FI93656C - Entsyymien nesteformulaatio - Google Patents

Description

93656

Entsyymien nesteformulaatio - Enzymatiskt vätskepreparat

Keksinnön kohteena ovat entsyymien nesteformulaatiot, joissa käytetään vedettömiä orgaanisia liuottimia, parhai-5 ten yhdessä Teologiaan vaikuttavien erityislisäaineiden kanssa. Nämä nesteformulaatiot sopivat erityisesti käytettäväksi nahkateollisuudessa.

Entsyymien teolliseen käyttöön voidaan sanoa nykyään koh-10 distuvan voimakas mielenkiinto, sillä kyseessähän on prototyyppi "pehmeästä" teknologiasta. Teollisten menetelmien, joissa käytetään entsyymejä, laatu ja lukumäärä on vielä rajoitettu. Käytön laajeneminen on kuitenkin odotettavissa (vrt. Ullmann's Encyclopädie der technischen Chemie, side 15 10. s. 522 - 526 ff, Verlag Chemie 1975; Kirk-Othmer,

Encyclopedia of Chemical Technology, 3. painos. Voi. 9,

Sivut 173 - 224, J. Wiley 1980)

Erityisesti mainittuja alueita ovat elintarvike- ja rehu-20 teknologia, pesuaineteknologia ja nahanvalmistus, joilla entsyymejä on jo perinteellisesti pitkään käytetty. Tämän lisäksi voidaan entsyymiä käyttää myös haluttuihin kemiallisiin reaktioihin (vrt. Raul Präwe, Jahrbuch Biotechnologie, 1986/87, Carl Hauser Verlag Munchen, Wiem, 25 s. 359 - 397) .

Teollisesti käytettyjen entsyymien (teollisuusentsyymit = IE) tärkeitä edustajia ovat mm. γ-aminobutyrotransaminaasi, amylaasi, sellulaasi, kollagenaasi, glukoosioksidaasi, glu-30 tamiinihappo-dekarboksylaasi, hemisellulaasi, invertaasi, katalaasi, lipaasi, pektinaasi, penisillaasi, proteaasi, ** streptokinaasi.

Koska mediumit, joissa luonnosta löydetyt entsyymit toimi-35 vat, ovat valtaosaltaan vesipitoisia mediumeja, jolloin usein havaitaan myös tietty riippuvuus pH-arvosta ja vesipitoisen mediumin liuenneista komponenteista, vesipitoista 2 93656 ympäristöä pidetään standardimediumina entsymaattisissa reaktioissa.

Tietyt orgaaniset liuottimet voivat myös muidenkin proteii-5 nien lailla denaturoida polypeptidi-entsyymit, joiden toimivuus näyttää päältäpäin katsoen riippuvan niiden rakenteellisesta organisaatiosta, minkä vuoksi on suositeltavaa pidättyä käyttämästä orgaanisia liuottimia yhdessä entsyymien kanssa. Viime aikoina on esimerkiksi immobilisoiduilla 10 entsyymeillä suoritetuissa tutkimuksissa määritetty vaikutukset, jotka vesiliukoisten orgaanisten liuottimien lisäämisellä vesipitoiseen mediumiin on, ja todettu, että reaktionopeus kasvaa dielektrisyysvakioiden pienentyessä [vrt.

H. Weetall, P. Vann kirjassa "Enzyme Engineering Voi. 4.

15 (toim. G.B.Brown, et ai)" NCI Monograph No. 27 (toim. M.P. Stulberg) (1967) . sivut 141 - 152] .

Kemiallisten aineiden käsittelyssä, erityisesti annostelussa on usein havaittu edulliseksi näiden oleminen nestemäi-20 sessä muodossa. Nestemäisten valmisteiden sekoittamiseen nestemäisiin reaktiomediumeihin liittyy yleensä vähemmän ongelmia kuin jauheiden tai muiden kiinteiden aineiden lisäämiseen. Tämä koskee myös entsyymivalmisteita. Vastaavia suuntauksia on havaittavissa esimerkiksi pesuaineteol-25 lisuudessa. Toisaalta tämän vastapainona on juuri nestemäi-·· sillä entsyymivalmisteilla melkoinen joukko ongelmia.

Ensimmäisenä on tällaisten entsyymivalmisteiden stabiilisuus. Kuten jo on mainittu, entsyymit ovat vesipitoisessa mediumissa alttiina mediumin muiden komponenttien, kuten 30 happojen, emästen, suolojen, pinta-aktiivisten tai komplek-siaktiivisten komponenttien, muiden makromolekyylien, erityisesti muiden entsyymien, jne. vaikutuksille. Nämä lisäaineet voivat vaikuttaa sekä stabiloivasti että desta-biloivasti. Määrättyjä entsyymejä vesiliuoksessa stabi-35 loiviksi lisäaineiksi on ehdotettu mm. glykoleja, polygly-koleja, tensidejä, proteiineja ja proteiinihydrolysaatteja, synteettisiä polymeerejä, karboksyylihappoja, spesifisiä 3 93656 kationeja tai anioneja. [Vrt. US-patentti n:o 4 519 934; L. Kravetz, K.F. Guin, Journal of the Am. Oil, Chem. Soc. Voi. 62, 5 (1985); L. Gianfreda, M. Modafferri ja G. Greco, Enzyme Microb. Technol. 7, 78 - 82 (1985); K. Martinek, 5 V P. Torchilin, Enzyme Microb. Technol. Voi. 1, 74 - 82 (1979); US-A 4 111 855 (1978); US-A 4 318 818 (1982); US-A 3 557 002 (1971); US-A 4 169 817 (1979)].

Toisena mahdollisuutena stabiloida entsyymejä vesiliuok-10 sessa on kiinnitetty huomio käänteismisellien muodostamiseen systeemissä: vesi/tensidi/orgaaninen liuotin [vrt. P.L. Luisi, Angew. Chem. 97, 449 - 460 (1985)].

Tätä tavoitetta on selvitetty lähemmin esimerkissä, jossa 15 on kyse nahanvalmistuksessa käytetyistä entsyymeistä tai entsyymisysteemeistä.

Juuri nahanvalmistuksessa on nesteen annostelu saavuttanut viime aikoina voimakkaasti jalansijaa kiinteän aineen 20 annosteluun verrattuna, koska sillä on todellakin etuja, mm. käsittelyn suhteen. Nestemäisten, entsyymejä sisältävien valmisteiden, esimerkiksi entsymaattisten peittaus-ja liotusapuaineiden valmistuksen ongelmana on kuitenkin tällaisten tuotteiden riittämätön stabiilisuus. Pysymättö-25 myys, erityisesti haimavalmisteiden, ei ole millään lailla odottamatonta; tämä tunnetaan jo osaksi entsyymien jatkokäsittelystä. Kun kysymys on proteaaseista, huomioon on otettava erityisesti myös itsehajottava vaikutus ja muihin läsnäoleviin entsyymiproteiineihin kohdistuva hajottava 30 vaikutus. (Vrt. K. Martinek, V.P. Torchilin, Enzyme Microb. Technol. Voi. 1, s. 74 - 82 (1979).

Lopuksi todettakoon, että käytännössä ei tähän mennessä ole voitu nestemäisiä entsyymivalmisteita korvata. Tavoitteena 35 oli siten edellä olevan mukaisesti siten saada käyttöön entsyymeille tarkoitettuja nestemäisiä formulaatioita, a) joiden tuli olla käytännön olosuhteissa riittävän stabiile- 4 93656 ja, b) joissa ei vaikutettaisi entsyymien aktiivisuuteen tai ei vaikutettaisi irreversiibelisti, c) jotka olisivat mainituilla käyttöaloilla entsyymien kanssa yhteensopivia, ja d) jotka olisivat taloudellisesti ja ekologisesti koh-5 tuullisia. Tällaiseen, nahanvalmistuksen moderneissa menetelmissä käytettävään, nk. "neste-entsyymiin" kohdistuvat vaatimukset lähtevät siitä, että aktiivisuus ei saa laskea 4-6 kuukauden sisällä enempää kuin 15 %.

10 Nyttemmin on havaittu, että keksinnön mukaiset nestemäiset entsyymiformulaatiot yllättäen täyttävät tekniikan vaatimukset erittäin hyvin. Keksinnön kohteena ovat teknilliseen käyttöön tarkoitetut entsyymien nesteformulaatiot, jolloin entsyymien kantajanesteenä käytetään vähintään yhtä oleel-15 lisesti vedetöntä orgaanista liuotinta (LM) tai sellaisten seoksia. Liuottimina tulevat kysymykseen edellä esitettyjen tavoitteiden kanssa sopusoinnussa olevat, edullisesti sinänsä tavanomaiset, mieluummin ympäristölle vaarattomat, erityisesti vain vähän toksiset, entsyymejä vahingoittamat-20 tomat liuottimet. Keksinnön mukaisesti käytettävät orgaaniset liuottimet LM eivät sisällä parhaiten hiilen, vedyn ja mahdollisesti hapen ja mieluummin pienen rikkimäärän lisäksi muita heteroatomeja. Suositeltuja ovat liuottimet, joilla on rakenne I 25 ·· Ri - x - R2 jossa X on happi tai rikki ja

Rx on 1-8 hiiliatominen alkyyliryhmä tai ryhmä - CH - OH 30 | R3 : jolloin R3 on vety, -CH3 tai -CH2OH tai tarkoittaa ryhmää -(CH2 - CH20)n - H, jolloin n on luku 1 - 15 ja R2 on vety tai 1-8 hiiliatominen alkyyliryhmä, tai 35 Rx ja R2 tarkoittavat ryhmää -CH2-CH2OH tai

Rj^ ja R2 yhdessä hapen kanssa muodostavat 5- tai 6-jäsenisen renkaan, jolloin kaikki renkaan jäsenet muodostuvat -CH2-ryhmistä tai yksi renkaan jäsen tarkoittaa karbonyyli-

• I

5 93656 ryhmää, ja jolloin mahdollisesti toinen renkaan jäsen voi muodostua hapesta, tai X tarkoittaa karbonyyliryhmää -C=0 edellyttäen, että tässä tapauksessa Rj^ ja R2 tarkoittavat 1-3 hiiliatomista alkyy-5 liryhmää, tai X tarkoittaa COO-ryhmää edellyttäen, että tässä tapauksessa R-j^ ja R2 tarkoittavat 1-6 hiiliatomista alkyyliryhmää tai Rx tarkoittaa vetyä ja R2 tarkoittaa 1-6 hiiliatomista alkyyliryhmää.

