DK146964B - Proteolytisk enzymprodukt og fremgangsmade til dets fremstilling - Google Patents

Description

(19) DANMARK (J/

§,12, FREMLÆGGELSESSKRIFT (11) 146964 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Patentansøgning nr.: 5185/7S (51) Int.CI.3: C 12 N 9/54 (22) Indleveringsdag: 18 nov 1975 (41) Alm. tilgængelig: 20 maj 1976 (44) Fremlagt: 27 feb 1984 (86) International ansøgning nr.: - (30) Prioritet: 19 nov 1974 GB 50044/74 (71) Ansøger: *GIST-BROCADES N.V.; Delft, NL.

(72) Opfinder: Bauke Te *N)jenhuis; NL.

(74) Fuldmægtig: Internationalt Patent-Bureau (54) Proteolytisk enzymprodukt og fremgangsmåde til dets fremstilling

Opfindelsen angår et hidtil ukendt proteolytisk enzymprodukt med høj virkning i det alkaliske område samt en fremgangsmåde til dets fremstilling.

Proteolytiske enzymer, der har høj proteolytisk virkning i det alkaliske område, er ve Ikendte. Vedder beskriver i Antonie van Leeuwenhoek, JL (1934) 141-[Q 147 en ny mikroorganisme, som han kalder Bacillus alcalophilus, der er i stand til at nedbryde gelatine og hæmoglobin i et stærkt alkalisk medium. Denne egen-^ skab hos mikroorganismen kan tilskrives et enzym, som senere undersøgelser har ^ vist (jvf. engelsk patentbeskrivelse nr. 1.205.403). Enzymer med stor virkning i alkaliske medier er også beskrevet i adskillige andre litteraturhenvisninger |f· bl.a. engelsk patentbeskrivelse nr. 1.243.784 og hollandsk patentansøgning nr.

72.07050, der omhandler adskillige proteolytiske enzymer produceret af medlemmer 2 146964 af slægten Bacillus,der er virksomme i vaskemiddelkompositioner, som normalt er alkaliske, når de opløses i vaskevæsker.

Det proteolytiske enzymprodukt ifølge den foreliggende opfindelse har en høj proteolytisk virkning i alkaliske medier, som gør det overordentlig velegnet til at inkorporeres i vaskemiddelkompositioner. Desuden viser enzymproduktet en forbløffende god vaskeevne i perboratholdige vaskemiddelkompositioner.

Enzymproduktet ifølge opfindelsen er kendetegnet ved, a) at det har optimal proteolytisk aktivitet ved en pH-værdi over 12, idet aktiviteten måles overfor denatureret hæmoglobin i overensstemmelse med Anson-metoden, b) at det består af mindst to proteolytisk aktive komponenter, der viser et karakteristisk zymogram ved pladeelektroforese som vist på tegningen, c) at de to hovedkomponenter har følgende aminosyresammensætning:

Komponent A Komponent B

Lysin 6 6

Histidin 7 6

Arginin 9 8

Asparagin. syre 27 28

Threonin 16 16

Serin 30 30

Glutaminsyre 15 15

Prolin 12 13

Glycin 31 33

Alanin 36 36

Cystin 0 0

Valin 22 22

Methionin 3 3

Isoleucin 8 9 leucin 18 18

Tyrosin 7 6

Phenylalanin 2 2

Tryptophan 3 3 d) at de to hovedkomponenter har følgende fysiske egenskaber:

Isoelektrisk punkt 10,5 10,5

Molekyl·vægt 25.500 25.500 e) og at det er identisk med det proteolytiske enzymprodukt, der kan isoleres fra et dyrkningssubstrat fremkommet ved dyrkning af Bacillus nov.spec.PB 92, hvoraf en kultur er deponeret i Laboratoriet for Mikrobiologi ved Det Tekniske Ihiversi-tet i Delft, Holland, under nr. 0R-60, under aerobe betingelser i et substrat, inde- 3 U 6964 holdende sædvanlige carbon- og energikilder, en nitrogenkilde, calcium- og magnesiumsalte og sporelementer.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af det omhandlede enzyms produkt er af den art, ved hvilken en mikroorganisme af slægten Bacillus dyrkes under aerobe betingelser i et substrat^ indeholdende sædvanlige carbon- og energikilder, en nitrogenkilde, calcium- og magnesiumsalte og sporelementer, og den er kendetegnet ved, at man dyrker den nævnte Bacillus nov. spec. PB 92 og om ønsket udvinder detdannede proteolytiske enzymprodukt. Ved denne fremgangsmåde kan enzymproduktet opnås i forbløffende højt udbytte. Udbytterne er større end de, der opnås med eksemplvis en Bacillus firmus stamme, jvf. beskrivelsen til hollandsk patentansøgning nr. 72.07050.

