DK147305B - Fremgangsmaade til selektiv inaktivering af amylase i amylase-protease-blandinger - Google Patents
Fremgangsmaade til selektiv inaktivering af amylase i amylase-protease-blandinger Download PDFInfo
- Publication number
- DK147305B DK147305B DK161877AA DK161877A DK147305B DK 147305 B DK147305 B DK 147305B DK 161877A A DK161877A A DK 161877AA DK 161877 A DK161877 A DK 161877A DK 147305 B DK147305 B DK 147305B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- amylase
- protease
- mixture
- enzyme
- approx
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/99—Enzyme inactivation by chemical treatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
- Y10S435/836—Bacillus licheniformis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
- Y10S435/839—Bacillus subtilis
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
147305
Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til selektiv inaktivering af amylase i blandinger af protease og amylase.
Proteolytiske enzympræparater opnås ved velkendte teknikker ud fra bakterie- og funguskulturer såvel som dyreorganer, såsom pankreas. Specielt er fremstillingen af proteaseholdige enzymblandinger ud fra bakteriekilder velkendt. Amylaseenzymer medproduceres sædvanligvis under væksten af mikroorganismen. Til visse formål ønsker man at få et proteaseholdigt præparat, som i det væsentlige er fri for noget amylaseenzym. F.eks. vil' man til anvendelsesområder, som kræver enzymatisk indvirkning på proteinfasen i et materiale, uden at dets 2 147305 stivelsesindhold påvirkes, ønske at anvende et protease-enzympræparat, som er fri for amylolytisk aktivitet. Ved behandlingen af sojamel med protease er det således til visse formål ønskeligt at anvende et amylasefrit enzympræparat.
Forskellige kendte metoder til rensning og isolering af enzymer indbefatter fraktioneret udfældning med uorganiske salte såsom natrium- og ammoniumsulfater eller polymere fældningsmidler; organiske opløsningsmidler såsom alkoholer og ketoner; ionbytningskromatografi; selektiv absorption og eluering med calciumphosphat-geler; adskillelse på kolonner af CMC eller DEAE cellulose; "Sephadex"-gelfiltrering; differentieret inaktivering med varme ved forskellige pH-værdier; isoelektrisk udfældning; ultrafiltrering; og ultracentrifugering. Nærmere beskrivelse af konventionelle teknikker til enzymrensning og isolering findes i Process Biochemistry, August 1973, p. 9 et seq., og de deri citerede referencer.
En særlig virkningsfuld fremgangsmåde til fjernelse af uønsket enzymaktivitet fra råpræparater indbefatter behandling af præparatet til inaktivering af det forurenende enzym, mens den ønskede aktivitet efterlades i det væsentlige intakt. Skønt det inaktive forurenende stof er til stede i præparatet, er det derfor lige så effektivt neutraliseret, som hvis det var blevet fjernet fysisk. Inaktivering er i denne sammenhæng en irreversibel inaktivering snarere end ren inhibering. Efter fjernelse eller fortynding af det inaktiverende middel viser aktiviteten af det inaktiverede enzym sig således ikke igen. Omkostningerne ved disse inaktiveringsfremgangsmåder er betragteligt lavere end ved rensningsteknikker, som kræver bekostelige reagenser og multiple bearbejdnings- og adskillelsestrin. En sådan inaktiveringsfremgangsmåde beskrives i USA-patentskrift nr. 2.683.682, hvor pH-værdien af et proteinase- og alfa-amylase præparat indstilles til differentiel inaktivering af enten proteinase eller alfa-amylase.
Med den foregående kendte teknik i tankerne er det formålet med frsre-gangsmåden ifølge opfindelsen at tilvejebringe proteolytiske enzympraqparater, som er blevet gjort i det væsentlige fri for amylaseaktivitet uden behov for langvarige adskillelsestrin eller brug af bekostelige reagenser.
