DE2551742B2

DE2551742B2 - Proteasepräparat und seine Verwendung in Waschmitteln

Info

Publication number: DE2551742B2
Application number: DE2551742A
Authority: DE
Inventors: Bauke Rijswijk Te Nijenhuis (Niederlande)
Original assignee: Gist Brocades NV
Current assignee: Gist Brocades NV
Priority date: 1974-11-19
Filing date: 1975-11-18
Publication date: 1980-07-17
Also published as: US4002572A; SE442749B; GB1519148A; JPS5182783A; IT1050910B; CH626916A5; FI55848C; JPS5742310B2; DE2551742C3; DK518575A; JPS51125407A; BE835693A; IE42844L; SE7512938L; NL167995C; USRE30602E; SE8104191L; NL167995B; JPS5616200B2; JPS55148086A

Description

Molekulargewicht: 25 500;
Isoelektrischer Punkt 104;

hohe proteolytische Aktivität bei pH 12,5, bestimmt nach der Anson-Hämoglobinmethode gemäß der Beschreibung und folgende Aminosäurezusammensetzung:

Aminosäure	Kompo	Kompo
	nente A	nente B
Lysin	6	6
Histidin	7	6
Arginin	9	8
Asparaginsäure	27	28
Threonin	16	16
Serin	30	30
Glutaminsäure	15	15
Prolin	12	13
Glycin	31	33
Alanin	36	36
Cystin	0	0
Valin	22	22
Methionin	3	3
Isoleucin	8	9
Leucin	18	18
Tyrosin	7	6
Phenylalanin	2	2
Tryptophan	3	3

2. Verwendung des Proteasepräparats
Anspruch I in Waschmitteln.

Proteolytisch wirkende Enzyme mit hoher proteolytischer Aktivität im alkalischen Bereich sind bekannt. Von Vetter (vgl. Antonie van Leeuwenhoek, Bd. 1 [1934], Seiten 141 bis 147) wurde ein Mikroorganismus beschrieben, der als Bacillus alcalophilus bezeichnet wurde. Dieser Mikroorganismus kann Gelatine und Hämoglobin in stark alkalischem Medium abbauen. Diese Eigenschaft des Mikroorganismus wird, wie spätere Untersuchungen ergaben (vgl. GB-PS 12 05 403), der Wirkung eines Enzyms zugeschrieben. Enzyme mit hoher Aktivität in alkalischen Medien sind auch aus der GB-PS 12 43 784 und der NL-OS 72.07050 bekannt. Darin werden mehrere proteolyiisch wirkende Enzyme beschrieben, die von Mikroorganismen der Gattung Bacillus gebildet werden und in Waschmittel·! verwendet werden können, die normalerweise alkalisch sind, wenn sie in der Waschflüssigkeit aufgelöst werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Protcascpräparal (nachstehend kurz als Protease oder Enzym bezeichnet) mit hoher proteolytischer Aktivität in alkalischen Medien zu schaffen iias sich als Zusatz für Waschmittel eignet Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst

Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Die Protease ist in überraschend hohen Ausbeuten aus dem Mikroorganismus Bacillus nov. spec, PB 92 erhältlich. Die Ausbeuten sind höher als die, die beispielsweise mit dem in der NL-OS 72.07050 beschriebenen Stamm von Bacillus firmus erhalten ίο werden. Die Protease der Erfindung zeigt auch in perborathaltigen Waschmitteln eine überraschend gute Wirkung. Eine Kultur des Mikroorganismenstammes Bacillus PB 92 ist im Laboratorium für Mikrobiologie der Technischen Universität Delft Niederlande, hinterlegt und hat dort die Bezeichnung OR-60 erhalten.

Die Protease der Erfindung wird durch Züchten von Bacillus PB 92 in einem Nährmedium, das übliche Kohlenstoff-, Stickstoff- und Spurenelementquellen enthält unter aeroben Bedingungen und anschließendes Isolieren des erhaltenen, proteolytisch wirkenden Enzyms aus der Kulturbrühe hergestellt

Eigenschaften des Enzyms
(a) Beziehung pH-Wert/Aktivität

Zur Bestimmung der Beziehung pH-Wert/Aktivität wird die Hämoglobinmethode nach Anson (vgl. J. Gen. Physiology, Bd. 22 [19391 Seiten 79 bis 89) so genau wie möglich angewandt. Anweisungen, die nicht in dem »ι Artikel von Anson angegeben sind, sind nachstehend aufgeführt:

Substrat

Rinderhämoglobulin, Proteasesubstrat gemäß Anson, Γι rein lyophilisiert.

