FR2610947A1 - Formulations liquides d'enzymes - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UNE FORMULATION LIQUIDE D'ENZYMES POUR APPLICATIONS INDUSTRIELLES, DANS LAQUELLE LE VEHICULE LIQUIDE POUR L'ENZYME SE COMPOSE D'AU MOINS UN SOLVANT ORGANIQUE ANHYDRE.

Description

L'invention concerne des formulations liquides d'enzymes, avec utilisation

de solvants organiques anhydres, de préférence conjointement avec des additifs qui influent sur la rhéologie, formulations qui conviennent particulièrement & l'application dans

l'industrie du cuir.

L'application industrielle d'enzymes peut actuellement susciter un grand intérêt, car elle passe pour le prototype d'une technique 'douce'. La nature et le nombre des procédés industriels dans lesquels des enzymes sont utilisées sont encore limités. On peut toutefois s'attendre à un développement <cf. Ullmanns Encyclopâdie der technischen Chemie, volume 10, pp. 522-526 sqq., Verlag Chemie 1975; Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical

Technology, 3ème éd., vol. 9, pp. 173-224, J. Wiley 1980).

Il y a lieu de mentionner en particulier les domaines de la technique des produits alimentaires et de fourrage, de la technique des détergents et de la fabrication des cuirs, dans lesquels l'application d'enzymes relève déjà d'une longue tradition. En outre, des enzymes trouvent aussi des applications dans des réactions chimiques orientées vers un objectif (cf. Raul Prawe, Jahrbuch Biotechnologie, 1986/87, Carl Hauser Verlag, Munich,

Vienne, pp. 359-397).

Des représentants importants d'enzymes utilisées dans l'industrie (Industrial Bnzymes = IE) sont, entre autres, les yaminobutyrotransaminases, les amylases, les cellulases, les collagênases, les glucose-oxydases, les acide glutamique-décarboxylases, les hémicellulases, les invertases, les catalases, les lipases, les pectinases,

les pénicillases, les protéases, les streptokinases.

Etant donné qu'en ce qui concerne les milieux dans lesquels les enzymes que l'on trouve dans la nature sont actives, il s'agit dans une très large mesure de milieux aqueux, on peut considérer le milieu aqueux comme milieu

standard pour des réactions enzymatiques.

Eu égard au fait qu'en tant que polypeptides dont l'activité dépend en première approximation de leur organisation structurale, les enzymes, de même que d'autres protéines, peuvent être dénaturées par certains solvants organiques, il a été conseillé de tout temps de garder une certaine réserve quant à l'emploi de solvants organiques avec des enzymes. Plus récemment, à l'occasion de recherches sur des enzymes immobilisées, on a déterminé l'influence d'additions de solvants organiques hydrosolubles au milieu aqueux et on a constaté que la vitesse de réaction augmentait avec l'abaissement de la constante diélectrique [cf. H. Weetall, P. Vann dans "Enzyme Engineering" vol. 4 (Ed. G.B. Brown et al.), "NCI

Xonograph" n' 27 (Ed. X.P. Stulberg) 1967, pp. 141-152].

Pour la manipulation, et en particulier pour le dosage d'agents chimiques, il est souvent considéré comme

avantageux que ceux-ci se présentent sous forme liquide.

En règle générale, on rencontre moins de difficultés à incorporer des préparations liquides dans des milieux réactionnels liquides qu'à y introduire des poudres ou d'autres corps solides. Cela vaut aussi pour des

préparations d'enzymes.

On constate par exemple des tendances dans ce sens dans l'industrie des produits de lavage. D'un autre côté, on se trouve en face de toute une série de problèmes a*ec les préparations d'enzymes liquides. En premier lieu se situe la stabilité de telles préparations d'enzymes. Comme on l'a déjà indiqué, les enzymes en milieu aqueux subissent l'influence des autres constituants présents dans le milieu, tels qu'acides, bases, sels, constituants tensio-actifs et complexants, autres macromolécules et notamment autres enzymes, substrats de l'action enzymatique, etc. Ces additifs peuvent aussi bien avoir un effet stabilisant que déstabilisant. En tant qu'additifs stabilisants pour certaines enzymes dans des solutions aqueuses, il a par exemple été proposé des glycols, des polyglycols, des agents tensio-actifs, des protéines et des hydrolysats de protéines, des polymères synthétiques, des acides carboxyliques, des cations ou des anions spécifiques, etc. [cf. brevet US n' 4 519 934; L. Kravetz, K.F. Guin, Journal of the Am. Oil. Chem. Soc., vol 62, 5 <1985); L. Gianfrede, K. Modafferri et G. Greco, Enzyme

Xicrob. Technol., 7, 78-52 <1985); K. Kartinek, V.P.

Torchilin, Enzyme Microb. Technol., vol. 1, 74-82 (1979);

US-A 4 111 855 (1978); US-A 4 318 818 (1982); US-A 3 557

002 (1971); US-A 4 169 817 <1979)].

En tant qu'autre possibilité pour stabiliser des enzymes en solution aqueuse, il a été envisagé la formation de micelles inverses dans le système eau/agent

tensio-actif/solvant organique [cf. P.L. Luisi, Angew.

Chem. 97, 449-460 (1985)].

Le but de la présente invention sera exposé en détail à propos de l'exemple des enzymes ou systèmes d'enzymes

utilisés dans la fabrication des cuirs.

Dans la fabrication des cuirs précisément, le dosage de liquides a fortement gagné du terrain depuis quelque temps par rapport au dosage de matières solides, car il présente effectivement des avantages, notamment à la manipulation. Le problème, à la confection de préparations liquides contenant des enzymes, par exemple d'adjuvants de déchaulage et de trempe enzymatiques, se situe dans

l'insuffisance de stabilité de ces produits.

L'instabilité, en particulier de préparations de produits pancréatiques, n'est nullement inattendue: on la constate déjà en partie dès le traitement des enzymes. S'agissant de protéases, on doit spécialement s'attendre à l'effet d'auto-digestion et & l'effet de dégradation sur d'autres protéines enzymatiques présentes [cf. K. Martinek, V.P. Torchilin, Enzyme Microb. Technol., vol. 1, pp. 74-82

(1979>].

Il reste à constater que Jusqu'ici, les préparations liquides d'enzymes n'ont pas pu s'imposer dans la pratique. Il se posait donc, après comme avant, le problème de mettre à la disposition des utilisateurs des formulations liquides pour enzymes (a) qui soient suffisamment stables dans les conditions de la pratique, <b) avec lesquelles, dans toute la mesure du possible, l'activité des enzymes ne soit pas influencée, tout au moins de façon irréversible, <c> qui soient compatibles avec les domaines d'utilisation envisagés des enzymes et (d) qui soient acceptables du point de vue économique et écologique. On peut exiger d'une telle préparation, dite "enzyme liquide", pour les méthodes modernes de la fabrication des cuirs, que la baisse d'activité en une

période de 4 à 6 mois ne dépasse pas 15%.

Or, il a été découvert que, de façon surprenante, les formulations d'enzymes selon l'invention répondaient dans

une large mesure aux exigences de la technique.

L'invention concerne des formulations liquides d'enzymes & application technique, avec utilisation, comme véhicule liquide pour les enzymes, d'au moins un solvant <S) organique pratiquement anhydre ou de mélanges de tels solvants. Entrent de préférence en ligne de compte, en tant que solvants, en harmonie avec les buts précités de l'invention, des solvants usuels en soi, non nuisibles aux enzymes, de préférence inoffensifs pour l'environnement et notamment peu toxiques. En dehors 'du carbone, de l'hydrogène et éventuellement de l'oxygène ou, avec une moindre préférence, du soufre, les solvants organiques S utilisés d'après l'invention ne contiennent de préférence pas d'autres hétéroatomes. La préférence est donnée à des solvants de structure I

R1 - X - R2 I

dans laquelle X est mis pour un atome d'oxygène ou de soufre, Ri pour un radical alkyle à 1-8 atomes de carbone, pour un radical -CH-OH, Rs représentant un atome R3 d'hydrogène, -CH3 ou -CH20H, ou pour un radical (CHr-CH.O).-H, n représentant un nombre de 1 à 15, R2 pour un atome d'hydrogène ou un radical alkyle à 1-8 atomes de carbone, ou dans laquelle R et R2 sont mis pour un radical -CH2-CH20H, ou dans laquelle

Ri et R2 forment avec l'atome d'oxygène un noyau penta-

ou hexagonal, tous les termes cycliques étant des groupes -CHz2 ou un terme cyclique étant un groupe carbonyle ou, le cas échéant, un autre terme cyclique pouvant être un atome d'oxygène, ou dans laquelle X est mis pour un groupe carbonyle -C=O, avec cette condition que, dans ce cas, Ri et R2 sont mis pour un radical alkyle à 1-3 atomes de carbone, ou dans laquelle X est mis pour un groupe -COO avec cette condition que, dans ce cas, Ri et R2 sont mis pour un radical alkyle à 1-6 atomes de carbone ou Ri est mis pour un atome d'hydrogène et R2 pour un radical alkyle à 1-6 atomes

de carbone.

