DE60209817T2

DE60209817T2 - Verfahren zur inaktivierung von amylase in gegenwart von protease

Info

Publication number: DE60209817T2
Application number: DE60209817T
Authority: DE
Inventors: Mylene Caussette; Frederik Miggelbrink; Gregory Maufroid
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2001-12-19
Filing date: 2002-12-18
Publication date: 2006-10-12
Anticipated expiration: 2022-12-19
Also published as: AU2002366266A1; DK1448768T3; EP1448768A2; ATE319820T1; WO2003052092A3; EP1448768B1; US7955829B2; WO2003052092A2; ES2258177T3; US20050064573A1; DE60209817D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Inaktivierung von Amylase in Gegenwart von Protease. Die Erfindung betrifft weiterhin eine Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist, sowie ihre Verwendung bei der Herstellung von Milchprodukten.
Bei dem aus Kälbermagen gewonnenen Chymosin handelt es sich derzeit um eines der wirksamsten Milchgerinnungsenzyme; es wird hauptsächlich bei der Käseherstellung verwendet. Die steigende Nachfrage nach Chymosin in der Milchindustrie und seine begrenzte Verfügbarkeit von natürlichen Quellen hat jedoch die Wissenschaft dazu angeregt, nach geeigneten Alternativen zu suchen. Chymosin kann derzeit mit Hilfe der DNA-Rekombinationstechnik in Bakterien, also Escherichia coli, Hefe, also Kluyveromyces lactis, sowie in Fadenpilzen, also Aspergillus niger, produziert werden. Außerdem werden derzeit in der Käseproduktion fast ausschließlich pilzliche Proteasen verwendet. Das häufigste Milchgerinnungspräparat ist aufgrund seiner Leistungsfähigkeit die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease (Sternberg, M.Z. (1971) Crystalline milk clotting protease from Mucor miehei, and some of its properties [kristalline Milchgerinnungsprotease aus Mucor miehei und gewisse Eigenschaften]. J. Dairy Sci., Bd. 54, S. 159–167). Diese Protease kann auch heterolog in Fadenpilzen mittels der DNA-Rekombinationstechnik produziert werden (Boel E. et al. Europäisches Patent EP-238023). Die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease ist in hohem Ausmaß hitzestabil. Nach der Pasteurisation bleibt sie in der Molke teilweise aktiv erhalten und führt, wenn die Molke für andere Präparate, wie angereicherter Milch für Babynahrung, verwendet wird, zu einer unerwünschten Milchgerinnung. Die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease wird daher häufig modifiziert, um ihre Hitzestabilität zu verringern. In der Fachwelt sind mehrere Verfahren zur Erhöhung der Hitzedestabilisation der Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease bekannt. Manche davon sind in den britischen Patenten GB 2038339B , GB 2045772B und GB 2045773B beschrieben.
Ein Problem bei der mikrobiellen Produktion von Milchgerinnungsenzymen auf dem fermentativen Weg ist die Expression von anderen, unerwünschten Enzymen. Aufgrund einer steigenden Nachfrage auf dem Markt nach reinen Enzympräparaten sind in der Fachwelt mehrere Verfahren für die Abtrennung und Aufreinigung von erwünschten Enzymen aus Enzymmischungen oder für selektive Inaktivierung von unerwünschten Enzymen entwickelt worden.
Das US-Patent 2,683,682 (1954) beschreibt die differenzielle Inaktivierung von einem der Enzyme aus der Gruppe der Proteasen und Amylasen aus Mischungen, die beide Enzymtypen enthalten. Bei dem Verfahren wird der pH-Wert der wäßrigen Lösung auf zwischen 3,0 und 4,5 (für die selektive Inaktivierung der Amylase) bzw. zwischen 7,0 und 10,5 (für die selektive Inaktivierung der Protease) eingestellt und die Mischung wird solange bei einer Temperatur im Bereich zwischen ungefähr 5°C und 60°C gehalten, daß das unerwünschte Enzym inaktiviert wird, im allgemeinen ungefähr 0,5 Stunden oder weniger bei höheren Temperaturen bis zu 20 Stunden bei niedrigeren Temperaturen. Die 0,5stündige Behandlung von Enzymmischungen aus gemälztem Weizenmehl oder gemälzter Gerste bei pH 3,6 und 50°C führt zu einer Proteaseausbeute von maximal 66% und einer Amylasedesaktivierung von 99,7%. Bei 20 Stunden bei dem gleichen pH-Wert und 5°C beträgt die Proteaseausbeute 85% und die Amylasedesaktivierung 99,6%.
Das US-Patent 4,086,139 (1978) beschreibt die selektive Inaktivierung von Amylase in Enzymmischungen, die Protease und Amylase enthalten. Die Inaktivierung von Amylase erfolgt durch Behandlung der Enzymmischung mit einem Oxidationsmittel aus der Reihe Chlorit- und Hypochloritionen. Die Ionen werden der Enzymmischung in solch einer Menge zugegeben, daß die Amylase inaktiviert wird, während die Protease intakt gelassen wird, wodurch weitere Aufreinigungsschritte vermieden werden. Die Temperatur und der pH-Wert der Behandlung sind insofern nicht kritisch, als sie die Protease nicht negativ beeinflussen. Die Enzymzusammensetzungen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt werden können, stammen von tierischen Organen (z.B. Tierorgan-Rohextrakte) oder Bakterien wie Bacillus subtilis oder licheniformis (z.B. Fermentationsbrühen). Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Amylase zu über 80% inaktiviert, wobei die Proteaseaktivität zu mehr als 80% intakt bleibt.
Das US-Patent 5,139,943 (1992) beschreibt ein Verfahren für die selektive Gewinnung von mikrobiell produziertem Chymosin aus Polypeptid- oder Enzymmischungen, die durch Fermentation produziert wurden, wie zum Beispiel α-Amylase. Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Verwendung eines zweiphasigen Flüssig-Flüssigsystems mit einem Chymosinverteilungskoeffizienten, der größer als ungefähr 85% ist. Das Zweiphasensystem wird dadurch erhalten, daß man die wäßrige Enzymzusammensetzung mit PEG und einem Salz wie einem Phosphat oder einem Sulfat versetzt. Das Chymosin wird selektiv in die organische Phase extrahiert, während die Amylase in der wäßrigen Phase verbleibt. Das Chymosin kann aus dem PEG mittels Ionenaustauschchromatographie gewonnen werden. Verwendet man einen pH-Wert unter 3, so kann man zu Chymosinverteilungskoeffizienten von ungefähr 1000 gelangen, was eine vollständige Abtrennung von der Amylase und eine Chymosinausbeute von ungefähr 96–98% ermöglicht.
Die internationale Patentanmeldung WO 97/20921 (Veröffentlichungsdatum: 12. Juni 1997) beschreibt ein Verfahren für die selektive Inaktivierung von mindestens einem unerwünschten Enzym aus einer Enzymmischung, die erwünschte und unerwünschte Enzyme enthält. Die Enzymmischung wird mindestens 20 Sekunden lang bei einem pH-Wert unter 5 und einer Temperatur von 2 bis 75°C und/oder mindestens 20 Sekunden lang bei einem pH-Wert über 9 und bei einer Temperatur von 2 bis 75°C behandelt. Mit diesem Verfahren wird die Amylase vollständig dadurch inaktiviert, daß man eine Enzymmischung, die Amylase und Cellulase enthält, 1 Minute lang bei 70°C und pH 3,5 behandelt, wobei die Cellulaseaktivität zu 96% intakt verbleibt (Beispiel 4). Andererseits verbleiben nur 2% der Proteaseaktivität, wenn eine Enzymmischung, die Lipase und Protease enthält, 60 Minuten lang bei 45°C und pH 3,5 behandelt wird. In Mischungen, die Cellulase und Protease enthalten (Beispiel 7), wird die Protease vollständig dadurch inaktiviert, daß man 60 Minuten lang bei 3°C oder 25°C sowie einem pH von 2,5 behandelt.
Manche Verfahren des Stands der Technik weisen den Nachteil auf, daß sie ziemlich arbeitsaufwendig sind. Im allgemeinen sind die Verfahren des Stands der Technik durch eine niedrige Selektivität in bezug auf die Inaktivierung der Amylase und durch einen relativ hohen Verlust an Proteaseaktivität gekennzeichnet.
Während der mikrobiellen Produktion von Chymosin und Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease auf dem fermentativen Weg wird auch das Enzym Amylase in der Fermentationsbrühe produziert. Die Milchindustrie ist nun aber bestrebt, höhere Käseausbeuten und Milchprodukte höherer Qualität zu erhalten. Letzteres hängt stark von der Reinheit der bei der Herstellung dieser Produkte verwendeten Milchgerinnungsenzyme ab. Eines der Probleme im Zusammenhang mit dem Vorhandensein von Amylase in Milchgerinnungsenzymen sind die unerwünschten Nebenwirkungen der Amylase in der Molke, was für eine Weiterverwendung der Molke von Nachteil sein kann. Ein Zweck der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, ein einfaches, wirksames Verfahren zur Inaktivierung von Amylase in Gegenwart von Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease mit hoher Selektivität und mit einer hohen Proteaseausbeute bereitzustellen.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß eine Inaktivierung der Amylase in Gegenwart einer Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease mit der vorliegenden Erfindung gelingt, wobei die amylasehaltige Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteaselösung über einen Zeitraum zwischen 0,5 und 24 Stunden bei einem pH-Wert zwischen 2,1 und 2,8 und einer Temperatur zwischen 20°C und 40°C gehalten wird, um die Amylase mindestens zu 95% zu inaktivieren. Dadurch, daß man diese Bedingungen anwendet, wird die Amylasedesaktivierung auf unerwartete Weise erhöht, während die Asparaginsäureproteaseakivität in hohem Ausmaß erhalten bleibt.
Die Vorteile dieses Verfahrens sind die Einfachheit und insbesondere die hohe Selektivität, mit der die Amylase in amylasehaltigen Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteaselösungen inaktiviert wird. Überraschenderweise wurde gefunden, daß mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nach der Behandlung mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 95%, der Asparaginsäureproteaseaktivität in der Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteaselösung aufrechterhalten bleibt, während die restliche Amylaseaktivität im allgemeinen weniger als 0,05 RAU/g, vorzugsweise weniger als 0,001 RAU/g, stärker bevorzugt weniger als 0,0005 RAU/g beträgt.
Unter dem Begriff "Amylase" versteht man jegliches Enzym mit Amylaseaktivität, z.B. α-Amylase (EC 3.2.1.1), ß-Amylase (EC 3.2.1.2), γ-Amylase (EC 3.2.1.3), Amylase III (2.4.1.161) oder eine beliebige Mischung dieser Amylasen.
1 RAU (amylase activity unit) ist als diejenige Enzymmenge definiert, die unter Standardbedingungen (pH = 6,6, 30°C) 1 mg lösliche Stärke pro Minute umwandelt. Der Begriff IMCU (international milk clotting unit) ist für Rinder-Lab durch die International Dairy Federation (IDF), Protokoll 157: 1992, definiert.