Substratlösung

Das Hämoglobin wird unter Rühren mit Wasser zu einer 22prozentigen Lösung (Gcv'cht/Volumen) ver-•iii mischt. 10 ml dieser frisch angesetzten, konzentrierten Lösung werden mit 8 mil η Natronlauge, 72 ml Wasser und 36 g Harnstoff versetzt und verdünnt. Die alkalische Lösung wird 60 Minuten auf 25°C erwärmt, um das Hämoglobulin zu denaturieren.

Es werden die nachstehenden Pufferlösungen, Harnstoff und Natriumäthylmercurithiosalicylat (Thiomersal) zugegeben. Der pH-Wert wird mit einer Elektrode (Ingold HA) eingestellt. Das Volumen wird so eingestellt, daß eine 2,2prozenlige Hämoglobinlösung erhalten wird.

Als pH-Vergleichslösungen werden !Pufferlösungen -nit einem pH-Wert von 8,00, 9,00, 10,00, 11,00 und 12,00 eingesetzt. Es wird ein digitales pH-Meter verwendet.

Die Zusammensetzung des Puffers für die Substratlösung mit einem pH-Wert von 8 folgt nach der Beschreibung für die Trypsinbestimmung. Die Zusammensetzung der übrigen Pufferlösungen sind aus Dawson et al., »Date for Biochemical Research«, 2 Ausgabe(1969),Oxford, S.475 ff. entnommen.

Die Komponenten werden zur Substratlösung gegeben, bis die nachstehenden Endkonzentralionen erhalten werden:

pH-Bereich 8.3- lOJ:
pH-Bereich 10.8-IU:

Puffersystem

Glycin-NaOH (0.05 M)

Puffersystem

Na₂IIPO₁-NaOII

(0.025 M)

pH-Bereich 11,7-12£: Puffersystem

KCl-NaOH (0,05 M).

Enzymlösung

Es werden frische Lösungen in Wasser hergestellt. Eine verdünnte Lösung hat eine Enzymkonzentration von 200 DE/ml. Die Bezeichnung DE bezieht sich auf Delft-Einhejten, die sich wiederum auf eine Methode zur Bestimmung der Enzymaktivität beziehen, die in der GB-PS13 53 317 beschrieben ist

Inkubation

Jede Analyse besteht aus zwei Bestimmungen und einer Blindbestimmung. Die Substrat- und Enzymlösungen werden in einem Wasserbad auf 25" C eingestellt Der pH-Wert der Substratlcsungen wird mit einer Elektrode (Ingold HA) bestimmt, wobei für pH-Werte unter 11,0 auch eine Elektrode (ftigold LOT) verwendet wird. Als pH-Vergleichslösungen werden Puffer-Vergleichslösungen verwendet 2,5 ml der Substratlösung werden in einem Zcntrifugcnröhrchen mit 0,5 rn! Enzymlösung versetzt und unmittelbar Janach mit einem Glasstab, der mit einem Griff versehen ist durch Rühren vermischt Die Blindlösung, die kein Enzym enthält, wird ebenfalls inkubiert

Die Inkubation wird nach 10 Minuten durch Zugabe von 5 ml 03 η Trichloressigsäure beendet Zur Blindlösung werden 5 ml der Trichloressigsäurelösung und 0,5 ml Enzymlösung zugegeben. Die Trichloressigsäurelösung wird mit einer ZIPPbI It zugegeben. Das Gemisch wird anschließend mit dem Glasstab, der mit einem Griff versehen ist noch in dem Zentrifugenröhrchen stark gerührt Anschließend werden die Zentrifugenröhrchen in ein Wasserbad von 2°C eingebracht.