Sont en outre utilisables, comme solvants S, ceux qui présentent la structure

O - R. II

dans laquele Re est mis pour un radical -CH3 ou -CH=CH2.

On citera en particulier, comme représentants de formule I, des esters de l'acide carbonique, en particulier des esters cycliques de l'acide carbonique, notamment le carbonate de propylène. Intéressants sont par ailleurs des polyalcools tels que la glycérine, l'éthylèneglycol, le butylglycol, le butyldiglycol, le diéthylèneglycol, le polyéthylèneglycol (<w d'au moins 400). des polyéthylèneglycols liquides et leurs dérivés éthérifiés, des monoalcanols tels que le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol, le n-butanol, l'isobutanol, le 2-éthylhexanol et le cyclohexanol, des éthers tels que l'éther diéthylique, le méthoxypropanol, l'éther monométhylique du diéthylèneglycol et en particulier des éthers cycliques tels que le dioxanne, le tétrahydrofuranne, des cétones telles que l'acétone, l'éthylméthylcétone et la cyclohexanone, des esters tels que l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, des lactones telles que la butyrolactone. On peut également citer: les oxoalcools et leurs produits d'éthoxylation avec de 3 à environ 14 unités oxyde d'éthylène, les alcools gras et leurs produits d'éthoxylation avec Jusqu'à 14 unités oxyde d'éthylène, les oléfines et leurs dérivés sulfonés, par exemple les a-oléfinesulfonates en C*-C,2 sous forme par exemple de leurs sels alcalins et particulièrement de sodium, les éthersulfates d'alcools gras comme par exemple les alcools en C12-Cs sulfatés condensés avec de l'oxyde d'éthylène, ainsi que les alcanolamides d'acides gras liquides comme par exemple l'éthanolamide d'acides gras en C1.-Ci., de même que les alkylphénols et leurs dérivés, tels que l'octylphénol et ses dérivés éthoxylés et le nonylphénol éthoxylé avec 8-9 mol d'oxyde d'éthylène. Des mélanges peuvent aussi être avantageux. En tant que représentants de formule II, on citera le toluène et le styrène; sont par ailleurs utilisables la térébenthine, le white-spirit, des essences minérales, des hydrocarbures aliphatiques et des huiles minérales (gamme d'ébullition comprise de préférence entre 50 et 180'C, notamment entre et 150'C). A l'exception des polyéthylèneglycols, il s'agit en règle générale, en ce qui concerne les solvants S, de solvants qui ont un poids moléculaire < 110 et, pour la plupart, des points d'ébullition au-dessous de 300'C sous la pression atmosphérique normale (on pourra par exemple trouver d'autres données concernant les solvants dans la monographie de Gnamm, Fuchs, Losungsmittel und

Weichmachungsmittel, 8ème édition, Wissensch.

Verlagsgesellschaft, Stuttgart 1980). Les solvants organiques S à utiliser melon l'invention sont pratiquement anhydres, c'est-à-dire qu'ils contiennent en règle générale moins de 1% en poids d'eau, de préférence pas plus de l'humidité résiduelle habituelle. La déshydratation des solvants S est effectuée de façon cnnue en soi, par exemple par utilisation de dessiccateurs usuels, par distillation, par formation d'azéotropes, etc.

(cf. Houben Weyl, vol. I/2, pp. 765-886, Georg Thieme-

Verlag 1959).

La présence d'eau dans les formulations de l'invention n'est en général pas prévue, tout au moins dans des proportions nuisant au but de l'invention. En cas d'utilisation de solvants qui ne me mélangent pas à l'eau, les formulations d'enzymes peuvent contenir en plus des

agents tensio-actifs. On préférera ici des agents tensio-

actifs non ioniques du type alcool gras/éthoxylate d'alkylphénol (par exemple avec l'alcool oléocétylique et oléilque), ainsi que des produits d'addition de polyglycols avec 4 à 42 mol d'oxyde d'éthylène, outre des agents de type anioniques tels qu'alkylsulfates, alkyléthersulfates, alkylphosphates, alkylétherphosphates, alkylsulfonates et alkylarylsulfonates (cf. DE-A 33 22 840). La proportion des agents tensioactifs est comprise d'une manière générale entre 0,001 et 50% en poids, de préférence entre 0,005 et 20% en poids par rapport au véhicule liquide. En général, la valeur HLB des émulsifiants <ou activité émulsionnante huile/eau) est de l'ordre de 8 à 18, de préférence de 9 à 15 (au sujet des émulsifiants et de la

valeur HLB, cf. Kirk-Othmer, 3ème édition, volume 8, 910-

916>. On préférera par ailleurs les solvants S qui se mélangent à l'eau, en particulier les solvants miscibles à l'eau dans tout rapport. En première approximation, on peut partir du fait que les enzymes restent entièrement non dissoutes dans les solvants S. En conséquence, la tendance & l'autodigestion ou à la dégradation d'autres

enzymes diminue dans une très large mesure.

La quantité des solvants S utilisés se Juge en premier lieu d'après ce qui convient pour la manipulation des enzymes; & proprement parler, elle n'a pas une importance décisive. En général, pour des raisons de possibilité de manipulation, on ne descendra pas au-dessous d'un rapport en poids enzyme/solvant S de 1:10. Pour que les conditions de concentration soient raisonnables, la limite supérieure du rapport en poids enzyme/S sera fixée en règle générale entre 1:30 et 1:500. En tant que règle générale, un

rapport enzyme/S de 1 à 50 s'est révélé très convenable.

Conviennent aussi, le cas échéant, des mélanges des solvants S précités. Lors de l'addition des enzymes, essentiellement constituées par des protéines, aux solvants S pratiquement anhydres, il peut se poser des problèmes tels qu'une humectation difficile et/ou des problèmes de distribution tels que des phénomènes de

dépôt ou de crémage.

En un développement de la présente invention, il a été découvert que les problèmes liés à la préparation de formulations d'enzymes liquides homogènes, tels que le crémage et le dépôt, pouvaient être résolus, au moins en partie, lorsqu'on introduisait des additifs inorganiques en poudre AI en dispersion dans les solvants. Des additifs en poudre formés de dispersants inorganiques ont éte décrits pour des applications tout & fait différentes, par exemple en tant que dispersants de dispersions "huile dans eau" ou que dispersants dans la polymérisation radicalaire en perles (cf. Houben-Weyl, Xethoden der Organischen Chemie, vol XIV/1,] akromolekulare Stoffe, pp. 420-421, Georg-Thieme-Verlag 1961). Comme dispersants inorganiques de ce type, on citera par exemple des sels insolubles des métaux alcalinoterreux (carbonates, phosphates, sulfates, silicates), l'hydroxyde d'aluminium, le talc et la bentonite, et en particulier le bioxyde de silicium, et spécialement le bioxyde de silicium fortement dispersé

(c.f. Kirk-Othmer, 3ème édition, op.cit, vol.20, p.748-

781, Ullmann, 4ème édition, vol.18, p.652-656, Verlag Chemie 1979). Pour atteindre le but de la présente invention, des argiles, en particulier la bentonite, sont à conseiller. Comme on le sait, le kaolin et la bentonite forment, avec une série de liquides organiques polaires et non polaires, des gels thixotropes. La thixotropie des gels disparaît lorsqu'on ajoute par exemple de petites quantités d'alcools à longue chaine [cf. Ullmanns Enzyklopâdie der techn. Chemie, 4ème édition, vol. 23, pp. 318-326, Verlag Chemie 1972; U. Hoffmann et al., Kolloid

