im Bereich 7-8 herabzusetzen. Zum Entkälken sollen vorzugsweise keine stark dissoziierten, sondern schwache organische Säuren, z. B. vom Typ der Dicarbonsäuren oder schwachsauren Salze verwendet werden. Bei der Beize sollen Epidermis-, Haar- und Pigmentreste entfernt und ein zusätzlicher Haut­ aufschluß bewirkt werden. Außerdem werden nicht-kollagene Eiweißbestandteile entfernt (Vgl. Ullmann, 4. Auflage, Bd. 16 loc.cit S. 119-120) Bei der Beize wird konventionell bei pH 7,5 bis 8,5 gearbeitet. Aus der DE-A 31 08 428 ist die Anwendung cyclischer Carbonate in der Entkälkung bekannt.

Gleichzeitig können bei der Beize auch Lipasen gemäß C., beispielsweise Pankreas-Lipasen mit einem Wirkungsbereich bei pH 7,0-9,0 eingesetzt werden.

Auch Amylasen gemäß B., beispielsweise Pankreas-Amylasen, mit einem Wirkungsbereich bei pH 5,5-8,5, welche die Spaltung glykosidischer Bindungen bei der Beize begünstigen, sind (vor allem als Begleitenzyme von Trypsin und Chymotrypsin) von günstigem Einfluß auf die Beize.

Zu IV) Im Pickel

Bekanntlich muß die Blöße zur Vorbereitung auf die mineralische Gerbung sauer gestellt werden, d. h. vom pH- Wert von ca. 8 auf 3-4 gebracht werden. Dies geschieht z. B. im Pickel, der eine Säure/Salzlösung in Wasser darstellt, beispielsweise Schwefelsäure oder Ameisensäure zusammen mit Kochsalz.

Empfohlen werden z. B. Schimmelpilztryptasen, Pankreas­ tryptasen und Bakterientryptasen gegebenenfalls zusammen mit Kohlehydrat-spaltenden Enzymen, insbesondere aus Bakterien oder Schimmelpilzen.

Vorteilhafte Wirkungen

Die Flüssig-Formulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung bieten eine verallgemeinerungsfähige und relativ problem­ lose Lösung der vielfach vorhandenen, wenn auch nicht immer ausgesprochenen Aufgabe, nämlich flüssige Enzymformulie­ rungen zur Anwendung bringen zu können. Vorteilhaft ist auch die Möglichkeit Enzyme mit anderen Komponenten zur kombinieren, die in wäßrigem Milieu und bei längerer Einwirkungsdauer die Enzymwirkung beeinträchtigen. Dies gilt vor allem für die Kombination verschiedener Enzyme, z. B. von Proteasen mit Amylasen, Lipasen, u.ä., aber auch mit Hydrotropica wie z. B. Harnstoff, Guanidiniumsalze, Cumolsulfonat etc.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der erfindungsgemäßen Flüssig-Formulierungen und ihrer Anwendung.

Beispiele Beispiel A Herstellung einer flüssigen Enzympräparation auf Basis Pankreas- und Pilzenzym.

700 g Propylencarbonat (0,6% Wasser) werden nach Zusatz von 3,5 g eines organisch modifizierten Betonits (z. B. Betone 27, Fa. Kronos/Titan Leverkusen) 45 bis 60 Minuten lang bei einer Umdrehung von 16 m/Sek. in einem Zahnscheibenrührer dispergiert (Scheibe: Gefäß = 1 : 2,5; Einfüllhöhe ist das 2 bis 2,5fache des Scheibendurchmessers, der Bodenabstand des Rührers ist der halbe Scheibendurchmesser).

Unter weiterem Dispergieren werden 2,54 g eines Pilzproteasekonzentrates aus Aspergillus parasiticus (pH- Optimum 7,5-9) (150 000 LVE) und 1,48 g eines Pankreasenzympräparates (pH-Optimum 6-8) (220 000 LVE) zugegeben. Bei gleichbleibender Drehzahl wird weitere 30 Minuten lang dispergiert, wobei darauf zu achten ist, daß die Temperatur 40 Grad C nicht überschreitet. Das Endprodukt hat eine Aktivität von 1000 LVE und nach 4 Wochen bei 20 Grad C keinen Aktivitätsabfall. Das Produkt zeigt keine Aufrahm- bzw. Absetzerscheinungen des Enzyms.

Entsprechend der Art des Lösungsmittels, der Korngröße und der Konzentration des Enzymkonzentrates müssen die Dispergierbedingungen (Drehzahl) und der Typ des organisch modifizierten Bentone geändert werden.

Beispiel B

Kombinierte Entkälkung und Beize mit einem flüssigen Enzym­ produkt auf Basis Pankreas- und Pilzenzym in Propylen­ carbonat.

10 kg geäscherte und gewaschene Rindsblößen, Spaltstärke 3 bis 4 mm, 30% Wasser, Temperatur 35 Grad C, 3% Enzym­ lösung auf Pankreas- und Pilzenzymbasis in Propylencarbonat wie in Beispiel A (Aktivität 1000 LV/g), 0,2% nichtionogenes Netzmittel auf Basis Fettalkoholethoxylat mit 8 bis 9 mol Ethylenoxyd.

Nach 80 Minuten ist die Blöße vollständig durchentkälkt sowie Grund und Gneist hervorragend gelockert. Der End-pH der Flotte liegt bei 8,0. Während der Entkälkung entweicht kein giftiger Schwefelwasserstoff, da der pH nie unter pH 8,0 fällt.

Beispiel C

920 g Butylglykol und 40 g Petroleum Kp 110-130 werden nach Zusatz von 30 g eines organisch, modifizierten Bentonits (z. B. Bentone 27, Firma Kronos-Titan, Leverkusen) 38 Minuten lang in einem Ultra-Turrax-Rührer mit 16 m/sec. dispergiert.

Die Dispersion läßt man 24 Stunden stehen. Unter obigen Dispersionsbedingungen werden nun 18,5 g einer neutralen Protease aus einem Bazillus subtilis-Stamm (pH-Optimum 5,5-7) (70.000 LVE/g) zugegeben. Man dispergiert insgesamt weitere 5 Minuten. Das Endprodukt hat eine Aktivität von 1300 LVE. Nach 5 Wochen ist kein Aktivitätsabfall in der LVE-Messung zu beobachten. Die Enzymflüssigformulierung bleibt homogen ohne abzusetzen bzw. aufzurahmen.

Beispiel D Enzymatische Weiche und Entfettung von schmutzgeweichten Rindshäuten

Prozentangaben auf Salzgewicht:

100,0 kg schmutzgeweichte Rindshäute,
200,0% Wasser mit T = 26 Grad C
0,8% Enzymflüssigformulierung aus Beispiel C,
0,4% nichtionogenes Netzmittel auf Basis Fettalkohol­ ethoxylat mit 6 Mol Ethylenoxid,
0,2% eines Bakterizids auf Basis Chloracetamid.

Nach 5 Stunden Weichdauer sind die Häute völlig zurückgeweicht und gleichzeitig zur Haarlockerung bereit. Ein großer Teil des Naturhautfetts ist in der Weichflotte emulgiert.

Die auf obiger Art und Weise geweichten Häute werden nach bekannten Verfahren geäschert und zum Crustleder für Schuhe weitergearbeitet.

Beispiel E

1000 g Petroleum Kp 110-130 Grad C werden auf 40 Grad C erhitzt und nach Zusatz eines organisch modifizierten Bentonits (z. B. MPA-X-2000, Firma Kronos-Titan, Leverkusen) 10 Minuten lang dispergiert, dann werden 2,5 g einer sauren Pilzprotease (pH-Optimum 3,5-5) aus Aspergillus parasiticus (80 000 LVE/g) zugesetzt und weitere 5 Minuten dispergiert.

Man erhält eine flüssige Enzymformulierung mit einer Aktivität von 200 LVE, welche nach 4 Wochen bei 20 Grad C keinen Aktivitätsabfall zeigt. Die Lösung ist homogen und rahmt weder auf noch setzt sie ab.

Beispiel F

Entfetten und enzymatische Auflockerung von Schaf- und Lammpickelblößen.

Aufwalken (Prozentangaben auf Pickelgewicht)

200% Wasser 35 Grad C, 15% Kochsalz, 5 Minuten bewegen, 10 kg Pickelblößen zugeben und 30 Minuten bewegen, entfleischen, Flotte ablassen.

Entfetten (Prozentangaben auf Entfleischgewicht)

30% Wasser, 35 Grad C, 2% eines nichtionogenen Netzmittels auf Basis Fettalkoholethoxylat (6-8 Mol Ethylenoxid), 6% des Flüssigenzyms aus Beispiel E (200 LVE/g), 8 kg Pickelblöße, 30 Minuten bewegen.

Die Blößen sind durch die Wirkung der Kombination Enzym/Tensid/Petroleum gut entfettet und aufgelockert.

Zur Entpicklung können in verlängerter bzw. neuer Flotte handelsübliche Entpickelungsgerbstoffe zugegeben werden und kann in bekannter Weise weitergearbeitet werden.

Beispiel G

In einem Rührkessel werden 927,5 g eines nichtionogenen wasserfreien Netzmittels auf der Basis Nonylphenol + 8,5 Mol Ethylenoxid mit 12 g Aerosil 38® (Fa. Degussa, Hanau, W-Germany, hochdisperses amorphes Siliziumdioxid) versetzt sowie 5 g Borchigen STL® (Netz- und Aufschlußmittel, Basis modifizierte Fettsäure, Borchers, Goslar, W-Germany) 15 Minuten lang bei 15-18 m/sec mit einem Zahnscheibenrührer dispergiert. Die Viskosität steigt von 15 mPas auf 255 mPas. (Bestimmung mit dem Brookfield- Viscometer, Bedingung I/6 upm). Nun wird 55,5 α-Amylase- Konzentrat (90 000 SKB/g (SKB-Analyse siehe Sandstedt, R.M.E., E. Kneen und M.J. Blish, Cereal Chem. 16, 712 (1939) gewonnen aus Bacillus subtilis) zugegeben. Man dispergiert weitere 15 Minuten.

Die flüssige Fertigformulierung mit einer Ausgangsstabilität von 5000 SKG/g hat nach 4 Wochen weder abgesetzt noch aufgerahmt. Der Aktivitätsverlust bei Lagerung bis 25 Grad C beträgt 3,4%.

Beispiel H Enzymatisches Vorweichen von Jeansstoffen

10 kg Denimgewebe (Jeansstoffe), welches mit einer Stärkeschlichte behandelt ist, wird in 50 l Wasser bei 40 Grad C gegeben. Nach Zusatz von 50 ml des Produktes aus Beispiel G wird die Temperatur innerhalb 10 Minuten auf 60 Grad C erhöht und das Gewebe 5-10 Minuten lang gewaschen und anschließend mit je 50 l Wasser von 40 Grad C zweimal gespült. Ein zusätzlicher Waschvorgang mit einem Netzmittel zur Entfernung der Stärkeabbauprodukte entfällt. Das entschlichtete Gewebe hat einen schönen weichen Griff.

Beispiel I Flüssiges, biologisch abbaubares Grobwaschmittel

In einem Rührkessel werden 466 g 1,2-Propylenglykol, 400 g nichtionisches Tensid Marlipal 013-90® (Isotridecylalkohol + 9 Mol Ethylenoxid, Produkt der Chemischen Werke Hüls, W- Germany), 100 g Ethylalkohol (98%ig) mit 10 g Aerosil 380® (hochdisperses Siliziumdioxid, Degussa, W- Germany) und 4 g Borchigen STL® (Netz- und Aufschlußmittel auf Basis modifizierter Fettsäuren (verethert) Fa. Borchers, Goslar, W-Germany) 15 Minuten lang bei 15- 18 m/sec mittels eines Zahnscheibenrührers dispergiert. Die Viskosität steigt auf 1250 mPas. Nun werden in folgender Reihenfolge unter weiterem Dispergieren folgende Festprodukte zugegeben:

6 g alkalische Protease (aus Bacillus subtilis, Aktivität 92 000 LVE/g)
4 g α-Amylase (aus Bacillus subtilis, 90 000 SKB/g
6 g optischer Aufheller (4,4′-Bis-(4-amino-6-[N-(2- hydroxyethyl)-N-(2-carbamoylethyl)-amino]-S-triaxin- 2-yl-amino-2,2′-stilben-disulfonsäure
2 g Na-Salz von EDTA (Ethylendamin-tetraessigsäure)
6 g -C₉-C₁₂-Olefinsulfonat Na-salz (98%).

Nach erfolgter Zugabe wird weitere 15 Minuten dispergiert. Die erhaltene dickflüssige, gut gießbare Lösung hat nach 4 Wochen Lagerzeit bei 25 Grad C weder abgesetzt noch aufgerahmt.

Der Aktivitätsverlust α-Amylase betrug nach 4 Wochen bei 25 Grad C 1%, die Protease hatte 1,4% an ihrer Ausgangsaktivität verloren.

Beispiel J Weiche eines blutverschmierten Baumwollgewebes bei 60 Grad C

500 g weißes Baumwollgewebe, welches mit Rinderblut getränkt und getrocknet wurde, wird in 2,5 l Wasser mit 6 g Flüssigwaschmittel (Lagerzeit 3 Monate) aus Beispiel I und 2 g Natrium-metasilikat 15 Minuten bei 60 Grad C behandelt und anschließend 2 × bei 30 Grad C mit 2,5 l Wasser gewaschen.

Im Vergleich dazu wurde dasselbe Gewebe unter gleichen Bedingungen mit ebenfalls 6 g eines Flüssigwaschmittels gleicher Lagerzeit behandelt, welches identisch ist mit Beispiel I, jedoch wurde anstelle von 1,2-Propylenglykol Wasser verwendet.

Die Auswertung der beiden Versuchsgewebe im Remissionsphotometer ELREFOMAT DFC 5® (Zeiss, W-Germany) ergab für die Behandlung mit dem wasserfreien Waschmittel ein um 46% bessere Entfernung des Bluts vom Gewebe.

Beispiel K Herstellung eines flüssigen Lipaseproduktes

In einem Rührkessel werden 968 g Genapol 0-050® (C₁₆- C₁₈-Fettalkohol mit 5 Mol Ethylenoxid, Hoechst AG, W- Germany) mit 12 g Aerosil 380® (hochdisperses Siliciumdioxid, Degussa, W-Germany) und 4 g Borchigen STL® (Netz- und Aufschlußmittel auf der Basis modifizierter Fettsäuren, Borchers, Goslar, W-Germany) 15 Minuten bei 15-18 m/sec mit einem Zahnscheibenrührer dispergiert. Die Viskosität steigt von 18 mPas auf 290 mPas an. Nun werden 16 g eines Lipasekonzentrats (aus Pseudomonas spez. Aktivität 5 000 LCA/mg, Definition und Bestimmung von LCA- Einheiten: Sem´riva, Biochem. 10, 2143 (1971) zugegeben und 10 Minuten weiterdispergiert.

Man erhält ein flüssiges Enzymprodukt mit 80 LCA/mg Aktivität, welches nach 6 Wochen Lagerung bei 25 Grad C weder abgesetzt noch aufgerahmt hat. Die Aktivität nach dieser Lagerzeit beträgt noch 77-78 LCA/mg.

Beispiel L Verseifung von Rindertalg

400 g Rindertalg und 600 g Wasser werden mit 5 g Lipaseprodukt aus Beispiel K bei 50 Grad C emulgiert und 3 Stunden lang bei dieser Temperatur gerührt. Nach dieser Zeit wird durch Titration der durch Hydrolyse freigesetzten Fettsäuren (JUPAC-Standard Methods of oils, Fats and Derivatives, Pergamon Press, Oxford, 6th edition, pg. 56, 1979) ein Hydrolysegrad von 72% festgestellt.

Beispiel M Herstellung eines flüssigen Cellulase/Hemicellulasepräparates

In einem Rührkessel werden 882 g Ethylenglykol mit 13 g Aerosil 200® (hochdisperses Siliziumdioxid, Hoechst AG, W- Germany) und 5 g Borchigen STL® (Netz- und Aufschlußmittel auf der Basis modifizierte Fettsäure, Fa. Borchers, Goslar, W-Germany) 10 Minuten bei 15-18 m/sec Umdrehungsgeschwindigkeit mit einem Zahnscheibenrührer dispergiert. Die Viskosität steigt von 35 mPas auf 330 mPas. Nun werden 100 g eines Cellulase/Hemicellulase Konzentrats (aus Trichoderma viridi, Aktivität 10 000 FPU/g, FPU-Einheit: Mandels, M., Andreotti, R., and Roche C., (1976) Biotech. Bioemp. Symp. 6, 17) zugegeben und weitere 10 Minuten dispergiert.

Man erhält ein viskoses, homogenes Enzymprodukt (2600 mPas) 1000 FPU/g, welches nach 5 Wochen Lagerzeit bei 25 Grad C weder abgesetzt noch aufgerahmt hat. Die Aktivität nach dieser Lagerzeit beträgt 95%.

Beispiel N Cellulase/Hemicellulasen für die Glutenfiltration

10 kg Glutensuspension (Trockengehalt ∼30%), welche durch Zentrifugation von Maisstärke getrennt wird, wird mit 3 g des Cellulaseproduktes 1 Stunde bei 40 Grad C behandelt. Polysaccharide, welche die Filtration behindern, werden abgebaut und eine schnellere und einfachere Filtration auf dem Vakuumdrehfilter ist das Ergebnis.

Beispiel O

In einem Rührkessel werden 975 g Glycerin (Wassergehalt 1%) mit 20 g Aerosil 380® (hochdisperses Siliziumdioxid, Degussa, W-Germany) 15 Minuten lang mit einem Zahnscheibenrührer (Umdrehungsgeschwindigkeit 15- 18 m/sec dispergiert. Man gibt nun 5 g eines Pectinase- Konzentrats (aus Aspergillus oryzae, Aktivität 100 000 PGU/mg, Definition und Bestimmung PGU-Einheit, vgl. Röhm - Analysenvorschrift PZV-30) zu und dispergiert weitere 10 Minuten.

Man erhält ein flüssiges, gut gießbares, homogenes Pectinaseprodukt mit 5000 PGU/mg Aktivität, welches nach 6 Wochen Lagerung bei 25 Grad C weder aufgerahmt noch abgesetzt hat.

Die Aktivität nach dieser Lagerzeit beträgt noch 97% des Ausgangswertes.

Beispiel P Pectinasen zur Saftklärung

1000 l frisch abgepreßter Apfelsaft werden mit 50 g des Pectinaseproduktes aus Beispiel O behandelt. Es erfolgt der Abbau von Pectinen sowie von kolloidalen Substanzen, welche in den Trubpartikeln sitzen. Diese Kolloide stören bei der Trubflockung, bzw. bei einer Klärung durch Ultra- oder Mikrofiltration. Nach 2 Stunden Behandlung wird durch Zugabe von Bentoniten eine Trubflockung durchgeführt. Der anschließende Filtrationsprozeß gestaltet sich leicht und unproblematisch.

Beispiel Q Flüssiges Hilfsmittel für die enzymatische Weiche

In einem Rührkessel werden 300 g nichtionisches Tensid auf der Basis C₁₃-Oxo-alkohol + 6 Mol Ethylenoxid und 682 g nichtionisches Tensid, Basis C₁₃-Oxoalkohol, + 9 Mol Ethylenoxid mit 13 g Aerosil 380® (hochdisperses Siliziumdioxid, Degussa, W-Germany) und 5 g Borchigen STL® (Netz- und Aufschlußmittel auf Basis einer modifizierten Fettsäure, Fa. Borchers, Goslar, W-Germany) 15 Minuten lang mit einem Zahnscheibenrührer bei 15-18 m/sec Umdrehungsgeschwindigkeit dispergiert.

Nun werden nacheinander 27,5 g einer alkalischen Protease (aus Bacillus subtilis, Aktivität 80 000 LVE/g) und 10 g einer Pilzprotease (aus Aspergillus parasiticus, 220 000 LVE/g) zugegeben und weitere 10 Minuten dispergiert.

Man erhält ein flüssiges homogenes, gut gieß- und pumpbares Enzymprodukt, welches nach 4 Wochen Lagerzeit weder abgesetzt, noch aufgerahmt hat. Die Aktivität nach dieser Zeit beträgt bei 25 Grad C Lagertemperatur noch 97% der Ausgangsaktivität von 4400 LVE/g.

Beispiel R Enzymatische Weiche von schmutzgeweichten Rindshäuten (Prozentangaben beziehen sich auf Salzgewicht)

100 kg schmutzgeweichte Rindshäute
200% Wasser, 26 Grad C
0,25% Enzymprodukt aus Beispiel Q
0,2% Natronlauge, 50%ig.

Nach 5 Stunden Weichdauer im Faß sind die gesalzenen Häute vollständig zurückgeweicht, von einem Großteil des Hautfetts und Schmutz es befreit und zur Haarlockerung vorbereitet.

Beispiel S Herstellung eines flüssigen Beizmittels mit entkälkender und entfettender Wirkung

In einem Rührkessel werden 400 g Ethylencarbonat eingetragen und mit 300 g Methylethylketon und 264 g nichtionisches Tensid (C₁₆-C₁₈-Fettalkohol mit 9 Mol Ethylenoxid) gemischt, auf 40 Grad C erwärmt und mit 10 g Aerosil 380® (hochdisperses Siliziumdioxid, Degussa, W- Germany) sowie 6 g Borchigen STL® (Borchers, Goslar, W- Germany, siehe Beispiel Q) versetzt. Die Mischung wird 15 Minuten bei 15-18 m/sec Umdrehungsgeschwindigkeit mit einem Zahnscheibenrührer dispergiert.

Die Viskosität steigt von 60 mPas auf 1040 mPas. Nun wird 20 g Pankreasenzym Konzentrat (Aktivität 40 000 LVE/g) zugegeben und weitere 20 Minuten dispergiert. Man erhält eine flüssige, gut gießbare homogene Enzymformulierung, welche nach 5 Wochen Lagerzeit bei 25 Grad C nicht absetzt oder aufrahmt. Die Aktivität nach dieser Zeit bei 25 Grad C beträgt 760 LVE/g.
(Ausgangsaktivität 800 LVE/g).

Beispiel T Enzymatische Beize und Entkälkung von Rindsblößen

10 kg geäscherte und gewaschene Rindsblößen, Spaltstärke 3-4 mm, 30% Wasser, 35 Grad C, 1 Gew.-% Enzymprodukt (800 LVE/g, identisch mit Beispiel S), 2 Gew.-% Ammoniumsulfat.

Nach 70 Minuten ist die Blöße vollständig durchentkälkt, sowie Grund und Gneist hervorragend gelockert. Der End-pH- Wert der Flotte liegt bei pH 7,8. Das Naturfett ist gut aus der Haut entfernt und in der Flotte emulgiert.

Beispiel U

In einem Becherglas werden 984 g 1,2-Propylenglykol (wasserfrei) mit 10 g Aerosil 380® (siehe Beispiel G) und 5 g Borchigen STL® (siehe Beispiel G) 10 Minuten mit einem Zahnscheibenrührer bei 15-18 m/sec Umdrehungsgeschwindigkeit dispergiert. Die Viskosität steigt von 20 mPas auf 310 mPas. Nun wird 1 g Meerrettich- Peroxidase (1000 Units/g, Definition und Bestimmung: Taele, F.W.J., Biochem. Biophys. Acta, 35, 543 (1959) zugegeben und 10 Minuten weiter dispergiert. Man erhält eine flüssig gut fließende Produktformulierung (280 mPas), welche nach 4 Wochen Lagerzeit weder absetzt noch aufrahmt. Die Aktivität ist nach dieser Zeit um 2% zurückgegangen.

Beispiel V Herstellung einer Farbstofflösung (Modellreaktion) Lösung A

1 g m-Phenylendiamin wird in 999 g 0,1 m Phosphatpuffer (0,1 m, pH 7) gelöst.

Lösung B

Wasserstoffperoxid (30%).

Reaktionsdurchführung

1 g des Peroxidaseprodukts aus Beispiel U werden in 1000 g Lösung A gegeben und unter Rühren mit 5 g Lösung B versetzt. Man beobachtet die Bildung eines roten, nach einigen Minuten immer dunkler werdenden Azofarbstoffs.

Claims (26)

1. Flüssigformulierung von Enzymen zur technischen Anwendung, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerflüssigkeit für das Enzym aus wenigstens einem wasserfreien organischen Lösungsmittel besteht und wenigstens einen anorganischen, pulverförmigen Dispergator enthält.

2. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wasserfreien organischen Lösungsmittel ein Molekulargewicht < 110 und einen Siedepunkt unterhalb 300 Grad C Normaldruck besitzen.

3. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gewichtsverhältnis Enzym zu Lösungsmittel von 1 : 10 bis 1 : 500 besteht.

4. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerflüssigkeit aus einem wasserfreien, aber an sich wassermischbaren, organischen Lösungsmittel besteht.

5. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerflüssigkeit aus einem nicht mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmittel besteht.

6. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt an anorganischen pulverförmigen Dispergatoren 0,1 bis 6 Gew.-% bezogen auf die Trägerflüssigkeit beträgt.

7. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die wassermischbaren, organischen Lösungsmittel 1 bis 10 Gew.-% bezogen auf diese an Kohlenwasserstoffen mit 5 bis 20 Kohlenstoffatomen enthalten.

8. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie Tenside in Anteilen von 0,001 bis 50 Gew.-% bezogen auf die Trägerflüssigkeit enthält.

9. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerflüssigkeit aus einem cyclischen Kohlensäureester besteht oder diesen enthält.

10. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerflüssigkeit aus Propylen­ carbonat besteht oder dieses enthält.

11. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme Proteasen (nach E.C.3.4) sind.

12. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme Amylasen (nach E.C.3.2) sind.

13. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme Lipasen (nach E.C.3.1.1.3) sind.

14. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme Katalasen (nach E.C.1.11.1.6) sind.

15. Flüssigformulierung von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme Cellulasen (nach E.C.3.2.1.4) sind.

16. Verwendung der Flüssigformulierungen von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 bis 13 bei der Lederherstellung.

17. Verwendung der Flüssigformulierungen von Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 bis 13 in Wasch- und Reinigungsmitteln.

18. Verwendung der Flüssigformulierungen von Enzymen gemäß Anspruch 11 und 12 bei der Entschlichtung.

19. Verwendung der Flüssigformulierungen von Enzymen gemäß Anspruch 14 zur Peroxidbleichung.

20. Verwendung der Flüssigformulierungen von Enzymen gemäß Anspruch 15 zur technischen Umwandlung cellulosehaltiger Substrate.

21. Verwendung von Flüssigformulierungen der Enzyme gemäß den Ansprüchen 1-12 zur Entkälkung und Beize von Blößen.

22. Verwendung gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die Flüssigformulierungen von Pankreasenzymen einsetzt.

23. Verwendung von Flüssigformulierungen der Enzyme gemäß den Ansprüchen 1-12 zur enzymatischen Weiche von Häuten und Fellen.

24. Verwendung gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man die Flüssigformulierungen von neutralen Proteasen einsetzt.

25. Verwendung von Flüssigformulierungen einer sauren Protease gemäß den Ansprüchen 1 bis 11 zur Entfettung von Blößen.

26. Verwendung gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß man die Flüssigformulierung einer Aspergillus-Protease einsetzt.