Die Drift des pH-Wertes während der Inkubation wird zu Beginn und am Ende der Inkubation mit einer Elektrode (LOT-Elektrode für pH-Werte unterhalb 11,0 und HA-Elektrode für pH-Werte oberhalb 11,0) gemessen. Die Drift des pH-Wertes beträgt wenigei als 0,1 pH-Einheiten bei der Inkubation von Enzymlösungen, die 50 oder weniger DE/ml enthalten und weniger als 0,15 pH-Einheiten bei der Inkubation von Enzymlösungen, die 200 bis 500 DE/ml enthalten. Als Grundlage dienen Mittelwerte, die mit der HA-Elektrode erhalten wurden.

Zentrifugation

Nachdem die Inkubationslösung mindestens 30 Minuten bei 2° C gehalten wurden, werden die Zentrifugenröhrchen bei 6000 g zentrifugiert

Farbentwicklung

Die Farbentwicklung wird in einem Wasserbad bei 25° C durchgeführt 5 ml des Oberätandes werden mit 10 ml 03 η Natronlauge versetzt. Das Gemisch wird anschließend sofort mit einer Vortex-Genie-Vorrich-

2Ii tung gerührt. Nach genau 2 Minute·« wird das Gemisch mit 3 m! eines Pher.olreagenzes iw: einer ZIPPETTE unter fortwährendem Rühren versetzt Als Phenolrea genz wird das Folin-Ciocalteus-Phenolreagenz verwen det, das mit 2 Volumenteilen Wasser verdünnt wird.

2% Die Farbentwicklung wird mit einem Spektrometer mit automatischem Spalt bei 750 nm genau 6 Minuten nach der Phenol-Reagenz-Zugabe gemessen. Als Vergleichslösung zur Bestimmung der Farbentwicklung wird eine Tyrosinlösung verwendet, die 8x10-'

so Tyrosinäquivalente in 5 ml 0,2 η Salzsäure mit 03 Volumenprozent Formaldehyd enthält Die Farbentwicklung der Vergleichslösung wird in gleichmäßigen Abständen überprüft. Die Abweichungen vom Mittel wert liegen dabei unter 1% bei einem Ansatz eines

»> verdünnten Phenolreagenzes.

Das Enzym weist folgende proteolytische Aktivität auf:

pll-Wcrtc 8,3

8,8

10,3

10,8

11.3

11,7

12.5

Relative Aktivität

87

91

87

94

99

100

(b) Elektrophoreseuntersuchung

Das Verhalten des Enzyms kann weiterhin d'irch die Zymogramm-Methode gekennzeichnet werden, die auf einer Kombination der Discelcktrophorese in Polyacrylamidgel und einer visuellen Beobachtung der Aktivität beruht. Die Methode ist von Zuidweg et rl., Biotech, and Bioeng., Bd. 14(1972), Seiten 685 bis 714, beschrieben und gestattet einen direkten Vergleich der Enzympräparate. Der Vergleich wird

(a) mit dem Enzym der Erfindung

(b) einer Protease, die von einem Stamm der Gattung Bacillus erhalten wurde, der bei der National Collection of Type Cultures in London unter der Bezeichnung NCTC 4553 hinterlegt wurde (vgl. GBPS I2 05 403),

(c) einem im Handel erhältlichen, protcolytisch wirkendem Enzym MAXATASE®und

(d) einem im Handel erhältlichen Enzym ESPERASE" durchgeführt und ist in der Figur gezeigt. Die Figur weist nur die Ha jptkomponenten der Präparate auf (als Puffersystem wird in der elektrophoretischen Trennung das System E verwendet, das 2-Amino-2-hydrnxymethyl-l.3-propandiol und Borsäure enthält).

Die visuelle Beobachtung der Aktivität wird nach der Immersion-Kontakt-Technik (vgl. die Beschrei bung von Zuidweg et al., a.a.O.) durchgeführt.

Die Figur zeigt, daß das Enzym der Erfindung aus mehreren Verbindungen besteht, wobei sich die Zusammensetzung des Enzyms von den Zusammensetzungen der übrigen Enzym Präparate unterscheidet.