Z. 151, 97-115 (1957)].

Par argiles, on entend les silicates d'aluminium usuels et par bentonite, les préparations du commerce, composées principalement de montmorillonite (Al Od.4 SiO2.H20). Particulièrement intéressantes sont des bentonites activées organiquement, par exemple celles qui sont obtenues par réaction de Na-montmorillonite avec des composés d'alkylammonium quaternaires. Par échange de cations, il se forme ce qu'on appelle des bentonites organophiles, qui gonflent dans des liquides organiques (cf. Ullmanns, op. cit., p. 323>. En général, on peut utiliser les formes sous lesquelles elles sont livrées dans le commerce (paillettes, grosseur de particules dans la gamme de 0,5 à 5 pm), mais il convient de les soumettre à un traitement sous sollicitation au cisaillement dans le solvant S choisi. En général, la teneur des solvants S en additifs inorganiques AI est comprise entre 0,1 et 3% en poids par rapport au solvant, de préférence entre 0,3 et 1% en poids. Il s'est révélé particulièrement avantageux de soumettre l'additif inorganique du concentré d'enzyme & l'effet de cisaillement en même temps que le solvant S, au moyen d'un appareil approprié, en particulier un appareil à disperser. Entrent en ligne de compte, comme appareils à disperser, des appareils courants dans le commerce (cf. Ullmanns Encyklopadie der technischen Chemie, 4ème édition, vol. 1, p. 239, Verlag Chemie 1972). Les vitesses de rotation ou les durées de traitement à appliquer dépendent en premier lieu du type de l'appareil. On peut donner comme valeur indicative, pour l'action d'appareils à disperser du commerce sur la bentonite dans un solvant S à utiliser selon l'invention, 2 à 60 mn à une vitesse

circonférentielle de 4 à 36 m/s.

Le solvant carbonate de propylène s'est révélé particulièrement approprié, notamment en combinaison avec

la bentonite.

Les formulations selon l'invention ne sont soumises à aucune limitation apparente quant aux enzymes qu'elles contiennent <sauf en ce qui concerne la stabilité des enzymes elles-mêmes en présence de solvants organiques tels que des alcools). Il est entendu que le composant solvant L doit être compatible avec l'utilisation finale

des enzymes. Afin d'accroître l'effet anti-dépôt ou anti-

crémage, on peut ajouter encore des solvants peu polaires aux véhicules liquides, en particulier lorsqu'il s'agit de solvants polaires, par exemple du type de la formule I. C'est ainsi qu'il peut être avantageux que le véhicule liquide contienne 1 à 10% en poids d'hydrocarbures, en particulier de carbures aliphatiques à 5-20 atomes de carbone à chaîne ramifiée ou droite. On mentionnera par exemple des fractions du pétrole, par exemple dans la plage d'ébullition de 50 à 180'C <cf. la définition précédente de S). En tant qu'enzymes, on citera en particulier celles qui sont déjà utilisées industriellement ou dans d'autres domaines d'application

<voir le passage consacré à l'état de la technique ci-

dessus). A> Protéases (E.C. 3.4; Kirk-Othmer, op. cit., vol. 9; K. Aunstrup dans B. Spencer Ed., Industrial Aspects of Biochemistry, vol. 30 (I), pp. 23-46, North Holland 1974) a) d'origine animale, come par exemple a) Rénine (E.C. 3.4.23.4) P) Protéases du pancréas: Pancréatine, en particulier trypsine, chymotrypsine (plage active de pH, 7-10 environ), Pepsine (E.C. 3.4.23.1) (plage active de pH, 1,5-4,0 environ) Cathepsine (E.C. 3.4.23.5) (plage active de pH, 4,0-5,0 environ) b) d'origine végétale a) Papaïne (E.C. 3.4.22.1) plage active de pH, 5,0-8,0 environ >) Ficine (E.C. 3.4.22.3) plage active de pH, 4,0-9,0 environ Y) Bromélaïne (E.C. 3.4.22.4 et 3.4.22.5) plage active

de pH, 5,0-7,0 environ.

c) d'origine microbienne (cf. L. Keay dans "Process Biochemistry", 1971, 17-21 a) du genre Bacillus (comme B. subtilis, B. licheniformis, B. alcalophilus, B. cereus, B. natto, B. vulgatus, B. mycoides) $) du genre Streptococcus y) du genre Streptomyces (comme S. fradiae, S. griseus, S. rectus) 6) du genre Aspergillus (comme A. flavus-oryzae, A. niger, A. saitoi, A. usamii) c) 'des genres Mucor et Rhizopus (commne M. pusillus, M. mietrei) ) du genre Endothia (comme E. parasitica)

) du genre Trametes (comme T. sanguinea).

Outre la distinction selon l'origine, on peut aussi appliquer une distinction selon le lieu d'attaque (exo- ou endo-enzymes) et selon le "site actif" des protéases <sérine-protéases, qui sont inhibées par DFP, sulfhydryle- enzymes). En outre, la dépendance de l'activité enzymatique à l'égard du pH a une grande importance pratique. C'est pourquoi on distingue, avant tout d'un point de vue pratique: i) Des protéases alcalines, avec un optimum d'activité dans la gamme de pH de 7,5 à 13, en particulier des protéases bactériennes alcalines (E.C. 3.4.21) (qui appartiennent le plus souvent au type sérine) et des

protéases de champignons alcalines.

ii) Des protéases neutres, avec un optimum d'activité dans la gamme de pH de 6,0 à 9,0, en particulier des protéases bactériennes neutres (E.C. 3.4. 24) (qui font partie des métallo-enzymes) et des protéases de champignons, par exemple des protéases de Bacillus, des protéases de Pseudomonas, des protéases de Streptomyces,

des protéases d'Aspergillus.

iii) Des protéases acides, avec un optimum d'activité dans la gamme de pH de 2,0 à 5,0 (E.C. 3.4.23), en particulier des protéases de champignons, par exemple de Rhizopus sp., d'Aspergillus sp., de Penicillium sp., de Nucor sp.,

d'Impex lacteus et d'Endothitia parasitica.

Les protéases trouvent des applications industrielles, entre autres dans la fabrication des cuirs, dans des détergents et pour le lavage, dans le désencollage, dans la fabrication de fromages, dans l'écharnage et dans la

stabilisation de la bière.

On citera en particulier, en tant que protéases, les subtilisines, protéinases bactériennes alcalines du type sérine, qui sont stables dans la gamme de pH 9-10 et sont

dans une certaine mesure insensibles au perborate.

L'activité protéolytique des enzymes est déterminée habituellement par la méthode à l'hémoglobine d'Anson (X.L. Anson, J. Gen. Physiol. 22, 79 (1939> ou par la méthode de Lëhlein-Volhard (Die Lbhlein-Volhard'sche Xethode zur Bestimmung der proteolytischen Aktivitat, Gerbereichem. Taschenbuch, Dresden-Leipzig, 1955) et exprimée en 'ULVM (unités LëhleinVolhard). Par unité Lohlein-Volhard, on entend la quantité d'enzyme qui digère 1,725 mg de caséine dans les conditions spécifiques de la méthode. Ci-après, on utilisera également, pour la détermination de l'activité des enzymes actives dans la plage acide, des unités qui sont dérivées de la méthode Anson. Celles-ci sont appelées "unités de protéinase (hémoglobine> )" <Un). Une Ue. correspond à la quantité d'enzyme qui catalyse la libération de fragments d'hémoglobine solubles dans l'acide trichloracétique dans une mesure équivalente & 1 pmol de tyrosine par minute à

37'C <mesurée à 280 nm) (1 mU-. = 10-3 U#-.).

B) Amylases (E.C. 3.2, cf. Ullmann, op. cit., vol. 10, pp. 506-510 et B. Spencer, Industrial Aspects of Biochemistry,

op. cit., pp. 143-144, 175).

a) Endo-amylases a.) e-amylases <a-1,4-glucane-hydrolases <(B.C. 3.2.1.1) a2) a-l,6-glucane-hydrolases >) Exo-amylases <amylases saccharogènes)

Bu) B-amylases <(a-1,4-glucane-maltohydrolases (E.C.

3.2.1.2)

P=) Glucamylases (a-1,4-glucane-glucohydrolases (E.C.

3.2.1.3).

Comme on le sait, les a-amylases sont présentes entre

autres dans des plantes en même temps que des g-amylases.

L'extraction industrielle s'effectue par exemple à partir de glandes pancréas et de cultures de bactéries et de champignons. Une préparation particulièrement favorable s'effectue & partir d'espèces de bacilles telles que B. subtilis, B. mesentericus, B. polymixa, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, ainsi qu'& partir de champignons, en particulier d'espèces d'Aspergillus telles que A. niger, A. phoenicis, A. oryzae, A. awamori, d'espèces de Xucor telles que X. rouxianus, d'espèces de Rhizopus telles que R. delemar, R. oryzae, R. japonicus,

et d'espèces d'Endomyces telles que E. fibuliger.

L'optimum de pH des c-amylases se situe en général dans la gamme de 4,7 à 7,2. Les amylases trouvent une application,

entre autres, dans le secteur de l'alimentation [cf. H.-J.

Rehm et G. Reed Ed., "Biotechnology", vol. 5, Verlag Chemie, 1983; B. Spencer Ed., Industrial Aspects of Biochemistry, vol. 30, partie I, pp. 139-186, 213-260, Elseviers (1973)], dans la liquéfaction de l'amidon, la préparation de malt, la préparation d'éthanol, le désencollage, la fabrication des cuirs, etc. L'activité des a-amylases avec utilisation d'amidon comme substrat peut être déterminée par la méthode de Sandstedt, Kneen et Blish (Cereal Chem., 16, 172 (1939) et Technical Bulletin Nr. 1024, U.S. Dept. of Agriculture). Dans ce cas, 1 unité amylase (= 1 unité SKB) est la quantité d'enzyme qui est en mesure, à 30'C et dans les conditions de réaction données par ailleurs, de transformer en dextrine 1 g d'amidon soluble en l'espace de 1 h. On utilise d'autre part la méthode de Villstâtter pour la détermination de l'activité de l'amylase pancréatique [Hoppe-Seylers, Z. physiol. Chem., 126, 143 (1923)]. Dans ce cas, une unité amylase WillstUtter est définie comme le centuple de la quantité d'enzyme qui, dans les conditions expérimentales données, clive l'amidon à une vitesse telle que la constante de réaction monomoléculaire soit égale & 0,01. C) Lipases <E.C. 3.1.1.3) Comme on le sait, on désigne par lipases des carboxylestérases qui clivent les esters de glycérine en émulsion aqueuse. Elles se différencient en cela d'autres carboxylestérases, qui clivent le substrat en solution aqueuse. a) Lipases du pancréas Outre des lipases, le complexe d'enzymes pancréatiques contient généralement des estérases, ainsi que des protéases et des amylases en tant qu'enzymes

accompagnatrices techniquement importantes.

L'optimum de pH (à l'égard de l'huile d'olive) se situe dans la gamme de 7 à 8,5, la gamme d'activité étant comprise entre les pH 6,5 et 9,5. Les lipases sont en général très instables, en particulier à l'égard de la dégradation protéolytique par les protéases accompagnatrices. P) Lipases microbiologiques

issues par exemple de Pseudomonas fragi, Aspergillus sp.

(par exemple A. luchuensis), Candida cylindracea, Geotrichum candicum, Humicola lanuginosa, Mucor pusillus, Penicillium sp. (par exemple P. chrysogenum,

P. oxalicum), Rhizopus sp. (R. nigricans, R. oryzae).

En règle générale, ces lipases présentent au moins un optimum de pH > 7,0. Dans la mesure o leur instabilité le permet, les lipases trouvent notamment des utilisations dans l'élimination des déchets, l'industrie

du cuir et dans la branche alimentaire.

D) Catalases/hydroperoxydases (E.C. 1.11.1.6) a) Tirées de tissus animaux par exemple de foie D) Tirées de plantes par exemple de raifort Y) Tirées de micro-organismes

par exemple de Micrococcus lysodeicticus.

Les catalases trouvent des applications dans le

blanchiment au peroxyde et dans l'industrie du lait.

E) Cellulases (E.C. 3.2.1.4) (cf. Ullmann, op. cit., pp.

510-511).

Comme on le sait, la cellulase est un complexe d'enzymes dont les composants participent successivement &

la dégradation de la cellulose native.

Les cellulases se trouvent chez les insectes, les mollusques et les microorganismes (bactéries/moisissures). Les sources utilisées commercialement pour les cellulases sont en particulier des espèces d'Aspergillus, de Neurospora, de Rhizopus, de Trichoderma et de Trametes. L'optimum d'activité de préparations techniques se situe entre les pH 4 et 6. Les préparations de cellulase de l'état de la technique perdent environ 10 à 204 de leur activité par an lorsqu'elles sont conservées au froid et ausec. Les cellulases trouvent notamment des applications techniques dans l'industrie des produits alimentaires pour la conversion de matières de déchet contenant de la cellulose. La présente invention sera expliquée en détail à propos de l'exemple de l'utilisation d'enzymes dans la fabrication des cuirs. Depuis l'introduction du confitage enzymatique/enzymes trypsiques de digestion pancréatiques dans le confit OROPON par le Dr. Otto Rohm <DE-PS 20 05 19) il y a 80 ans environ, l'utilisation d'enzymes, en particulier d'enzymes protéolytiques, est une composante définitivement admise de la fabrication des cuirs. Outre les utilisations dans le confitage (brevets DE 9 2? 464, 9

76 107, 9 41 811, 9 74 813, 9 75 095, 9 76 928, 11 20

066, 11 34 474, 12 19 620, 12 82 837; brevets US 3 939 , 4 273 876), des préparations d'enzymes sont également utilisées dans la trempe (brevets DE 2 88 095, 9 76 602, 22 748, 10 34 317, 12 82 838, 20 59 453; Brevets US 4 278 432, 4 344 726), pour le relâchement du poil et la digestion de la peau (brevet US 4 294 087), pour l'épilage (brevets DE 10 26 038, 12 11 349, 11 55 560, 12 30 169, 12 88 728; brevet US 3 623 950) et dans le pelain (brevets DE 10 23 183, 12 03 416, 20 53 016, DE-OS 34 29 047), dans le picklage (brevets DE 8 47 947, 9 41 680) ou dans un procédé compact (brevets US 3 986 926, 3

966 551),

pour le dégraissage au mouillé <DE-A 33 12 840), pour le relâchement de la texture fibreuse de pelleteries <brevets US 3 549 495, 3 558 430), etc. En outre, des préparations d'enzymes servent pour la

décomposition de cuir à colle de machine et d'autres sous-

produits de la fabrication du cuir (brevets US 4 210 721, CH 631 486, US 4 293 647, US 4 220 723>, de matières premières contenant de la kératine (brevet US 4 232 123), de préparations contenant de l'élastine <brevet US 4 179 333), pour le retraitement de matières premières contenant du collagène <brevet US 4 220 714), etc. En s'appuyant sur les procédés enzymatiques précités, des formulations liquides d'enzymes correspondant aux

revendications de la présente invention peuvent être

utilisées dans les différentes phases de la fabrication des cuirs (cf. Ullmanns Encyclopadie der techn. Chemie, 3ème édition, vol. 11, p. 609, Urban/Schwarzenberg, Ullmanns Encyclopâdie der techn. Chemie, 4ème édition, vol. 16, pp. 111-174, Verlag Chemie 1978; F. Stather, Gerbereichemie und Gerbereitechnologie, 4ème édition, Akademie-Verlag Berlin 1967): I) Dans la trempe II) Lors du relâchement du poil, dans le pelain et dans l'épilage III) Lors du déchaulage, dans le confitage et éventuellement

IV) Dans le picklage.

I) La trempe des peaux brutes, par laquelle est supprimé le racornissement des peaux qui se produit à la conservation dans le sel, est effectuée ordinairement à un pH de- 7,0 à 10,0. L'utilisation simultanée d'enzymes, en particulier d'enzymes protéolytiques [cf. A)], accélère l'effet de la trempe par "digestion" des protides hydrosolubles et autres qui ne font pas partie de la texture fibreuse collagénique de la peau. En général, on utilise dans la trempe des enzymes dont la gamme d'activité (ou optimum de pH de l'activité protéolytique) se situe entre un pH de 7,0 et de 10,0. Avec l'élimination des protides non- collagéniques, un mouillage plus rapide et plus intense de la peau est assuré. L'eau de trempe est avantageusement réglée & un pH légèrement alcalin, mais le pH doit touJours rester < 12. En outre, des adjuvants de trempe (comme par exemple la monoéthanolamine avec un

antiseptique tel que le zéphyrol ou l'acide naphtalène-

sulfonique en combinaison avec des phénols substitués; des esters butyliques d'acide ricinoléique fortement sulfoné avec la méthylhexaline; des sulfates d'alcools gras avec des solvants) sont avantageux dans les gammes de concentration usuelles <10 - 1000 g/l). Entrent par exemple en ligne de compte, comme additifs enzymatiques dans les formulations liquides d'enzymes selon l'invention, les protéases citées ci-dessus dans le paragraphe A), en particulier les protéases mentionnées dans le sousparagraphe A)c): on citera spécialement des protéases microbiennes dans la gamme d'activité de 4 à 9,5, en particulier des protéases de champignons provenant d'espèces d'Aspergillus telles que A. saitoi et A. usamil, notamment des protéinases acides & activité dans la gamme de pH 2, 5 & 4,5, ainsi que celles qui proviennent de A. oryzae à activité dans la gamme de pH 4,0-9,5 et de A.

niger et A. flavus à activité dans la gamme de pH 9,5-

11,0. En général, la concentration d'activités protéolytiques des protéinases utilisées se situe dans la plage de 0,1 à 1,0 unité Anson ou de 1000 & 3000 unités

Lëhlein-Volhard par litre de bain de trempe.

Enfin, les bains de trempe peuvent encore contenir des amylases selon B). Les amylases sont présentes en tant

qu'enzymes accompagnatrices de protéinases de champignons.

Elles favorisent l'ouverture de liaisons glucosidiques

dans les protéoglycannes et les glycoprotéines de la peau.

Conviennent en particulier des amylases d'origine microbienne, en particulier celles d'espèces d'Aspergillus telles qu'A. oryzae et A. niger, spécialement celles dont l'activité se situe dans la gamme de pH 3, 0-5,8 et, en outre, des amylases d'origine bactérienne comme celles qui proviennent de Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. polymixa, ayant une gamme d'activité de 5,0 à 7,0. En général, les activités glycolytiques des amylases se

situent dans la plage de 500 à 2000 SKB.

La température des bains de trempe est avantageusement supérieure à 20'C. La durée de la trempe est choisie aussi courte que possible: elle est comprise en général entre 4 et 36 h. II) Pour l'épilage, on utilise le plus souvent des pelains (cf. Ullmann, op. cit. 3ème édition, vol. 11, p. 560; 4ème édition, vol. 16, pp. 118-119). On procède touJours avec des pelains dits Uaffûtés", de préférence une combinaison d'hydroxyde de calcium et de sulfure de sodium, et en présence d'adjuvants de pelanage à effet tampon, empochant le gonflement (par exemple des agents mouillants, en particulier des agents mouillants cationiques en combinaison avec la monoéthanolamine et des désinfectants tels que des composés d'alkyldiméthyl-benzylammonium quaternaires ou une dialkylamine et son sulfate). Pour le relâchement du poil et la digestion de la peau, on peut utiliser, outre les produits chimiques de pelanage usuels, des enzymes qui restent stables dans cette gamme de pH. Le bain de trempe et le pelain peuvent être réunis par élévation progressive du pH et introduction d'enzymes appropriées. L'utilisation des enzymes en rapport avec l'effet de pelanage/rel&chement du poil/épilage s'effectue en général dans la gamme de pH de 9 & 13, et notamment de

9 à 12.

Conformément au brevet DE-A 29 17 376 ou US-A 4 294 687, la peau débarrassée du sel de conservation peut être tout d'abord soumise & un pré-traitement dans la gamme acide du pH par des substances ouvrant les ponts disulfure, à la suite de quoi et sans trempe préalable, le relâchement du poil et la digestion de la peau sont effectués simultanément avec utilisation de protéases actives dans la région alcaline, à un pH d'environ 11 & 13. Suivent alors les autres phases de traitement III) et éventuellement IV), pratiquées ordinairement dans le travail de rivière. On utilise opportunément, dans les opérations du travail de rivière mentionnées en II), des protéases alcalines du type i) (voir di-dessus), en particulier des protéinases bactériennes alcalines <sérine-protéases), provenant par exemple de B. subtilis, B. licheniformis, B. firmus, B. alcalophilus, B. polymixa, B. mesentericus. Ces protéases ont en général une activité qui se situe entre 8000 et 10 000 unités Lahlein-Volhard (ULV) par gramme. On les utilise opportunément dans des proportions qui s'élèvent à 0,1-10% en poids, de préférence 1-5% en poids, sur la base du poids des peaux et cuirs en poils salés (poids brut). On mène la réaction enzymatique de relâchement du poil/digestion de la peau à 18-28'C environ, les durées de réaction se situant en général entre 12 et 24 h. notamment entre 12 et 16 h. L'épilage ou délainage peut être aussi effectué avec des protéinases de champignons alcalines du type i), par exemple avec des protéases d'Aspergillus, en particulier de A. niger et de A. flavus, ayant une gamme d'activité à

un pH de 9,5 à 11,0.

Il est en outre possible d'appliquer le procédé d'épilage enzymatique selon le brevet DE-A 34 29 047, d'après lequel des peaux et cuirs en poils sont traités dans un bain, dans la gamme de pH de 9 à 11, par.des enzymes protéolytiques dont l'optimum d'activité se situe

dans la gamme de pH de 2 à 7,5 et on procède à l'épilage.

On utilise donc des protéases du type iii) (voir ci-

dessus), en particulier celles qui proviennent de A. oryzae, A. saitoi, A. parasiticus, A. usamii, A. awamori,

de Paelomyces sp., de Penicillium sp., de Rhizopus sp.

et/ou de Mucor pusillus, ainsi que les protéases acides

mentionnées en A)a) et A)b) (voir ci-dessus).

D'une manière générale, on utilise 0,5 & 6% en poids, de préférence 1,0 & 3% en poids, sur la base du poids des peaux ou cuirs en poils salés. Dans ces conditions, l'activité se situe en général dans la gamme de 50 à 200 mU>-. III) Les enzymes sont utilisées préférentiellement pour le déchaulage et dans le confitage. Le déchaulage sert à abaisser l'alcalinité des cuirets depuis des pH de 13-14 jusqu'à des pH dans la gamme de 7 à 8. De préférence, pour le déchaulage, on doit utiliser, non pas des acides fortement dissociés, mais des acides organiques faibles, par exemple du type des acides dicarboxyliques ou des sels faiblement acides. Dans le confitage, les restes d'épiderme, de poils et de pigments doivent être éliminés et une digestion supplémentaire de la peau doit être effectuée. En outre, les constituants protidiques ne faisant pas partie du collagène sont éliminés (cf.

Ullmann, 4ème édition, vol. 16, op. cit., pp. 119-120).

Dans le confit, on opère classiquement à un pH de 7,5 à 8,5. L'utilisation de carbonates cycliques est connue

d'après le brevet DE-A 31 08 428.

On peut utiliser en même temps, dans le confitage, des lipases selon C), par exemple des lipases de pancréas dont

la gamme d'activité se situe à un pH de 7,0 & 9,0.

Des amylases selon B), par exemple des amylases de pancréas, dont la gamme d'activité se situe à un pH de 5,5 à 8,5 et qui favorisent l'ouverture de liaisons glucosidiques dans le confitage,.ont une influence favorable (surtout en tant qu'enzymes accompagnatrices de

la trypsine et de la chymotrypsine) dans le confitage.

IV) On sait que le cuiret doit être rendu acide pour sa préparation au tannage minéral, c'est-à-dire qu'à partir du pH d'environ 8, il doit être amené à un pH de 3-4. Cela s'effectue par exemple dans le bain de picklage qui représente une solution acide/sel dans l'eau, par exemple d'acide sulfurique ou d'acide formique avec du chlorure de sodium. Il est par exemple conseillé des tryptases de moisissures, des tryptases de pancréas et des tryptases de bactéries, le cas échéant avec des enzymes clivant les glucides, provenant en particulier de bactéries ou de moisissures. Les formulations liquides selon la présente invention fournissent une solution généralisable et relativement exempte de difficultés d'un problème auquel on se heurte fréquemment, bien qu'il n'y soit pas toujours fait allusion, à savoir la possibilité d'utiliser des formulations liquides d'enzymes. Un autre avantage est la possibilité de combiner des enzymes avec d'autres composants qui influencent défavorablement l'activité des enzymes en milieu aqueux et avec des durées prolongées d'action. Cela s'applique avant tout à la combinaison de différentes enzymes, par exemple de protéases avec des amylases, des lipases, etc., mais aussi avec des hydrotropes comme par exemple l'urée, les sels de guanidinium, le cumènesulfonate, etc. Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer les formulations liquides selon l'invention et leur utilisation.

Exemple A

Confection d'une préparation liquide d'enzymes à base

d'enzymes de pancréas et de champignon.

700 g de carbonate de propylène (0,6% d'eau) sont mis en dispersion, après addition de 3,5 g d'une bentonite

modifiée organiquement (par exemple Bentone 27, Kronos-

Titan, Leverkusen>, pendant 45 à 60 mn à une vitesse de

26 10947

rotation de 16 m/s, dans un agitateur & disque denté <disque: récipient = 1: 2,5; hauteur de remplissage, 2 à 2,5 fois le diamètre du disque; distance de l'agitateur au fond = demi-diamètre du disque). En poursuivant la mise en dispersion, on ajoute 2,54 g d'un concentré de protéase de champignon provenant d'Aspergillus parasiticus (optimum de pH, 7,5-9) (150 000 ULV) et 1,48 g d'une préparation

d'enzymes de pancréas <optimum de pH, 6 - 8)(220 000 ULV).

A la même vitesse de rotation, la mise en dispersion est poursuivie pendant 30 mn encore, en veillant à ce que la température ne dépasse pas 40'C. Le produit final a une activité de 1000 UVE et on ne constate pas de baisse d'activité après 4 semaines à 20'C. Le produit ne présente

pas de phénomènes de crémage ou de dépôt.

Selon la nature du solvant, la grosseur de grains et la concentration du concentré d'enzymes, les conditions de dispersion (vitesse de rotation) et le type de la Bentone

modifiée organiquement doivent être modifiés.

Déchaulage et confitage combinés, avec un produit enzymatique liquide à base d'enzymes de pancréas et de

champignon dans le carbonate de propylène.

kg de cuiret de boeuf pelané et lavé, épaisseur de refendage 3 à 4 mm, 30% d'eau, température 35'C, 3% de solution d'enzymes à base d'enzymes de pancréas et de champignon dans le carbonate de propylène selon l'exemple A (activité 1000 LV/g), 0,2% d'agent mouillant non ionique à base d'éthoxylate d'alcool gras avec 8 à 9 mol d'oxyde d'éthylène. Au bout de 80 mn, le cuiret est complètement déchaulé, le fond et la fleur sont remarquablement relàchés. Le pH final du bain se situe aux alentours de 8, 0. Pendant le déchaulage, il ne se dégage -pas d'acide sulfhydrique

toxique, car le pH ne tombe jamais au-dessous de 8,0.

Exem|pl C 920 g de butylglycol et 40 g de fractions de pétrole de P.éb. 110-130'C sont mis en dispersion, après addition de 30 g d'une bentonite modifiée organiquement (par exemple Bentone 27, Kronos-Titan, Leverkusen), pendant 38

mn dans un agitateur Ultra-Turrax & 16 m/s.

On abandonne la dispersion pendant 24 h. Puis, dans les conditions de dispersion indiquées ci-dessus, on aJoute 18,5 g d'une protéase neutre provenant d'une souche

de Bacillus subtilis <optimum de pH, 5,5-?7><70 000 ULV/g).

On met en dispersion le tout pendant 5 mn encore. Le produit final a une activité de 1300 ULV. Au bout de 5 semaines, on n'observe pas de baisse d'activité à la mesure des ULV. La formulation liquide d'enzymes reste

homogène, sans dépôt ni crémage.

Ezxoul e D Trempe enzymatique et dégraissage de peaux de boeuf chargées de crasse Pourcentages du poids salé: 100,0 kg de peau de boeuf chargée de crasse ,0 % d'eau, T = 26'C 0,8 % de formulation liquide d'enzymes de l'exemple C

0,4 % d'agent mouillant non ionogène & base d'éthoxy-

late d'alcool gras avec 6 mol d'oxyde d'éthylène

0,2 % d'un bactéricide à base de chloracétamide.

Après 5 h de trempe, les peaux ont complètement repris leur souplesse et en même temps, elles sont prêtes pour le relâchement du poil. Une grande partie de la graisse naturelle de la peau est émusionnée dans le bain de

trempe.

Les peaux trempées de cette manière sont pelanées par des procédés connus et transformées en cuir en croûte pour chaussures.

Exemple E

1000 g de fractions de pétrole, P.éb. 110-130'C sont réchauffés à 40'C et mis en dispersion pendant 10 mn après addition d'une bentonite modifiée organiquement (par exemple MPA-X-2000, Kronos-Titan, Leverkusen>, puis 2, 5 g d'une protéase acide de champignon (optimum de pH, 3,5-5) provenant d'Aspergillus parasiticus (80 000 ULV/g) sont ajoutés et mis en dispersion pendant 5 mn encore. On obtient une formulation d'enzyme liquide, ayant une activité de 200 ULV, qui ne présente pas de baisse d'activité au bout de 4 semaines à 20'C. La solution est homogène et ne présente pas de phénomènes de crémage, ni

de dépôt.

ERxt=mpl e 'F Dégraissage et relâchement enzymatique de cuirets pickles de mouton et d'agneau Foulage <Pourcentages du poids picklé) % d'eau à 35'C, 15% de chlorure de sodium, agiter pendant 5 mn, aJouter 10 kg de cuirets pickles et remuer

pendant 30 mn, écharner, vider le bain.

Dégraissage (Pourcentages du poids écharné> % d'eau à 35'C, 2% d'un agent mouillant non ionogène & base d'éthoxylate d'alcool gras (6-8 mol d'oxyde d'éthylène), 6% de l'enzyme liquide de l'exemple E (200

ULV/g), 8 kg de cuirets pickles, agiter 30 mn.

Les cuirets sont bien dégraissés et relâchés par

l'action de la combinaison enzyme/agent tensio-

actif/pétrole. Pour le dépicklage, des matières tannantes de dépicklage courantes dans le commerce peuvent être ajoutées dans un bain prolongé ou frais et on peut

poursuivre le traitement de façon connue en soi.

Exem=le G Dans une cuve à agitateur, 927,5 g d'un agent mouillant non ionogène anhydre à base de nonylphénol + 8,5 mol d'oxyde d'éthylène sont mélangés avec 12 g d'Aerosil 3805 (Degussa, Hanau, Allemagne de l'Ouest; bioxyde de silicium amorphe fortement disperse), et 5 g de Borchigen STLO (agent mouillant et de dissolution à base d'acide gras modifié, Borcher, Goslar, Allemagne de l'Ouest) sont mis en dispersion pendant 15 mn à 1518 m/s avec un agitateur à disque denté. La viscosité s'élève de 15 mPa à 255 mPa (détermination au viscosimètre de Brookfield, condition 1/6 tr/mn) . On ajoute alors 55,5 g de concentré d'c-amylase [90 000 SKB/g <analyse SKB, cf. Sanstedt, R.X.E., E. Kneen et X.J. Blish, Cereal Chem. 16, 712 (1939) - obtenu à partir de Bacillus subtilis). On met en

dispersion pendant 15 mn encore.

La formulation liquide prête à l'emploi, ayant une stabilité initiale de 5000 SKG/g, n'a subi ni dépôt, ni crémage après 6 semaines. La perte d'activité au stockage

Jusqu'à 25'C s'élève à 3,4%.

Exemple H

Pré-trempe enzymatique de tissus de jean kg de tissu denim (tissu de Jean) , qui a été traité par un produit d'encollage à l'amidon, sont introduits dans 50 1 d'eau à 40'C. Après addition de 50 ml du produit de l'exemple G, la température est élevée à 60'C en l'espace de 10 mn, le tissu est lavé pendant 5 à 10 mn, puis rincé à deux reprises avec 50 1 d'eau à 40'C chaque fois. Une opération supplémentaire de lavage avec un agent mouillant pour éliminer les produits de décomposition de l'amidon est superflue. Le tissu désencollé a un toucher

doux agréable.

Exemple I

Produit de gros lavage liquide, biodégradable

Dans une cuve à agitation, 466 g de 1,2-

propylèneglycol, 400 g d'agent tensio-actif non ionogène Xarlipal 013-900 <alcool isotridécylique + 9 mol d'oxyde d'éthylène, produit de Chemischen Werke HUls, Allemagne de l'Ouest), 100 g d'alcool éthylique <a 98%) sont mis en dispersion avec 10 g d'Aerosil 380 (bioxyde de silicium fortement dispersé, Degussa, Allemagne de l'Ouest) et 4 g de Borchigen STLe (agent mouillant et de dissolution à base d'acides gras modifiés (éthérisés), Borchers, Goslar, Allemagne de l'Ouest) pendant 15 mn à 15-18 m/s au moyen d'un agitateur à disque denté. La viscosité s'élève à 1250 mPa. On aJoute alors, dans l'ordre, les produits suivants en poursuivant la mise en dispersion: g de protéase alcaline (provenant de Bacillus subtilis, activité 92 000 ULV/g), 4 g d'a-amylase (provenant de B. subtilis, 90 000 SKB/E),

6 g d'azurant optique (acide 4,4'-bis-(4-amino-6-[N-(2-

hydroxyéthyl)-N-<2-carbamoyléthyl)-amino]-s-triazine-

2-yl-amino-2,2'-stilbène-disulfonique),

2 g de sel sodique d'EDTA (acide éthylènediamine-tétra-

acétique),

6 g de sel sodique d'oléfine en C9-C,2-sulfonate <98%).

Après la fin de l'addition, on met en dispersion pendant 15 mn encore. La solution visqueuse et bien coulable obtenue n'a présenté ni dépôt, ni crémage après 4

semaines de stockage à 25'C. La perte d'activité de l'o-

amylase s'élevait à 1% après 4 semaines à 25'C, la

protéase avait perdu 1,4% de son activité initiale.

Trempe d'un tissu de coton souillé de sang & 60'C 500 g de tissu de coton blanc, qui a été imprégné de sang de boeuf et séché, sont traités pendant 15 mn à 60'C dans 2,5 1 d'eau contenant 6 g de produit de lavage liquide (temps de stockage 3 mois) de l'exemple I et 2 g de métasilicate de sodium, puis lavés deux fois à 3O'C

avec 2,5 1 d'eau.

A titre de comparaison, le même tissu a été traité dans les mêmes conditions, également avec 6 g d'un produit de lavage liquide stocké pendant le même temps et identique à celui de l'exemple I, à cette exception que de

l'eau a été utilisée à la place de 1,2-propylèneglycol.

L'évaluation des deux tissus d'essai au photomètre à réflectance Elrefomat DFC 50 (Zeiss, Allemagne de l'Ouest)

261094?

a donné, pour le traitement par le produit de lavage

anhydre, une élimination du sang meilleure de 46%.

Exe M12 -K Préparation d'un produit liquide à base de lipase Dans une cuve à agitateur, 968 g de Genapol 0-0500 (alcool gras en CG,-Cs avec 5 mol d'oxyde d'éthylène, Hoechst AG, Allemagne de l'Ouest) sont mis en dispersion avec 12 g d'Aerosil 380 (bioxyde de silicium fortement dispersé, Degussa, Allemagne de l'Ouest) et 4 g de Borchigen STLO (agent mouillant et de dispersion à base d'acide gras modifié, Borchers, Goslar, Allemagne de l'Ouest) pendant 15 mn à 15-18 m/s au moyen d'un agitateur

* à disque denté. La viscosité s'élève de 18 mPa à 290 mPa.

On ajoute alors 16 g d'un concentré de lipase (provenant de Pseudomonas sp., activité 5000 LCA/mg, définition et détermination des unités LCA: Semériva, Biochem. 10, 2143

(1971)> et on poursuit la mise en dispersion pendant 10mm.

On obtient un produit enzymatique qui a une activité de 80 LCA/mg et qui ne présente ni dépôt, ni crémage après 6 semaines de stockage à 25'C. L'activité à la suite de

cette période de stockage s'élève encore à 77-78 LCA/mg.

Exemple I

Saponification de suif de boeuf 400 g de suif de boeuf et 600 g d'eau sont émulsifiés à 50'C avec 5 g du produit à base de lipase de l'exemple K et agités à cette température pendant 3 h. Au bout de ce temps, on observe, par titrage des acides gras libérés par hydrolyse (Jupac- Standard Methods of Oils, Fats and Derivatives, Pergamon Press, Oxford, 6ème édition, p. 56,

1979>, un degré d'hydrolyse de 72%.

Confection d'une préparation liquide de cellulase/hémicellulase Dans une cuve à agitateur, 882 g d'éthylèneglycol sont mis en dispersion avec 13 g d'Aerosil 2000 (bioxyde de silicium fortement dispersé, Hoechst AG, Allemagne de l'Ouest) et 5 g de Borchigen STLO (agent mouillant et de dispersion à base d'acide gras modifié, Borchers, Goslar, Allemagne de l'Ouest) pendant 10 mn à une vitesse de rotation de 15-18 m/s avec un agitateur à disque denté. La viscosité s'élève de 38 mPa à 330 mPa. On ajoute alors 100 g d'un concentré de cellulase/ hémicellulase (provenant de Trichoderma viridi, activité 10 000 FPU/g, unité FPU:

Xandels, M., Andreotti, R. et Roche C. (1976), Biotech.

Bioemp. Symp. 6, 17) et on met en dispersion pendant 10 mn

encore.

On obtient un produit enzymatique homogène visqueux (2600 mPa), 1000 FPU/g, qui ne présente ni dépôt, ni crémage après 5 semaines de stockage à 25'C. L'activité

après cette période de stockage s'élève à 95%.

Exemple N

Cellulase/hémicellulase pour la filtration de gluten kg de suspension de gluten (teneur en matières sèches 30%), qui a été séparée d'amidon de maïs par centrifugation, sont traités pendant i h à 40'C par 3 g du produit de cellulase. Les polysaccharides, qui empêchent la filtration, sont décomposés et le résultat en est une filtration plus rapide et plus aisée dans le filtre

rotatif à vide.

Rxemgl e O Dans une cuve à agitateur, 975 g de glycérine (teneur en eau 1%) sont mis en dispersion avec 20 g d'Aerosil 3800 (bioxyde de silicium fortement dispersé, Degussa, Allemagne de l'Ouest) pendant 15 mn au moyen d'un

agitateur à disque denté (vitesse de rotation 15-18 m/s).

On ajoute alors 5 g d'un concentré de pectinase (provenant d'Aspergillus oryzae, activité 100 000 PGU/mg, définition

et détermination de l'unité PGU, cf. Rohm-

Analysenvorschrift PZV-30) et on met en dispersion pendant

mn encore.

On obtient une préparation de pectinase ayant une activité de 5000 PGU/mg, qui ne présente ni dépôt, ni crémage après 6 semaines de stockage & 25'C. L'activité après cette période de temps s'élève encore & 97'% de la

valeur initiale.

Exmpl--e P Pectinase pour la clarification de Jus de fruits 1000 1 de Jus de pommes exprimé récemment sont traités par 50 g de la préparation de pectinase de l'exemple 0. Il en résulte la décomposition de pectines, ainsi que de substances colloïdales qui se trouvent dans les particules de trouble. Ces colloïdes entravent la floculation du trouble ou une clarification par ultra- ou microfiltration. Après 2 h de traitement, on procède & une

floculation du trouble par addition de bentonite.

L'opération de filtration subséquente se déroule

facilement et sans problèmes.

Exmpule_ Adjuvant liquide pour la trempe enzymatique Dans une cuve & agitateur, 300 g d'agent tensio-actif non ionique à base d'oxo-alcool en C,. + 6 mol d'oxyde d'éthylène et 682 g d'agent tensio-actif non ionique à base d'oxo-alcool en Cça + 9 mol d'oxyde d'éthylène sont mis en dispersion avec 13 g d'Aerosil 3800 (bioxyde de silicium fortement dispersé, Degussa, Allemagne de l'Ouest) et 5 g de Borchigen STLS (agent mouillant et de dispersion à base d'un acide gras modifié, Borchers, Goslar, Allemagne de l'Ouest) pendant 15 mn avec un agitateur à disque denté tournant & 15-18 m/s. On ajoute alors successivement 27,5 g d'une protéase alcaline (provenant de Bacillus subtilis, activité 80 000 ULV/g) et 10 g d'une protéase de champignon (provenant d'Aspergillus parasiticus, 220 000 ULV/g) et on met en dispersion

pendant 10 mm encore.

On obtient une préparation enzymatique liquide homogène, bien coulable et pompable, qui ne présente ni dépôt, ni crémage après 4 semaines de stockage. L'activité au bout de ce temps s'élève encore, à une température de stockage de 25'C, à 97% de l'activité initiale de 4400 ULV/g.

ExempleR

Trempe enzymatique de peaux de boeuf chargées de crasse (les pourcentages se rapportent au poids salé> kg de peaux de boeuf chargées de crasse % d'eau, 26'C 0,25 % de préparation enzymatique de l'exemple Q

0,2 % de lessive de soude à 50%.

Après 5 h de trempe dans la cuve, les peaux salées ont complètement retrouvé leur souplesse, sont débarrassées d'une grande partie de la graisse cutanée et de la crasse

et sont prêtes pour le relâchement du poil.

Exemple S

Préparation d'un confit liquide à, action déchaulante et dégraissante 400 g de carbonate d'éthylène sont introduits dans une cuve à agitateur etmélangés avec 300 g de méthyléthylcétone et 264 g d'agent tensio-actif non ionique (alcool gras en Ci-Cle. avec 9 mol d'oxyde d'éthylène>, réchauffés à 40'C et additionnés de 10 g d'Aerosil 3800 (bioxyde de silicium fortement dispersé, Degussa, Allemagne de l'Ouest>, ainsi que de 6 g de Borchigen STLO (Borchers, Goslar, Allemagne de l'Ouest, cf. exemple Q). Le mélange est mis en dispersion pendant mn à une vitesse de rotation de 15-18 m/s au moyen d'un agitateur à disque denté. La viscosité s'élève de 60 mPas à 1040 mPas. On ajoute alors 20 g de concentré d'enzymes pancréatiques (activité 40 000 ULV/g) et on met en dispersion pendant 20 mn encore. On obtient une formulation d'enzyme liquide homogène, bien coulable, qui ne présente ni dépôt, ni crémage au bout de 5 semaines de stockage à 25'C. L'activité après cette période àa 25'C

s'élève à 760 ULV/g (activité initiale, 800 ULV/g).

Exemple T

Confitage enzymatique et déchaulage de cuiret de boeuf.

kg de cuiret de boeuf pelané et lavé, épaisseur de refendage 3-4 mm, 30% d'eau, 35'C, 1% en poids de produit enzymatique <800 ULV/g, identique à celui de l'exemple S),

2% en poids de sulfate d'ammonium.

Au bout de 70 mn, le cuiret est entièrement déchaulé, le fond et la fleur sont remarquablement rel&chés. Le pH final du bain se situe à 7,8. La graisse naturelle est

bien éliminée de la peau et émulsifiée dans le bain.

Exemp u Dans un bécher, 984 g de 1,2-propylèneglycol (anhydre) sont mis en dispersion avec 10 g d'Aerosil 3800 (cf. exemple G) et 5 g de Borchigen STL@ (cf. exemple G) pendant 10 mn avec un agitateur à disque denté à une vitesse de rotation de 15-18 m/s. La viscosité s'élève de 20 mPa & 310 mPa. On aJoute alors 1 g de peroxydase de raifort 11000 Unités/g, définition et détermination: Taele, F.W.J., Biochem. Biophys. Acta, 35, 543 (1959)] et on met en dispersion pendant 10 mn encore. On obtient une formulation liquide de produit bien fluide (280 mPa) qui ne présente ni dépôt, ni crémage après 4 semaines de

stockage. Après ce temps, l'activité a diminué de 2%.

Exemple V

Préparation d'une solution de colorant (réaction modèle) Solution A 1 g de m-phénylènediamine est dissous dans 999 g de

tampon de phosphate (<0,1 M, pH ?).

Solution B

Peroxyde d'hydrogène <à 30%).

Exécution de la réaction 1 g de la préparation de peroxydase de l'exemple U est introduit dans 1000 g de solution A et additionné de 5 g de solution B sous agitation. On observe la formation d'un colorant azoique rouge, qui devient de plus en plus foncé

au bout de quelques minutes.

Claims (22)

REVENDICATIONS

1.- Formulation liquide d'enzymes pour applications techniques, caractérisée en ce que l'enzyme se trouve à l'état dispersé dans un véhicule liquide organique essentiellement anhydre avec des dispersants inorganiques en poudre. 2.- Formulation liquide d'enzymes selon la revendication 1, caractérisée en ce que les solvants organiques anhydres ont un poids moléculaire < 110 et un point d'ébullition au-dessous de 300'C à la pression

atmosphérique normale.

S.- Formulation liquide d'enzymes selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'il existe un

rapport en poids enzyme/solvant de 1:10 à 1:500.

4.- Formulation liquide d'enzymes selon l'une

quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce

que le véhicule liquide est constitué par un solvant

organique anhydre, mais miscible en soi à l'eau.

5.- Formulation liquide d'enzymes selon l'une

quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce

que le véhicule liquide est constitué par un solvant

organique non miscible à l'eau.

6.- Formulation liquide d'enzymes selon l'une

quelconque des revendications I à 5. caractérisée en ce

qu'on utilise du bioxyde de silicium en tant que

dispersant inorganique en poudre.

7.- Formulation liquide d'enzymes selon l'une

quelconque des revendications 1 & 6, caractérisée en ce

que la teneur en dispersants inorganiques en poudre s'élève à 0,6-6 % en poids sur la base du véhicule liquide. 8.- Formulation liquide d'enzymes selon la revendication 4, caractérisée en ce que les solvants organiques miscibles à l'eau contiennent 1 à 10'% en poids, par rapport à eux, d'hydrocarbures à 5-20 atomes de

carbone.

9.- Formulation liquide d'enzymes selon l'une

quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce

qu'elle contient des agents tensio-actifs dans des proportions de 0,001 à 50% en poids sur la base du

véhicule liquide.

10.- Formulation liquide d'enzymes selon l'une

quelc. -ue des revendications 1 à 9, caractérisée en ce

que i véhicule liquide est constitué par un ester

cyclique de l'acide carbonique ou contient celui-ci.

11.- Formulation liquide d'enzymes selon la revendication 10, caractérisée en ce que le véhicule liquide est constitué par du carbonate de propylène ou

contient celui-ci.

12.- Formulation liquide d'enzymes melon l'une

quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce

que les enzymes sont des protéases <selon E.C. 3.4>.

13.- Formulation liquide d'enzymes selon l'une

quelconque des revendications i à 11, caractérisée en ce

que les enzymes sont des amylases (selon E.C. 3.2).

14.- Formulation liquide d'enzymes selon l'une

quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce

que les enzymes sont des lipases (selon E.C. 3.1.1.3).

15.- Formulation liquide d'enzymes selon l'une

quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce

que les enzymes sont des catalases (selon E.C. 1.11.1.6>.

16.- Formulation liquide d'enzymes selon l'une

quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce

que les enzymes sont des cellulases (selon E.C. 3.2.1.4>.

17.- Utilisation des formulations liquides d'enzymes

selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 dans la

fabrication de cuirs.

18.- Utilisation des formulations liquides d'enzymes

selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 dans des

produits de lavage et de nettoyage.

19.- Utilisation des formulations liquides c enzymes

selon la revendication 12 ou 13 dans le désencollbge.

20.- Utilisation des formulations liquides d'enzymes

selon la revendication 15 pour le blanchiment au peroxyde.

21.- Utilisation des formulations liquide? d'enzymes selon la revendication 16 pour la tr -;formation

industrielle de substrats cellulosiques.

22.- Procédé de déchaulage et de confitaF e cuirets, caractérisé en ce qu'on utilise des formulat s liquides d'enzymes selon l'une quelconque des revenu ations 1 à 13. 23.- Procédé selon la revendication 22,. :ractérisé en ce qu'on utilise les formulations liquides d'enzymes pancréatiques. 24.- Procédé de trempe enzymatique de peaux et ce cuirs en poils, caractérisé en ce qu'on utilise des formulations liquides d'enzymes selon l'une quelconque des

revendications 1 à 13.

25.- Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'on utilise des formulations liquides de protéases

neutres.

26.- Procédé de dégraissage de cuirets, caractérisé en ce qu'on utilise les formulations liquides d'une protéase

acide selon l'une quelconque des-revendications 1 à 13.

27.- Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce qu'on utilise les formulations liquides d'une protéase d'Aspergillus.