3 147305
Det har nu vist sig, at proteasen i et blandet protease-amylase enzympræparat kan blive befriet for amylaseaktiviteten ved behandling af præparatet med et oxidationsmiddel i form af chlorit- og/eller hypochloritioner.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved det i krav l’s kendetegnende del anførte.
Ionerne sættes til enzymblandingen i en mængde, som er tilstrækkelig til i højere grad at inaktivere amylasen end proteasen. Dette vil sædvanligvis medføre, at amylasen i det væsentlige inaktiveres, mens proteasen efterlades med i det væsentlige den oprindelige aktivitet i det ubehandlede præparat. Da ionerne i høj grad forbruges af præparatet under inaktiveringen af amylasen, og da den inaktiverede amylase blot er et enzymatisk uskadeligt protein, er der ikke noget behov for nogen adskillelses- eller rensningstrin efter behandling med ionerne. Efter behandling er præparatet lagringsstabilt.
En yderligere fordel ved fremgangsmåden er, at ionerne vil reducere eller eliminere mikroorganisme-populationen i præparaterne. Disse populationer kunne ellers til sidst resultere i enten ødelæggelse af præparaterne eller negative virkninger på produkterne fremstillet ved brug af præparaterne.
Det er kendt at kombinere oxidations- eller blegningsmidler, inklusive hypochloritioner, med enzymer; se f.eks. USA-patentskrifter nr. 2.262.138, 3.709.790, 3.755.085 og 3.795.586 samt "Chemical Abstrac.ts" 75:107533 p (1973) . Bariumperoxid er blevet anyendt til inaktivering af såvel amylaser som proteinaser (USA-patentskrift nr. 2.647.854). Desuden er det almindelig kendt at reducere den mikrobielle forurening af materialer og overflader ved behandling af dem med hypochlorit. Det kan imidlertid ikke af nogen af disse referencer udledes, at amylase i protease-amylase'blandinger kan inaktiveres differentielt. I realiteten vækker referencen ifølge "Chemical Abstracts" formodning om det modsatte.
4 147305 I det efterfølgende beskrives foretrukne udførelsesformer.
Hypochloritionen (CIO-) kan f. eks. fås fra chlorundersyrling eller et alkalimetalsalt af chlorundersyrling, f.eks. natrium-, kalium-, calcium- eller magnesiumhypochlorit. På lignende måde kan chlorit-ionen (ClC^-) fås direkte som chlorsyrling eller et alkalimetalsalt deraf. Som anvendt heri er det hensigten at endelsen "it" skal referere til en ion afgivet enten af syren eller saltet. Almindeligvis vil hver af ionerne blive anvendt alene i vandig opløsning, men blandinger af de to ioner kan imidlertid anvendes. Endvidere kan de hidrøre fra en in situ reaktion, som vil give den ene eller begge ionerne ud fra prækursorer, som er sat til præparatet. Reaktionen og udgangsmaterialerne dertil må naturligvis ikke være skadelige for proteasen. Desuden bør reaktionen og udgangsmaterialerne fortrinsvis være ufarlige. Således foretrækkes det f.eks. ikke at indføre anhydridet af hypochlorit, chlormonoxid (C^O) i et vandigt enzympræparat til dannelse af hypochlorit in situ. Snarere foretrækkes det at sætte natriumhypochlorit i fortyndet vandig opløsning til enzympræparatet. En let tilgængelig fortyndet vandig opløsning af natriumhypochlorit, som indeholder 5,25% natriumhypochlorit og 94,75% inerte materialer, fås i handelen under varemærket "Clorox"N^
Egnede enzympræparater, som kan inaktiveres selektivt i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen, indbefatter præparater, som fås fra bakterier og dyr. Fra dyr hidrørende præparater er f. eks. fra pankreas, en rig kilde for fordøjelsesenzymer, inklusive protease og amylase. Pankreatin, som er et velkendt materiale indeholdende lipase, esterase, protease og amylase, er et pankreas-enzympræparat, som er egnet til behandling i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen.
Til brug ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er amylaseholdige proteaser fra mange forskellige bakterier egnede. Særligt foretrukket er proteaserne fra Bacillus subtilis og Bacillus licheniformis.
Effektiviteten eller udstrækningen af den differentielle inaktivering af amylase i proteasepræparater kan afhænge af mange faktorer. F.eks. kan forholdet mellem koncentrationen af den ene eller begge ionerne og mængden af protein i det blandede protease-amylase-præparat, fortyndingen af præparatet og pH-værdien, temperaturen og tidsrummet, hvori ionerne bringes i kontakt med præparatet, påvirke 147305 5 resultatet, som opnås. Sådanne faktorer kan let afbalanceres af den, der arbejder inden for dette område, således at amylasen inaktiveres i den ønskede grad, mens proteaseaktiviteten i det væsentlige bevares. Det ønskes sædvanligvis at inaktivere i det mindste ca. 80% af amylasen, mens proteaseaktiviteten reduceres mindre end ca. 20%. I overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen er det almindeligvis muligt at opnå en reduktion i amylaseaktivitet på mere end 95%, mens samtidig proteaseaktiviteten reduceres mindre end 5%. Inaktiveringen kan efterfølges af en hvilken som helst af de velkendte analyser for proteolytisk og amylolytisk aktivitet.
Ønskelige resultater fås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen over et bredt område af vægtforhold mellem enzympræparat og tilsatte ioner* men fortrinsvis anvendes ca. 0,1% til ca. 5% ioner på basis af den tørre vægt i omgivende luft af det pulveriserede enzympræparat. Det foretrækkes yderligere at anvende fra ca. 0,2% til ca. o,5% hypochloritioner eller fra ca. 0,2% til ca. 2% chloritioner. De mest foretrukne koncentrationer af ionerne, når de anvendes adskilt, er ca. 0,30% hypochlorit og ca. 0,35% chlorit. Sædvanligvis kan der for ennver given mængde chlorit anvendes noget mindre hypochlorit. Sammenfattende er mængden af ioner, som anvendes, ikke kritisk. For lidt vil resultere i relativt høj rest-amylaseaktivitet, skønt dette kan være ønskeligt til nogle anvendelser for det behandlede præparat, mens for meget er spild af reagens.
Enzympræparaterne, som skal behandles, kan være hovedsagelig eller i det væsentlige cellefri opløsninger, såsom fermenteringssubstratfiltrater, rå dyreorganekstrakter eller opløsninger af tørrede fermenteringssubstratfiltrater. Præparaterne kan indeholde ikke blot et fermenteringssubstrat, men også cellerne fra den anvendte mikroorganisme alene eller i kombination med flere andre arter til frembringelse af de blandede protease-amylasepræparater. Derudover kan et hvilket som helst af de forannævnte præparater indeholde forurenende celler. Disse celler vil blive dræbt ved behandlingen, en yderligere fordel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Det er således unødvendigt ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen at anvende et adskilt trin med det formål at gøre præparatet fri for levende celler. Det bør bemærkes, at celler i stort antal vil forbruge så meget af ioner 6 147305 ne, at det kan være nødvendigt at supplere de tilsatte ioner for at sikre den ønskede inaktivering af amylase.
Egende kilder af blandede protease-amylase enzymsystemer, som kan anvendes som udgangsmaterialer ifølge den foreliggende opfindelse, er kendte og kan fås ved mikrobiel fermentering under anvendelse af velkendte fermenteringsfremgangsmåder, såsom fremgangsmåderne, der er generelt beskrevet i Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 8, 173-230, og de deri citerede referencer. Specielt er brugen af bakteriekilder til frembringelse af blandede proteolytiske og amylolytiske enzymsystemer ved fermentering beskrevet i USA-patentskrift nr. 2.530.210.
En særlig egnet kilde for et proteaseholdigt enzympræparat er Bacillus subtilis. Denne mikroorganisme er en bakterieart, som er vidt udbredt, og som er sporedannende, aerob og catalase-positiv.
Den er klassificeret i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, pp. 613-621 (7. udgave 1957), Williams and Wilkins Co., Baltimore, Md., og i Aerobic Spore Forming Bacteria, Agricultural Monograph No. 16, U.S. Department of Agriculture. Denne mikroorganisme er let tilgængelig for offentligheden i kraft af dens vide udbredelse i naturen. Desuden er talrige kulturer af denne mikroorganisme tilgængelige på offentlige deponeringssteder, som tilbyder opbevaring af det deponerede i permanent tilstand, og hvorfra offentligheden let kan få dem. Et eksempel på en sådan kultur er kulturen, som er blevet deponeret i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, under betegnelsen ATCC 6051a. Et andet eksempel på denne mikroorganisme er kulturen, som er deponeret hos United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois under accessionsnummeret NRRL B-3411. Yderligere eksempler vil fremgå for fagmanden ved reference til forskellige velkendte offentlige deponeringssteder for mikroorganismer over hele verden.
Enzympræparatet kan være tørt, i opløsning eller være en opslæmning, når det bringes i kontakt med oxidationsmidlet. Koncentrationen af præparatet i opløsning er ikke kritisk. Der anvendes almindeligvis et område på fra ca. 5% til ca. 75% faststof på vægtbasis i vand eller puffer med ca. 20% som det foretrukne. Koncentrationen, som udvælges, vil i høj grad afhænge af, hvilke behandlingsteknikker, der anvendes før eller efter behandlingen. F.eks. er et lavt faststofindhold almindeligvis karakteristisk for fermenteringssubstrater, og disse kan behandles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen uden 7 147305 yderligere behandling. Hvis på den anden side der ønskes et koncentreret slutprodukt, kan præparatopløsningen afvandes i passende grad før behandlingen.
Der kan til behandlingen udvælges en hvilken som helst pH-værdi, som ikke indvirker ugunstigt på proteaseaktiviteten. Proteaseaktivi-teten som funktion af pH-værdien vil variere afhængigt af enzympræpa-ratkilden. I praksis indeholder de fleste rå præparater fra enten bakterie- eller animalsk kilde forskellige proteaser, som hver er aktive i forskellige pH-områder. Det er fordelingen af disse proteaser, som bestemmer pH-aktivitetsområdet for enzymerne. Hvor et enzym inden for et pH-område på ca. 3 til ca. 10 vil udvise den bedste proteaseaktivitet, afhænger således at fordelingen af proteaser i præparatet. Ved anvendelse af B. subtilis enzymblandingen er et område på fra ca. 5,8 til ca. 7 foretrukket, og ca. 6,3 er optimalt. Indstilling af enzymblandingen til den ønskede pH-værdi kan, såfremt den er nødvendig, foretages bekvemt ved tilsætning af en passende mængde fortyndet syre eller alkali.
Hverken temperaturen eller tidsrummet for ionbehandlingen er kritisk, dog bør temperaturen ikke være så høj, at proteasen inaktive-res. Til illustration kan opløsninger ved temperaturer fra lidt over frysepunktet til ca. 60°C behandles i ca. nogle minutter til 3 timer. Almindeligvis er længere behandlingstidsrum nødvendige ved lavere temperaturer og ionkoncentrationer. Det foretrækkes at behandle opløsningerne i ca. 1 time og 15 minutter ved en temperatur omkring stuetemperatur. Udvælgelsen af disse parametre er i høj grad et spørgsmål om økonomi.
Efter behandlingen med oxidationsmidlet kan opløsningen behandles på en hvilken som helst konventionel måde for at gøre produktet klart til videre brug. Almindeligvis lyofiliseres det eller spraytørres, fremgangsmåder, som også fjerner resterende chlorit- eller hypochlorit-ioner.
Den foreliggende opfindelse illustreres i det efterfølgende nærmere ved eksempler.
Eksempel 1
Et alkalisk proteasepræparat ud fra B. subtilis, som sælges af "Wallerstein Co." under navnet "Alkaline Protease", opløstes i ledningsvand til en koncentration på 20 vægtprocent baseret på lokale-tørvægten af præparatet. Det blev ikke forsøgt at fjerne uopløseligt materiale, skønt dette om ønsket let kunne gøres. pH-værdien af 8 147305 denne opløsning var 6,3. Til 26 g portioner af proteaseopløsningen sattes under omrøring vandige opløsninger af natriumhypochlorit og natriumchlorit i mængder, som var tilstrækkelige til at give forskellige natriumhypochlorit og -chloritkoncentrationer baseret på lokale-tørvægten af enzympræparatet. Disse koncentrationer er udtrykt i Tabel I som procenter. De varierende forøgelser af opløsningen af inaktiverende ion udlignedes ved tilsætning af vand. Tilsætningen af de inaktiverende ioner ændrede ikke begyndelses-pH-værdien af enzymopløsningen af betydning. Ionerne forblev i kontakt med enzymopløsningen i ca. 1 1/4 time. Opløsningen analyseredes dernæst for protea-se- og amylaseaktivitet. Resultaterne er vist i Tabel I.
TABEL· I
Indvirkning af chlorit- og hypochlorittilsætning på protease- og amylaseaktivitet_
Ionsalt % Amylase- ^ % Protease- % tilsat Ionsalt aktivitet1 tab aktivitet2 tab 0 282 - 40.300
Natrium- 0,152 151 47 40.800 0 chlorit 0,304 14 g5 40.800 0 0,486 3 99 39.900 1 1,94 2 99 37.200 8
Natrium- 0 583 - 25.900 hypochlorit o,125 242 55 25.100 3 0,25 16 97 25.900 0 0,40 11 98 24.600 5 2. Amylase og protease bestemtes ved de i
Food Chemicals Codex, 1. tillæg, 2. udgave, hhv. p. 66 og 89 rapporterede fremgangsmåder.
Sammenligningseksempel (a) 2
Fremgangsmåden fra Eksempel 1 blev gentaget, bortset fra, at det anvendte ionsalt var natriumchlorat eller natriumperchlorat. Saltene anvendtes henholdsvis i mængder på fra 0,179% til 2,29% og fra 0,236% til 3,02% på basis af vægten af det lokaletørre enzympulver. Disse mængder af natriumchlorat og natriumperchlorat er de omtrentlige molære ækvivalenter til natriumhypochloritkoncentrationer på fra 0,125% til 1,6%. Ingen af disse salte havde nogen virkning på 9 147305 protease- eller amylaseaktiviteten på trods af, at både natrium-chlorat og natriumperchlorat er nært beslægtede med chlorit og hypochlorit. Dette understreger den yderst selektive og overraskende opførsel af hypochlorit- og chloritionerne, der anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til selektiv inaktivering af amylasen.
Sammenligningseksempel (b)
Chlorgas bobledes ved stuetemperatur gennem 25 g af den i Eksempel 1 ovenfor beskrevne enzymopløsning. Både protease og amylase in-aktiveredes fuldstændigt. Chlor er et velkendt blegemiddel. Ikke destomindre viser det sig overraskende, at der ikke opnås den selektive amylase-inaktivering, som kan fås med hypochlorit- og chloritionerne,der anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.
Eksempel 2
En enzymopløsning fremstilledes som i Eksempel 1 og indstilledes til en pH-værdi på 6,4. Til 976 g af den pH-indstillede opløsning sattes natriumhypochlorit til opnåelse af en koncentration på 0,3% natriumhypochlorit baseret på vægten af enzympræparatet. Den samlede vægt blev bragt op på 1000 g med ledningsvand. Slut-pH-værdien var 6,5. Denne fremgangsmåde blev så gentaget, bortset fra at der blev tilsat hydrogenperoxid til opnåelse af en koncentration på 0,15% baseret på vægten af enzympræparatet. pH-værdien var 6,4. Denne hydrogenperoxidkoncentration er 9,5% mere end en mængde, som ville være ækvimolær med mængden af natriumhypochlorit anvendt ved en koncentration på 0,3%. Den resterende del af behandlingen er som beskrevet i Eksempel 1. Protease - og amylaseaktiviteten er rapporteret i Tabel II.
TABEL II
Sammenligning af virkningen af hydrogenperoxid og hypochlorit _på protease-amylase-blandinger_
Oxidationsmiddel Amylaseaktivitet Proteaseaktivitet
Natriumhypochlorit 3 27.365
Hydrogenperoxid 236 29.579
De behandlede opløsninger blev dernæst spraytørret, genopløst og analyseret.
Resultaterne vises i Tabel III.
10 147305
TABEL· III
Analyse af spraytørret produkt
Oxidationsmiddel- Amylaseaktivitet Proteaseaktivitet
Natriumhypochlorit 15 147.650
Hydrogenperoxid 1250 157.512
De i Tabel II og III anførte data viser, at hydrogenperoxid, et velkendt oxidationsmiddel, er betragteligt mindre effektivt til selektivt at inaktivere amylase end hypochloritet, der anvendes ifølge opfindelsen.
Eksempel 3
Pancreatin fra Cudahy Co. blev opløst i isotonisk saltopløsning (0,9% NaCl) til en koncentration på 3,13 g i 25 g opløsning. Opløs-.ningens pH-værdi var 6,5. Der tilsattes natriumhypochlorit-opløsning ("Clorox" ), og mængdeforøgelserne udjævnedes ved tilsætning af isotonisk saltopløsning. Den isotoniske saltopløsning anvendes for at undgå styrkeforringelse af opløsningen ved henstand. Saltet har ingen indvirkning på den i Tabel IV nedenfor anførte differentielle inaktivering. En lignende mangel på virkning noteredes, når der anvendtes en enzymopløsning med en pH-værdi på 5,8 frem for 6,5. Enzymblandingen behandledes i 1 1/4 time ved stuetemperatur og analyseredes dernæst for protease og amylaseaktivitet. Som i de foregående eksempler er natriumhypochlorit-procenten baseret på faststofindholdet i enzymopløsningen. Resultater er anført i Tabel IV.
- i .
TABEL· IV
Indvirkning på pancreatin af hypochlorittilsætning % Natrium- Amylase- . % Protease-, % hypochlorit aktivitetx tab aktivitet2 tab 0 1075 - 27.300 1,8 467 57 28.400 0 3,6 31 97 24.800 9 7,2 3 100 19.100 30 10,8 *0 100 11.200 59 1 2.. Amylase- og proteaseaktiviteten analyseredes ved hjasip af samme teknikker som anført i Tabel I.
Claims (5)
1. Fremgangsmåde til selektiv inaktivering af amylase i en blanding af protease og amylase, kendetegnet ved, at blandingen bringes i kontakt med et oxidationsmiddel i form af hypochloritioner og/eller chloritioner i en mængde, som er effektiv til at inaktivere amylasen i væsentligt højere grad end proteasen, fortrinsvis ca. 0,1% til ca. 5% på basis af vægten af blandingen.
2. Fremgangsmåde.ifølge krav 1, kendetegnet ved, at oxidationsmidlet er hypochloritioner,og at der anvendes ca. 0,2% til ca. 0,5% af midlet på basis af vægten af blandingen.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at oxidationsmidlet er chloritioner, og at der anvendes ca. 0,2% til ca. 2% af midlet på basis af vægten af blandingen.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at enzymblandingen hidrører fra arter af slægten Bacillus, fortrinsvis Bacillus subtilis eller Bacillus licheniformis.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetgnet ved, at enzymblandingen hidrører fra pankreaskirtler. o
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US05/675,385 US4086139A (en) | 1976-04-09 | 1976-04-09 | Differential inactivation of amylase in amylase-protease mixtures |
| US67538576 | 1976-04-09 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK161877A DK161877A (da) | 1977-10-10 |
| DK147305B true DK147305B (da) | 1984-06-12 |
| DK147305C DK147305C (da) | 1985-01-07 |
Family
ID=24710255
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK161877A DK147305C (da) | 1976-04-09 | 1977-04-12 | Fremgangsmaade til selektiv inaktivering af amylase i amylase-protease-blandinger |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4086139A (da) |
| JP (1) | JPS52134091A (da) |
| CA (1) | CA1080146A (da) |
| DE (1) | DE2715893A1 (da) |
| DK (1) | DK147305C (da) |
| FR (1) | FR2347380A1 (da) |
| GB (1) | GB1538739A (da) |
| NL (1) | NL7703872A (da) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK145679A (da) * | 1979-04-09 | 1980-10-10 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til termisk destabilisering af mikrobiel osteloebe |
| US4716116A (en) * | 1980-12-04 | 1987-12-29 | Owens-Illinois Glass Container Inc. | Protein modification to provide enzyme activity |
| GB2156821A (en) * | 1984-04-03 | 1985-10-16 | Simmons James W | Process for purifying chymopapain |
| FR2589479B1 (fr) * | 1985-11-05 | 1988-02-05 | Hoechst France | Nouvel enzyme, son procede d'obtention et son application a la preparation de n-(l-aspartyl-1)l-phenylalaninate de methyle |
| ATE124719T1 (de) * | 1987-07-17 | 1995-07-15 | Modrovich Ivan Endre | Stabiles alpha-amylase-reagenz. |
| EP0865485A1 (en) * | 1995-12-07 | 1998-09-23 | Novo Nordisk A/S | Selective inactivation of enzyme activities |
| FR2742765B1 (fr) * | 1995-12-21 | 1998-02-13 | Armines | Procede d'inactivation irreversible d'enzymes en solution |
| US7955829B2 (en) * | 2001-12-19 | 2011-06-07 | Dsm Ip Assets B.V. | Method for the inactivation of amylase in the presence of protease |
| AU2003232845A1 (en) * | 2002-05-29 | 2003-12-12 | Dsm Ip Assets B.V. | Method for the purification of microbial protease |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US1892247A (en) * | 1930-01-31 | 1932-12-27 | Kalle & Co Ag | Process of preparing proteinases free from peptidases |
| US2262138A (en) * | 1936-11-07 | 1941-11-11 | Standard Brands Inc | Method for the control of proteolytic activity |
| US2647854A (en) * | 1949-11-25 | 1953-08-04 | Wallerstein Co Inc | Inactivation of enzymes by barium peroxide |
| US2683682A (en) * | 1950-02-06 | 1954-07-13 | Research Corp | Differential inactivation of enzymes |
| US3795586A (en) * | 1969-08-11 | 1974-03-05 | Pabst Brewing Co | Recovery of enzymes |
| US3578462A (en) * | 1969-12-02 | 1971-05-11 | Caravan Prod Co Inc | Yeast leavened bread dough composition and process of manufacture |
| US3755085A (en) * | 1970-09-30 | 1973-08-28 | Procter & Gamble | Prevention of enzyme deactivation by chlorine |
| US3709790A (en) * | 1970-10-05 | 1973-01-09 | W Warner | Proteolytic enzyme formulation |
| GB1422795A (en) * | 1972-05-31 | 1976-01-28 | Bunyan J | Antiseptic and non-toxic substance and a method of making the same |
-
1976
- 1976-04-09 US US05/675,385 patent/US4086139A/en not_active Expired - Lifetime
-
1977
- 1977-04-07 CA CA275,800A patent/CA1080146A/en not_active Expired
- 1977-04-07 GB GB14968/77A patent/GB1538739A/en not_active Expired
- 1977-04-07 NL NL7703872A patent/NL7703872A/xx not_active Application Discontinuation
- 1977-04-08 FR FR7710728A patent/FR2347380A1/fr active Granted
- 1977-04-09 JP JP4087677A patent/JPS52134091A/ja active Pending
- 1977-04-09 DE DE19772715893 patent/DE2715893A1/de not_active Withdrawn
- 1977-04-12 DK DK161877A patent/DK147305C/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK147305C (da) | 1985-01-07 |
| NL7703872A (nl) | 1977-10-11 |
| FR2347380B1 (da) | 1982-10-22 |
| FR2347380A1 (fr) | 1977-11-04 |
| DK161877A (da) | 1977-10-10 |
| JPS52134091A (en) | 1977-11-09 |
| GB1538739A (en) | 1979-01-24 |
| CA1080146A (en) | 1980-06-24 |
| US4086139A (en) | 1978-04-25 |
| DE2715893A1 (de) | 1977-10-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4927558A (en) | Proteolytic detergent additive and compositions containing the same | |
| Kembhavi et al. | Salt-tolerant and thermostable alkaline protease from Bacillus subtilis NCIM No. 64 | |
| Krishnan et al. | Purification and characterization of α-amylase from Bacillus licheniformis CUMC305 | |
| Prakash et al. | Purification and characterization of extreme alkaline, thermostable keratinase, and keratin disulfide reductase produced by Bacillus halodurans PPKS-2 | |
| Sousa et al. | A novel metalloprotease from Bacillus cereus for protein fibre processing | |
| HU193936B (en) | Detergent additive containing fusarium oxysporum lipase | |
| NO307186B1 (no) | Fremgangsmåte for avlivning uten celle-lysis av celler i vekstkultur eller fermenteringsblanding | |
| Ali et al. | PRODUCTION, PURIFICATION AND SOME PROPERTIES OF EXTRACELLULAR KERATINASE FROM FEATHERS-DEGRADATION BY ASPERGILLUS ORYZAE NRRL-447. | |
| JPH04271785A (ja) | 酵素固形製剤及びその製造方法 | |
| Moridshahi et al. | Biochemical characterization of an alkaline surfactant-stable keratinase from a new keratinase producer, Bacillus zhangzhouensis | |
| El-Sayed et al. | L-Amino acid oxidase from filamentous fungi: screening and optimization | |
| Vijayaraghavan et al. | Novel sequential screening and enhanced production of fibrinolytic enzyme by Bacillus sp. IND12 using response surface methodology in solid-state fermentation | |
| DK146964B (da) | Proteolytisk enzymprodukt og fremgangsmade til dets fremstilling | |
| Madhumithah et al. | Utilization of vegetable wastes for production of protease by solid state fermentation using Aspergillus niger | |
| Hamamoto et al. | Characterization of a protease from a psychrotroph, Pseudomonas fluorescens 114 | |
| DK147305B (da) | Fremgangsmaade til selektiv inaktivering af amylase i amylase-protease-blandinger | |
| DK143164B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af sur protease | |
| US5427921A (en) | Method of preparing yeast extract containing hydrolyzed non-yeast protein with yeast autolytic enzymes | |
| Patel et al. | Production, partial purification, characterization and detergent compatibility of alkaline protease from soil isolate Bacillus cereus AG1 | |
| WO1997020921A1 (en) | Selective inactivation of enzyme activities | |
| Korkmaz et al. | Keratinolytic activity of Streptomyces strain BA7, a new isolate from Turkey | |
| JP3332510B2 (ja) | 洗浄剤組成物 | |
| US20080220499A1 (en) | Novel protease for industrial applications | |
| US4439522A (en) | Proteolytic enzyme composition | |
| JP3544383B2 (ja) | アルカリに安定なサイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼ及びその製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed | ||
| PBP | Patent lapsed |