Aminosäurezusammensetzung des Enzyms
der Erfindung

Die Arrinosäurezusammensetzung der zwei Hauptkomponenten A und B (vgl. l-'igur) wird bestimmt und ist in Tabelle I im Vergleich zu den Aminus'iurc/usammcnsetziingcn mchrerei bekannter F.n/>me

1. Subtilisin Carlsberg (vyl Delangc und Smith, |. Biol. Chem. Bd. 24J[1968] S. 21 34),

2. Enzym von Bacillus Sacchariticu·. (vgl. US-PS 3b 22 4Ί8).

3. Enzym von Bacilli^ firmus (vgl. NI.-OS 72.07050) und

4. Enzym von B 221 (vgl. K. Hnrikoshi. Agr. Biol. Chcm., Bd. 35[197I]. S. 1407) gezeigt.

Der Fehler dieser Bestimmungen liegt bei ± 10%.
Die Tabelle zeigt weiterhin die Molekulargewichte der Enzyme und ihre isoelektrischen Punkte.

Tabelle I

Aminosäure

(I)

(2)

(4)

lin/ym der Erfindung
Komp. (Λ) Komp. (B)

ARG

SER GLU PRO GLY ALA

MET ILEU

TYR PHE TRY

Mol-Gewicht

Isoelektrischer Punkt

4 28 19

32

12

36 42

0 31

5 10 16

13 4 1

27.300 9.3

6	4	6	6	6
5	6	8	7	6
3	6	8	9	8
20	23	29	27	28
14	14	18	16	16
37	22	23	30	.in
12	14	\b	15	15
10	12	16	12	13
25	30	39	31	33
27	32	45	36	36
0	0	0	0	0
20	21	27	22	22
3	2	4	3	3
12	7	9	8	9
12	16	22	18	18
9	6	7	7	6
2	2	IvJ	2	2
3	-	5	3	3
22.700	26.000	30,000	25.500	25,500
9.3	11,0	9,4	10,5	10,5

Taxonomie

Die taxonome Bestimmung wurde gemäß Smith-Gordon und Clark, »Aerobic Sporeforming Bacteria«. U. S. Dept of Agr. Monographie Nr. 16 (1952), durchgeführt Die Sporulierung des Mikroorganismus Bacillus PB 92 kann durch Kultivieren lyophilisierter Kulturen von 65 Tage alten TSB-Agarkulturen (TSB: Trypton-Soya-Brühe aus Oxoid) auf TSB-Agar induziert werden.

Morphologie

(a) Vegetative Zellen: (bewegliche) Stäbchen, abgerundete Enuen, im allgemeinen vereinzelt, aber auch in kurzen Ketten von 2 bis 8 Stäbchen; manchmal sehr lange Ketten mit einer Länge von mindestens 1000 μ.

(b) Sporangien: Manchmal etwas verdickt

(c) Sporen: 0,6—0,8 sowie 1,0—13 μ; ellipsoid, dickwandig; subterminal bis parazentral.

(d) Schattenformen: ziemlich viele; auch in der Mitte einer Kette von normalen Zellen.

Weitere Eigenschaften Maximale Wachstumstemperatur: 50° C

jGram-positiv; nur aerob

Wachstum auf Nähragar bei pH-Wert von 7,2: etwas langsamerer Wachstumsbeginn als bei einem pH-Wert von 9,4. Die Kanten der Kolonien sind bei dem pH-Wert von 7,2 glattrandig, bei einem pH-Wert von 9,4 aber gewellt bis faserförmig.

Keine Pigmentbildung auf Tyrosinagar bei einem pH-Wert von 9,5. Schwache Stärkehydrolyse auf Kartoffelstärke/Nähragar bei einem pH-Wert von 9,5.

Starke Verflüssigung von Gelatine auf Gelatine/Nähragar bei einem pH-Wert von 9,5.

Deutlicher Caseinabbau auf Milchagar bei einem pH-Wert von 8,4.

Kein oder kein wesentliches Wachstum auf Glucose- oder Mannitagar mit Nitrat als einziger Stickstoffquelle.

Positive Nitratreduktion in einer Nitrat/Nährbrühe bei einem pH-Wert von 9,5.