Unter dem Begriff "Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease" soll die homolog in Rhizomucor miehei produzierte Asparaginsäureprotease verstanden werden. Ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms auf fermentativem Weg ist in dem US-Patent Nr. 3,988,207 beschrieben. Unter dem Begriff "Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease" soll auch eine rekombinante Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease verstanden werden, also eine Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease, die in einem mit für die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease codierenden DNA transformierten Wirtsorganismus produziert wird. Bei dem Wirtsorganismus kann es sich um einen Pilz, z.B. eine Hefe oder einen Fadenpilz, handeln. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Wirtsorganismus um einen Fadenpilz aus den Gattungen Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium oder Humicola. Am stärksten bevorzugt gehört der Fadenpilz zu den Gattungen Aspergillus oder Trichoderma. Die Verwendung von Aspergillus niger, Aspergillus nidulans oder Aspergillus oryzae als Wirtsstamm ist bevorzugt. Verfahren für die Herstellung einer rekombinanten Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease in einem Wirtsorganismus ist in der europäischen Patentanmeldung EP0700253B1 beschrieben.
Unter dem Begriff "Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteaselösung" soll eine Lösung, vorzugsweise eine wäßrige Lösung, die eine Rhizomucor miehei- Asparaginsäureprotease und Amylase enthält, verstanden werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich vorteilhaft auf eine Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease, die aus Fermentationsbrühen oder deren Derivaten, die in einem beliebigen Stadium während des Downstream-Verfahrens erhältlich sind, stammt, anwenden, im allgemeinen vor dem Formulierungsschritt. Die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteaselösung ist vorzugsweise eine Fermentationsbrühe, am stärksten bevorzugt eine Fermentationsbrühe, die von der Fermentation von Rhizomucor miehei stammt, welche nach fachbekannten Verfahren erhalten werden kann, zum Beispiel wie in "Pilot plant experiment" des US-Patents Nr. 3,988,207 beschrieben. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Fermentationsbrühe eine Fermentationsbrühe eines Wirtsorganismus, der mit DNA, die für die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease codiert, transformiert worden ist, wobei dieser Organismus die Protease exprimiert. Im allgemeinen wird die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteaselösung aus der Fermentationsbrühe nach Abtrennung der Zellen gewonnen. Dies kann dadurch erfolgen, daß man die Mikroorganismen in der Fermentationsbrühe nach einem der mehreren fachbekannten Verfahren abtötet und die Zelltrümmer entfernt. Die Zellen können durch eine oder mehrere Fest-Flüssig-Trenntechniken wie Ausflocken, Zentrifugation, Filtration und Membrantrennung abgetrennt werden. Im allgemeinen wird die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteaselösung aus der Fermentationsbrühe nach Abtrennung der Zellen und Auf konzentrieren der zellfreien Lösung vor Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten. Das Auf konzentrieren kann durch Eindampfen oder Membrankonzentration erfolgen; eine Membrankonzentration wird vorzugsweise durch Ultrafiltrationstechniken erzielt. Bei einer bevorzug ten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich daher bei der Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteaselösung um eine zellfreie und/oder aufkonzentrierte Fermentationsbrühe. Unter "zellfrei" versteht man frei von jeglichen Teilchen oder Zellen mit einem Durchmesser von 0,4 μm oder darüber.
Es wurde beobachtet, daß die Zugabe eines Mittels wie Natriumchlorid zu der Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteaselösung die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease stabilisiert, den Verlist an Asparaginsäureproteaseaktivität während des erfindungsgemäßen Verfahrens verringert. Solche Mittel sind zum Beispiel Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Glyzerin, Sorbit, Polyethylenglykol. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteaselösung ein Mittel, das eine stabilisierende Wirkung auf die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease ausübt. Am stärksten bevorzugt umfaßt die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteaselösung Natriumchlorid. Ist Natriumchlorid anwesend, so wird dies der Fermentationsbrühe im allgemeinen in einer Menge zwischen 50–200 g/kg zugegeben.
Der pH-Wert der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteaselösung kann mit in Nahrungsmitteln annehmbaren Säuren oder Basen, die dem Fachmann gut bekannt sind, eingestellt werden. Der pH-Wert kann bevor, während oder nachdem die Enzymmischung die Aufheiztemperatur erreicht hat, eingestellt werden. Sobald die Lösung den korrekten pH-Wert aufweist, sollte jedoch mit dem Aufheizen begonnen werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der pH-Wert der Enzymmischung vor dem Aufheizen der Enzymmischung eingestellt.
Es wurde beobachtet, daß die besten Ergebnisse in bezug auf die Aufrechterhaltung der Proteaseaktivität und Inaktivierung der Amylase dann erzielt werden, wenn in einem erfindungsgemäßen Verfahren die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteaselösung bei einem pH-Wert zwischen 2,3 und 2,6 und/oder einer Temperatur zwischen 32°C und 38°C gehalten wird. Die Lösung wird bei diesem pH-Wert und dieser Temperatur für einen Zeitraum zwischen 0,5 und 24 Stunden gehalten. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beträgt daher der pH-Wert der Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteaselösung während des Inaktivierungsschritts zwischen 2,3 und 2,6. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt die Temperatur, bei der die Lösung während des Inaktivierungsschritts gehalten wird, zwischen 32°C und 38°C. Bei einer dritten bevorzugten Ausführungsform liegt der Zeitraum, während dessen die Reaktion bei der gewünschten Temperatur gehalten wird, zwischen 4 und 12 Stunden.
Sobald der Schritt der Amylaseinaktivierung vollständig ist, wird die Temperatur der Lösung im allgemeinen auf zwischen ungefähr 4°C bis 25°C, vorzugsweise 4°C, gesenkt, und der pH-Wert der Lösung wird auf einen Wert, bei dem die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease stabil ist, erhöht, üblicherweise auf einen pH-Wert zwischen ungefähr 4 und 6.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird Amylase in Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteaselösungen mit hoher Selektivität inaktiviert. Am Ende der Behandlung bleibt mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 95%, der Asparaginsäureproteaseaktivität erhalten, während die restliche Amylaseinaktivität im allgemeinen weniger als 0,05 RAU/g, vorzugsweise weniger als 0,001 RAU/g, stärker bevorzugt weniger als 0,0005 RAU/g, beträgt. Das Ausmaß der Amylaseaktivität in der Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteaselösung vor dem Inaktivierungsschritt beträgt im allgemeinen 100 RAU/g oder mehr. Das Ausmaß der Amylaseinaktivierung in der Lösung nach der Behandlung beträgt daher im allgemeinen mindestens 99,95%.
Es ist bekannt, daß die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease stark hitzestabil ist. Diese Eigenschaft kann von Nachteil sein, da während der Käseherstellung das Enzym in der Molke nach der Pasteurisation teilweise aktiv bleibt und dadurch zu einer unerwünschten Milchgerinnung führt, wenn die Molke für andere Produkte verwendet wird. Die in Koagulationsenzympräparaten vorliegende Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease wird daher vorzugsweise dahingehend modifiziert, daß ihr thermischer Stabilitätsabbau verstärkt ist. Falls die in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease nicht auf eine Verstärkung ihres thermischen Stabilitätsabbaus behandelt worden ist, kann das erfindungsgemäße Verfahren einen nach der Amylaseinaktivierung durchzuführenden Schritt umfassen, bei dem der thermische Stabilitätsabbau der Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease verstärkt wird. Die Behandlung zur Verstärkung des thermischen Stabilitätsabbaus der Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease kann auch vor dem Schritt der Amylaseinaktivierung durchgeführt werden. In diesem Fall wird der Schritt der Amylaseinaktivierung vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 20°C und 25°C, vorzugsweise bei ungefähr 20°C, durchgeführt, wobei die anderen Parameter unverändert bleiben. Die Enzymlösung umfaßt vorzugsweise Natriumchlorid oder ein Mittel, das eine stabilisierende Wirkung auf die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease ausübt. wird Natriumchlorid verwendet, so wird dies der Fermentationsbrühe üblicherweise in einer Menge zwischen 50–200 g/kg zugegeben.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird nach der Inaktivierung der Amylase der thermische Stabilitätsabbau der Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease in der Lösung nach einem fachbekannten Verfahren verstärkt.
Das Verfahren, das für die Verstärkung des thermischen Stabilitätsabbaus der Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease verwendet wird, ist nicht kritisch und kann eines der verschiedenen fachbekannten Verfahren für diesen Zweck umfassen. So kann zum Beispiel das Enzymprodukt in einem wäßrigen Medium mit einem Oxidationsmittel, das ein Aktivhalogen, z.B. Hypochlorit enthält, behandelt werden (z.B. GB-Patent Nr. 2,045,772B). Eine andere Möglichkeit besteht darin, das Enzymprodukt in dem wäßrigen Medium mit einem Acylierungsmittel, z.B. Essigsäure- oder Propionsäureanhydrid, zu behandeln (z.B. GB-Patent Nr. 2,038,339B). Vorzugsweise wird das Enzymprodukt in einem wäßrigen Medium mit einer Peroxysäure, wie einer anorganischen Peroxysäure oder einer niederen aliphatischen Peroxysäure, behandelt. Vorzugsweise wird Peroxyessigsäure oder Peroxypropionsäure verwendet (GB-Patent Nr. 2,045,773). Die Art und Weise, auf die diese Verfahren durchgeführt werden, ist in der Literatur vielfach beschrieben und daher dem Fachmann gutbekannt.
Die Erfindung stellt auch eine nach einem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease, sowie Zusammensetzungen, die solche Asparaginsäureproteasen enthalten, bereit. Die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease enthält weniger als 0,0005 RAU Amylase pro 2000 IMCU Protease.
Das Enzymprodukt, das nach einem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease enthält, kann weiter verarbeitet werden. Nach dem Schritt der Amylaseinaktivierung oder der Verstärkung des thermischen Stabilitätsabbaus der Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease eignet sich jedes beliebige traditionelle fachbekannte Verfahren für die Vorbereitung des Enzyms für eine Weiterverwendung.
Das Enzymprodukt kann für die Herstellung eines Nahrungsmittels verwendet werden. Diese Zusammensetzungen können auch andere Enzyme enthalten. Die Erfindung stellt daher auch Zusammensetzungen, die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease enthalten, bereit. Bei diesen Zusammensetzungen kann es sich um feste oder flüssige Zusammensetzungen handeln. Die festen Zusammensetzungen können in Form von Tabletten, Granulaten, Pulvern, Kristallen usw. vorliegen.
Die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease oder auch die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann für die Herstellung eines Milchprodukts verwendet werden. Für die Herstellung solch eines Produkts, bei dem es sich vorzugsweise um ein Käseprodukt handelt, kann Milch unterschiedlicher Herkunft verwendet werden. Beispiele für Milch, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind, sind Kuhmilch, Ziegenmilch, Schafsmilch, Kamelmilch usw. Die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease eignet sich für die Herstellung jeder Art von Käse oder Milchprodukt. Die Verwendung von mikrobiellen Asparaginsäureproteasen als Gerinnungsenzyme bei der Käseherstellung ist in der Fachwelt gut beschrieben. Ein Vorteil der nach einem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease oder auch der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ist das äußerst niedrige Ausmaß bzw. Fehlen von Amylaseaktivität. Die Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms oder der oben genannten Zusammensetzung als Gerinnungsenzym bei der Käseherstellung ermöglicht zum Beispiel eine vorteilhaftere Weiterverarbeitung der nach Abtrennung des Milchgerinsels erhaltenen Molke. Diese Molke, die frei von Amylaseaktivität ist, kann erfolgreicher für die Herstellung von Milchprodukten, die Stärke, Klebereiweiß usw. enthalten, verwendet werden.
Die Erfindung soll nun an Hand von Beispielen, die jedoch nicht als einschränkend zu verstehen sind, erläutert werden.
Beispiel 1
Im folgenden Beispiel sind die Ergebnisse der Amylaseinaktivierung in einer Rhizomucor mieheizellfreien, konzentrierten Fermentationsbrühe, die von einer unbehandelten Rhizomucor miehei-Fermentationsbrühe nach den Schritten 1) fest-flüssig-Trennung, 2) Reinigungstrennung sowie 3) Ultrafiltration unter Zusatz von 100 g/kg NaCl als Stabilisator erhalten wurde, beschrieben. Die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease, die in der Fermentationsbrühe vorlag, war zwecks Verstärkung ihres thermischen Stabilitätsabbaus nicht behandelt worden. Die Amylaseaktivität und die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteaseaktivität in der Lösung werden nach Standardmethoden, mit denen der Fachmann vertraut ist, bestimmt.
Tabelle 1
Tabelle 2
Anmerkung: Amylaseaktivitäten von 1 RAU/g oder darüber werden mittels UV-Vis-Absorption bestimmt. Aktivitäten unter 1 RAU/g werden über ein Petrischalenverfahren bestimmt. Die Nachweisgrenze beträgt 0,0005 RAU/g.
In Tabelle 1 sind die restliche Amylaseaktivität und die restliche Asparaginsäureproteaseaktivität nach der Behandlung angegeben, wobei letztere über einen Zeitraum zwischen 2 und 24 Stunden bei einem pH-Wert zwischen 2,5 und 3,0, einer Temperatur zwischen 20°C und 40°C in einer zellfreien, konzentrierten Fermentationsbrühe, die 3950 IMCU/g R. miehei-Asparaginsäureproteaseaktivität und 520 RAU/g Amylaseaktivität enthält, durchgeführt wurde.
In Tabelle 2 sind die gleichen Werte über einen Zeitraum zwischen 4 und 8 Stunden bei einem pH-Wert von 2,5, einer Temperatur zwischen 30°C und 40°C für eine zellfreie, konzentrierte Fermentationsbrühe, die 2000 IMCU/g R. miehei-Asparaginsäureproteaseaktivität und 250 RAU/g Amylaseaktivität enthält, angegeben.
Aus diesen Versuchen geht hervor, daß zur Erzielung einer optimalen Amylaseinaktivierung (also mindestens 99,99% Amylseinaktivierung) in einer Rhizomucor miehei zellfreien, konzentrierten Fermentationsbrühe, die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease, die nicht zwecks Verstärkung ihres thermischen Stabilitätsabbaus behandelt worden ist, enthält, bei minimalen Verlusten an Asparaginsäureproteaseaktivität die folgenden Bedingungen angewandt werden können: pH-Wert ungefähr 2,5, Temperatur ungefähr 35°C, Erhitzungszeit ungefähr 4 Stunden.
Beispiel 2
In diesem Beispiel werden die Ergebnisse einer an einer Rhizomucor miehei-zellfreien, konzentrierten, mit 100 g/kg NaCl vorstabilisierten Fermentationsbrühe durchgeführten Amylaseinaktivierungsbehandlung dargestellt.
Tabelle 3
Anmerkung: Amylaseaktivitäten von 1 RAU/g oder darüber werden mittels UV-Vis-Absorption bestimmt. Aktivitäten unter 1 RAU/g werden über ein Petrischalenverfahren bestimmt. Die Nachweisgrenze beträgt 0,0005 RAU/g. nb = nicht bestimmt.
In Tabelle 3 sind die restliche Amylaseaktivität und die restliche Asparaginsäureproteaseaktivität nach einer zwischen 0 und 8 Stunden lang bei pH 2,5 und einer Temperatur von 35°C durchgeführten Behandlung dargestellt. Ansatz 1 enthält 2000 IMCU/g R. miehei-Asparaginsäureprotease, 250 RAU/g Amylase, Ansatz 2 enthält 3990 IMCU/g R. miehei-Asparaginsäureprotease, 626 RAU/g Amylase, und Ansatz 3 enthält 3389 IMCU/g R. miehei-Asparaginsäureprotease, 701 RAU/g Amylase.
Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß eine Inaktivierung der Amylase in Rhizomucor mieheizellfreien, konzentrierten Fermentationsbrühederivaten, die Natriumchlorid und eine Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease, die nicht zwecks Verstärkung ihres thermischen Stabilitätsabbaus behandelt wurde, enthalten, innerhalb von 4 Stunden mit durchschnittlichen Asparaginsäureproteaseaktivitätsverlusten von weniger als 5% erzielt werden kann.
Beispiel 3
Im folgenden Beispiel sind die Ergebnisse der Amylaseinaktivierung in Rhizomucor miehei-zellfreien, konzentrierten Fermentationsbrühen, die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease, die zwecks Verstärkung ihres thermischen Stabilitätsabbaus behandelt worden war, enthalten, dargestellt. Die Konzentrate waren mit 100 g/kg Natriumchlorid stabilisiert worden. Die Ergebnisse der Versuche, die als restliche Amylaseaktivität und restliche Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteaseaktivität nach dem Inaktivierungsschritt angegeben sind, sind in Tabelle 4 dargestellt. Alle Versuche wurden 0 bis 8 Stunden lang bei 20°C und einem pH-Wert zwischen 2,3 und 2,7 durchgeführt.
Tabelle 4
Anmerkung: Amyl: restliche Amylaseaktivität (RAU/g); RAF: restliche Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteaseaktivität in Prozent. Amylaseaktivitäten von 1 RAU/g oder darüber werden mittels UV-Vis-Absorption bestimmt. Aktivitäten unter 1 RAU/g werden über ein Petrischalenverfahren bestimmt. Die Nachweisgrenze beträgt 0,0005 RAU/g.
Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß bei Rhizomucor miehei-Lösungen, die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease, die zwecks Verstärkung ihres thermischen Stabilitätsabbaus behandelt worden war, enthalten, höhere Asparaginsäureproteaseaktivitätsverluste und höhere restliche Amylaseaktivitäten zu beobachten sind. Die Proteaseaktivitätsverluste betragen jedoch immer weniger als 10% und die restliche Amylaseaktivität beträgt immer weniger als 0,05 RAU/g (d.h. das Ausmaß der Amylaseinaktivierung beträgt 99,98%).

Claims

Verfahren für Inaktivierung von Amylase in einer Proteaselösung, wobei die Proteaselösung über einen Zeitraum zwischen 0,5 und 24 Stunden bei einem pH-Wert zwischen 2,1 und 2,8 und bei einer Temperatur zwischen 20°C und 40°C gehalten wird, und mindestens 95% der Amylaseaktivität zu inaktivieren, und wobei es sich bei der Protease um eine Asparaginsäureprotease aus Rhizomucor miehei handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die restliche Asparaginsäureproteaseaktivität in der Lösung am Ende der Aktivierungszeit mindestens 90% vorzugsweise mindestens 95% beträgt, und/oder die restliche Amylaseaktivität 0,05 RAU/g oder weniger, stärker bevorzugt 0,001 RAU/g oder weniger, noch stärker bevorzugt 0,0005 RAU/g oder weniger beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Asparaginsäureproteaselösung bei einem pH-Wert zwischen 2,3 und 2,6 gehalten wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Asparaginsäureproteaselösung bei einer Temperatur zwischen 32°C und 38°C gehalten wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Zeitraum, der ausreicht, um die Amylase zumindest zu 95% zu aktivieren, zwischen 4 und 12 Stunden beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei der Asparaginsäureprotease um eine zellfreie und/oder konzentrierte Fermentationbrühe oder deren Derivate handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteaselösung weiterhin ein Stabilisierungsmittel für die Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease enthält.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem Stabilisierungsmittel um Natriumchlorid handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei nach der Inaktivierung der Amylase der thermische Stabilitätsabbau der Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease verstärkt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der thermische Stabilitätsabbau der Rhizomucor miehei-Asparaginsäureprotease vor der Inaktivierung der Amylase durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Inaktivierung bei einer Temperatur von 20°C und 25°C durchgeführt wird.