Undersøgelse af enzymproduktets egenskaber omtales mere detaljeret i det følgende: Egenskaber ved enzymproduktet.

a) Forholdet mellem pH/aktivitet.

Til bestemmelse af pH/aktivitetsforholdet anvendtes Anson hæmoglobinmetoden (jvf. J. Gen. Physiology, 2_2 (1939), 79-89) så nært som muligt. Specifikationer, der ikke er givet i Anson litteraturen, anføres nedenfor:

Substrat-fremstilling: Oksehæmoglobin, proteasesubstrat ifølge Anson, lyofiliseret, rent, opnået fra SERVA, Heidelberg, Tyskland.

Substrat-opløsning: SERVA hæmoglobin blandedes med vand ved omrøring til opnåelse af en 22%'s opløsning (vægt/volumen). Ud fra denne frisk fremstillede koncentrerede opløsning fremstilledes en fortyndet opløsning indeholdende 8 ml 1 N natriumhydroxid, 72 ml vand, 36 g urinstof og 10 ml af den koncentrerede opløsning. Denne alkaliske opløsning holdtes ved 25°C i 60 minutter for at denaturere hæmoglobinet.

Bufferopløsninger (se nedenfor), urinstof og merthiolat tilsattes, og pH indstilledes, idet man anvendte en Ingold HA elektrode. Volumenet indstilledes til en hæmoglobinkoncentration på 2,2%.

pH-referenceopløsningerne opnået hps Merck, Darmstadt, Tyskland (Buffer-Ti trisol 8,00, 9,00, 10,00, 11,00 og 12,00).

Man anvendte et Philips digital pH-meter (PW 9408).

For buffersammensætningen af substratopløsningen med pH 8. fulgtes beskrivelsen for trypsinbestemmelse. Sammensætningen af de andre bufferopløsninger blev taget fra Dawson et al jvf. "Data for Biochemical Research", 2. udgave (1969) Oxford, siderne 475 og følgende.

Komponenterne sattes til substratopløsningen, indtil man fik dé slut-koncentrationer, der er angivet nedenfor:

pH-område 8,3 - 10,3: glycin - NaCH 0,05 M pH-område 10,8 - 11,3: Na2HP04 - NaCH 0,025 M pH-område 11,7 - 12,5: KCl - NaCH 0,05 M

4 146964

Enzymopløsning: Opløsningerne frisk-fremstilledes i vand. Man fremstillede fortyndinger heraf, idet koncentrationen var 200 DU/ml. Betegnelsen DU betyder Delft-enheder, idet man refererer til en metode til bestemmelse af enzymaktivitet, der er beskrevet i engelsk patentbeskrivelse nr. 1.353.317.

Inkubering: Hver analyse bestod af to bestemmelser og en kontrol. Substrat- og enzymopløsninger anbragtes i vandbad ved 25°C.Substratopløsningernes pH bestemtes ved hjælp en Ingold HA elektrode og også ved hjælp af en Ingold LOT elektrode til bestemmelse af pH-værdier under 11,00. Man anvendte titrisol pH-referenceopløsninger hele vejen igennem. Til 2,5 ml af substratopløsningen anbragt i et centrifugeglas sattes 0,5 ml af en enzymopløsning. Man sikrede sig tilstrækkelig blanding ved at omrøre lige efter med en glasspatel. Kontrollen, uden enzym, blev også inkuberet.

Inkuberingen afsluttedes efter 10 minutter ved tilsætning af 5 ml 0,3 N trichloreddikesyre. Kontrollen fik tilsat 5 ml trichloreddikesyreopløsning og 0,5 ml enzymopløsning. Trichloreddikesyre op løsningen blev tilsat ved hjælp af en ZIPPETTE ( Jencons, Hemel Hempstead, Hertfordshire). Blandingen omrørtes kraftigt ved hjælp af glasspatelen, idet den stadig var i centrifugeglasset. Glasset anbragtes i et vandbad ved 2°C.

pH-Forandringen under inkuberingen fulgtes ved at måle pH ved· begyndelsen og afslutningen af inkuberingen, idet man anvendte en LOT-elektrode til inkube-ringsværdier under 11,0 og en HA-elektrode til pH-værdier over 11,0. pH-foran-dringen var på mindre end 0,1 pH-enhed for inkubering af enzymopløsninger, der indeholdt 50 eller mindre DU/ml og mindre end 0,15 pH-enheder for inkuberinger af enzymopløsninger, der indeholdt 200 eller 500 DU/ml. Middelværdierne måltes med Ingold HA-værdier som basis.