_Μ Isolierung

Der Mikroorganismus, der das Enzym der Erfindung produziert, wurde aus einer Bodenprobe in Sambia mit einer spezifischen Isolationsmethode bei einem pH-Wert von 8,0 bis 9,5 isoliert

Züchtung

Das von dem Mikroorganismus Bacillus PB 92 produzierte Enzym wird durch Züchten des Mikroorganismus und anschließendes Abtrennen des produzierten Enzyms in üblicher Weise erhalten. Zur Erzielung hoher Ausbeuten des Enzyms ist ein Medium nötig, das gut assimilierbare Kohlenstoff- und Energiequellen, wie Glucose, Sucrose, Dextrine oder Stärke, und Stickstoffquellen organischen Ursprungs enthält wie Casein, Hefe oder Sojamehl. Weiterhin werden vorzugsweise bestimmte Mengen von Calcium- und Magnesiumsalzen sowie mehrere Spurenelemente zugegeben. Während der Züchtung ist eine gute Belüftung

notwendig. Der pH-Wert des Mediums wird bei 6.5 bis 10, vorzugsweise bei 7 bis 9, gehalten. Die Züchtigungstcmperatur liegt bei 37"C.

Bei Beachtung dieser Maßnahmen können sehr hohe Ausbeuten (Proteaseaktivität pro g umgesetzte Glucose) erhalten werden. Die Ausbeute ist hinreichend hoch für ein/ wirtschaftliche Herstellung des Enzyms.

Abtrennung des Enzyms

Das Enzym wird aus der Kulturbrühe in üblicher Weise abgetrennt. Die Brühe wird filtriert, um die Mikroorganismen und unlösliches Material abzutrennen. Zur Herstellung wasserfreier Waschmittel wird das Enzym im allgemeinen durch Zugabe wassermischbarer organischer Lösungsmittel oder anorganischer Salze, wie Natriumsulfat oder Ammoniumsulfat, zum Filtrat

ti. r*i%„ _: _.:„. u _/*i:_i ι ■-·-._n ...: ι j__

■ it. rui cmc WH isinamnnc riciaiciiuiig nituuaa und weitere Verbindungen, wie Carboxymethylcellulose. Duftstoffe und optische Aufheller. Eine weitere üblich verwendete Verbindung ist ein Alkalimetallperborat, insbesondere Natriumperborat. In Verbindung

-, mit den Perboraten zeigt das Enzym der Erfindung eine unerwariet hohe Stabilität.

Die Waschmittel können in üblicher Weise hergestellt werden, beispielsweise durch Vermischen der Komponenten oder durch Herstellen eines Teilgemisches, das

K) anschließend mit den üblichen Komponenten vermischt wird. Vorzugsweise wird das Enzym mit einem oder mehreren der üblichen Verbindungen, beispielsweise dem Füllstoff, vermischt, um ein Konzentrat mit einer zuvor bestimmten enzymatischen Aktivität herzustellen, das wiederum mit den anderen Komponenten vermischt werden kann. Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Filtratvolumen zuerst durch Verdampfen eingeengt, bevor die Lösungsmittel oder die Salze zugegeben werden. Für flüssige Waschmittel können die filtrierte Brühe oder das wieder aufgelöste Enzym verwendet werden.

Nach dem Ausfällen wird das Enzym durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt. Anschließend wird der erhaltene Filterrückstand getrocknet.

Formulierung

Dat Enzym kann in üblicher Weise Waschmitteln einverleibt werden. Die Menge des verwendeten Enzyms entspricht im allgemeinen der Menge, bei der das gesamte Waschmittel eine proteolytische Aktivität von ungefähr 100 bis 5000 DE/g, vorzugsweise 500 bis 1000 DE/g, besitzt. Die Bestimmung der proteolytischen Aktivität ist in der GB-PS 13 53 317 beschrieben.

Die Waschmittel mit dem Enzym der Erfindung enthalten weiterhin mindestens ein Tensid. Als Tenside in Waschmitteln werden diejenigen Tenside eingesetzt, die allgemein in Waschmitteln mit enzymatischer Aktivität verwendet werden. Im aligemeinen können nicht-ionische und anionische oberflächenaktive Verbindungen, wie wasserlösliche Seifen, anionische, nicht-ionische, ampholytische oder zwitterionische Tenside, verwendet werden. Ein Beispiel eines allgemein verwendeten Tensids ist Dodecylbenzolsulfonat. Üblicherweise liegen die Tenside, die allein oder im Gemisch verwendet werden können, in einer Menge von ungefähr 4 bis 20% des Waschmittels vor.