10

Liuottimina LM voidaan edelleen käyttää sellaisia liuottimia, joilla on rakenne II

15 -R5 II

jossa R5 on ryhmä -CH3 tai -CH = CH2.

20 Erityisesti mainittakoon kaavan I mukaisten yhdisteiden edustajina hiilihappoesterit, erityisesti sykliset hiili-happoesterit, erityisesti propyleenikarbonaatti. Mielenkiintoisia ovat edelleen moniarvoiset alkoholit, kuten glyseriini, etyleeniglykoli, butyyliglykoli, butyylidigly-25 köli, dietyleeniglykoli, polyetyleeniglykoli sikäli kuin ne *:* ovat nestemäisiä, yhdenarvoiset alkanolit, kuten metanoli, etanoli, isopropanoli, n-butanoli, isobutanoli, 2-etyyli-heksanoli, sykloheksanoli, eetterit, kuten dietyylieetteri, erityisesti sykliset eetterit, kuten dioksaani, tetrahydro-30 furaani, ketonit, kuten asetoni, etyylimetyyliketöni, esterit, kuten etyyliasetaatti, butyyliasetaatti, laktonit, t kuten γ-butyrolaktoni. Kaavan II mukaisten yhdisteiden edustajina mainittakoon tolueeni ja styreeni, edelleen käyttökelpoisia ovat terpentiini, liuotinnafta, lakkaben-35 siini, alifaattiset hiilivedyt ja mineraaliöljyt (kiehu-mispistealue parhaiten välillä 50 ja 180°C, erityisesti välillä 70 ja 150°C). Polyetyleeniglykolia lukuunottamatta 6 93656 liuottimet LM ovat yleensä liuottimia, joiden molekyyli-paino on < 110°C ja joiden kiehumispisteet ovat pääosaltaan alle 300°C normaalipaineessa. (Lisää tietoja liuottimista voidaan saada esimerkiksi monografiasta: Gramm, 5 Fuchs, Lösungsmittel und Weichmachungsmittel, 8. painos, Wissensch. Verlagsgesellschaft, Stuttgart 1980). Keksinnön mukaisesti käytettävät orgaaniset liuottimet LM ovat oleellisesti vedettömiä, so. ne sisältävät yleensä alle 1 pai-no-% vettä, parhaiten ei enempää kuin tavanomainen jäännös-10 kosteus. Liuotin LM kuivataan sinänsä tavanomaisella tavalla, esimerkiksi käyttämällä tavanomaisia kuivausaineita, tislaamalla, muodostamalla aseotrooppi jne. (vrt. Houben Weyl. painos, Voi. 1/2, sivut 765 - 886, Georg Thieme-Verlag 1959).

15

Veden mukanaolo keksinnön mukaisissa formulaatioissa ei ole yleensä tarkoituksellista, ainakaan keksinnön tavoitetta haittaavina määrinä. Käytettäessä veden kanssa sekoittumat-tornia liuottimia voivat entsyymiformulaatiot sisältää 20 lisäksi tensidejä. Tällöin hyvänä pidettyjä ovat ei-ionil-liset tensidit tyyppiä rasva-alkoholi-/alkyylifenolietok-sylaatti (esimerkiksi oleosetyyli- ja oleiinialkoholi), polyglykoleenin adduktit 4-42 moolin kanssa etyleenioksi-dia, lisäksi tyypiltään anioniset tensidit, kuten alkyyli-25 sulfaatti, alkyylieetterisulfaatti, alkyylifosfaatti, alkyylieetterifosfaatti, alkyylisulfonaatti ja alkyyliaryy-lisulfonaatit. (Vrt. DE-A 33 22 840). Tensidien määrä kantajanesteestä laskettuna on yleensä 0,001 - 50 paino-%, mieluummin 0,005 - 20 paino-%. Emulgointlaineiden HLB-arvo 30 (so. öljy/vesi-emulgointivaikutus) on yleensä 8-18, mieluummin 9-15. (Emulgointiaineet ja HLB-arvo: kts.

Kirk-Othmer 3. painos Voi. 8., 910 - 916). Suositeltuja ovat edelleen veden kanssa sekoittuvat liuottimet LM, erityisesti liuottimet, jotka sekoittuvat veden kanssa 35 kaikissa suhteissa. Ensisijaisesti on lähdettävä siitä, että entsyymit pysyvät liuottimiin LM täysin liukenemattomina. Tällä tavoin pysyy itsehajottamistaipumus tai muiden 7 93656 entsyymien vaikutuksesta tapahtuva hajoaminen mahdollisimman vähäisenä.

Käytetyn liuottimen LM-määrä mitoitetaan ensi sijassa sen 5 mukaan, mikä on tarkoituksenmukaista entsyymien käsittelyssä; se ei varsinaisesti ole kriittinen. Entsyymi/liuotin LM-painosuhteen ei yleensä tule olla pienempi kuin 1:10 käsiteltävyyssyistä. Järkevämpiä konsentraatiosuhteita saadaan asettamalla entsyymi/LM-painosuhteen ylärajaksi 10 yleensä 1:30 - 1:500.

Nyrkkisääntönä voidaan sanoa, että hyvin käyttökelpoiseksi entsyymi/LM-suhteeksi on osoittautunut 1: noin 50. Sopivia ovat myös edellä mainittujen liuottimien LM-seokset. Kun 15 oleellisesti proteiinista muodostuvia entsyymejä lisätään oleellisesti vedettömiin liuottimiin LM, voi esiintyä ongelmia, kuten hidasta kostumista ja/tai jakaantumison-gelmia, kuten saostumista tai pinnalle nousemista. Esillä olevan keksinnön eräässä toisessa suoritusmuodossa havait-20 tiin, että homogeenisten nestemäisten entsyymiformulaati-oiden valmistumiseen liittyvät ongelmat, kuten pinnalle-nouseminen ja saostuminen voidaan ainakin osittain välttää, kun liuottimeen LM dispergoidaan epäorgaanisia jauhemaisia lisäaineita AZ. Epäorgaanisista dispergointiaineista muo-25 dostuvia jauhemaisia lisäaineita on kuvattu täysin muihin '!* käyttötarkoituksiin, esimerkiksi "öljy vedessä"-dispersioiden dispergointiaineina tai radikaalihelmipolymeroinnin dispergointiaineina (vrt. Houben-Weyl; Methoden der Organischen Chemie, Band XIV/1 Makromolekulare Stoffe, 30 s. 420 - 421, Georg-Thieme-Verlag 1961). Tällaisiksi epäorgaanisiksi dispergointiaineiksi on suositeltu esimerkiksi maa-alkalimetallien liukenemattomia suoloja (karbonaatti, fosfaatti, sulfaatti, silikaatti), alumiinihydroksidia, talkkia ja bentoniittia. Esillä olevan tavoitteen saavutta-35 miseen suositellaan savilajeja, erityisesti betoniittia. Kaoliini ja bentoniitti muodostavat tunnetusti monien polaaristen ja polaarittomien orgaanisten nesteiden kanssa 8 93656 tiksotrooppisia geelejä. Geelien tiksotropia häviää esimerkiksi lisättäessä pieniä määriä pitkäketjuisia alkoholeja [vrt. Ullmanns Enzyclopädie der techn. Chemie, 4. painos,

Voi. 23., s. 318 - 326, Verlag Chemie 19; U. Hoffmann et ai.

5 Kolloid Z. 151, 97 - 115 (1957)].

Savilajeilla ymmärretään tavanomaisia alumiinisilikaatteja, bentoniitilla pääasiallisesti montmorilloniitista (A1203.4.Si02.H20) muodostuvia, kaupallisia valmisteita.

10 Erityisen mielenkiintoisia ovat orgaanisesti aktivoidut bentoniitit, esimerkiksi tuotteet, jotka saadaan saattamalla Na-montmorilloniitti reagoimaan kvartääristen alkyy-liammoniumyhdisteiden kanssa. Suorittamalla kationinvaihto muodostuu nk. organofiilisiä bentoniitteja, jotka turpoavat 15 orgaanisissa nesteissä (vrt. Ullmann loc.cit. s. 323).

Yleensä voidaan käyttää kaupallisia toimitusmuotoja (levy-siä, hiukkaskokoalue 0,5 - 5 μπι) , jolloin on kuitenkin tarkoituksenmukaista kohdistaa tuotteeseen leikkauskäsittely valitussa liuottimessa LM. Liuotin LM sisältää yleensä 20 epäorgaanisia lisäaineita AZ 0,1 - 3 paino-%, mieluummin 0,3 - 1 paino-% liuottimesta laskettuna. Erityisen edulliseksi on osoittautunut kohdista entsyymikonsentraatin epäorgaaniseen lisäaineeseen yhdessä liuottimen LM kanssa leikkausvaikutus käyttämällä sopivaa laitetta, erityisesti 25 dispergaattoria. Dispergaattoreina tulevat kysymykseen kaupalliset laitteet (vrt. Ullmanns Encyclopädie der technischen Chemie, 4. painos, Bd. 1, s. 239, Verlag Chemie 1972) .