Centrifugering:Rørene centrifugeredes'med en acceleration på 6000 g, efter at de var blevet holdt mindst 30 minutter ved 2°C.

Farveudvikling: Farveudviklingen udførtes i et vandbad ved 25°C. 5 ml af super-natanten blev sat til 10 ml 0,5 N NaOH, og blandingen omrørtes straks, idet man anvendte en V0RTEX-GENIE (Scient. Industr., U.S.A.). Efter nøjagtig 2 minutters forløb sattes 3 ml phenolreagens til blandingen ved hjælp af en Zippette under kontinuert omrøring. Phenolreagenset var Merck1s Folin-Ciocalteus Phenolreagens, fortyndet med 2 rumfang vand.

Farven måltes ved hjælp af et ZEISS M4 QIII spektrofotometer med spalteautomatisering ved 750 nm præcis 6 minutter efter Folin-tilsætningen. Som reference for farveudviklingen anvendtes en tyrosinopløsning, der indeholdt 8 x 10 7 ækvivalenter tyrosin i 5 ml 0,2 N HC1 med 0,5 vægtvolumen-% formaldehyd. Referencefarve-udviklingen undersøgtes med regelmæssige mellemrum, men afvigelser fra middelværdien overskred aldrig 1% for en prøve af fortyndet Folin-reagens.

Enzymproduktet udviser proteolytis.k aktivitet ’som følger; 5 146964 pH 8,3 8,8 I 9,4 9,8 10,3 10,8 11,3 11,7 12,5 i relativ g5 g? gi gg g? g4 I gi gg 100 virkning j : _______I_I__ (b) Elektroforesemønster.

Enzymproduktets karakter kan yderligere bestemmes ved zymogrammetoden, der er baseret på en kombination af pladeelektroforeseipolyacrylamidgel og visuel observering af virkningen. Metoden er blevet beskrivet af Zuidweg et al., i Biotech. og Bioeng. _14 (1972), 685-714, og tillader en direkte sammenligning af præparationer. Der er foretaget en sammenligning af enzymproduktet ifølge opfindelsen (a) , en protease opnået fea en Bacillus-stamme deponeret hos the National Collection of Type Cultures i London, som NCTC 4553, jvf. engelsk patentbeskrivelse nr. 1.205.403 (b) , er kommercielt tilgængeligt protelytisk enzym "MAXATASE"(Gist-Brocades N-.V., Delft, Holland) (c), og et kommercielt tilgængeligt enzym^ESPERASE11 (d), jvf. de medfølgende tegninger.Kun hovedkomponenterne er angivet. Det anvendte buffersystem i elektroforeseadskillelsen var system E, der indeholdt Tris (dvs. 2-amino- 2-hydroxymethyl-l,3-propandiol) og borsyre, og den visuelle observering af virkningen udførtes ved immersionskontaktteknik, således som beskrevet i Zuidweg et al. artiklen.

Tegningen viser, at enzymproduktet ifølge opfindelsen består af flere forbindelser, hvis sammensætning er forskellig fra sammensætningen af de andre enzympræparationer.

(c) Aminosyresammensætning.

Aminosyresammensætning af de to hovedkomponenter A og B (jvf. den medfølgende tegning) bestemtes. Sammensætningen er vist i tabellen sammenlignet med ami-nosyresammensætningen af adskillige kendte enzymer: (l)subtilisin Carlsberg, jvf. Delange og Smith, J. Biol. Chem. 243 (1968) 2134; (2) enzymet fra Bacillus subtilis var. aipylosacchariticus, anvendt som reference-enzym i U.S.A. patentbeskrivelsen nr. 3.622.458; (3) enzymet fra Bacillus firmus, jvf. hollandsk patentansøgning nr. 72.07050, og (4) enzymet fra B 221, jvf. K.Horikoshi, Agr. Biol.

Chem. 35 (1971) 1407.

Bestemmelserne skal anses for at ligge inden for de sædvanlige + 10Z af de angivne værdier.

6 146964

Tabellen viser yderligere molekylvægtene af enzymprodukterne,såvel som de isoelektriske punkter.

Amino- Enzymproduktet ifølge opfindelsen syre (1) (2) (3) (4) Forbindelse (A) Forbindelse (B) LYS 9 6 4 $ 6 6 HIS 5 5 6 8 7 6 ARG 4 3 6 8 9 8 ASP 28 20 23 29 27 28 THR 19 14 14 18 16 16 SER 32 37 22 23 30 30 GLU 12 12 14 16 15 15 PRO 9 10 12 16 12 13 GLY 36 25 30 39 31 33 ALA 42 27 32 45 36 36 CYS 0 0 0 0 0 0 VAL 31 20 21 27 22 22 MET 5 3 2 4 3 3 ILEU 10 12 7 9 8 9 LEU 16 12 16 22 18 18 TYR 13 9 6 7 7 6 PHE 4 2 2 2 2 2 TRY 1 3 - 5 3 3 27.300 22.700 26.000 30.000 25.500 25.500 vægt __|_____

Isoelek- ; trisk 9,3 7,5-8,0 11,0 9,4 10,5 10,5 punkt

Substrat-specificitet. Sammenligning med de kendte proteolytiske enzymer "Nagarse" og "Maxatase".

Substrat Relativ reaktionshastighed (%)

Enzymprodukt "Nagarse" "Maxatase" iflg.opfindelsen

Casein ifølge Hammersten 100 100 100 Æggehvidealbumin 10 10 8

Gelatine ' 202 110 149 Hæmoglobin 179 132 144 7 146964

Enzymkoncentrationen var 4,2 DU/ml. Resultaterne viser en bred substrat-specificitet for enzymproduktet ifølge opfindelsen og en vis. grad af ulighed mellem de tre enzymprodukters specificiteter, særlig med gelatine som substrat.

Temperaturens indflydelse på den relative aktivitet af enzymproduktet ifølge opfindelsen ved pH 8,5.

Temp. (°C) 40 50 60 70

Relativ aktivitet ved pH 8,5 41 74 100 9

Temperaturens indflydelse på den relative aktivitet af enzymproduktet ifølge opfindelsen ved pH 10,0.

Temp. (°C) ' 40 50 52,5 55 57,5 60 70

Relative aktivitet ved pH 10,0 i % af aktiviteten ved 55°C 42 82 95 100 77 41 8

Betydning af pH, temperatur og andre faktorer for deaktivering.

Stabiliteten i opløsning af enzymproduktet ifølge opfindelsen overfor temperaturen undersøgtes. På grund af enzymproduktets anvendelse som tilsætning til husholdningsvaskemidler, bestemtes varmestabiliteten under normale vaskebetingelser. I overensstemmelse hermed udførtes varmestabilitets-forsøgene i syntetisk postevand (STW) med eller uden tripolyphosphat (TPF, 0,15% vægt/volumen). Enzymkoncentrationen under opvarmningen var 400 DU/mg.

Indflydelse af pH på stabilitet ved 40°C.

pH under opvarmning 2345678910 11

Restaktivitet (%) ved

Opvarmning i STW med TPF 79 98 90 93 89 91 85 11

Opvarmning i STW uden TPF 16 8 100 97 100 97 95 98 88 79 I et andet forsøg bestemtes stabiliteten ved pH 8,5 i syntetisk postevand indeholdende tripolyphosphat (0,15% vægt/volumen) ved to temperaturer.

Temperaturens indflydelse på stabiliteten ved pH 8,5.

Restaktivitet (%) efter opvarmning

Varighed af opvarmning (timer) 0 0,5 1,0 2,0

Opvarmningstemperatur 40°C 100 95 93 87

Opvarmningstemperatur 50°C 100 82 77 69 Hæmning, aktivering og stabilisering.

Der udførtes forsøg med følgende enzym-hæmmere: 8 146964

Phenylmethyl sulfonylfluorid (P KSF)

Mercuri- eller parachlormercuri-benzosyre (PCMB)

Ethylendiamintetraedd ikesyre (EDTA)

Monoiodeddikesyre (MIA)

Indflydelse af hæmmere på enzymaktiviteten.

Hæmmer (kone. 1x10 ^ M) Ingen PMSF PCMB EDTA MIA

Relativ aktivitet 100 < 5 117 91 106

Inkubationerne udførtes i syntetisk postevand indeholdende tripolyphos-phat (0,15% vægt/volumen) ved pH 8,5 i 30 minutter og ved 40°C.

Den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendte Bacillus nov.spec.

PB 92 beskrives nærmere i det følgende:

Taxonomi.

Til den taxonomiske bestemmelse er anvendt Smith, Gordon og Clark, "Aerobic Sporeforming Bacteria", U.S. Dept. of Agr., Monograph No. 16 (1952). Sporulering af Bacillus PB 92 kan fremkaldes ved dyrkning af lyophiliserede kulturer af gamle TSB (Trypton Soja bouillon fra Oxoid) agar kulturer (65 dage) på TSB agar. Morphologi.

(a) Vegetative celler: (mobile) stave, rundede ender, i reglen enkelte, men også i korte kæder af 2-8 stave. Sommetider findes meget lange kæder, der har en længde på 1000 y eller' mere.

(b) Sporangier: Sommetider lidt svulmede.

(c) Sporer: 0,6-0,8 til 1,0-1,3 y; ellipSoide; tykvæggede; subterminale til paraceltrale.

(d) Skyggeformer: Temmelig mange; også i midten af en kæde af normale celler.

Vækstforhold_ Bemærkninger: _

Agarkoloni:

Form Uregelmæssig

Overflade Ujævn, hindeagtig spredning

Kant Udragende dele

Vades thøj de Flad

Optisk karakter Uklar

Agar-s tregkultur: Vækst Moderat Vækstform Spredning

Glans Mat Nærings-bouillon:

Overfladevækst Hinde

Uklarhed Forbigående 9 146964 Vækstforhold:_Bemærkninger:___

Sediment Flaget

Sedimentmængde Meget sparsom

Gelatine-stik: Vækst Bedst for oven

Stiklinie Sparsom vækst

Smeltning Positiv, substrat uændret

Smeltningsgrad Ringe, de dog nedenfor

Lakmusmælk:

Reaktion Syrning

Syre-kasein Negativ

Enzym-kasein Negativ

Peptonisering Positiv

Fysiologiske forhold:_Bemærkninger:_

Reduktion af nitrat Positiv, se nedenfor

Denitrifikation af nitrat Negativ

Methylrødt Negativ

Voges-Proskauer Positiv

Indol Negativ

Dannelse af hydrogensulfid Negativ

Hydrolyse af stivelse Positiv, se nedenfor

Citratudnyttelse Positiv

Udnyttelse af uorg. nitrogen:

Nitrat Negativ

Ammoniumsalt Positiv

Farvedannelse:

Agar-bouillon Ingen

King A Ingen

Urease Positiv

Oxidase Positiv

Katalase Positiv Vækstområde Ikke vækst under pH 4,0

Forhold til fri oxygen Aerob O-F test (Hugh Leifson) Oxiderende

Fermentering: Dannelse af syre og gas: Syre Gas

Monosaccharider: L-Arabinose D-Xylose + D-Glucose + 146964 ίο

Syre Gas D-Mannose + D-Fructose + D-Galactose + - L-Rhamnose

Disaccharider:

Sucrose +

Maltose + -

Lactose

Trehalose + -

Polysaccharider:

Dextrin +

Stivelse + -

Alkoholer: D-Sorbitol + D-Mannitol +

Inositol + -

Glycerol +

Adonitol Ikke udnyttet

Dulcitol Ikke udnyttet

Glucosid:

Salicin Ikke udnyttet

Andre forhold:

Lysin-decarboxylering Negativ

Cytochrom Positiv

Indol-phenylpyrodruesyre Negativ

Natriumchlorid-tolerance 7Z

Yderligere kan følgende forhold nævnes:

Maksimum vaksttemperatur: 50°C.

Gram-positive; obligat aerobe.

Vækst på næringsagar pH 7,2; starter sommetider noget langsommere end ved pH 9,4. Kanterne af kolonierne ved pH 7,2 fuldstændige, men ved pH 9,4 krøllede til filamentøse.

Ingen dannelse af pigment på tyrosinagar ved pH 9,5.

Svag stivelseshydrolyse på kartoffelstivelse/næringsagar ved pH. 9,5.

Stærk smeltning af gelatine på gelatine/næringsagar ved pH 9,5.

Klar kaseinfordøjelse på mælkeagar ved pH 8,4.

Ingen eller ringe vækst på glucose-eller raannitolagar med nitrat som eneste nitrogenkilde.

Nitratreduktion positiv i nitrat/næringsbouillon pH 9,5.

Nærmest beslægtede kendte mikroorganisme af Bacillus-slægten anses at være 11 146964 en Bacillus cereus-stamme, betegnet som Bacillus cereus No. 8-1 (bekrevet bl.a. i den offentliggjorte japanske patentansøgning nr. 13708/78). Denne sidstnævnte mikroorganisme er af en uafhængig japansk institution blevet sammenlignet med

Bacillus nov.spec. PB 92 ved undersøgelse af de forskellige, ovenfor omtalte forhold. Forskellene mellem de to organismer er blevet opsummeret som følger:

Egenskaber Bacillus cereus PB 92

No. 8-1

Morfologi:

Polymorfi - +

Motilitet + Vækst på substrat: pH Næsten ingen vækst Vækst ved ved pH 7,0 pH 7,2

Overfladevækst på nærings-bouillon Ingen hinde Hinde

Biologiske egenskaber:

Reduktion af

Nitrat - + V P test - +

Citratudnyttelse - +

Udnyttelse af ammoniumsalt - +

Urease - +

Vækst-temperatur mindre end 45°C Vækst ved 50°C

Fermentering:

Fructose - +

Galactose - ' +

Sorbitol - +

Mannitol - +'

Natriumchloridtolerance 12% 7%

Bacillus nov.spec. PB 92 må formentlig anses som repræsenterende en ny art, selv om dette endnu ikke har kunnet fastslås, helt sikkert.

Isolering:

Mikroorganismerne, der producerer æmzymproduktet ifølge opfindelsen, iso-leredes fra en jordprøve frå Zambia-ved'hjælp af en særlig isolåtionsteknik ved et pH inden for området 8*0 til 9,5.

Forgæring.

For at opnå høje udbytter af enzymproduktet ved dyrkning af Bacillus PB 92 er substrater, der indeholder let assimilerbart carbon og energikilder nødvendige, såsom glucose, sucrose, dextriner og stivelse, og en nitrogenkilde af 12 146964 organisk oprindelse såsom casein, gær og sojamel. Yderligere tilsættes fortrinsvis visse mængder af calcium og magniumsalte og adskillige sporelementer.

En god gennemluftning er nødvendig under forgæringen. Substratets pH holdes passende mellem 6,5 og 10, fortrinsvis mellem 7 og 9. Forgæringstempera-turen er passende 37°C.

Når der iagttages alle sikkerhedsforanstaltninger, kan man opnå meget høje udbytter (proteaseaktivitet pr. g af omsat glucose). Udbyttet er tilstrækkeligt højt til en økonomisk produktion af enzymproduktet.

Udvinde Ise af enzymproduktet.

Enzymproduktet udvindes af forgæringsbouillonen på sædvanlig måde.Bouillonen filtreres for at fjerne mikroorganismerne og uopløseligt materiale. Til tørre vaske-middelkompositioner udfældes enzymproduktet sædvanligvis ved at tilsætte vandblandbart organisk opløsningsmiddel eller uorganiske salte såsom Na^SO^ eller (NH^^SO^ til filtratet. For at opnå en økonomisk produktion reduceres rumfanget af filtratet ved inddampning først, inden man tilsætter opløsningsmidlerne eller saltene. Til flydende vaskemiddelkompositioner kan anvendes den filtrerede bouillon eller det genopløste enzymprodukt.

Efter udfældning fraskilles enzymproduktet.ved filtrering eller centrifugering, og den resulterende kage tørres.

Anvendelse i vaskemiddelkompositioner:

Enzymproduktet kan indføres i vaskemiddelkompositioner på sædvanlig måde. Mængden af enzymproduktet, der skal indføres, svarer sædvanligvis til, at man i den endelige vaskemiddelkomposition får en proteolytisk aktivitet på ca 100-5000 DU/g fortrinsvis 500-1000 DU/g. Bestemmelsen af den proteolytiske aktivitet er beskrevet i engelsk patentbeskrivelse nr. 1.353.317.

Vaskemiddelkompositioner indeholdende enzymproduktet ifølge opfindelsen indeholder yderligere, mindst en detergent. Detergenterne, der er nyttige i vaskemiddelkompositionerne, er de i vaskemiddelkompositioner med enzymatisk virkning sædvanligt anvendte. Sædvanligvis kan ikke-ioniske eller anioniske overfladeaktive forbindelser anvendes, såsom vandopløselige sæber, anioniske, ikke-anioniske, amfolytiske og zwitterioniske detergenter. Et eksempel på en almindeligvis anvendt detergent er dodecylbenzensulfonat. Sædvanligvis anvendes detergenterne, der kan anvendes alene eller i blandinger, i en mængde af ca. 4-20% af vaske-middelkompo s it ionen.

Vaskemiddelkompositionerne kan indeholde andre forbindelser, der sædvanligvis anvendes i andre vaskemiddelkompositioner med proteolytisk aktivitet.

De indeholder sædvanligvis komplekse phosphater, f.eks. et alkalimetaltripoly-phosphat eller et alkalimetalpyrophosphat, fortrinsvis i mængder på ca. 40-50 vægt% af vaskemiddelkompositionen. Yderligere eller alternativt kan de indeholde sådanne forbindelser, som alkalimetalcyanotriacetat og 13 146964 alkalimetalcitrat. Deres virkning i vaskemiddelkompositionerne er kompleks,. men deres mest vigtige virkning er, at de virker som vandblødgøringsmidler.

Andre forbindelser er f.eks. et alkalime talsilikat, sædvanligvis i mængder på 1-10 vægt%, svagt alkaliske forbindeIser, såsom alkalimetalbicarbonat, sædvanligvis i mængder indtil 20 vægt%, fyldstoffer, f.eks. et alkalimetalsulfat, og andre forbindelser, såsom carboxymethylcellulose, parfumer og optiske blegemidler. Andre forbindelser, der sædvanligvis er inkorporeret, er alkalimetalperborater, specielt natriumperborat, og i forbindelse med perboraterne bør det bemærkes, at enzymproduktet ifølge opfindelsen har en uventet høj stabilitet i næirværele af disse. Vaskemiddelkompositionerne kan fremstilles på sædvanlig måde, f.eks. ved at sammenblande komponenterne eller ved først at lave en pre-mix. Denne blandes herefter med de andre forbindelser. Fortrinsvis blandes enzymproduktet med en eller flere af de andre forbindelser, f.eks. med fyldstoffet, for at fremstille et koncentrat af en forud bestemt enzymatisk aktivitet, hvilket koncentrat kan blandes med de andre ønskede komponenter.

Opfindelsen illustreres nærmere ved hjælp af de følgende eksempler^ hvor eksempel 2 er et anvendelseseksempel.

Eksempel 1

Forgæring af Bacillus PB 92.

Det følgende substrat anvendtes: Gær (beregnet som tørstof) 22 g/liter ί^ΗΡΟ^^Ο 5

MgS04.7H20 0,05 -

CaCl2 0,05

FeS04.7H20 0,005

MnS04.4H20 0,005

Substratkomponenterne opløstes i 9 (JA af det endelige volumen, og steriliseredes herefter ved pH 7,0 ved en temperatur på 120°C i 1 time.

Man opnåede podningskulturen ved fra en skråagar med Bacillus PB 92 at pode 100 ml trypticasesojabouillon (Qxoid), til hvilken, der efter sterilisering ved 120°C i 20 minutter, var sat 4 ml 1 M natriumcarbonat. Podningskulturen dyrkedes ved 30°C i 24 timer på et GALLENKAMP rysteapparat.

Substratet dyrkedes ved 37°C og pH 8,0 med et rumfang af podningskulturen pr. 100 rumfang substrat. Hovedforgæringen udførtes ved 37°C i en omrøringsforgæringsbeholder udstyret med en pH-kontrolanordning, en temperaturkontrolanordning, en antiskumningsanordning og en anordning til kontinuerlig måling af den opløste oxygenkoncentration og oxygenoptagelseshastighed. 17 timer efter podningen tilsattes en 307.'s g lueose op løsning steriliseret ved 120°C i 1 time, til opnåelse af en s lutkoncentration af 30 g glueose pr. liter substrat.

14 148964

De opnåede resultater tydede på et udbytte af det proteolytiske enzymprodukt ifølge opfindelsen på ca. 8x10^ DU/g glucose forgæret.

I hollandsk patentansøgning 72.07050, eksempel 1, beskrives et forgærings-forsøg, i hvilket det endelige udbytte på 11,10 DU/liter bouillon opnås (50 Anson-enheder svarer omtrent til 11x10^ DU). Mængden af anvendt kulhydrat er ækvivalent med ca. 75 g glucose pr. liter bouillon. Udbyttet af protease pr. g omsat glucose i eksemplet i ansøgning 72.07050 andrager 1,5 x 10^ DU. Udbyttet ifølge opfindelsen er således 5 gange større.

Eksempel 2

Vaskeevne.

Vaskeprøver udførtes på følgende måde: (1) Forsøgsstykker af klæde: EMPA-116 (plettet med blod, mælk og tush) opnået fra Eidgenossische Material Prufungs- und Versuchsanstalt fur Industrie, Bauwesen und Gewerbe i Skt. Gallen, Svejts. Forsøgsstykkerne opbevares i mørke og lufttæt»

Til vaskeforsøg skæres de nødvendige stykker på 5 x 5 cm ud fra en visuelt homogen del af klædet.

(2) Vaskerisæbevand: 4 g/1 af et perboratholdigt kommercielt tilgængeligt vaskemiddel uden enzym pr. liter "syntetisk postevand" (STW), der havde en hårdhed på 15°dH, fremstillet på følgende måde: 10 ml 2% CaC^ (pro analysi) opløsning i destilleret vand sattes til 10 ml af en opløsning af 0,656% MgC^ i destilleret vand i en 1000 ml målekolbe. Indholdet blandedes grundigt. Herefter tilsættes 10 ml af en 2,1%'s NaHCO^ (pro analysi) opløsning og indholdet blandes igen, og der fyldes op med destilleret vand, således at der bliver 1000 ml.

(3) Prøve: Til hver af et tilstrækkeligt antal 300 ml Erlenmeyer-kolber sattes 250 ml af vaskerisæbevandet. Der tilsattes mængder af enzym svarende til 0, 250, 500 og 1000 DU/g af vaskemiddelkompositionen (dobbeltforsøg). Erlenmeyer-kolberne anbringes i en rystetermostat ved 45°C, i hvilken de varmes op under omrystning. Herefter tilsættes et stykke stof til hver af Erlenmeyer-kolberne, og der rystes i nøjagtig 1 time ved 45°C.

Efter vask dekanterés vaskerisæbevandet, og der tilsættes 250 ml STW. Kolberne lukkes med gummipropper, og rystes kraftigt i nøjagtig 1 minut.

Tøj stykkerne lægges i et bæger, i hvilket de skylles i langsomt rindende postevand. Efter at det sidste stykke tøj er sat til, fortsættes skylningen i ca.

10 minutter. Tøj stykkerne får lov at tørre i luften i mørke, langt ind i et hvidt rent håndklæde.

Efter tørring bestemmes remissionen i et ZEISS ELEEPH0 remissionsmeter med filter nr. 1 på begge sider, idet man anvender MgO som reference. Middelværdierne 15 146964 udregnes med reference til et fuldstændig rent stykke tøj, der har en remission på 65,8% over for MgO.

Sammenligning mellem enzymproduktet ifølge opfindelsen og"MAXÅTASri'°g ESPERASÉ'. Vaskeproverne udførtes på en ovenfor nævnte måde ved pH 9,7. Resultaterne var følgende: DU< _% remis s ion___________ ® enzymprodukt ifølge opfindelsen_MAXATASE ESPERASE_ ____Δ__a_ δ_ o 20 - - 250 41 21 30 10 31 11 500 46 26 33 13 36 16 1000 52 32 36 16 39 19 Således viser tabellen, at under forsøgsbetingelserne har enzymproduktet ifølge opfindelsen en bedre vaskeevne, end de kommercielt tilgængelige "MAXATASE" og "ESPERASE".

Claims (2)

14 6 9 6 Λ 16

1. Proteolytisk enzymprodukt med høj virkning i det alkaliske omrade, kendetegnet ved, a) at det har optimal proteolytisk aktivitet ved en pH-værdi over 12, idet aktiviteten måles overfor denatureret hæmoglobin i overensstemmelse med Anson-metoden, b) at det består af mindst to proteolytisk aktive komponenter, der viser et karakteristisk zymogram ved pladeelektroforese som vist på tegningen, c) at de to hovedkomponenter har følgende aminosyresammensætning: Komponent A Komponent B Lycin 6 6 Histidin 7 6 Arginin 9 8 Asparagin syre 27 28 Threonin 16 16 Serin 30 30 Glutaminsyre 15 15 Prolin 12 13 Glycin 31 33 Alanin 36 36 Cystin 0 0 Valin 22 22 Methionin 3 3 Isoleucin 8 9 Leucin 18 18 Tyrosin 7 6 Phenylalanin 2 2 Tryptophan 3 3 1 2 at de to hovedkomponenter har følgende fysiske egenskaber: isoelektrisk punkt 10,5 10,5 molekylvægt 25.500 25.500, 2 og at det er identisk med det proteolytiske enzymprodukt, der kan isoleres fra et dyrkningssubstrat fremkommet ved dyrkning af Bacillus nov.spec. PB 92,hvoraf en kultur er deponeret i Laboratoriet for Mikrobiologi ved Det Tekniske Universitet i Delft, Holland, under nr. OR-60, under aerobe betingelser i et substrat, indeholdende sædvanlige carbon- og energikilder, en nitrogenkilde, calcium- og magnesiumsalte og sporelementer.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af det i krav 1 angivne enzymprodukt ved