Die Waschmittel der Erfindung können weitere zusätzliche Verbindungen enthalten, die allgemein in Waschmitteln mit proteolytischer Aktivität verwendet werden. Sie enthalten üblicherweise komplexe Phosphate, beispielsweise ein Alkalimetalltripolyphosphat oder ein Alkalimetallpyrophosphat, vorzugsweise in Mengen von etwa 40 bis 50 Gewichtsprozent, bezogen auf das Waschmittel. Weiterhin oder alternativ können Verbindungen, wie ein Alkaiimetallcyanotriacetat oder ein Alkalimetallcitrat, verwendet werden. Ihre Wirkung in Waschmitteln ist komplex, wobei aber ihre Wirkung als Wasserweichmacher die größte Bedeutung hat Weitere Verbindungen, die üblicherweise zur Herstellung von Waschmitteln verwendet werden, sind beispielsweise Alkalimetallsilikate, im allgemeinen in Mengen von 1 bis 10 Gewichtsprozent, schwach alkalische Verbindungen, wie Alkalimetallcarbonate, im allgemeinen in Mengen von höchstens 20 Gewichtsprozent, Füllstoffe, beispielsweise Alkalimetallsulfate,

Beispiel!

Züchtung des Mikroorganismus Bacillus PB 92.
Es wird folgendes Medium verwendet:

g/Liter

Hefe (bezogen auf das

Trockengewicht) 22

K₂HPO₄ ■ 3 H₂O 5

MgSO₄ · 7 H₂O 0,05

CaCI₂ 0,05

"' FeSO₄ ■ 7 H₂O 0,005

MnSO₄ ■ 4 H₂O 0,005

Die Komponenten des Mediums werden in 90% des Endvolumens gelöst. Anschließend wird die Lösung 1

r, Stunde bei einem pH-Wert von 7,0 und einer Temperatur von 120⁰C sterilisiert.

Die Impfkultur wird durch Impfen von 100 ml Trypticase-Soja-Brühe (Oxoid), zu der nach 20minütigem Sterilisieren bei 120°C 4 ml 1 M Natriumcarbonatlösung aus einem Schrägröhrchen zugegeben wurde, mit dem Mikroorganismus Bacillus PB 92 erhalten. Die Impfkultur wird 24 Stunden bei 30⁰C auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert.

Das Medium wird bei 37°C und einem pH-Wert von 8,0 mit 1 Volumenteil der Impfkultur pro 100 Volumenteile Medium beimpft. Die Hauptzüchtung wird bei 37° C in Rührfermentern durchgeführt die mit einer pH-Regelvorrichtung einer Temperaturregelvorrichtung, einer Antischaumvorrichtung und einer Vorrichtung für das kontinuierliche Messen der Konzentration des gelösten Sauerstoffs und der Sauerstoffaufnahmegeschwindigkeit ausgerüstet ist 17 Stunden nach dem Impfen wird eine 30prozentige Glucoselösung,die 1 Stunde bei 120⁰C sterilisiert wurde, bis zu einer Endkonzentration von 30 g Glucose pro Liter Medium zugegeben.

Die erhaltenen Ergebnisse weisen auf eine Ausbeute des proteolytisch wirkenden Enzyms von etwa 8 χ ΙΟ⁵ DE/g verbrauchte Glucose hin.

In Beispiel 1 der NL-OS 72.07050 ist ein Züchtungsversuch beschrieben, bei dem eine Endausbeute von 11 χ 10⁶ DE/Liter Kulturbrühe erhalten wird (50 Anson-Einheiten entsprechen etwa 11 χ 10* DE). Die Menge der verwendeten Kohlenhydrate entspricht etwa 75 g Glucose/Liter Kulturbrühe. Die Ausbeute an Protease/g verbrauchte Glucose im Beispiel der NL-OS 72.07050 entspricht 1,5 χ 10⁵ DE. Das bedeutet daß die Ausbeute des Enzyms der Erfindung etwas 5 mal größer ist