30 Kierrosluvut tai käytettävät käsittelyajat riippuvat ensi sijassa laitteen laadusta. Kaupallisten dispergoivien laitteiden vaikutusajan, jolla bentoniittia käsitellään keksinnön mukaisesti käytettävässä liuottimessa LM, lähtöarvoksi mainittakoon 2-60 minuuttia kehänopeuden ollessa 35 4-36 m/sek.

9 93656

Erityisen sopivaksi on osoittautunut propyleenikarbonaatti-liuotin yhdistelmänä bentoniitin kanssa.

Keksinnön mukaisille formulaatioille ei ole entsyymikom-5 ponenttien suhteen mitään havaittuja rajoituksia (itse entsyymien stabiilisuuden suhteen näitä voi olla orgaanisille liuottimille, kuten alkoholeille). Edellytyksenä on, että liuotinkomponentti LM sopii yhteen entsyymien lopullisen käytön kanssa. Saostumista tai pinnallenousemista 10 estävää vaikutusta voidaan parantaa lisäämällä kantaja- nesteeseen, erityisesti, kun on kysymys kaavan I mukaisen tyypin polaarisista liuottimista, vielä vähän polaarisia liuottimia. Siten voi olla edullista, että kantajaneste sisältää 1-10 paino-% hiilivetyjä, erityisesti haarautu-15 neita tai suoraketjuisia alifaatteja, joissa on 5 - 20 hiiliatomia. Mainittakoon esimerkiksi öljyjakeet, joiden kiehumisalue on noin 50 - 180°C (vrt. myös edellä olevan liuottimen määritelmä). Entsyymeinä tuotakoon esiin erityisesti jo teollisesti tai muilla käyttöalueilla hyödyksikäy-20 tetyt entsyymit (vrt. edellä oleva tekniikan taso).

A) Proteaasit (E.C. 3.4; Kirk-Othmer, loc.cit. Voi. 9, K. Aunstrup kirjassa B. Spencer toim. Industrial Aspects of

Biochemistry, Voi. .30 (I), sivut 23 - 46, North Holland 25 1974) < · · a) eläinperäiset, kuten esimerkiksi a) Renniini (E.C. 3.4.23,4) β) Haiman proteaasit 30 pankreatiini, erityisesti trypsiini, kymo- trypsiini (pH-vaikutusalue noin 7-10) pep-siini (E.C.3.4.23.1) (pH-vaikutusalue noin 1,5 - 4,0) katepsiini (E.C.3.4.23.5) (pH-vaikutusalue 35 noin 4,0 - 5,0) 10 93656 b) kasviperäiset a) Papaiini (E.C. 3.4.22.1) pH-vaikutusalue noin 5,0 - 8,0 β) Fisiini (E.C. 3.4.22.3) pH-vaikutusale noin 5 4,0 - 9,0 γ) Bromelaiini (E.C. 3.4.22.4 ja 3.4.22.5) pH-vaiku-tusalue noin 5,0 - 7,0 c) mikrobiperäiset (vrt. L- Keay julkaisussa "Process 10 Biochemistry", 1971, 17 - 21.

a) Bacillus-lajeista, kuten B. subtilis, B. licheniformis, B. alkalophilus, B. cereus, B. natto, B. vulgatus, B. mycoides β) Streptococcus-lajeista 15 γ) Streptomyces-lajeista kuten Streptomyces fradiae, S. griseus, S.rectus δ) Aspergillus-lajeista kuten Aspergillus flavus-oryzae, A. niger, A. saitoi, A. usamii 20 ε) Mucor- ja Rhizopus-lajeista kuten Mucor pusillus, M. mietrei £) Endothia-lajeista kuten Endothiia parasitica η) Trametes-lajeista 25 kuten Trametes sanguinea < »«

Alkuperän perusteella tapahtuvan erottelun lisäksi käytetään erottelua vaikutuksen laadun (Exo-versus Endo-entsyy-mit) ja proteaasien "aktiivisen kohdan" perusteella (se- 30 riiniproteaasit, joita DFP ehkäisee, sulfhydryyli-entsyy mit) . Käytännössä on huomattava merkitys lisäksi entsyymi-aktiivisuuden riippuvuudella pH-arvosta. Ennen kaikkea käytännön lähtökohdista katsoen erotetaan sen vuoksi 11 93656 i) Alkaliset proteaasit, joiden vaikutusoptimi on noin pH-alueella 7,5 - 13, erityisesti alkaliset bakteeriproteaasit (E.C.3.4.21.) (jotka kuuluvat enimmäkseen seriini-tyyppiin) ja alka- 5 liset homeproteaasit ii) Neutraalit proteaasit, joiden vaikutusoptimi on pH-alueella 6,0 - 9,0 erityisesti neutraalit bakteeriproteaasit (E.C.3.4.24.) (jotka kuuluvat metalloentsyymeihin) ja 10 homeproteaasit, esimerkiksi Bacillus-proteaasit,

Pseudomonas-proteaasit, Streptomyces-proteaasit, Aspergillus-proteaasit iii) Happamet proteaasit, joiden vaikutusoptimi on pH-alu-eella 2,0 - 5,0 (E.C.3.4.23) 15 erityisesti happamet homeproteaasit, esimerkiksi la jeista: Rhizopus spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Mucor spp., ja Impex lacteus ja Endothitia parasitica 20 Proteaaseilla on teollista käyttöä mm. nahanvalmistuksessa, pesuaineissa ja puhdistamisessa, liimaliuoksen poistossa, liuosten valmistuksessa, lihan hajottamisessa ja oluen stabiloinnissa.

25 Aikalisinä proteaaseina mainittakoon erityisesti subtili-siinit, jotka ovat seriinityyppisiä aikalisiä bakteeri-proteaaseja, jotka ovat stabiileja pH-alueella 9 - 10 ja jotka jossakin määrin eivät ole herkkiä perboraatille.

30 Entsyymien proteolyyttinen teho määritetään tavallisesti Anson'in hemoglobiinimenetelmällä (M.L. Anson J. Gen. Physiol. 22., 79 (1939) tai Löhlein-Volhard-menetelmällä (di Löhlein-Volhard'sche Methode zur Bestimmung der proteo-lytischen Aktivität. Gerbereichem. Taschenbuch. Dresden-35 Leipzig, 1955) "LVE"-arvona (Löhlein'in ja Volhard'in yksikkö). Yhdellä Löhlein'in ja Volhard'in yksiköllä tarkoitetaan sitä entsyymimäärää, joka menetelmän spesifisissä 12 93656 olosuhteissa hajottaa 1,725 mg kaseiinia. Edelleen seuraa-vassa käytetään happamella alueella vaikuttavien entsyymien aktiivisuusmäärityksessä yksikköä, joka on saatu Anson'in menetelmästä. Tästä käytetään nimitystä "proteinaasiyksikkö 5 (hemoglobiini)". Yksi UHb vastaa sitä entsyymimäärää, joka katalysoimalla vapauttaa trikloorietikkahappoon liukoista hemoglobiinipalasista 1 μπκ>1 tyrosiinia minuutissa 37°C:ssa (mitattuna aallonpituudella 280 nm) . (1 mU^ = 10~3 U^.) 10 B) Amylaasit (E.C. 3.2, vrt. Ullmann, loc.cit Bd. 10, s. 506 - 510, ja B. Spencer, Industrial Aspecxts of Biochemistry loc.cit, sivut 143 - 144, 175). a) Endo-amylaasit αχ) α-amylaasit (α-l,4-glukaanihydrolaasit) 15 (E.C.3.2.1.1) β1) β-l,6-glukaanihydrolaasit β) Ekso-amylaasit (sakkarogeeniset amylaasit) /31) β-amylaasit (α-l, 4-glukaanimaltohydrolaasit) (E.C.3.2.1.2) 20 β2) Glukamylaasit (α-l,4-glukaani-glukohydrolaasit) (E.C.3.2.1.3) α-amylaaseja esiintyy tunnetusti mm. kasveissa yhdessä jS-amylaasien kanssa. Teknillisesti niitä saadaan esimerkik- 25 si haimarauhasista ja bakteeri- ja homeviljelmistä.

·

Erityisen edullisesti valmistus tapahtuu Bacillus-lajeista, esimerkiksi seuraavista: B. subtilis, B. mesentericus, B. polymixa, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, edel-30 leen homeista, erityisesti Aspergillus-lajeista, kuten esimerkiksi lajeissa: A. niger, A. Phoenicis, A. oryzae, A. awamori, Mucor-lajeista, esim, lajeista: M. roucianus, Thizopus Arten, kuten R. delemar, R. oryzae, R. Japonicus, ja Endomyces-lajeista, esim. E. fibuliger-lajeista. a-amy-35 laasien pH-optimi on enimmäkseen välillä 4,7 - 7,2. Amy- laaseilla on mm. käyttöä elintarvikesektorilla [vrt. H.-J. Rehm & G Reed toim. "Biotechnology" Voi. 5, verlag Chemie 13 93656 1983; B. Spencer, toim. Industrial Aspects of Biochemistry; Vol. ^0/ osa I, sivut 139 - 186, 213 - 260, Elseviers (1973)] tärkkelyksen nesteyttämisessä, mallastuksessa, etanolin valmistuksessa, liimaliuoksen poistossa, nahan-5 valmistuksessa jne. α-amylaasien aktiivisuus voidaan määrittää käyttämällä substraattina tärkkelystä menetelmällä: Sandsted, Kneen & Blish (Cereal Chem. 16., 172 (1939) und Technical Bulletin Nr. 1024, U.S. Dept. of Agriculture). Tällöin ymmärretään yhdellä amylaasiyksiköllä (= 1 SKB-10 yksikkö) sitä entsyymimäärää, joka 30°C:ssa ja muissa annetuissa reaktio-olosuhteissa dekstrinisoi 1 g liukoista tärkkelystä 1 tunnin kuluessa.

Haima-amylaasien aktiivisuuden määrittämiseen käytetään li-15 säksi Willstätter'in menetelmää (Hoppe-Seylers, Z. physiol. Chem. 126, 143 (1923). Tällöin on Willstätter'in amylaasi-yksiköksi määritelty 100 kertaa se määrä entsyymiä, joka annetuissa koeolosuhteissa pilkkoo tärkkelystä sellaisella nopeudella, että yksimolekyylinen reaktiovakio on 0,01.

20 C) Lipaasit (E.C.3.1.1.3)

Lipaaseilla tarkoitetaan tunnetusti karboksyylieste-raaseja, jotka pilkkovat glysiiniesterin vesiemulsios-sa. Ne eroavat näin muista karboksyyliesterasseista, 25 jotka pilkkovat substraatin vesiliuoksessa.

a) Haiman lipaasit

Haiman entsyymikompleksi sisältää lipaasien lisäksi teknisesti tärkeinä saatto-entsyymeinä 30 enimmäkseen esteraaseja sekä proteaaseja ja amy- laaseja. pH-optimi (oliiviöljyyn nähden) on alu- eella 7 - 8,5 ja aktiivisuusalue on pH-alueella 6,5 - 9,5. Lipaasit ovat yleensä erittäin pysy-mättömiä, erityisesti saattoproteaasien aiheutta-35 man proteolyyttisen hajoamisen vuoksi.

14 93656 β) Mikrobiperäiset lipaasit esimerkiksi seuraavista: Pseudomonas fragi, Aspergillus sp. (esim. A. luchuensis) Candida cylindracea, Geotrichum candidum, Humicola 5 lanuginosa, Mucor pusillus, Penicillium sp.

(esim. chrysogenum, P. oxalicum, Rhizopus sp.

(R. nigricans, R. oryzae) Näillä lipaaseilla on pH-optimi yleensä vähintään 10 pH > 7,0. Mikäli pysymättömyys sen sallii, on lipaa seilla käyttöä mm. jätteiden hävityksessä, nahkateollisuudessa ja elintarvikealoilla.

D) Katalaasit/hydroksiperoksidaasit (E.C.1.11.1.6) 15 a) eläinkudoksesta esimerkiksi maksasta β) kasveista esimerkiksi piparjuuresta 20 γ) mikro-organismeista esimerkiksi Micrococcus lysodeicticus-bakteerista

Katalaaseilla on käyttöä peroksidivalkaisussa ja meijeriteollisuudessa .

25 E) Sellulaasit [E. C. 3.2.1.4] (vrt. Ullmann loc.cit, ss.

510 - 511)

Sellulaasi on tunnetusti entsyymikompleksi, jonka komponentit osallistuvat peräkkäin natiivin sellu-30 loosan hajottamiseen.

Sellulaaseja on hyönteisissä, nilviäisissä ja mikro-organismeissa (bakteerit/sädesienet). Kaupallisesti hyödynnettyjä sellulaasilähteitä ovat erityisesti 35 Aspergillus-, Neurospora-, Rhizopus-, Trichoderma- ja

Tramets-lajit. Teknillisten preparaattien vaikutus-optimi on pH-välillä 4-6. Tekniikan tason mukaiset 15 93656 sellulaasivalmisteet menettävät kylmässä ja kuivassa säilytettynä vuotta kohti aktiivisuudestaan noin 10 - 20 %. Sellulaaseilla on teknistä käyttöä elintarviketeollisuudessa selluloosapitoisten jäteaineiden 5 jne. muuntamisessa.

Esillä olevaa keksintöä on lähemmin selitetty käyttämällä esimerkkinä entsyymien käyttöä nahanvalmistuksessa. Entsyymien käyttö on ollut jo 80 vuotta nahanvalmistuksen kiinteä 10 osa siitä lähtien, kun Dr. Otto Rohm otti käyttöön entsy-maattiset peittausaineet/haiman tryptiset pilkkomisentsyy-mit OROPON^ -peittausaineessa (DE-PS 20 05 19), erityisesti vesilaitoksissa:

Peittausaineissa käytön lisäksi (DE-PS 9 27 464; 15 DE-PS 9 76 107; DE-PS 9 41 811; DE-PS 9 74 813, DE-PS 9 75 095; DE-PS 9 76 928; DE-PS 11 20 066; DE-PS 11 34 474; DE-PS 12 19 620; DE-PS 12 82 837; US-PS 3 939 040; US-PS 4 273 876) entsyymipreparaateilla on käyttöä myös pehmitysliuoksissa (DE-PS 2 88 095; 20 DE-PS 9 76 602; DE-PS 10 22 748; DE-PS 10 34 317, DE-PS 12 82 838, DE-PS 20 59 453, US-PS 4 278 432, US-PS 4 344 762) karvojen möyhentämisessä ja nahankäsitte-lyssä (US-PS 4 294 087) . Entsyymipreparaatteja käytetään myös karvojen poistoon (DE-PS 10 26 038, DE-PS 12 11 349, 25 DE-PS 11 55 560, DE-PS 12 30 169, DE-PS 12 88 728, US-PS 3 623 950) ja kalkkiammeissa (DE-PS 10 23 183; DE-PS 12 03 416, DE-PS 20 53 016, DE-OS 34 29 047) piklauk- sessa (DE-PS 8 47 947, DE-PS 9 41 680) tai kompaktimenetel- mässä (US-PS 3 986 926, US-PS 3 986 926, US-PS 3 966 551), 30 rasvanpoistoon märkämenetelmällä (DE-A 33 12 840), turkis-. ten kuiturakenteen möyhentämiseen (US-PS 3 549 495; US-PS 3 558 430) jne. Entsyymipreparaatteja käytetään edelleen kone-nahkajätteiden ja nahanvalmistuksen muiden sivutuotteiden (US-PS 4 210 721, CH-PS 631 486, 35 US-PS 4 293 647, US-PS 4 220 723), keratiinipitoisten raaka-aineiden (US-PS 4 232 123), elastiinipitoisten preparaattien (US-PS 4 179 333) käsittelemiseen, kollageeni- 16 93656 pitoisen raaka-aineen jatkokäsittelyyn (S-PS 4 220 714) jne.

Edellä mainittuihin, entsymaattisiin menetelmiin perustuen 5 voidaan oheisten patenttivaatimusten mukaisia entsyymi- neste-formulaatioita käyttää nahanvalmistuksen yksittäisissä vaiheissa (vrt. Ullmanns Encyclopädie der Techn. Chemie, 3. painos, Bd. 11, s. 609, Urban / Schwarzenberg, Ullmanns Encyclopädie der Techn. Chemie, 4. painos, Bd. 16.^ s.

10 111 - 174, Verlag Chemie, 1978, F. Stather, Gerbereichemie und Gerbereitechnologie, 4. painos, Akademie-Verlag, Berlin 1967) .

I) Pehmennysliuoksissa 15 II) Karvojen möyhentämisessä, kalkkiammeissa ja karvan-poistossa III) Kalkinpoistossa ja peittausliuoksissa ja mahdollisesti IV) Piklauksessa 20 I.) Pehmennysliuoksessa

Nahkamateriaalin pehmentäminen, jossa suolakonservoinnissa esiintyvä nahkojen kovettuminen poistetaan, suoritetaan tavallisesti pH-arvossa 7,0 - 10,0. Entsyymien, erityisesti 25 proteolyyttisten entsyymien [kts. A)] käyttäminen mukana jouduttaa pehmentymistä "pilkkomalla" vesiliukoiset ja muut valkuaisaineet, jotka eivät kuulu nahan kollageenikuitura-kenteeseen. Pehmennysliuoksissa käytetään yleensä entsyymejä, joiden vaikutusalue (tai proteolyyttisen vaikutuksen 30 pH-optimi) on pH-välillä 7,0 - 10,0. Poistamalla muut valkuaisaineet kuin kollageeni, varmistetaan nahan nopeampi ja tehokkaampi kostuminen. Pehmennysvesi on edullista säätää hieman alkaliseksi, mutta pH-arvon on kuitenkin aina pysyttävä < 12. Sitä paitsi mukana on edullista olla tavanomai-35 sissa konsentraatioissa (10 - 1000 g/1) pehmennysapuaineita (esimerkiksi monoetanoliamiini yhdessä antiseptikumin, kuten zefyrolin kanssa tai naftaliinisulfonihappo yhdistel- 17 93656 mänä substituoitujen fenolien kanssa; runsaasti sulfinoitu risiiniöljyhappobutyyliesteri metyyliheksaliinin kanssa; rasva-alkoholisulfaatti yhdessä liuottimen kanssa). Entsy-maattisina lisäaineina keksinnön mukaisissa entsyymineste-5 formulaatioissa tulevat kysymykseen esimerkiksi edellä kohdassa A) mainitut proteaasit, erityisesti kohdassa A)c) mainitut proteaasit: Erityisesti mikrobiproteaasit, joiden vaikutusalue on 4 - 9,5, erityisesti homeproteaasit, esimerkiksi Aspergillus-lajeista, kuten A. saitoi ja 10 A. usamii, saadut proteaasit, erityisesti happamet proteaasit, joiden pH-vaikutusalue on 2,5 - 4,5, edelleen A. oryzaeproteaasit, joiden pH-vaikutusalue on 4,0 - 9,5, edelleen A. niger ja A. flavus-lajeista saadut proteaasit, joiden pH-vaikutusalue on 9,5 - 11,0.

15 Käytettyjen proteaasien proteolyyttisten aktiivisuuksien konsentraatio on yleensä välillä 0,1 - 1,0 Anson'in yksikköä tai 1000 - 3000 Löhlein'in ja Volhard'in yksikköä pehmennysliemen litraa kohti. Pehmennysliemet voivat sisäl-20 tää vielä kohdan B) mukaisia amylaaseja. Amylaasit esiintyvät esimerkiksi homeproteaasien saattoentsyymeinä. Ne edistävät glykosidisidosten lohkeamista nahan proteoglykaa-neissa ja glykoproteiineissa. Erityisen sopivia ovat mikro-biperäiset amylaasit, erityisesti Aspergillus-lajeista, 25 kuten A. oryzae ja A. niger-lajeista saadut amylaasit, eri-tyisesti amylaasit, joiden pH-vaikutusalue on 3,0 - 5,8. Lisäksi tällaisia bakteeriperäisiä amylaaseja ovat esimerkiksi Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. polymixa-lajien amylaasit, joiden vaikutusalue on 5,0 - 7,0. Amy-30 laasien glykolyyttiset aktiivisuudet ovat yleensä välillä 500 - 2000 SKB. Pehmennysliuosten lämpötila on edullisesti > 20°C. Pehmennysaika mitoitetaan mahdollisimman lyhyeksi. Yleensä se on 4 tunnin ja 36 tunnin välillä.

35 II) Karvojen möyhentämisessä, kalkkiammeissa, nahankäsitte-lyssä 18 93656

Karvanpoistoon käytetään enimmäkseen kalkkiammeita (vrt. Ullmann loc. cit., 3. painos Bd. 1JL, s. 560; 4. painos Bd. 16, s. 118 - 119. Kauttaaltaan käytetään nk. terästettyjä kalkkiammeita, parhaiten kalsiumhydroksidin ja natriumsul-5 fidin yhdistelmää ja puskuroivien, turpoamista estävien kalkitusapuaineiden läsnäollessa (esimerkiksi kostutusai-neet, erityisesti kationiaktiiviset kostutusaineet yhdistelmänä monoetanoliamiinin ja desinfiointiaineiden, kuten kvartääristen alkyyli-dimetyyli-bentsyyliammoniumyhdistei-10 den tai dialkyyliamiinin ja sen sulfaatin kanssa). Karvojen möyhennykseen ja nahankäsittelyyn voidaan käyttää tavanomaisten kalkituskemikaalien lisäksi entsyymejä, jotka ovat tällä pH-alueella riittävän stabiileja. Pehmennysliuokset ja kalkkiammeet voidaan muodostaa nostamalla vähitellen 15 pH-arvoa ja lisäämällä vastaavia entsyymejä. Entsyymejä käytetään kalkkiammeissa, karvojen möyhennyksessä ja kar-vojenpoistossa yleensä pH-alueella 9-13, erityisesti 9-12.

20 Patenttijulkaisujen DE-A 29 17 376 tai US-A 4 294 687 mukaisesti voidaan nahka, josta konservointisuola on poistettu, esikäsitellä ensin happamella pH-alueella disulfi-disiltoja lohkaisevilla aineilla, minkä jälkeen suoritetaan samanaikaisesti karvojen möyhentäminen ja nahan käsit-25 tely ilman edeltävää pehmentämistä käyttämällä alkalisella „!·* alueella tehokkaita proteaaseja pH-arvossa noin 11 - 13.

Tämän jälkeen suoritetaan muut, vesilaitoksessa tavanomaiset työstämisvaiheet III) ja mahdollisesti IV). Vesilaitoksen toimenpiteissä kohdassa II) käytetään tarkoituksen-30 mukaisesti tyypin i) (ks. edellä) aikalisiä proteaaseja, erityisesti aikalisiä bakteeriproteaaseja (seriini-prote-aasit), esim. bakteereista B. subtilis, B. licheniformis, B. firmus, B. alcalophilus, B. polymixa, B. mesethericus. Näiden proteaasien aktiivisuus on yleensä välillä 8000 ja 35 10000 Lohlein'in ja Volhard'in yksikköä (LVE) grammaa kohti. Niitä käytetään tarkoituksenmukaisesti suolattujen nahkojen ja vuotien (raakapaino) painosta laskettuna 19 93656 0,1 - 10 paino-%, parhaiten 1-5 paino-%. Karvojen talteenotossa ja nahkojen käsittelyssä suoritetaan entsymaat-tinen reaktio noin 18 - 28°C:ssa, jolloin reaktioajat ovat yleensä välillä 12 ja 24 tuntia, erityisesti 12 - 16 tun-5 tia.

Karvojenpoisto tai villanpoisto voidaan suorittaa myös tyypin i) aikalisissä homeproteaaseilla, erityisesti Aspergillusproteaaseilla, erityisesti A. niger ja 10 A. flavus-proteaaseilla, jotka toimivat pH-alueella 9,5 - 11,0.

Käyttökelpoinen on myös patenttijulkaisun DE-A 34 29 047 mukainen entsymaattinen karvanpoistomenetelmä, jossa nahat 15 ja vuodat käsitellään altaassa pH-alueella 9-11 sellaisilla proteolyyttisillä entsyymeillä, joiden vaikutusoptimi on pH-alueella 2 - 7,5, ja suoritetaan karvanpoisto. Tällöin käytetään siten tyypin iii) (kts. edellä) proteaaseja, erityisesti seuraavista: A. oryzae, A. saitoi, A. parasiti-20 cus, a. usamii, a. awamori, Paelomyces sp., Penicillium sp., myös Thizopus sp. ja/tai Mucor pusillus, sekä kohdan A) a) ja A)b) (kts. edellä) happamia proteaaseja.

Käytetyt määrät ovat yleensä 0,5-6 paino-%, mieluummin 25 1,0-3 paino-% laskettuna suolattomien nahkojen tai vuo- tien painosta. Aktiivisuus on tällöin yleensä välillä 50 - 200 mUjjh· III) Kalkin poistossa ja peittausliuoksissa 30

Kalkinpoistossa ja peittausliuoksissa käytetään suositel-lusti entsyymejä. Kalkinpoiston tarkoituksena on laskea nahasten alkalisuus pH-arvoista 13 - 14 pH-välille 7-8. Kalkinpoistoon ei mieluummin käytetä mitään voimakkaita 35 dissosioituja, vaan heikkoja orgaanisia happoja, esimerkiksi dikarboksyylihappojen tapaisia happoja tai heikosti happamia suoloja. Peittauksessa poistetaan epidermi-, karva- 20 93656 ja pigmenttijäämiä ja lisäksi saadaan aikaan ylimääräinen nahankäsittely. Lisäksi poistetaan valkuaiskomponentit, jotka eivät ole kollageenia (vrt. Ullmann, 4. painos, Bd.

16 loc.cit s. 119 - 120): Peittausliuoksissa toimitaan 5 tavanomaisesti pH-arvoissa 7,5 - 8,5. Patenttijulkaisusta DE A 31 08 428 tunnetaan syklisten karbonaattien käyttö kalkinpoistossa. Peittausliuoksissa voidaan samanaikaisesti käyttää myös kohdan C. mukaisia lipaaseja, esimerkiksi haiman lipaaseja, jotka vaikuttavat pH-alueella 7,0 - 9,0.

10

Peittausliuoksiin on edullinen vaikutus myös kohdan B. mukaisilla amylaaseilla, esimerkiksi haiman amylaaseilla, jotka vaikuttavat pH-alueella 5,5 - 8,5 ja jotka edistävät glykosidisidosten katkeamista peittausliuoksissa (ennen 15 kaikkea trypsiinin ja kymotrypsiinin saattoentsyymeinä).

IV) Pikkeliliuoksessa

Nahakset on tunnetusti säädettävä happamiksi mineraalipar-20 kituksen esikäsittelynä, so. pH-arvosta 8 arvoon 3-4.

Tämä tapahtuu esimerkiksi pikkeliliuoksessa, joka on hap-po/suolaliuos vedessä, esimerkiksi rikkihappo tai muurahaishappo yhdessä keittosuolan kanssa. Suositeltavia ovat esimerkiksi sädesienitryptaasit, haimatryptaasit ja baktee-25 ritryptaasit mahdollisesti yhdessä hiilihydraatteja pilkko-...Γ vien entsyymien, erityisesti bakteereista tai sädesienistä saatujen entsyymien kanssa.

Edulliset vaikutukset 30

Esillä olevan keksinnön mukaiset nesteformulaatiot tarjoavat helposti yleistettävän ja suhteellisen ongelmattoman ratkaisun usein kyseeseen tulevaan, vaikkakaan ei aina ilmaistuun ongelmaan, nimittäin siihen, että voitaisiin 35 käyttää nestemäisiä entsyymitormulaatioita. Edullista on myös mahdollisuus yhdistää entsyymejä muiden komponenttien kanssa, jotka vaikuttavat haitallisesti entsyymien toimin- 95656 21 taan vesipitoisessa miljöössä ja vaikutusaikojen ollessa pidempi. Tämä koskee ennen kaikkea erilaisten entsyymien yhdistelmiä, esimerkiksi proteaaseja amylaasien, lipaasien jne. kanssa, mutta myös hydrotrooppisten aineiden, kuten 5 esimerkiksi urean, guanidiniumsuolojen, kumeenisulfonaatin jne. kanssa.

Seuraavat esimerkit selventävät keksinnön mukaisia neste-formulaatioita ja niiden käyttöä.

10

ESIMERKIT Esimerkki A

Haima- ja home-entsyymipohjaisen nestemäisen entsyymival-15 misteen valmistaminen 700 g propyleenikarbonaattia (0,6 % vettä), johon on lisätty 3,5 g orgaanisesti modifioitua bentoniittia (esimerkiksi bentone 27, Kronos/Titan Leerkusen), dispergoidaan 45 - 60 20 minuuttia 16 m/sek. pyörimisnopeudella hammas1evysekoitti-messa (levy: astia = 1:2,5; täyttökorkeus on 2 - 2,5 kertaa levyn halkaisija, sekoittimen etäisyys pohjasta on puolet levyn halkaisijasta). Edelleen dispergoiden lisätään 2,54 g Aspergillus parasiticus-sienestä saatua homeproteaasikon-25 sentraattia (pH-optimi 7,5 - 9) (150 000 LVE) ja 1,48 g haimaentsyymipreparaattia (pH-optimi 6 8) (220 000 LVE) .

Pitämällä kierrosnopeus samana dispergoidaan vielä 30 minuuttia, jolloin on huolehdittava siitä, että lämpötila ei nouse yli 40°C. Lopputuotteen aktivisuus on 1 000 LVE. Sen 30 aktiivisuus ei laske lainkaan 4 viikon sisällä 20°C:ssa.

Tuotteilla ei esiinny mitään entsyymin nousemista pinnalle tai entsyymin saostumista.

Dispergointiolosuhteita (kierrosnopeus) ja orgaanisesti 35 modifioidun bentoniitin tyyppiä on muutettava liuottimen laadun, entsyymitiivisteen raekoon ja konsentraation mukaan .

22 93656

Esimerkki B

Yhdistetty kalkinpoisto ja peittaus haima- ja home-entsyy-mipohjaisella nestemäisellä entsyymituotteella propyleeni-karbonaatissa 5 10 kg kalkittuja ja pestyjä nautojen nahaksia, halkaistun nahan paksuus 3-4 mm, 30 % vettä, lämpötila 35°C, 3 % esimerkin A mukaista haima- ja home-entsyymipohjaista entsyymiliuosta propyleenikarbonaatissa (aktiivisuus 10 1000 LV/g), 0,2 % ei-ionillista kostutusainetta, jonka pohjana rasva-alkoholi-etoksylaatti 8-9 etyleenioksidi-moolin kanssa.

Nahas on kalkkeutunut 80 minuutin jälkeen täydellisesti ja 15 juuri- ja parkitsemisjätteet ovat möyhentyneet erinomaisesti. Liuoksen loppu-pH on 8,0. Kalkinpoiston aikana ei poistu lainkaan myrkyllistä rikkivetyä, koska pH ei laske alle 8,0.

20 Esimerkki C

920 g butyyliglykolia ja 40 g petrolia, kp 110 - 130°C, joihin on lisätty 30 g orgaanista, modifioitua bentoniittia (esimerkiksi Bentone 27, Kronos-Titan-yhtiö, Leverkusen), 25 dispergoidaan 38 minuuttia Ultra-Turrax-sekoittimessa nopeudella 16 m/sek.

Dispersion annetaan seistä 24 tuntia. Edellä olevissa dispergointiolosuhteissa lisätään nyt 18,5 g Bacillus 30 subtilis-kannasta saatua neutraalia proteaasia (pH-optimi 5,5-7) (70.000 LVE/g). Dispergoidaan yhteensä vielä 5 minuuttia. Lopputuotteen aktiivisuus on 1300 LVE. LVE-mittauksessa ei havaita mitään aktiivisuuden laskua 5 viikon kuluttua. Entsyymi-nesteformulaatio pysyy homo-35 geenisenä saostumatta tai nousematta pinnalle.

23 93656

Esimerkki D

Lihan pehmentämien naudannahkojen entsymaattinen pehmentäminen ja rasvanpoisto 5 Prosenttiluvut suolan painosta: 100.0 kg lian pehmentämiä naudannahkoja,

200.0 % vettä, lämpötila 26°C

0,8 % esimerkin C entsyymi-nesteformulaatiota, 10 0,4 % ei-ionillista kostutusainetta, jonka pohjana rasva-alkoholi-etoksylaatti 6 etyleenioksidimoolin kanssa, 0,2 % klooriasetamidipohjaista bakterisidia.

15 5 tunnin pehmentämisajan jälkeen nahat ovat täysin pehmen tyneet uudelleen ja samanaikaisesti valmiita karvojen möyhentämiseen. Suuri osa luonnonnahan rasvasta on emulgoi-tunut pehmennysliuokseen.

20 Edellä olevalla tavalla pehmennetyt nahat kalkitetaan tunnetuilla menetelmillä ja työstetään edelleen kenkiin tarkoitetuksi viimeistelemättömäksi nahaksi.

Esimerkki E 25 , .. * 1 000 g petrolia, kp. 110 - 130°C, kuumennetaan 40°C:een, lisätään orgaanisesti modifioitua bentoniittiä (esimerkiksi MPA-X-2 000, Kronos-Titan-yhtiö, Leverkusen), minkä jälkeen dispergoidaan 10 minuuttia ja tämän jälkeen lisätään 2,5 g 30 Aspergillus parasiticus-homeesta saatua hapanta homeprote-aasia (pH-optimi 3,5 - 5) (80.000 LVE/g) ja dispergoidaan * » · edelleen 5 minuuttia.

Saadaan nestemäinen entsyymiformulaatio, jonka aktiivisuus 35 on 200 LVE. Tuotteen aktiivisuus ei laske lainkaan 4 viikon kuluessa 20°C:ssa. Liuos on homogeeninen eikä siinä tapahdu pinnalle nousemista eikä saostumista.

24 93656

Esimerkki F

Lampaan ja karitsan piklausnahasten rasvanpoisto ja entsy-maattinen kuohkeuttaminen 5 Vanuttaminen (prosenttitiedot piklauspainosta)

Sekoitetaan 5 minuuttia 200 % 35°C vettä ja 15 % keittosuolaa, lisätään 10 kg piklausnahaksia ja sekoitetaan 10 30 minuuttia, poistetaan lihat ja liuos valutetaan pois.

Rasvanpoisto (prosenttitiedot lihattomasta painosta) 15 Sekoitetaan 30 minuuttia 30 % 35°C vettä, 2 % ei-ionillista kostutusainetta, jonka pohjana on rasva-alkoholietoksylaat-ti (6-8 moolia etyleenioksidia), 6 % esimerkin E nestemäistä entsyymiä (200 LVE/g) ja 8 kg piklausnahaksia.

20 Entsyymi/tensidi/petroli-yhdistelmän vaikutuksesta saadaan nahaksista rasva hyvin poistettua ja nahakset möyhennettyä.

Piklauksenpoistoa varten voidaan kaupallisia piklauksen-poistoparkitsemisaineita lisätä pidempään käytettyihin tai 25 uusiin liuoksiin, jolloin jatkokäsittely voidaan suorittaa tunnetulla tavalla.

Esimerkki G

30 Sekoitusastiaan lisätään 927,5 g ei-ionillista vedetöntä kostutusainetta, jonka pohjana on nonyylifenoli +8,5 moolia etyleenioksidia, ja 12 g Aerosil 380-tuotetta (Degussa, Hanau, Saksa-BRD, voimakkaasti dispergoitu amorfinen piidioksidi) ja dispergoidaan 5 g Borchigen 35 STL-tuotetta (kostutus- ja käsittelyaine, pohjana modifioidut rasvahapot, Borchers, Goslar, Saksa-BRD) 15 minuutin aikana hammaslevysekoittimella nopeudella n 25 93656 15 - 18 m/sek. Viskositeetti nousee arvosta 15 mPA arvoon 255 mPa. (Määritetään Brookfield-viskositeettimittarilla, mittauspää 1/6 kierr./min.). Sen jälkeen lisätään 55,5 g a-amylaasitiivistettä (90 000 SKB/g (SKB-analyysi, kts.

5 Sandsted, R.M.E., E. Kneen ja M.J. Blish, Cereal Chem. 16, 712 (1939) saatu Bacillus subtilis-bakteerista). Dispergoi-daan vielä 15 minuuttia. Valmis neste-formulaatio, jonka aktiivisuus alussa on 5 000 SKG/g, ei ole 4 viikon kuluttua saostunut eikä noussut pintaan. Aktiivisuustappio säilytet-10 täessä 25°C:ssa on 3,4 %.

Esimerkki H

Farkkukankaan entsymaattinen esipehmennys 15 10 kg Denim-kangasta (farkkukangasta), joka on käsitelty tärkkelysliimalla, lisätään 50 litraan 40°C vettä. Lisätään 50 ml esimerkin G tuotetta, minkä jälkeen lämpötilaa nostetaan 10 minuutin kuluessa 60°C:een ja kangasta pestään 5-10 minuuttia ja tämän jälkeen huuhdellaan kaksi kertaa 20 50 ml:11a 40°C vettä. Tärkkelyksen hajoamistuotteiden pois tamiseen tarkoitettu lisäpesu kostutusaineella jätetään pois. Kankaalla, josta liimaliuos on poistettu, on kaunis pehmeä tuntu.

25 Esimerkki I

. Nestemäinen, biologisesti hajoava suurtalouspesuaine

Sekoitusastiassa dispergoidaan hammaslevysekoittimen avulla nopeudella 15 - 18 m/sek. 15 minuuttia 466 g 1,2-propylee-30 niglykolia, 400 g ei-ionillista Marlipal 01390(isotri-dekyylialkoholi + 9 moolia etyleenioksidia, Chemischen Werke HCils-yhtiön tuote, Saksa-BRD) , 100 g etyylialkoholia (98 %) ja 10 g Aerosil 380*R)-tuotetta (pitkälle dispergoi-tu piidioksidi (Degussa, Saksa-BRD sekä 4 g Borchigen 35 STD^-tuotetta (modifioituihin rasvahappoihin (eetteröity) pohjautuva kostutus- ja käsittelyaine, Borchers, Goslar, Saksa-BRD). Viskositeetti nousee arvoon 1250 mPa. Tämän 26 93656 jälkeen lisätään seuraavassa järjestyksessä seuraavat kiinteät tuotteet yhä edelleen dispergoiden: 6 g alkalista proteaasia (Bacillus subtilis-bakteerista, aktiivisuus 92 000 LVE/g) 5 4 g a-amylaasia (Bacillus subtilis-bakteerista, 90 000 SKB/g) 6 g optista kirkastinta (4,4'-bis-(4-amino-6-/N-(2-hydroksietyyli)-N-(2-karbamoyylietyy-li)amino/-S-triaksin-2-yyli-amino-2,2'-stilbeeni-di-sulfonihappo 10 2 g EDTA'n (etyleenidiamiini-tetraetikkahappo) Na-suolaa 6 g -C9-C12-olefiinisulfonaatti-Na-suolaa (98 %)

Suoritetun lisäämisen jälkeen dispergoidaan vielä 15 minuuttia. Saadulla sakealla, hyvin kaadettavissa olevalla 15 liuoksella ei esiinny saostumista eikä pinnallenousua 4 viikon varastointiajan jälkeen 25°C:ssa. ar-amylaasin aktiivisuustappio oli 1 % 4 viikon jälkeen 25°C:ssa ja proteaasi oli menettänyt lähtöaktiivisuudestaan 1,4 %.

20 Esimerkki J

Veren likaaman puuvillakankaan liottaminen 60°C:ssa 500 g valkoista puuvillakangasta, joka oli kyllästetty naudanverellä ja kuivattu, käsitellään 15 minuuttia 25 60°C:ssa 2,5 litralla vettä, jossa on 6 g esimerkin 1 Γ nestemäistä pesuainetta (varastointiaika 3 kuukautta) ja 2 g natriummetasilikaattia, minkä jälkeen pestään kaksi kertaa 30°C:ssa 2,5 litralla vettä. Vertailun vuoksi käsitellään sama kangas samoissa olosuhteissa myös 6 g :11a yhtä 30 pitkän varastointiajan omaavaa nestemäistä pesuainetta, joka on identtinen esimerkin I kanssa, jolloin kuitenkin käytetään 1,2-propyleeniglykolin asemesta vettä.

Kun kummatkin koekankaat arvioitiin ELREFOMAT DFC 5 ^ -35 remissiofotometrillä (Zeiss, Saksa-BRD) havaittiin, että veri poistui kankaasta 46 % paremmin, kun käsittely suoritettiin vedettömällä pesuaineella.

Il 27 93656

Esimerkki K

Nestemäisen lipaasituotteen valmistaminen

Sekoitusastiassa dispergoidaan hammaslevysekoittimella 5 nopeudella 15 - 18 m/sek. 15 minuuttia 968 g Genapol 0 - 050 -tuotetta (C16-C18-rasva-alkoholi, jossa 5 moolia etyleenioksidia, Hoechst AG, Saksa-BRD), 12 g Aerosil 380 tuotetta (pitkälle dispergoitu piidioksidi, Degussa, Saksa-BRD) ja 4 g Brochigen STD-tuotetta (modifioituihin 10 rasvahappoihin pohjautuva kostutus- ja käsittelyaine,

Borchers, Goslar, Saksa-BRD). Viskositeetti nousee arvosta 18 mPa arvoon 290 mPa. Tämän jälkeen lisätään 16 g lipaasi-tiivistettä (Pseudomonas-lajista, aktivisuus 5 0000 LCA/mg, LCA-yksiköiden määritelmä ja määrittäminen: Semeriva, 15 Biochem. 10, 2143 (1971) ja dispergoidaan edelleen 10 minuuttia. Saadaan nestemäistä entsyymituotetta, jonka aktiivisuus on 80 LCA/mg ja jossa 25°C:ssa tapahtuvan 6 viikon säilyttämisen jälkeen ei tapahdu saostumista eikä pinnal-lenousua. Tämän säilytysajan jälkeen aktiivisuus on vielä 20 77 - 78 LCA/m g.

Esimerkki L

Naudantalin saippuointi 25 400 g naudantalia ja 600 g vettä emulgoidaan 50°C:ssa ...Γ 5 g kanssa esimerkin K lipaasituotetta ja sekoitetaan tässä lämpötilassa 3 tuntia. Tämän ajan kuluttua saadaan hydrolyysiasteeksi 72 % titraamalla hydrolyysin vapauttamat rasvahapot (IUPAC-Standard Methods of Oils, Fats and 30 Derivatives, Permagon Press, Oxford, 6. painos, s. 56, 1979).

28 93656

Esimerkki M

Nestemäisen sellulaasi/hemisellulaasipreparaatin valmistaminen 5 Sekoitusastiassa dispergoidaan hammaslevysekoittimella 15 - 18 m/sek. pyörimisnopeudella 10 minuutin ajan 882 g etyleeniglykolia, 13 g Aerosil 200-tuotetta (pitkälle dispergoitu piidioksidi, Hoechst AG, Saksa-BRD) ja 5 g Borchigen STL-tuotetta (modifioituihin rasvahappoihin 10 perustuva kostutus- ja käsittelyaine, Borchers, Goslar, Saksa-BRD). Viskositeetti nousee arvosta 35 mPA arvoon 330 mPa. Tämän jälkeen lisätään 100 g sellulaasi/hemisellu-laasikonsentraattia (Trichoderma viridi-homeesta, aktiivisuus 10 000 FPU/g, FPU-yksikkö: Mandels, M., Andreotti, R., 15 ja Roche C., (1976) Biotech. Bioemp. Symp. 6, 17) ja dis pergoidaan edelleen 10 minuuttia. Saadaan viskoosi homogeeninen entsyymituote (2 600 mPA), jonka aktiivisuus on 10000 FPU/g ja jossa ei esiinny saostumista eikä pinnalle-nousua 5 viikon 25°C:ssa tapahtuvan säilyttämisen jälkeen.

20 Tämän säilytysajan jälkeen aktiivisuus on 95 %.

Esimerkki N

Sellulaasi/hemisellulaasi gluteenin suodattamiseen 25 10 kg gluteenisuspensiota (kuiva-ainepitoisuus noin 30 %), joka on erotettu sentrifugoimalla maissitärkkelystä, käsitellään 3 g:11a sellulaasituotetta tunnin ajan 40°C:ssa.

Näin hajotetaan suodattamista estävät polysakkaridit ja tuloksena on nopeampi ja yksinkertaisempi suodattaminen 30 vakuumirumpusuodattimellä.

»

Esimerkki O

Sekoitusastiassa dispergoidaan hammaslevysekoittimella 35 15 minuuttia (pyörimisnopeus 15 - 18 m/sek.) 975 g glyse- riiniä (vesipitoisuus ± 1 %) 20 g kanssa Aerosil 380^R^-

II

29 93656 tuotetta (pitkälle dispergoitu piidioksidi, Degussa, Saksa-BRD). Sen jälkeen lisätään 5 g pektinaasitiivistettä (Aspergillus oryzae-homeesta, aktiviisuus 100 000 PGU/mg, PGU-yksikön määritelmä ja määrittäminen, vrt. Röhm-5 Analysenvorschrift PZV-30) ja dispergoidaan edelleen 10 minuuttia. Saadaan nestemäinen, hyvin kaadettavissa oleva, homogeeninen pektinaasituote, jonka aktiivisuus on 5 000 PGU/mg ja jossa ei esiinny pinnalle nousemista eikä saostumista 6 viikon 25°C:ssa tapahtuvan säilyttämisen 10 jälkeen. Aktiviisuus tämän säilyttämisajan jälkeen on vielä 97 % lähtöarvosta.

Esimerkki P

Pektinaasi mehun kirkastamiseen 15 1000 1 juuri puristettua appelsiinimehua käsitellään 50 g:11a esimerkin O pektinaasituotetta. Tällöin pektiini sekä kolloidaaliset aineet, joita on samentavissa hiukkasissa, hajoavat. Nämä kolloidit ovat haitallisia samentuman 20 blokkauksessa tai ultra- tai mikrosuodattamalla tapahtuvassa kirkastamisessa. Kahden tunnin käsittelyn jälkeen samen-tuma plokataan lisäämällä bentoniittiä. Tätä seuraava suo-datusprosessi sujuu helposti ja ongelmitta.

25 Esimerkki O

Nestemäinen apuaine entsymaattiseen liotukseen

Sekoitusastiassa dispergoidaan hammaslevysekoittimella pyörimisnopeudella 15 - 18 m/sek. 15 minuutin ajan 300 g 30 ionitonta C-okso-alkoholi + 6 etyleenioksidimooli-pohjaista tensidiä ja 682 g ionitonta, C-oksoalkoholi + 9 etyleeni--j oksidimooli-pohjaista tensidiä sekä 13 g Aerosil 380 ^- tuotetta(pitkälle dispergoitu piidioksidi, degussa, Saksa-BRD) ja 5 g Borchigen STL#R)-tuotetta (modifioituun rasva-35 happoon pohjautuva kostutus- ja käsittelyaine, Borchers, Goslar, Saksa-BRD). Sen jälkeen lisätään peräkkäin 27,5 g alkalista proteaasia (Bacillus subtilis-bakteerista, aktii- 30 93656 visuus 80 000 LVE/g) ja 10 g homeproteaasia (Aspergillus parasiticus-homeesta, 220 000 LVE/g) ja dispergoidaan vielä 10 minuuttia. Saadaan nestemäinen homogeeninen, hyvin kaadettavissa ja pumpattavissa oleva entsyymituote, jossa 5 4 viikon säilytysajan jälkeen ei esiinny saostumista eikä pinnaltanousua. Aktiivisuus tämän jälkeen on 25°C säilytys-lämpötilassa vielä 97 % lähtöaktiivisuudesta 4 400 LVE/g.

Esimerkki R

10 Likaantuneiden naudannahkojen entsymaattinen pehmentäminen (prosenttitiedot suolan painosta) 100 kg likaisia naudannahkoja 200 % 26°C vettä 15 0,25 % esimerkin Q entsyymituotetta 0,2 % 50-prosenttista natriumhydroksidia

Pehmennetään 5 tuntia ammeessa, minkä jälkeen suolatut nahat ovat saaneet täydellisesti takaisin pehmeytensä ja 20 niistä on poistunut suuri osa nahan rasvasta ja liasta ja ne ovat valmiita karvojen möyhentämiseen.

Esimerkki S

Nestemäisen peittausaineen, jolla on kalkkia poistava ja 25 rasvaa poistava vaikutus, valmistaminen

Sekoitusastiaan lisätään 400 g etyleenikarbonaattia ja tämän kanssa sekoitetaan 300 g metyylietyyliketonia ja 264 g ionitonta tensidiä (Clg-C18-rasva-alkoholi, jossa 30 9 moolia etyleenioksidia), lämmitetään 40°C:een ja tähän lisätään 10 g Aerosil 380^-tuotetta (pitkälle dispergoitu • piidioksidi, Degussa, Saksa-BRD) sekä 6 g Brochigen STL^-tuotetta (Borchers, Goslar, Saksa-BRD, kts. esimerkki Q). Seosta dispergoidaan 15 minuuttia hammaslevysekoittimella 35 15-18 m/sek. pyörimisnopeudella. Viskositeetti nousee arvosta 60 mPA arvoon 1040 mPa. Tämän jälkeen lisätään 20 g haimaentsyymi-tiivistettä (aktiivisuus 40 000 LVE/g) ja 31 93656 dispergoidaan vielä 20 minuuttia. Saadaan nestemäinen, hyvin kaadettavissa oleva homogeeninen entsyymiformulaatio, jossa ei esiinny saostumista tai pinnallenousua 5 viikon 25°C:ssa säilyttämisen jälkeen. Aktiivisuus tämän ajan jäl-5 keen 25°C:ssa on 760 LVE/g. (Lähtöaktiivisuus 800 LVE/g).

Esimerkki T

Naudannahasten entsymaattinen peittaus ja kalkinpoisto 10 10 kg kalkittuja ja pestyjä naudannahaksia, halkaistun nahan paksuus 3-4 mm, 30 % 35°C vettä, 1 paino-% entsyy-mituotetta (800 LVE/g, identtinen esimerkin S kanssa), 2 paino-% ammoniumsulfaattia.

15 70 minuutin kuluttua nahaksista on kalkki täydellisesti poistunut ja juuri- ja parkitsemisjätteet möyhentyneet erittäin hyvin. Liuoksen loppu-pH on 7,8. Luonnonrasva on poistunut hyvin nahoista ja emulgoitunut liuokseen.

20 Esimerkki U •

Dekantterilasissa dispergoidaan hammaslevysekoittimella 15 - 18 m/sek. pyörimisnopeudella 10 minuutin ajan 984 g 1,2-propyleeniglykolia (vedetön) 10 g kanssa Aerosil 25 380 -tuotetta (kts. esimerkki G) ja 5 g kanssa Borchigen . STL-tuotetta (kts. esimerkki G). Viskositeetti nousee arvosta 20 mPa arvoon 310 mPa. Tämän jälkeen lisätään 1 g piparjuuri-peroksidaasia (1000 yksikköä/g, määritelmä ja määrittäminen: Taele, F.W.J., biochem. Biophys. Acta, 35, 30 543 (1959) ja dispergoidaan vielä 10 minuuttia. Saadaan nestemäinen, hyvin valuva tuoteformulaatio (280 mPA), jossa • ei esiinny saostumista eikä pinnallenousua 4 viikon säily-tysajan jälkeen. Tämän ajan jälkeen aktiivisuus on laskenut 2 %.

35 95656 32

Esimerkki V

Väriliuoksen valmistaminen (mallireaktio)

Liuos A

5 1 g m-fenyleenidiamiinia liuotetaan 999 g:aan 0,1 m fos- faattispuskuria (0,1 m, pH 7).

Liuos B

Vetyperoksidi (30 %).

10

Reaktion suorittaminen 1 g esimerkin U peroksidaasituotetta lisätään 1000 g:aan liuosta A ja lisätään sekoittaen 5 g liuosta B. Tällöin havaitaan, että muodostuu punainen, muutaman minuutin 15 jälkeen yhä tummemmaksi muuttuva atsoväri.

1 ·

II

Claims (18)

1. 93656
2. 1. Teolliseen käyttöön tarkoitettu nestemäinen entsyymifor-mulaatio, tunnettu siitä, että entsyymi, joka on 5 valittu ryhmästä: A) proteaasit B) amylaasit C) lipaasit D) katalaasit/hydroksiperoksidaasit 10 E) sellulaasit dispergoidaan vedettömään orgaaniseen liuottimeen, jonka molekyylipaino on pienempi kuin 110 ja jonka kiehumispiste on alle 300°C normaalipaineessa, sillä edellytyksellä, että entsyymin painosuhde liuottimeen on 1:10 - 1:500, pulveri-15 maisen epäorgaanisen dispergaattorin, joka on valittu ryhmästä maa-alkalikarbonaatit, fosfaatit, sulfaatit, silikaatit, savilajit ja silikadioksidit, läsnäollessa paino-osina 0,1 - 6 laskettuna liuotinaineesta.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen nestemäinen entsyymifor- mulaatio, tunnettu siitä, että neste on vedetön, mutta veden kanssa sekoittuva orgaaninen liuotin.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen nestemäinen entsyymifor-25 mulaatio, tunnettu siitä, että neste on orgaaninen liuotin, joka ei sekoitu veden kanssa.
5. 4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen nestemäinen entsyymifor-mulaatio, tunnettu siitä, että veden kanssa se- 30 koittuva orgaaninen neste sisältää jälkimmäisestä laskettuna 1 - 10 paino-% hiilivetyjä, joissa on 5 - 20 hiiliato--· mia.
6. 5. Patenttivaatimuksen 1-4 mukainen nestemäinen entsyymi-35 formulaatio, tunnettu siitä, että se sisältää pinta-aktiivisia aineita, joiden määrä nesteestä laskettuna on 0,001 - 50 paino-%. 93656
7. 6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen entsyymiformu-laatio, tunnettu siitä, että liuotin on syklinen hiilihappoesteri tai sisältää sitä.
8. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen formulaatio, tun nettu siitä, että liuotin on propyleenikarbonaatti tai sisältää sitä.
9. 8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukaisen nestemäisen 10 entsyymiformulaation käyttö nahan valmistuksessa.
10. 9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukaisen nestemäisen entsyymiformulaation käyttö pesu- ja puhdistusaineena.
11. 10. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen nestemäisen proteaasi- ja/tai amylaasiformulaation käyttö liimaliuoksen poistamisessa.
12. 11. Patenttivaatimuksen 1 mukaisten nestemäisten katalaasi-20 formulaatioiden käyttö peroksidivalkaisussa.
13. 12. Patenttivaatimuksen 1 mukaisten nestemäisen sellulaa-siformulaatioiden käyttö selluloosapitoisten substraattien teknistä muuntamista varten. 25 . 13. Menetelmä nahkojen kalkin poistamiseksi ja peittaami- seksi, tunnettu siitä, että käytetään patenttivaatimuksen 1 mukaisia nestemäisiä proteaasi- ja/tai amylaasi-formulaatioita. 30
14. 14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, t u n -• n e t t u siitä, että käytetään pankreaasientsyymin nestemäistä formulaatiota.
15. 15. Menetelmä nahkojen ja vuotien entsymaattista liotusta varten, tunnettu siitä, että käytetään patentti 93656 vaatimuksen 1 mukaisia nestemäisiä proteaasi- ja/tai amy-laasiformulaatioita.
16. 16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, t u n - 5. e t t u siitä, että käytetään neutraalien proteaasien nestemäisiä formulaatioita.
17. 17. Menetelmä nahkojen rasvan poistamiseksi, tunnet -t u siitä, että käytetään patenttivaatimuksen 1 mukaisia 10 happamien proteaasien nesteformulaatioita.
18. 18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään Aspergillus-proteaasin nestemäistä formulaatiota. 15 > · 93656