ES2258177T3 - Metodo para la inactivacion de amilasa en presencia de proteasa. - Google Patents
Metodo para la inactivacion de amilasa en presencia de proteasa.Info
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Abstract
Un método para la inactivación de amilasa en una solución de proteasa.
Description
Método para la inactivación de amilasa en
presencia de proteasa.
La invención se relaciona con un método para la
inactivación de amilasa en presencia de proteasa. La invención se
relaciona además con una proteasa aspártica del Rhizomucor
miehei obtenible por el método de la invención y con su uso en
hacer productos lácteos.
La quimosina, extraída del estómago del ternero
es, en el presente, una de las enzimas más eficientes en la
coagulación de la leche conocida y es ampliamente usada en la
producción de queso. Sin embargo la creciente demanda de quimosina
por parte de la industria lechera y su limitada disponibilidad a
partir de las fuentes naturales ha incitado a los científicos a
investigar alternativas apropiadas. La quimosina puede ahora ser
producida por medio de la tecnología del ADN recombinante en
bacterias, es decir Escherichia coli, levadura, es decir
Kluyveromyces lactis, y en hongos filamentosos, es decir
Aspergillus níger. También otras proteasas fúngicas están
siendo ahora extensamente usadas en la producción de queso. La
proteasa aspártica del Rhizomucor miehei es la preparación
más común para la coagulación de la leche por su buena ejecución
(Sternberg, M.Z. (1971) Proteasa para la coagulación de la leche
cristalina del Mucor miehei, y algunas de sus propiedades.
J. Dairy Sci., Vol. 54, páginas 159-167).
Esta proteasa puede también ser producida de manera heteróloga
mediante la tecnología del ADN recombinante en hongos filamentosos
(Boel E. y otros Patente Europea EP-238023).
La proteasa aspártica del Rhizomucor miehei es altamente
estable al calor. La misma permanece parcialmente activa en el
suero después de la pasteurización, provocando coágulos de leche
indeseados cuando el suero es usado en otras preparaciones, tales
como en leche enriquecida para alimento de bebés. Por lo tanto, la
proteasa aspártica del Rhizomucor miehei es a menudo
modificada para disminuir su estabilidad al calor. Varios métodos
para incrementar la desestabilización térmica de la proteasa
aspártica del Rhizomucor miehei son conocidos en el arte.
Algunos de ellos son descritos en las Patentes del Reino Unido GB
2038339B, GB 2045772B y GB 2045773B.
Un problema con la producción microbiana de
enzimas de coagulación de la leche por medio de la fermentación es
la expresión de otras enzimas indeseables. Debido a una demanda
creciente en el mercado de preparaciones de enzimas puras, varios
métodos han sido desarrollados en el arte para la separación y
purificación de enzimas deseables a partir de mezclas de enzimas o
para la inactivación selectiva de enzimas indeseables.
La Patente US 2,683,682 (1954) describe la
inactivación diferencial de una de las enzimas del grupo que
consiste de proteasas y amilasas a partir de mezclas que comprenden
ambos tipos de enzimas. El método comprende ajustar el pH de la
solución acuosa entre 3.0 y 4.5 (para inactivar selectivamente la
amilasa) o entre 7.0 y 10.5 (para inactivar selectivamente la
proteasa) y mantener la mezcla a una temperatura comprendida entre
alrededor de 5ºC y 60ºC durante un período de tiempo suficiente para
inactivar la enzima indeseada, generalmente desde alrededor de 0.5
horas o menos para temperaturas más altas, hasta 20 horas para
temperaturas más bajas. El tratamiento de la mezcla de enzimas
derivadas de la harina de trigo malteada o cebada malteada a pH 3.6
y 50ºC durante 0.5 horas conduce a una recuperación de la proteasa
de a lo máximo 66% y una desactivación de la amilasa del 99.7%. Al
mismo pH y 5ºC durante 20 horas la recuperación de la proteasa es de
85%, con un desactivación de la amilasa del 99.6%.
La Patente US 4,086,139 (1978) describe la
inactivación selectiva de la amilasa en mezclas de enzimas que
comprenden proteasa y amilasa. La inactivación de la amilasa ocurre
por tratamiento de la mezcla de enzimas con un agente oxidante
seleccionado del grupo que consiste de iones clorito e hipoclorito.
Los iones son adicionados a la mezcla de enzimas en cantidad
suficiente para inactivar la amilasa mientras que deja la proteasa
intacta, evitando así pasos de purificación adicionales. La
temperatura y el pH del tratamiento no son críticos ya que ellos no
son perjudiciales para la proteasa. Las composiciones de enzimas,
las cuales pueden ser tratadas con el método de la invención, son
derivadas de órganos animales (por ejemplo extractos de órganos
animales crudos) o bacterias como Bacillus subtilis o
licheniformis (por ejemplo caldos de fermentación). Con el
método de la invención más del 80% de la amilasa es inactivada
dejando la actividad de la proteasa más del 80% intacta.
La Patente US 5,139,943 (1992) describe un método
para la recuperación selectiva de quimosina producida de manera
microbiana a partir de mezclas de polipéptidos o enzimas producidas
por fermentación, como por ejemplo la
\alpha-amilasa. El método de la invención está
basado en el uso de un sistema líquido-líquido de
dos fases que tiene un coeficiente de partición para la quimosina
mayor que alrededor de 85. El sistema de dos fases es obtenido
adicionando PEG y una sal como un fosfato o sulfato a la composición
de enzimas acuosas. La quimosina es selectivamente extraída en la
fase orgánica mientras que la amilasa permanece en la fase agua. La
quimosina puede ser recuperada del PEG por medio de la cromatografía
de intercambio iónico. Usando un pH menor que 3, los coeficientes de
partición para la quimosina pueden ser obtenidos de alrededor de
1000, permitiendo la separación total de la amilasa y una
recuperación de quimosina de alrededor de
96-98%.
La Solicitud Internacional de Patente WO 97/20921
(publicada el 12 de Junio de 1997) describe un método para la
inactivación selectiva de al menos una enzima indeseable a partir de
la mezcla de enzimas que comprende enzimas deseables y no deseables.
La mezcla de enzimas es tratada a pH menor que 5 y a una temperatura
desde 2 a 75ºC durante al menos 20 segundos, y/o a pH mayor que 9 y
a una temperatura desde 2 a 75ºC durante al menos 20 segundos. Por
este método la amilasa es completamente inactivada tratando una
mezcla de enzimas que comprende amilasa y celulasa a pH 3.5 durante
1 min a 70ºC, mientras que 96% de la actividad de la celulasa
permanece intacta (Ejemplo 4). Por otra parte solamente 2% de la
actividad de la proteasa es mantenida cuando se trata una mezcla de
enzimas que comprende lipasa y proteasa a pH 3.5, 45ºC durante 60
minutos. En mezclas que comprende celulasa y proteasa (Ejemplo 7),
la proteasa es completamente inactivada por tratamiento a 3ºC o 25ºC
durante 60 minutos y a un pH de 2.5.
Algunos métodos descritos en el arte tienen la
desventaja de ser demasiado laboriosos. En general los métodos en el
arte están caracterizados por una baja selectividad hacia la
inactivación de la amilasa y por una pérdida relativamente alta en
la actividad de la proteasa.
Durante la producción microbiana de quimosina y
de proteasa aspártica del Rhizomucor miehei por medio de la
fermentación, la enzima amilasa es también producida en el caldo de
fermentación. La industria lechera está esforzándose ahora para
obtener mayores producciones de queso y productos lácteos de calidad
superior. Lo último depende grandemente de la pureza de las enzimas
de coagulación de la leche empleadas en la producción de estos
productos. Uno de los problemas relacionados con la presencia de la
amilasa en las enzimas de coagulación de la leche son las
actividades colaterales indeseadas de la amilasa en el suero, lo
cual puede ser perjudicial para las futuras aplicaciones del suero.
Por lo tanto un propósito de la invención es proporcionar un método
simple y eficiente para inactivar la amilasa en presencia de la
proteasa aspártica del Rhizomucor miehei con alta
selectividad y con alta recuperación de la proteasa.
Sorprendentemente ha sido encontrado que la
inactivación de la amilasa en presencia de la proteasa aspártica del
Rhizomucor miehei puede ser lograda por la presente
invención, la cual comprende mantener la solución de proteasa
aspártica del Rhizomucor miehei que comprende amilasa a un pH
entre 2.1 y 2.8 y a una temperatura entre 20ºC y 40ºC durante un
período de tiempo entre 0.5 horas y 24 horas para inactivar la
amilasa en al menos un 95%. El empleo de estas condiciones dio como
resultado un incremento inesperado en la desactivación de la amilasa
mientras que se mantiene un alto nivel de la actividad de la
proteasa aspártica.
Las ventajas de este método son la simplicidad y
especialmente la alta selectividad con lo cual la amilasa es
inactivada en las soluciones de proteasa aspártica del Rhizomucor
miehei que comprenden amilasa. Ha sido sorprendentemente
encontrado que con el método de la invención al menos el 90%,
preferiblemente al menos el 95% de la actividad de la proteasa
aspártica es mantenida en la solución de la proteasa aspártica del
Rhizomucor miehei después del tratamiento mientras que la
actividad de la amilasa residual es generalmente menor que 0.05
RAU/g, preferiblemente menor que 0.001 RAU/g, más preferiblemente
menor que 0.0005 RAU/g.
Por el término "amilasa" se entiende
cualquier enzima con actividad amilasa, por ejemplo la
\alpha-amilasa (EC 3.2.1.1), la
\beta-amilasa (EC 3.2.1.2), la
\gamma-amilasa (EC 3.2.1.3), la amilasa III
(2.4.1.161) o cualquier mezcla de las mismas.
1 RAU (Unidad de actividad de la Amilasa) es
definida como la cantidad de la enzima que convertirá bajo
condiciones estandarizadas (pH=6.6, 30ºC) 1 mg de almidón soluble
por minuto. La IMCU (Unidad Internacional de Coagulación de la
Leche) es definida para los cuajos bovinos por la Federación Láctea
Internacional (IDF), protocolo 157: 1992.
Por el término "proteasa aspártica del
Rhizomucor miehei" se entiende la proteasa aspártica
producida de manera homóloga en Rhizomucor miehei. Un proceso
para la preparación de la enzima por medio de la fermentación es
descrito en la Patente US No. 3,988,207. Con el término "proteasa
aspártica del Rhizomucor miehei" también se pretende
incluir una proteasa aspártica del Rhizomucor miehei, es
decir una proteasa aspártica del Rhizomucor miehei producida
en un organismo hospedero transformada con ADN que codifica para la
proteasa aspártica del Rhizomucor miehei. El organismo
hospedero puede ser un hongo, por ejemplo una levadura o un hongo
filamentoso. Preferiblemente el organismo hospedero es un hongo
filamentoso seleccionado del género de Aspergillus, Trichoderma,
Penicillium, Fusarium o Humicola. Más preferiblemente,
los hongos filamentosos pertenecen al género Aspergillus o
Trichoderma. El uso de Aspergillus níger, Aspergillus
nidulans o Aspergillus oryzae como una cepa hospedera es
preferido. El método para la producción de una proteasa aspártica
del Rhizomucor miehei recombinante en un organismo hospedero
es descrito en la patente Europea EP0700253B1.
Por el término "solución de proteasa aspártica
del Rhizomucor miehei" se entiende una solución,
preferiblemente una solución acuosa, que comprende amilasa y
proteasa aspártica del Rhizomucor miehei.
El método de la invención puede ser
ventajosamente aplicado a la proteasa aspártica del Rhizomucor
miehei derivada de los caldos de fermentación o de los derivados
de los mismos obtenibles en cualquiera de las etapas durante el
proceso aguas abajo, generalmente antes del paso de formulación. La
solución de proteasa aspártica del Rhizomucor miehei es
preferiblemente un caldo de fermentación, más preferiblemente un
caldo de fermentación derivado de la fermentación del Rhizomucor
miehei, el cual puede ser obtenido de acuerdo a métodos
conocidos en el arte, por ejemplo como el descrito en "Experimento
en planta piloto" de la Patente US No. 3,988,207. En otra
realización preferida de la invención, el caldo de fermentación es
un caldo de fermentación de un organismo hospedero transformado con
ADN que codifica para la proteasa aspártica del Rhizomucor
miehei cuyo organismo expresa la proteasa. Generalmente, la
solución de proteasa aspártica del Rhizomucor miehei es
obtenida a partir del caldo de fermentación después de la
eliminación de las células. Lo último puede ser logrado matando los
microorganismos en el caldo de fermentación por uno de los varios
métodos conocidos en el arte y por la eliminación de los desechos de
las células. La eliminación de las células puede ser lograda por una
o más técnicas de separación sólido/líquido como la floculación, la
centrifugación, la filtración, y la separación de membrana.
Generalmente, la solución de proteasa aspártica del Rhizomucor
miehei es obtenida a partir del caldo de fermentación después de
la eliminación de las células y la concentración de la solución
libre de células antes de usarla en el método de la invención. La
concentración puede ser lograda por evaporación o por concentración
de membrana; preferiblemente la concentración de membrana es lograda
por técnicas de ultra-filtración. Por lo tanto en
una realización preferida de la invención la solución de proteasa
aspártica del Rhizomucor miehei es un caldo de fermentación
concentrado y/o libre de células. Por "libre de células" se
entiende libre de cualquier partícula o célula con diámetro de 0.4
\mum o mayor.
Ha sido observado que la adición de un agente tal
como cloruro de sodio a la solución de proteasa aspártica del
Rhizomucor miehei estabiliza la proteasa aspártica del
Rhizomucor miehei y disminuye las pérdidas en la actividad de
la proteasa aspártica durante el método de la invención. Ejemplos de
estos agentes son el cloruro de sodio, cloruro de potasio,
glicerol, sorbitol, polietileno glicol. En una realización preferida
de la invención, la solución de proteasa aspártica del Rhizomucor
miehei comprende un agente que tiene efecto de estabilización en
la proteasa aspártica del Rhizomucor miehei. Más
preferiblemente la solución de proteasa aspártica del Rhizomucor
miehei comprende cloruro de sodio. Cuando el cloruro de sodio
está presente, este es generalmente adicionado al caldo de
fermentación en una cantidad comprendida entre
50-200 g/kg.
El pH de la solución de proteasa aspártica del
Rhizomucor miehei usada en el método de la invención puede
ser ajustado usando ácidos o bases aceptables en la alimentación
dentro del conocimiento de aquellos expertos en el arte. El ajuste
del pH puede ser efectuado antes durante o después que la mezcla de
enzimas ha alcanzado la temperatura de calentamiento. Sin embargo el
tiempo de calentamiento comienza una vez que la solución tiene el pH
correcto. En una realización preferida de la invención el ajuste del
pH de la mezcla de enzimas es logrado antes de calentar la mezcla de
enzimas.
Ha sido observado que los mejores resultados en
el mantenimiento de la actividad de la proteasa y la inactivación de
la amilasa son obtenidos cuando, en un método de la invención, la
solución de proteasa aspártica del Rhizomucor miehei es
mantenida a un pH entre 2.3 y 2.6 y/o mantenida a una temperatura
entre 32ºC y 38ºC. La solución es mantenida a este pH y temperatura
durante un período de tiempo entre 0.5 y 24 horas. Por lo tanto, en
una realización preferida de la invención el pH de la solución de
proteasa aspártica del Rhizomucor miehei durante el paso de
inactivación está entre 2.3 y 2.6. En otra realización preferida la
temperatura a la cual la solución es mantenida durante el paso de
inactivación está comprendida entre 32ºC y 38ºC. En una tercera
realización preferida el período de tiempo al cual la reacción es
mantenida a la temperatura deseada está entre 4 y 12 horas.
Una vez que el paso de inactivación de la amilasa
ha sido completado, la temperatura de la solución es generalmente
disminuida a entre alrededor de 4ºC a 25ºC, preferiblemente a 4ºC, y
el pH de la solución es incrementado a un valor en el cual la
proteasa aspártica del Rhizomucor miehei es estable,
usualmente a un pH entre alrededor de 4 y 6.
Con el método de la invención, la amilasa es
inactivada con alta selectividad en las soluciones de proteasa
aspártica del Rhizomucor miehei. Al final del tratamiento al
menos 90%, preferiblemente al menos 95% de la actividad de la
proteasa aspártica es mantenida mientras que la actividad de la
amilasa residual es generalmente menor que 0.05 RAU/g,
preferiblemente menor que 0.001 RAU/g, más preferiblemente menor que
0.0005 RAU/g. El nivel de actividad de la amilasa en la solución de
proteasa aspártica del Rhizomucor miehei antes del paso de
inactivación es generalmente 100 RAU/g o mayor. Por lo tanto, el
grado de inactivación de la amilasa en la solución después del
tratamiento es generalmente al menos del 99.95%.
Es conocido que la proteasa aspártica del
Rhizomucor miehei es altamente estable al calor. Esta
característica puede ser desventajosa, ya que durante la fabricación
del queso la enzima permanece parcialmente activa en el suero
después de la pasteurización, provocando la coagulación indeseada de
la leche cuando el suero es usado en otras preparaciones. Por lo
tanto la proteasa aspártica del Rhizomucor miehei comprendida
en las preparaciones de enzimas de coagulación es preferiblemente
modificada para aumentar su desestabilización térmica. En caso de
que la proteasa aspártica del Rhizomucor miehei usada en un
método de la invención no ha sido tratada para aumentar su
desestabilización térmica, el método de la invención puede
comprender un paso, a ser aplicado después de a inactivación de la
amilasa, para aumentar la desestabilización térmica de la proteasa
aspártica del Rhizomucor miehei. El tratamiento para aumentar
la desestabilización térmica de la proteasa aspártica del
Rhizomucor miehei puede ser también aplicado antes del paso
de inactivación de la amilasa. En este caso el paso de inactivación
de la amilasa es preferiblemente aplicado a una temperatura entre
20ºC y 25ºC, preferiblemente a alrededor de 20ºC, los otros
parámetros permanecen los mismos. La solución de enzimas
preferiblemente comprende cloruro de sodio o un agente que tiene un
efecto de estabilización en la proteasa aspártica del Rhizomucor
miehei. Cuando el cloruro de sodio es usado, este es
generalmente adicionado al caldo de fermentación en una cantidad
entre 50-200 g/kg.
En una realización preferida, después de la
inactivación de la amilasa la desestabilizaicón térmica de la
proteasa aspártica del Rhizomucor miehei en la solución es
aumentada con un método conocido en el arte.
El método usado para aumentar la
desestabilización térmica de la proteasa aspártica del Rhizomucor
miehei no es crítico y puede comprender cualquiera de los varios
métodos conocidos en el arte para realizar esta tarea. Por ejemplo
el producto de enzima puede ser tratado en un medio acuoso con un
agente oxidante que contiene halógeno activo, por ejemplo
hipoclorito (por ejemplo la Patente de GB No. 2,045,772B). Otra
posibilidad es tratar el producto de enzima en medio acuoso con un
reactivo de acilación, por ejemplo anhídrido acético o propiónico
(por ejemplo la Patente de GB No. 2,038,339B). Preferiblemente el
producto de enzima es tratado en medio acuoso con un ácido peroxi
como un ácido peroxi inorgánico o un ácido peroxi alifático
inferior. Preferiblemente el ácido peroxi acético o peroxi
propiónico es usado (Patente de GB No. 2,045,773). El modo de
realizar estos métodos es ampliamente descrito en la literatura y
por lo tanto están dentro del conocimiento de aquellos expertos en
el arte.
La invención también proporciona una proteasa
aspártica del Rhizomucor miehei obtenible por un método de la
invención y proporciona además composiciones que comprenden tales
proteasas aspárticas. La proteasa aspártica del Rhizomucor
miehei comprende menos de 0.0005 RAU de amilasa por 2000 IMCU de
proteasa.
El producto de enzima que comprende proteasa
aspártica del Rhizomucor miehei obtenible por un método de la
invención puede ser procesado adicionalmente. A continuación del
paso de inactivación de la amilasa o el aumento de la
desestabilización térmica de la proteasa aspártica del Rhizomucor
miehei cualquier método convencional conocido en el arte es
apropiado para preparar la enzima para uso posterior.
El producto de enzima puede ser usado para la
preparación de una sustancia alimenticia. Estas composiciones pueden
comprender otras enzimas. Por lo tanto la invención también
proporciona composiciones que comprenden proteasa aspártica del
Rhizomucor miehei obtenible por un método de la invención.
Tales composiciones pueden ser composiciones sólidas o líquidas. Las
composiciones sólidas pueden estar en forma de tabletas, gránulos,
polvos, cristales, etc.
La proteasa aspártica del Rhizomucor
miehei obtenible por un método de la invención o
alternativamente la composición de la invención puede ser usada para
la producción de un producto lácteo. Leche de diferentes fuentes
puede ser usada en la producción de tal producto, el cual es
preferiblemente un producto de queso. Ejemplos de leche, que pueden
ser obtenidas por el método de la invención, son leche de vaca,
leche de cabra, leche de oveja, leche de camello etc. La proteasa
aspártica del Rhizomucor miehei es apropiada para la
producción de cualquier tipo de queso o producto lácteo. El uso de
proteasas aspáticas microbianas como enzimas de coagulación en la
fabricación de queso está bien documentado en el arte. Una ventaja
de la proteasa aspártica del Rhizomucor miehei obtenible por
el método de la invención o alternativamente de las composiciones de
la invención es el muy bajo nivel o ausencia de actividad de la
amilasa. El uso de la enzima de la invención o de la composición
antes mencionada como una enzima de coagulación en la fabricación de
queso permite, por ejemplo, un procesamiento adicional más ventajoso
del suero obtenido después de la separación de la cuajada. Este
suero, que está libre de actividad de la amilasa, puede ser usado
con mejores resultados para la preparación de productos lácteos que
comprenden almidón, gluten, etc.
La invención será ahora ilustrada por medio de
ejemplos, los cuales sin embargo no deben ser considerados como
limitantes.
\vskip1.000000\baselineskip
El siguiente ejemplo muestra los resultados de la
inactivación de la amilasa en un caldo de fermentación concentrado,
libre de células de Rhizomucor miehei obtenido a partir de un
caldo de fermentación de Rhizomucor miehei crudo después de
los pasos de: 1) separación sólido-líquido, 2)
filtración de refinamiento, y 3) ultra-filtración
que comprende 100g/kg de NaCl como estabilizador. La proteasa
aspártica del Rhizomucor miehei comprendida en el caldo de
fermentación no ha sido tratada para aumentar su desestabilización
térmica. La actividad de la amilasa y la actividad de la proteasa
aspártica del Rhizomucor miehei en la solución son medidas
con métodos estándares conocidos por aquellos expertos en el
arte.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| pH | 2.5 | 3.0 | |||||||||||
| Temperatura (ºC) | 20 | 30 | 40 | ||||||||||
| Tiempo (horas) | 2 | 4 | 6 | 8 | 2 | 4 | 8 | 2 | 4 | 6 | 8 | 12 | 24 |
| Proteasa Asp. | 97 | 101 | 100 | 99 | 99 | 102 | 100 | 104 | 97 | 99 | 99 | 102 | 98 |
| R. Miehei (%) | |||||||||||||
| Amilasa (RAU/g) | 218 | 100 | 30 | 10 | 25 | 5 | 0.01-1 | 150 | 70 | 26 | 6 | <1 | <1 |
| pH | 2.5 | |||
| Temperatura (ºC) | 35 | 40 | ||
| Tiempo (horas) | 4 | 8 | 4 | 8 |
| Proteasa Asp. | 101 | 100 | 100 | 96 |
| R. Miehei (%) | ||||
| Amilasa (RAU/g) | <0.0005 | <0.0005 | <0.0005 | <0.0005 |
| \begin{minipage}[t]{158mm} Nota: Las actividades de la amilasa de 1 RAU/g o mayores son medidas por medio de la absorción Vis UV. Las actividades menores que 1 RAU/g son medidas por medio del método de la placa Petri. El límite de detección es 0.0005 RAU/g.\end{minipage} | ||||
La tabla 1 muestra la actividad de la amilasa
residual y la proteasa aspártica residual después del tratamiento,
la última efectuada a un pH entre 2.5 y 3.0, una temperatura entre
20ºC y 40ºC, durante un tiempo entre 2 y 24 horas, en un caldo de
fermentación concentrado, libre de células que comprende actividad
de proteasa aspártica de R. Miehei de 3950 IMCU/g y actividad
de amilasa de 520 RAU/g.
La tabla 2 muestra los mismos valores a un pH de
2.5, una temperatura entre 30ºC y 40ºC, durante un tiempo entre 4 y
8 horas, en un caldo de fermentación concentrado, libre de células
que comprende actividad de proteasa aspártica de R. Miehei de
2000 IMCU/g y actividad de amilasa de 250 RAU/g.
Estos experimentos muestran que para obtener la
inactivación de la amilasa óptima (es decir al menos 99.99% de
inactivación de la amilasa) en un caldo de fermentación concentrado,
libre de células de Rhizomucor miehei, que comprende proteasa
aspártica del Rhizomucor miehei que no ha sido tratada para
aumentar su desestabilización térmica, con pérdidas mínimas en la
actividad de la proteasa aspártica, las siguientes condiciones
pueden ser aplicadas: un pH de alrededor de 2.5, una temperatura de
alrededor de 35ºC y un tiempo de calentamiento de alrededor de 4
horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo muestra los resultados del
tratamiento de inactivación de la amilasa efectuado en el caldo de
fermentación concentrado, libre de células de Rhizomucor
miehei pre-estabilizado con 100 g/kg de
NaCl.
\vskip1.000000\baselineskip
| Lote | 1 | 2 | 3 | |||
| Tiempo | Amilasa | Prot. Asp. | Amilasa | Prot. Asp. | Amilasa | Prot. Asp. |
| (h) | (RAU/g) | R. miehei (%) | (RAU/g) | R. miehei (%) | (RAU/g) | R. miehei (%) |
| 0 | 225 | 100 | 490 | 100 | 550 | 100 |
| 4 | <0.0005 | 101 | 0.001- | 98 | Nd | Nd |
| 0.005 | ||||||
| 5 | Nd | Nd | 0.0005- | 98 | Nd | Nd |
| 0.001 | ||||||
| 6 | Nd | Nd | <0.0005 | 96 | 0.0005 | 98 |
| 8 | <0.0005 | 100 | Nd | Nd | Nd | Nd |
| \begin{minipage}[t]{158mm} Nota: Las actividades de la amilasa de 1 RAU/g o mayores son medidas por medio de la absorción Vis UV. Las actividades menores que 1 RAU/g son medidas por medio del método de la placa Petri. El límite de detección es 0.0005 RAU/g. Nd=no determinado.\end{minipage} |
La tabla 3 muestra la actividad de la amilasa
residual y la proteasa aspártica residual después del tratamiento
efectuado a pH 2.5, a una temperatura de 35ºC durante entre 0 y 8
horas. El lote 1 comprende proteasa aspártica de R. Miehei de
2000 IMCU/g, amilasa de 250 RAU/g, el lote 2 comprende proteasa
aspártica de R. Miehei de 3990 IMCU/g, amilasa de 626 RAU/g
y el lote 3 comprende proteasa aspártica de R. Miehei de 3389
IMCU/g, amilasa de 701 RAU/g.
Estos resultados muestran que la inactivación de
la amilasa en los derivados del caldo de fermentación concentrado,
libre de células de Rhizomucor miehei que comprenden cloruro
de sodio y proteasa aspártica del Rhizomucor miehei que no ha
sido tratada para incrementar su desestabilización térmica, puede
ser lograda dentro de 4 horas con un promedio de pérdidas en la
actividad de la proteasa aspártica menor que 5%.
\vskip1.000000\baselineskip
El siguiente ejemplo muestra los resultados de la
inactivación de la amilasa en los caldos de fermentación
concentrados, libres de células de Rhizomucor miehei que
comprenden proteasa aspártica del Rhizomucor miehei, la cual
ha sido tratada para aumentar su desestabilización térmica. Los
concentrados han sido estabilizados con 100 g/kg de cloruro de
sodio. Los resultados de los experimentos, expresados como la
actividad de la amilasa residual y la actividad de la proteasa
aspártica del Rhizomucor miehei residual después del paso de
inactivación son mostrados en la Tabla 4. Todos los experimentos han
sido ejecutados a 20ºC, a un pH entre 2.3 y 2.7, durante un tiempo
de 0 a 8 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
| Ensayo 1 | Ensayo 2 | Ensayo 3 | ||||
| pH 2.5 | pH 2.3 | pH 2.7 | ||||
| Tiempo (h) | Amil | RAF | Amil | RAF | Amil | RAF |
| 0 | 125 | 100 | 125 | 100 | 125 | 100 |
| 6 | 0.01 | 97 | 0.01 | 95 | 0.02 | 96 |
| 8 | 3 | 9 | ||||
| 8 | 0.01 | 99 | 0.01 | 94 | 0.02 | 99 |
| 8 | 3 | 7 | ||||
| \begin{minipage}[t]{158mm} Nota: Amil: actividad de la amilasa residual (RAU/g); RAF: porcentaje de la actividad de la proteasa aspártica del Rhizomucor miehei residual. Las actividades de la amilasa de 1 RAU/g o mayores son medidas por medio de la absorción Vis UV. Las actividades menores que 1 RAU/g son medidas por medio del método de la placa Petri. El límite de detección es 0.0005 RAU/g.\end{minipage} |
Estos resultados muestran que con las soluciones
del Rhizomucor miehei que comprenden proteasa aspártica del
Rhizomucor miehei, la cual ha sido tratada para aumentar su
desestabilización térmica, mayores pérdidas de la actividad de la
proteasa aspártica y mayores niveles en la actividad de la amilasa
residual pueden ser observados. Sin embargo las pérdidas en la
actividad de la proteasa son siempre menores que 10%, y la actividad
de la amilasa residual es siempre menor que 0.05 RAU/g (es decir el
grado de inactivación de la amilasa es 99.98%).
Claims (11)
1. Un método para la inactivación de amilasa en
una solución de proteasa, donde la solución de proteasa es mantenida
a un pH entre 2.1 y 2.8 y mantenida a una temperatura entre 20ºC y
40ºC durante un período de tiempo entre 0.5 y 24 horas para
inactivar al menos el 95% de la actividad de la amilasa y donde la
proteasa es una proteasa aspártica del Rhizomucor
miehei.
2. El método de la reivindicación 1, donde la
actividad de la proteasa aspártica residual en la solución al final
del tiempo de inactivación es al menos de 90%, preferiblemente al
menos de 95%, y/o la actividad de la amilasa residual es 0.05 RAU/g
o menor, más preferiblemente 0.001 RAU/g o menor, aún más
preferiblemente 0.0005 RAU/g o menor.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, donde
la solución de proteasa aspártica es mantenida a un pH entre 2.3 y
2.6.
4. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde la solución de proteasa aspártica es
mantenida a una temperatura entre 32ºC y 38ºC.
5. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde el período de tiempo, el cual es
suficiente para inactivar la amilasa en al menos el 95%, está entre
4 y 12 horas.
6. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, donde la solución de proteasa aspártica es
un caldo de fermentación concentrado y/o libre de células o
derivados del mismo.
7. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, donde la solución de proteasa aspártica del
Rhizomucor miehei comprende adicionalmente un agente de
estabilización para la proteasa aspártica del Rhizomucor
miehei.
8. El método de la reivindicación 7, donde el
agente de estabilización es cloruro de sodio.
9. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, donde después de la inactivación de la
amilasa la desestabilización térmica de la proteasa aspártica del
Rhizomucor miehei es aumentada.
10. El método de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, donde la desestabilización térmica de la
proteasa aspártica del Rhizomucor miehei es realizada antes
de la inactivación de la amilasa.
11. El método de acuerdo a la reivindicación 10,
donde la inactivación es llevada a cabo a una temperatura entre 20ºC
y 25ºC.
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