Beispiel 2
Waschwirkung

Die Waschuntersuchungen weiden auf folgende Weise ausgeführt:

(a) zu untersuchende Kleidungsstückproben: F.MPA-Iifi (verschmutzt mit Blut, Milch und chinesischer Tinte) von der Eidgenössischen Materialpriifungs- und Versuchsanstalt für Industrie, Bauwesen und Gewerbe, St. Gallen, Schweiz. Die zu untersuchenden Kleidungsstückproben werden im Dunkeln und luftdicht aufbewahrt. Zur Waschuntersuchung werden Stücke von 5 χ 5 cm aus einem visuell homogenen Teil des Kleidungsstücks ausgeschnitten.

(b) Waschlaugen: 4 g eines perborathaltigen, handelsüblichen Waschmittels ohne Enzym pro Liter SyilirieiiäCi'ieS Leitungswasser iTiit cinCT üärtC VGPi 15°d (deutscher Härtegrad). Das synthetische Wasser wird auf folgende Weise hergestellt: 10 ml einer Lösung vcn 0,656% MgCb in destilliertem Wasser werden mit 10 ml einer Lösung von 2% CaCb (pA) in destilliertem Wasser in einem 1000 ml Meßkolben versetzt und kräftig vermischt. Die erhaltene Lösung wird anschließend unter Rühren mit 10 ml einer Lösung von 2,1% NaHCOj vermischt und mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.

(c) Waschuntersuchung: 250 ml Waschlauge werden jeweils in einer ausreichenden Zahl von 300 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben. Das Enzym wird anschließend in einer Menge von 0, 250, 500 und 1000 DE/g Waschmittel jeweils in einem doppelten Ansatz zugegeben. Die Erlenmeyerkolben werden in einem Schüttelthermostaten bei 45"C gehalten, in dem sie unter Schütteln aufgewärmt werden. Anschließen wird jeweils eine Kleidungsstückpro- > be in den Erlenmeyerkolben zugegeben, die genau

I Stunde bei 45°C geschüttelt werden. Nach dem Waschen wird die Waschlauge dekantiert. Es werden 250 ml synthetisches Leitungswasser zu den Erlenmeyer-Kolben zugegeben. Die Kolben

in werden mit Gummistopfen verschlossen und genau

1 Minute kräftig geschüttelt. Die Klcidungsstückproben werden in einem Bechcrglas gesammelt, in dem sie mit langsam fließenden Leitungswasser gespült werden. Nach Zugabe der lcizten Klei-

r> dungsstückproben wird das Spülen etwa 10

Minuten fortgesetzt. Anschließend läßt man Hie Kleidungsstückproben, die in einem weißen sauberen Handtuch zusammengefaltet sind, an der Luft irrj Durikwlri »rockPT*

.'ο Nach dem Trocknen wird die Remission in einem

Remissionsmeßgerät beidseitig bestimmt, wobei MgO als Referenzsubstanz verwendet wird. Die Mittelwerte werden hinsichtlich einer vollständig rein gewaschenen Kleidungsstückprobe berechnet,

r> die eine Remission von 65,8% bezogen auf MgO

besitzt.

Vergleich des Enzyms der Erfindung
mit MAXATASE®und ESPERASE®

Die Waschuntersuchungen werden gemäß der vorstehenden Weise bei einem pH-Wert von 9,7 durchgeführt. In Tabelle Il sind die Ergebnisse zusammengefaßt.

Tabelle Il

DK/g % Remission

lin/.ym der Krfindung
Λ

Maxatase

Espcra:;e

0	20	-	-	—	—	—
250	41	21	30	10	31	11
500	46	26	33	13	36	16
1000	52	32	36	16	39	19

Die Tabelle zeigt, daß unter den Untersuchungsbedingungen das Enzym der Erfindung eine bessere Waschwirkung als die handelsüblichen Enzyme aufweist.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1, Proteasepräparat erhältlich durch Züchten unter üblichen Bedingungen von Bacillus nov. spec, PB 92 (hinterlegt bei der Microbensammlung der Technischen Hochschule Delft unter der Nr, OR-60) und enthaltend die zwei Hauptkomponenten A und B mit folgenden Parametern: