DE69008194T2

DE69008194T2 - Aus einem nocardiopsis-stamm stammendes bakteriolytisches enzym, seine herstellung und verwendung.

Info

Publication number: DE69008194T2
Application number: DE69008194T
Authority: DE
Inventors: Carol Beck; Chi-Li Liu; Janet Overholt
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1990-01-11
Filing date: 1990-01-11
Publication date: 1994-07-28
Anticipated expiration: 2010-01-12
Also published as: WO1991010723A1; ATE104337T1; DE69008194D1; DK0509985T3; ES2063340T3; EP0509985B1; EP0509985A1; JPH05503206A

Description

TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft eine bakteriolytische Enzymzubereitung, ein Verfahren zur Herstellung einer bakteriolytischen Enzymzubereitung, eine mikrobielle Kultur zur Verwendung in besagtem Verfahren, ein Waschmittel und ein Deodorant, die besagte Enzymzubereitung umfassen, und die Verwendung besagter Enzymzubereitung.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Es hat sich herausgestellt, daß der ausgeprägte unangenehme Geruch erwachsener Menschen, volkstümlich "Körpergeruch" genannt, erzeugt wird, wenn Mikroorganismen mit apokrinen Schweiß in Wechselwirkung treten (J. J. Leyden et al. J. Invest. Dermatology, 1981, 77:413-416). In einer Anzahl von Veröffentlichungen ist vorgeschlagen worden, daß die übliche Haut-Mikroflora eine Mischung von Micrococcaceae, aeroben Diphtheroiden und Propionsäurebakterien ist (J. J. Leyden et al. 1981 & J. N. Labows et al J. Soc. Cosmet. Chem. 1982, 34:193-202). Die Diphtheroiden sind verantwortlich für die selektive Erzeugung der ausgeprägten stechenden Gerüche, während die Mikrokokken verantwortlich sind für die Erzeugung von schweißigen, sauren Gerüchen. Die Körpergeruchsprobleme in Kleidung haben zunehmende Bedeutung gewonnen, weil Kleidungsstücke, die aus einigen Synthetikfasern hergestellt sind, Gerüche festhalten und weil eine ständig steigende Popularität körperlicher Eetätigung viele mit Schweiß durchdrungene Kleidungsstücke erzeugt.
Die Waschmittelindustrie hat seit langem Duftstoffe eingesetzt um Kleidung frisch riechen zu lassen und den unangenehmen Geruch der Kleidung zu maskieren. Auch sind "Deoduftstoffe" eingeführt worden (z.H. in Surf ) , um mit Gerüchen zu reagieren und zu verhindern, daß sie ausdunsten und die Nase erreichen. Die Quellen der Geruchsproduktion, d.h. Mikroorganismen in der Kleidung, werden jedoch nicht beseitigt.
Zusätzlich zu den oben genannten geruchserzeugenden Mikroorganismen befassen sich Waschmittelhersteller auch mit in Wäsche anzutreffenden Mikroorganismen, die pathogen sein könnten, wie etwa Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus.
Man glaubt, daß das Zerstören der Mikroorganismenquelle(n) von Körpergeruch, eigentlich das Desinfizieren der Wäsche, der überlegene Ansatz für die Verringerung der Erzeugung von Körpergeruch in Kleidungsstücken ist. Dieses Ergebnis könnte während des Waschens durch Verwendung eines bakteriolytischen Enzyms zusammen mit dem Waschmittel erreicht werden. Für jedes Enzym, das bei Waschpraktiken als ein Waschmittelzusatzstoff brauchbar sein soll, muß das Enzym bei alkalischen pH-Niveaus aktiv sein und darf nicht durch Materialbestandteile in der Waschmittelzusammensetzung inhibiert werden, insbesondere durch das Tensid, die Buildersalze oder irgendwelche vorhandenen Chelatisierungsmittel (wie etwa EDTA). Außerdem muß solch ein Enzym gegenüber den relevanten Mikroorganismen aktiv sein.
Bakteriolytische Enzyme können auch zur Zerstörung schädlicher Mikroorganismen in Nahrung oder Wasser oder zur Verarbeitung bakterieller Zellmasse, z.B. zur Aktivschlammbehandlung, zur Protoplastenbildung oder zur Gewinnung intrazellulärer Produkte, verwendet werden.
Bakteriolytische Enzyme sind bekannt, einschließlich Peptidasen (wie etwa Alanin-Anidase), Glykosidasen (wie etwa Muramidase oder Lysozym) und Autolysine (aus einer Anzahl von Bazillen- und Bakterienspezies), die in der Lage sind, Peptidoglykan der Mikroorganismen-Zellwand zu depolymerisieren. Viele der bekannten bakteriolytischen Enzyme, z.B. Mutanolysin (aus Streptomyces globisporus 1829, ATCC 21553) und N-Acetylmuramidase (aus Streptomyces rutgersensis), haben ein pH-Optimum zwischen 6-7 und sind relativ inaktiv in der Gegenwart von Waschmittelbestandteilen und/oder bei alkalischen pH-Niveaus. Andere haben geringe oder keine Aktivität gegenüber einigen der relevanten Mikroorganismen.
Bakteriolytische Enzyme mit hoher lytischer Aktivität bei alkalischen pH-Niveaus (8-10) in der Gegenwart von Waschmittelbestandteilen sind bisher nicht bekannt gewesen. Es ist die Aufgabe dieser Erfindung, solche Enzyme zur Verfügung zu stellen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist nunmehr entdeckt worden, daß bestimmte Nocardiopsis- Stämme extrazelluläre Enzyme produzieren, die in der Lage sind, die Zellwände von Mikroorganismen, die in Haushaltswäsche vorhanden sind, zu hydrolysieren, einschließlich z.B. Mikrokokken, Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus. Diese Enzyme sind unter Waschbedingungen aktiv, d.h. bei alkalischen pH-Niveaus in der Gegenwart von Waschmittelbestandteilen. Ihre Verwendung während einer Wäsche oder Spülung führt zu verringerter Kontamination von Kleidung mit üblicher Haut-Mikroflora, wodurch der Geruch der schmutzigen Kleidung beseitigt werden kann.
Demgemäß stellt die Erfindung eine bakteriolytische Enzymzubereitung zur Verfügung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie ein aus einem Nocardiopsis-Stamm stammendes bakteriolytisches Enzym umfaßt daß sie die Fähigkeit besitzt bakterielle Zellwände von Micrococcus sedentarius, Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus zu hydrolysieren, daß sie ein pH-Optimum im Bereich 5-8 besitzt daß sie wenigstens 50% Aktivität im pH-Bereich 6,3-8,2 besitzt und daß sie eine optimale Temperatur im Bereich 40-60ºC besitzt. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung der bakteriolytischen Enzymzubereitung zur Verfügung, welches umfaßt, daß ein ein bakteriolytisches Enzym produzierender Nocardiopsis-Stamm aerob unter Submersbedingungen in der Gegenwart von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen kultiviert und danach das Enzym aus der Kulturbrühe gewonnen wird.
Ein dritter Aspekt der Erfindung stellt eine biologisch reine Kultur eines ein bakteriolytisches Enzym produzierenden Norcardiopsis-Stammes zur Verfügung.
Die Erfindung stellt außerdem eine Waschmittelzusammensetzung und ein Körperdeodorant zur Verfügung, die besagte bakteriolytische Enzymzubereitung umfassen. Schließlich stellt die Erfindung die Verwendung besagter Enzymzubereitung zum Hydrolysieren bakterieller Zellwände zur Verfügung.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Zum weiteren Verständnis dieser Erfindung wird Bezug genommen auf die beigefügten Zeichungen, in denen:
Figur 1 grafisch die lytische Aktivität von roher Enzymbrühe aus Stamm D38-3 gegenüber Pseudomonas aeruginosa-Zellen als eine Funktion des pHs darstellt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Mikroorganismen

Bakteriolytische Enzyme dieser Erfindung werden extrazellulär produziert von atypischen Nocardiopsis dassonvillei-Stämmen, die lytisches Enzym produzieren. Mehrere einen lytischen Enzymkomplex produzierende Stämme von Nocardiopsis dassonvillei sind isoliert worden. Andererseits produzieren der Nocardiopsis dassonvillei-Typstamm ATCC 23218 und der Norcardiopsis mutabilis-Typstamm ATCC 31520 keine lytischen Enzymkomplexe.
Die bevorzugten Mikroorganismen dieser Erfindung sind aerobe, ein lytisches Enzym produzierende Actinomycetenisolate von Nocardiopsis dassonvillei.
Drei solche Stämme sind für Patentierungszwecke von den Erfindern bei der Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, IL, U.S.A., unter den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt worden, wie folgt: Bezeichnung des Hinterlegers Hinterlegungs-Nr. Hinterlegungsdatum Taxonomische Bezeichnung 24.März 1988 Nocardiopsis dassonvillei 20.April 1988
Die Temperatur für das Wachstum der obenbeschriebenen Stämme ist 25ºC bis 35ºC, wobei bei oder oberhalb 35ºC schlechtes Wachstum eintritt. Der optimale pH für das Wachstum von Stamm G102-3 ist 7 und ist 8,5-9 für die Stämme G119-6 und D38-3. Kein Wachstum tritt auf bei oder unterhalb pH 7,0 für die Stämme G119-6 und D38-3.
Auf Nährstoff-Agarschrägplatten zeigen reife Kolonien von Stamm G119-6 mehliges Luftmycel mit einer schwachen cremiggelben Färbung; bei Stamm D38-3 zeigen die reifen Kolonien ein rötlich-beiges Bild. Auf Bennett-Agarschrägplatten besitzen reife Kolonien von Stamm G102-3 rauhes, weißes bis cremefarbenes Luftmycel.
Ein lytisches Enzym produzierende Mutanten und Varianten von diesen Stämmen liegen ebenfalls im Schutzumfang der Erfindung, sowie die Produktion von aus diesen Stämmen stammendem lytischen Enzyms aus transformierten Wirtszellen anderer Mikroorganismusspezies (transformiert mit den in der Technik bekannten rekombinanten DNA-Techniken).

Produktion von lytischem Enzym

Die Nocardionsis-Stämme der Erfindung können unter aeroben Bedingungen in einem Nährstoffmedium kultiviert werden, das assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff zusammen mit anderen essentiellen Nährstoffen enthält, wobei das Medium gemäß, den im Stand der Technik bekannten Prinzipien zusammengesetzt ist. Submersfermentation ist bevorzugt.
Geeignete Kohlenstoffquellen sind Kohlehydrate, wie etwa Saccharose, Glucose und Maltose, oder kohlehydrathaltige Materialien, wie etwa Getreidekörner, Malz, Reis und Sorghum. Die Kohlehydratkonzentration, die in das Medium eingearbeitet ist, kann in breitem Umfang variieren, z.B. 1 bis 15%, aber üblicherweise werden 8-10% geeignet sein, wobei die Prozentanteile als Glucose-Äquivalente berechnet sind.
Die Stickstoffquelle im Nährstoffmedium könnte organischer oder anorganischer Natur sein. Unter den organischen Stickstoffquellen werden eine ganze Reihe regelmäßig in Fermentationsverfahren, die die Kultivierung von Actinomyceten betreffen, verwendet. Veranschaulichende Beispiele sind Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl, Cornsteep-Flüssigkeit und Hefeextrakt. Zusätzlich sollte das Nährstoffmedium auch die üblichen Spurensubstanzen enthalten.
Da die Stämme G119-6 und D38-3 der Erfindung alkalophil sind, wird die Kultivierung vorzugsweise bei alkalischem pH (8,5- 9,0) durchgeführt. Der alkalische pH kann durch Zugabe geeigneter Puffer erhalten werden, wie etwa Natriumcarbonat oder ischungen aus Natriumcarbonat und Natriumbicarbonat (nach Sterilisation des Wachstumsmediums). Für aerobe Submerskultivierung von Stämmen in Tankfermentern ist es notwendig, künstliche Belüftung einzusetzen. Die Belüftungsrate kann diejenige sein, die bei konventioneller Tankfermentation eingesetzt wird.
Nach der Fermentation kann ein flüssiges Enzymprodukt aus der Fermentationsbrühe durch Entfernung von Grobmaterial aus der Brühe und, falls gewünscht, durch Konzentration der Brühe mit herkömmlichen Verfahren, z.B. Verdampfung bei niedriger Temperatur oder durch Ultrafiltration, gewonnen werden. Schließlich können dem Konzentrat Konservierungsstoffe zugesetzt werden.
Wie erwähnt worden ist, kann die bakteriolytische Enzymzubereitung dieser Erfindung auch durch Kultivierung einer transformierten Mikroorganismenzelle hergestellt werden, die so hergestellt ist, daß sie ein Gen enthält, das für ein aus Nocardiopsis dassonvillei, z.B. aus einem der hierin beschriebenen Stämmme, stammendes lytisches Enzym kodiert und dieses exprimiert, gefolgt von der Gewinnung des lytischen Enzyms aus der Kulturbrühe. So ist der zu kultivierende Mikroorganismus entweder ein ein lytisches Enzym produzierender Stamm von Nocardiorsis dassonvillei, für den das Enzym ein natives Enzym ist (einschließlich Mutanten und Varianten eines Wildstammes, der den lytischen Enzymkomplex produziert), oder ist ein transformierter Wirtsorganismus, in den das Gen für das lytische Enzym durch rekonbinante DNA-Techniken inseriert worden ist. Solche Techniken sind in der Technik bekannt und umfassen im allgemeinen die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines geeigneten rekombinanten DNA- Klonierungsvektors, der DNA-Sequenzen, die Funktionen kodieren, die Genexpression erleichtern, und eine DNA-Sequenz, die ein lytisches Nocardionsis dassonvillei-Enzym kodiert, umfaßt;
b) Transformieren eines geeigneten Wirtsorganismus mit dem Klonierungsvektor aus Schritt a) ; und
c) Kultivieren des transformierten Wirtes in einem geeigneten Kulturmedium und Gewinnen des lytischen Enzyms aus dem Kulturmedium.
Bevorzugte Wirtsorganismen sind Stämme von Nocardiopsis, Streptomyces, Hefe, Aspergillus und Bacillus. Es ist besonders bevorzugt, A.oryzae als den Wirt gemäß der Lehre in EP 238,023 (Novo) zu verwenden.

Eigenschaften des lytischen Enzyms

Für den Enzymkomplex aus G102-3 werden wenigstens 50% der Aktivität bei pH 5,5 (in 0,05M Succinat) bei pH 8,2 (in 0,05M TRIS) bei 30ºC mit Staphylococcus aureus als Substrat beobachtet.
Das Temperatur-Optimum des Enzymkomplexes aus G102-3 ist etwa 50ºC (im Bereich 40-60ºC), gemessen bei pH 7 in 0,05M Natriumphosphatpuffer gegenüber Staph.aureus.
Das pH-Optimum der Enzymzubereitung aus D38-3 ist etwa 7,5 (im Bereich von 7-8) in 0,05M Phosphat- oder MOPS-Puffer mit Pseudomonas aeruginosa als Substrat bei 30ºC. Wenigstens 80% der Aktivität bei pH 7,5 (in 0,05M Phosphat) werden bei pH 9 (in 0,05M TRIS oder Boratpuffer) mit Pseudomonas aeruginosa als Substrat beobachtet.
Das Temperatur-Optimum der Enzymzubereitung aus D38-3 auf Pseudomonas aeruginosa als Substrat ist 60ºC bei pH 7 in 0,05M Natriumphosphat, wobei 80% der Aktivität bei 50ºC (70ºC wurde wegen der Labilität dieses Substrates nicht getestet) beobachtet wurden.
Die Enzymzubereitungen der Erfindung haben einen optimalen pH im Bereich 5-8 (bei 30ºC) und haben wenigstens 50% lytische Aktivität im pH-Bereich 6,3-8,2. Sie haben ein Temperatur-Optimum im Bereich 40-60ºC (gemessen bei pH 7 in 0,05M Phosphatpuffer).
Wie in Tabelle I dargestellt, die im folgenden vorgelegt wird, zeigt der lytische Enzymkomplex aus Nocardiopsis dassonvillei- Stamm G102-3 (NRRL 18349) hervorragende Aktivität gegenüber den Zielorganismen sowohl in pH 7,0-Puffer als auch in pH 9,5- Puffer. Vorteilhafterweise zeigt der lytische Enzymkomplex aus Stamm G102-3 Aktivität gegenüber den Zielorganismen bei niedrigerer Temperatur von 15ºC sowie bei 40ºC, was diesen lytischen Enzymkomplex vorteilhaft für die Verwendung zum Waschen bei niedriger Temperatur oder die Verwendung für Spülwasser bei Raumtemperatur macht.
Tabelle II zeigt daß der lytische Enzymkomplex aus Stamm G102-3 gute lytische Aktivität gegenüber Substraten in der Gegenwart von Waschmittelbestandteilen zeigt. Unterdessen zeigt lytisches Enzym aus Stamm D38-3 hervorragende Aktivität gegenüber Pseudomonas aeruginosa in der Gegenwart von Waschmittelbestandteilen. Spezifischer haben die Enzymzubereitungen der Erfindung bakteriolytische Aktivität in 1,5 g/l-Waschmittellösung, die wenigstens gleich zu der Aktivität in Puffer bei demselben pH ist.
Die Daten in Tabelle I, verglichen mit den Daten in Tabelle III, und diejenigen in Tabelle II mit Tabelle IV, belegen, daß die Abnahme in der Zellsuspensions-Trübheit ungefähr mit der tatsächlichen Anzahl überlebender Bakterien sowohl in Puffern als auch in Waschmittellösungen korreliert.
Die in Tabelle VI dargestellten Daten zeigen, daß in der Gegenwart von Waschmittelbestandteilen Alcalase allein eine gewisse lytische Wirkung besitzt und daß die Zugabe des lytischen Enzymkomplexes dieser Erfindung die Lyse auf 75-93% erhöhte.
Wie durch die Daten in Tabelle VIII veranschaulicht, sind die Enzymzubereitungen der Erfindung gegenüber einem breiten Bereich von Bakterien aktiv, einschließlich einer Anzahl von Bakterien, deren Beseitigung zur persönlichen Körperpflege oder Nahrungsmittelhygiene wüschenswert ist, z.B. Micrococci, Corynebacteria, E.coli, Vibrio und Salmonella. Solche Bakterien wie Micrococcus kristinae und Streptococcus faecium werden von dem Enzymkomplex aus G102-3 lysiert.

Enzymzubereitung

Feste Enzymzubereitungen können aus der gereinigten und/oder konzentrierten Brühe durch Ausfällung mit Salzen wie etwa Na&sub2;SO&sub4; oder mit wassermischbaren Lösungsmitteln wie etwa Ethanol oder Aceton hergestellt werden. Entfernung des Wassers in der Fermentationbrühe durch geeignete Trocknungsverfahren wie etwa Sprühtrocknung, Eindampfen unter Vakuum oder sogar Lyophilisation kann ebenfalls eingesetzt werden. Die hydrolytische Aktivität von so erhaltenen lytischen Enzymzubereitungen liegt üblicherweise im Bereich von 200 bis 5000 Einheiten/g Pulver. Dieses Rohprodukt kann (teilweise) gereinigt werden, wenn Enzymkonzentrate mit größerer Einheitsaktivität im Markt gewünscht sind. Ein geeigneter Aktivitätsbereich für einen Waschmittelzusatzstoff, der das lytische Enzym dieser Erfindung enthält, beträgt 50.000 bis 1 Millionen Einheiten pro Gramm Zusatzstoff (feste Form oder flüssige Form).
Typische Formen für Waschmittelzusatzstoffe, die in der Technik bekannt sind, können eingesetzt werden, insbesondere ein nicht-staubendes Granulat, eine stabiiisierte Flüssigkeit oder ein geschütztes Enzym.
Nicht-staubende Granulate können z.B. gemäß U.S. 4,106,991 oder U.S. 4,661,452 hergestellt werden und die Körner können gemäß in der Technik bekannten Prinzipien beschichtet werden.
Lytische Enzymzubereitungen in flüssiger Form können z.B. durch Zusatz von Propylenglykol, anderen Polyolen, Zuckern, Zuckeralkoholen und Borsäure oder durch andere in der Technik bekannte Enzymstabilisatoren stabilisiert werden.
Ein besonders vorteilhaftes Merkmal der vorliegenden Erfindung ist, daß das lytische Enzym mit alkalischen Bacillus-Proteinasen und insbesondere mit den kommerziell erhältlichen alkalischen Bacillus-Proteasen, die den Waschmittelherstellern kommerziell angeboten und von diesen verwendet werden, z.B. Alcalase , Esperase , Savinase , Maxatase , kompatibel ist und in Kombination mit diesen am nützlichsten ist. Zusammen entfalten Protease und das lytische Enzym eine kombinierte und vielleicht synergistische bakteriolytische Wirkung. Waschtests an einigen Zielmikroorganisnen unter Verwendung von Kombinationen einer alkalischen Bacillus-Protease und eines lytischen Enzymkomplexes haben zu einem mehr als 90%igen Abtötungsniveau geführt. Ein Waschmittelzusatzstoff, der ein Protease/lytisches Enzym-Gemisch umfaßt, ist eine bevorzugte Produktart der Erfindung.

Komponenten-Enzyme

N. dassonvillei-Stamm G102-3 produziert einen Komplex von wenigstens zwei lytischen Enzymen. Der von G102-3 produzierte Enzymkonplex kann in die zwei lytischen Hauptkomponenten-Enzyme, bezeichnet mit Enzym A und B, mit CM-Sephadex-Ionenaustauschchromatographie aufgetrennt werden. Enzym A hat eine relative Molekülmasse von 24.000 und einen isoelektrischen Punkt von 8,3, wohingegen Enzym B eine MW von 26.000 und einen pI größer als oder gleich 9,5 hat. Beide Enzyme erzeugen reduzierende Enden aus Staphylococcus aureus-Peptidoglykan, was indikativ für N-Acetylhexosaminidase-Aktivität ist.

Waschmittelzusammensetzung

Die Waschmittelzusammensetzungen, die in der Praxis der Erfindung eingesetzt werden, werden umfaßt von in der Technik bekannten Tensiden, die vom anionischen, nicht-ionischen, kationischen oder zwitterionischen Typ sein können, oder einer Mischung von diesen. Typische Beispiele für anionische Tenside sind lineares Alkylbenzolsulfonat (LAS), Alpha-Olefinsulfonat (AOS), Alkoholethoxysulfat (AES) und natürliche Alkalimetallenseife.
Waschmittelzusammensetzungen, die in der Praxis der Erfindung eingesetzt werden, können andere in der Technik bekannte Waschmittelinhaltsstoffe enthalten, wie etwa Builder, Bleichmittel, Bleichaktivatoren, Antikorrosionsmittel, Maskierungsmittel, Mittel zur Verhinderung erneuter Ablagerung von Schmutz, Duftstoffe, Stabilisatoren für die Enzyme usw..
Die Waschmittelzusammensetzungen können in jeder geeigneten Form formuliert sein, wie etwa Pulver, Flüssigkeiten, etc.. Das lytische Enzym kann in einem flüssigen Waschmittel durch Einschluß von Enzymstabilisatoren in der Formulierung, z.B. den oben erwähnten, stabilisiert werden.
Die meisten Waschmittelzusammensetzungen zeigen einen pH in Lösung von 8-10,5. Wegen seines breiten pH-Optimums ist das lytische Enzym der Erfindung in diesem gesamten Bereich hoch aktiv, wie in Figur 1 und 2 dargestellt.
Die Waschmittelformulierung, die in der Praxis dieser Erfindung eingesetzt wird, kann ein oder mehrere andere Waschmittelenzyme zusätzlich zum lytischen Enzym der Erfindung einschließen. Beispiele sind Protease, Lipase, Amylase und Cellulase. Das Vorhandensein von Protease ist natürlich bevorzugt.
Die lytischen Enzyme dieser Erfindung (und ebenso die alkalischen Bacillus-Proteasen) sind kompatibel mit den meisten kommerziell erhältlichen Waschmittelzusammensetzungsformulierungen, mit der Maßgabe, daß ihr Einsatz in Waschmittelformulierungen, die bestimmte Bleichmittel enthalten, und in denjenigen, die einen Waschwasser-pH, der pH 11 übersteigt, erzeugen, nicht praktisch sein könnte. Die Menge an Enzymzusatzstoff beträgt im allgemeinen von 0,5-5 oew.-% der Waschmittelformulierung.
Die Form des Waschmittelzusatzstoffes mit den lytischen Enzymen dieser Erfindung paßt somit in eine gut definierte Nische in der Technik, nämlich als ein Konzentrat mit etwa 50.000 bis 1 Millionen Einheiten pro Gramm zur Einarbeitung in eine Waschmittelformulierung (eines Waschmittelherstellers) als 0,5-5 Gew.-% des Volumens desselben, um eine lytische Enzymkonzentration von etwa 1000 bis 20.000 Einheiten, vorzugsweise 2000 bis 10.000 Einheiten pro Liter im Waschwasser zu erzeugen. Zum Vergleich kann der Zusatzstoff zur direkten Zugabe in das waschmittelhaltige Waschwasser oder in ein von waschmittelfreies Spülwasser an die Verbraucher geliefert werden, um die letztendliche gewünschte Konzentration, z.B. 2000 bis 10.000 Einheiten pro Liter, zu erzeugen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann eine alkalische Bacillus-Protease in einer Konzentration von 0,5 bis 3,0 Anson-Einheiten pro Gramm Zusatzstoff (oder, wenn geeigneter dadurch gemessen, eine Aktivität von 0,5-3,0 KNPU/g) eingeschlossen werden in den Mischungszusatzstoff mit lytischem Enzym, der an die Waschmittelhersteller zur Einbeziehung in ihre Waschmittelformulierungen oder alternativ an Verbraucher zur separaten Zugabe zu Wasch- oder Spülwasser geliefert wird. Eine Protease, die Zusatzstoff enthält, kann natürlich dem Wasch- oder Spülwasser separat von dem lytischen Enzymzusatzstoff zugesetzt werden. In jedem Fall sind Konzentrationen von 2000-10.000 Einheiten pro Liter an lytischem Enzym und von 0,01-0,15 Anson-Einheiten pro Liter an Protease in Wasch- oder Spülwaser bevorzugt und am bevorzugtesten sind 0,02-0,15 AU/l. Die Enzymmischung führt zu einer kombinierten oder einer synergistischen Verbesserung im Abtötungsverhältnis von Körpergeruch erzeugender Mikroflora.

Hydrolyse bakterieller Zellwände

Die Enzymzubereitung der Erfindung ist nützlich zur Verringerung der Anzahl unerwünschter Bakterien. Sie kann somit bei Nahrungsmitteln angewendet werden (als ein Nahrungsmittelkonservierungsstoff oder zur Desinfektion während der Nahrungsmittelverarbeitung), um solche Organismen wie Listeria, E. coli, Salmonella, Vibrio und Campylobacter zu bekämpfen. Sie kann auch bei der Wasserbehandlung, z.B. in Krankenhäusern und in Industrie-Kühlwassertürmen, verwendet werden, um Legionella zu bekämpfen. Eine andere derartige Verwendung ist die Desinfektion von Krankenhausinstrumenten, insbesondere denjenigen, die keine Sterilisierungstemperatur aushalten können, wo Bekämpfung von Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa und Campylobacter wichtig ist.
Außerdem kann die Enzymzubereitung der Erfindung zum Lysieren bakterieller Zellmasse in einer Laboratoriums- oder Industrieanlage verwendet werden. Es kann somit verwendet werden, um Aktivschlamm zu behandeln oder um als Entwässerungshilfsmittel für Schlamm zu dienen. Es kann auch verwendet werden als ein Forschungsenzym für Protoplastenbildung. Und es kann verwendet werden als ein zellöffnendes Hilfsmittel, um Produkte zu gewinnen, die intrazellulär in Bakterien produziert werden, z.B. klonierte Produkte, wie etwa Enzyme.

BEISPIELE

Zum weiteren Verständnis der Erfindung werden die folgenden spezifischen Beispiele vorgelegt.

Test auf Zellwandhydrolyseaktivität

In den Beispielen wurde die Zellwandhydrolyseaktivität in Kulturen von Stamm G102-3 und Stamm G119-6 und Stamm D38-3 durch die Trübheitsverringerungsmethode bestimmt (K. Hayashi et. al. Agric. Biol. Chem. 1981. 45(10):2289-2300). Lebensfähige oder lyophilisierte Zielorganismen, Micrococcus kristinae (ATCC 27570) , Micrococcus sedentarius (ATCC 14392), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) und Staphylococcus aureus (ATCc 6538), werden zunächst in einem 62,5mM Phosphatpuffer, pH 7,0, auf eine OD bei 660 nm von 0,8 suspendiert. Zu 2 ml einer solchen Zellsuspension werden 0,5 ml einer in geeigneter Weise verdünnten Enzymbrühe zugegeben und die Reaktionsmischung wird bei 15ºC oder 40ºC für 10 Minuten inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit wird die Abnahme in der Trübheit der Zellsuspension bei 660 um (Δ OD 660 nm) unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen. Eine Einheit wird definiert als die Menge an lytischem Enzym, die eine Abnahme von 0,001 bei OD 660 nm in der Trübheit der Zellsuspension bei besagter Temperatur pro Minute bewirkt.
Es sollte anerkannt werden, daß erwartet werden kann, daß die Messung verschiedener lytischer Enzymzubereitungen gegenüber verschiedene Testmikroorganismen in breitem Umfang variierende Werte für Zellwandhydrolyseaktivität liefert, und es ist festgestellt worden, daß ein hoher Grad an Variabilität existiert. Um Verwirrung zu vermeiden, werden die numerischen Werte, die hier im weiteren für die Zellwandhydrolyseaktivität vorgelegt werden, diejenigen sein, die mit dem hierin beschriebenen Test in Tests gegenüber StaDhvlococcus aureus gemessen sind (ausgenommen natürlich, wenn ein anderer Zielmikroorganismus genannt ist). Die jetzigen Erfinder erkennen an, daß die Einheitenwerte, über die sie berichten, in gewisser Weise künstlich sind, und bemerken, daß jede aus einem Stamm von Nocardiopsis dassonvillei stammende lytische Enzymzubereiung, die hier nicht exemplifiziert ist, gegen viele Zielmikroorganismen getestet werden sollte, um die Wirksamkeit zu ermitteln
Zellzählungsexperimente haben zur Zufriedenheit der jetzigen Erfinder ergeben, daß die Trübheitsabnahme in Zellsuspension bei 660 nm gut mit der tatsächlichen Abtötung des Zielorganismus korreliert. Das Verfahren ist dasselbe, wie es von K. Hayashi et al., aaO, beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß alle Lösungen, ausschließlich Zellsuspension, autoklaviert werden und die lytische Enzymlösung filtersterilisiert wird. Am Ende der Inkubation werden die Reaktionsmischungen reihenverdünnt und zur Auszählung überlebender Bakterien auf Nährstoff-Agarplatten plattiert.
Zellwandhydrolyseaktivität wurde auch bestimmt mit den chemischen, enzymatischen Tests.
(a). N-Acetylmuramidase-Aktivität wird gemessen durch Verwendung von Zellwand von Staphylococcus aureus als dem Substrat und im Anschluß an die Bildung von N-Acetylhexosamin, das aus der Zellwand freigesetzt wird. Zu 1 ml Staphylococcus aureus-Zellwandsuspension (die 1,6 mg Zellwand enthält), hergestellt in 50 mM MES-Puffer, pH 6,0, werden 0,2 ml Enzymlösung zugesetzt und die Reaktionsmischung wird bei 37ºC für 30 Minuten unter Rütteln inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit wird die unverbrauchte Zellwand durch Zentrifugation entfernt und der Überstand wird verwendet, um die Konzentration von freigesetzten N-Acetylhexosamin über die p-Dimethylaminobenzaldehyd(DMAB)-Methode (J. L. Reissig et al. Biol. Chem. 1955, 217:959-966) zu messen. Eine Einheit ist die Enzymmenge, die 1 nMol N-Acetylhexosamin aus der Zellwand bei 37ºC pro Minute freisetzt.
(b). Chitinase-Aktivität wird gemessen unter Verwendung von Chitin als dem Substrat und im Anschluß an die Bildung von N-Acetylglucosamin in Lösung. 0,5 ml Enzymlösung werden vermischt mit 0,5 ml Chitinsuspension, die aus 4 mg Chitin/ml in 0,1M Zitronensäure/0,2M Na&sub2;HPO&sub4;-Puffer, pH 6,5 besteht. Die Reaktionsmischung wird dann bei 37ºC für 90 Minuten unter heftigem Rütteln inkubiert. Am Ende der Inkubation wird das unverbrauchte Chitin durch Zentrifugation entfernt und der Überstand wird dann mit der DMAB- Methode auf N-Acetylglucosamin-Konzentration analysiert.
(c). Laminarinase-Aktivität wird unter Verwendung von Laminarin als dem Substrat und im Anschluß an den Anstieg der Konzentration an reduzierendem Zucker untersucht. Reaktionsmischungen enthalten 0,1 ml Laminarin (15 mg/nl in 0,1M Zitronensäure/0,2M Na&sub2;HPO&sub4;-Puffer, pH 6,0), 0,4 ml Puffer und 0,2 ml Enzymlösung Die Mischungen werden für 10 Minuten bei 37ºC inkubiert. Dann wird die Reaktion durch Zugabe von 0,3 ml kaltem H&sub2;O abgebrochen und in kaltem Wasser auf Raumtemperatur abgekühlt. Ein Aliquot (200 ul) der Lösung wird dann verwendet, um die Konzentration des reduzierenden Zuckers über die Mikro-Nelson-Methode (R. G. Spiro, Method. Enzymology, 1966, Bd. 8:S.3 zu messen.

BEISPIEL I

Nocardiopsis dassonvillei-Stamm G102-3 (NRRL 18349) wurde bei 30ºC auf einem Drehrütteltisch (250 UPM) in 250 ml-Erlenmeyerkolben mit dreifachen Vorformböden kultiviert, die 50 ml Medium der folgenden Zusammensetzung enthielten:
Zusammensetzung des Mediums in Gramm pro Liter:
Maltodextrin M-100 20
Sojabohnenmehl 20
Hefeextrakt 5
NaCl 2
Vor der Sterilisation wurde der pH des Mediums durch die Zugabe einiger Tropfen 0,1M NaOH auf 7,0 eingestellt. Nach 2 bis 4 Tagen Inkubation wurde die lytische Enzymaktivität der Brühe unter Verwendung der Trübheitsverringerungsmethode, die oben beschrieben ist, bestimmt. Die lytische Aktivität der G102-3- Brühe betrug 16,2 Einheiten/ml mit Stanhvlococcus aureus als dem Substrat nach 72 Stunden Inkubation.
Nocardiopsis dassonvillei-Stamm G119-6 (NRRL 18350) und -Stamm D38-3 (NRRL 18364) wurden ebenfalls bei 30ºC, wie beschrieben, kultiviert, mit der Ausnahme der folgenden Unterschiede:
Zusammensetzung des Mediums in Gramm pro Liter:
Maltodextrin M-100 20
Sojabohnenmehl 20
Hefeextrakt 2
K&sub2;HPO&sub4; 1
MgSO&sub4;.7H&sub2;O 1
Nach Sterilisation wurde der pH des Mediums durch die Zugabe von 5 ml 1M Lösung von Natriumcarbonat/Natriumbicarbonat-Puffer, pH 9,2, auf 8,5-9,0 eingestellt. Nach 114 Stunden Inkubation hatte die Brühe von Stamm G119-6 eine lytische Aktivität von 17,8 Einheiten/ml mit dem lebensfähigen Staphylococcus aureus als dem Substrat. Nach 142 Stunden Inkubation hatte die Brühe von Stamm D38-3 eine lytische Aktivität von 47,5 Einheiten/ml mit dem lebensfähigen Pseudomonas aeruginosa als dem Substrat.

BEISPIEL II

Die lytische Aktivität von lytischem Enzym aus Stamm G-102-3 aus Beispiel I ist dargestellt in Tabelle 1, wenn andere Mikroorganismen verwendet wurden als die Substrate. Die Zielorganismen, Micrococcus kristinae, Micrococcus sedentarius, Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus, wurden suspendiert in 62,5mM Phosphatpuf fer, pH 7,0, und 50mM Borat-Puffer, pH 9,5, um eine anfängliche OD bei 660 nm von 0,8 zu ergeben. Lytische Reaktionen wurden durchgeführt mit 3 Einheiten pro ml der Reaktionsmischung bei 15ºC und bei 40ºC mit 10 Minuten Inkubation. Am Ende der Inkubation wurde die Verringerung der Trübheit der Zellsuspension bei 660 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen. Tabelle I Substratorganismus M. kristinae M. sedentarius Pseud. aeruginosa Staph. aureus in pH 7-Puffer 0,181 0,174 bei 15ºC

BEISPIEL III

Die lytische Aktivität von lytischem Enzym aus Stamm G102-3 und lytischem Enzym aus Stamm D38-3 (aus Beispiel I) in der Gegenwart von Waschmittel ist in Tabelle II dargestellt, wenn andere Mikroorganismen verwendet wurden als die Substrate. Die Zielorganismen, Micrococcus kristinae, Micrococcus sedentarius, Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus, wurden in Waschmittellösung suspendiert, die durch Zugabe von 1,5 g Waschmittelpulver in 1 l entionisiertes Wasser hergestellt und dann durch Zugabe von CaCl&sub2; und MgCl&sub2; auf 9º dH deutsche Härte eingestellt wurde. Die Waschmittelformulierung, die in den Tests verwendet wurde, war Tide ohne Phosphat.
Lytische Reaktionen wurden durchgeführt bei 15ºC und 40ºC mit 10 Minuten Inkubation bei 3 Einheiten pro ml des lytischen Enzymkomplexes. Am Ende der Inkubation wurde die Verringerung der Trübheit der Zellsuspension bei £60 nm durch Verwendung eines Spektrophotometers gemessen. Tabelle II Substratorganismus G102-3-Enzym D38-3-Enzym bei 15ºC M. kristinae M. sedentarius Pseud. aeruginosa Stach. aureus

BEISPIEL IV

Um die tatsächliche Anzahl von Mikroorganismen abzuschätzen, die durch aus Stamm G102-3 produziertes lytisches Enzym lysiert wurden, wurden die folgenden Experimente zur Zählung lebensfähiger Zellen durchgeführt und die Ergebnisse sind in Tabelle III dargestellt. Über Nacht gezüchtete Substratorganismen, Micrococcus kristinae und Staphylococcus aureus, wurden in 50mM Borat-Puffer, pH 9,5, auf 10&sup4; CFU/ml suspendiert. Zu 2 ml Zellsuspension wurden 0,5 ml angemessen verdünnte Enzymlösung (auf 3 Einheiten/ml Reaktionsmischung) zugegeben und bei 15ºC oder 40ºC für 10 Minuten mit periodischem Vermischen inkubiert. Alle Lösungen, einschließlich Enzym, waren steril. Am Ende der Inkubation wurden die Reaktionsmischungen reihenverdünnt und zur Auszählung überlebender Bakterien auf Nährstoff-Agarplatten plattiert. Tabelle III Substratorganismus % Abtötung bei 15ºC M. kristinae Stach. aureus 47 53

BEISPIEL V

Die tatsächliche Anzahl von Mikroorganismen, die von lytischem Enzym aus Stamm G102-3 bei 3 Einheiten/ml Reaktionsmischung in der Gegenwart von Waschmittelkomponenten (1,5 g/l) lysiert wurden, wurden durch ein Experiment bestimmt, das ähnlich war zu demjenigen in Beispiel IV, mit der Ausnahme, daß Micrococcus kristinae und Staphylococcus aureus in der Waschmittellösung auf ungefähr 10&sup4; CFU/ml suspendiert wurden, was in Beispiel III beschrieben wurde Die Ergebnisse sind in Tabelle IV dargestellt. Tabelle IV Substratorganismus % Abtötung bei 15ºC M. kristinae Staph. aureus
Es ist offensichtlich, daß in Puffer oder in Waschmittellösung lytisches Enzym aus Stamm G102-3 konsistent 35-64% der lebensfähigen Mikroorganismen lysiert. Das lytische Enzym ist höchst wirksam in Waschmittellösung.

BEISPIEL VI

Ein Vergleich der lytischen Aktivität von lytischen Enzymen aus Stamm G102-3, Mutanolysin und N-Acetylmuramidase aus Streotomyces rutgersensis (ATCC 3350) gegenüber Zielmikroorganismen in der Gegenwart von Waschmittelkomponenten ist in Tabelle V dargestellt. Lactobacillus plantarum (ATCC 8014) war der Substratorganismus für lytisches Enzym aus Stamm G102-3 und Mutanolysin, wohingegen Streptococcus faecium (ATCC 8043) das Substrat für lytisches Enzym aus G102-3 und Enzym aus Streptomyces rutgersensis (ATCC 3350) war. Es ist bekannt, daß Lactobacillus plantarum und Strentococcus faecium die besten Zielorganismen für Mutanolysin bzw. N-Acetylmuramidase aus Streptomyces rutgersensis sind. Die Waschmittellösung war, wie in Beispiel III beschrieben, und dieselben 3 Einheiten/ml an Enzymaktivitätsniveau wurden während des Experiments verwendet, während die Reaktionen bei 15ºC durchgeführt wurden. Tabelle V Enzym Lactobacillus plantarum Streptococcus faecium aus Stamm G102-3 Mutanolysin aus S. globisporus aus S. rutgersensis

BEISPIEL VII

Die Kombinationswirkung von Alcalase und lytischem Enzym aus Stamm G102-3 auf lebensfähigen Mikroorganismen wurde in den folgenden Experimenten nachgewiesen.
Wenn Micrococcus kristinae und Staphylococcus aureus in Waschmittellösung, wie in Beispiel V beschrieben, suspendiert wurden, wurden 0,05 AU/l Alcalase zudosiert, um irgendwelche zusätzliche lytische Wirkung von Alcalase in Waschmittellösung zu untersuchen. Wie in Tabelle VI dargestellt, hat Alcalase allein in Waschmittel eine gewisse lytische Wirkung. Wenn jedoch von G102-3 produziertes lytisches Enzym bei 3 Einheiten/ml (3000 Einheiten/l) in Kombination mit 0,05 AU/l Alcalase zugesetzt wurde, wurde im Mittel eine Lyse von 75-93% erreicht. Tabelle VI M. kristinae Staph. aureus Waschmittel allein Alcalase + Waschmittel lytisches Enzym + Alcalase + Waschmittel 0% Abtötung
Eine erhöhte Dosis Alcalase (bis zu 0,2 AU/l) in Waschmittel führte nicht zu einem signifikanten Anstieg in der Lyse von M. kristinae oder S. aureus.

BEISPIEL VIII

Die synergistische Wirkung von Savinase oder Esperase mit lytischem Enzym aus Stamm G102-3 auf die Lyse von Staphylococcus aureus in Flüssigwaschmittel wurde in den folgenden Experimenten nachgewiesen.
Flüssigwaschmittel, Wisk (Lösung mit alkalischem pH), wurde auf handelsüblichem Niveau hergestellt. Der Zielorganismus Staphylococcus aureus wurde direkt in der Waschmittellösung auf eine anfängliche OD&sub6;&sub6;&sub0; von 0,8 suspendiert. Savinase oder Esperase wurden auf dem kommerziellen Niveau (0,06 KNPU/l) zudosiert, wie in Beispiel VII beschrieben. Die lytische Reaktion mit 3 Einheiten/ml wurde durch die Abnahme in der Trübheit bei 660 nm überwacht. Wie in Tabelle VII dargestellt, hat Savinase oder Esperase allein in Flüssigwaschmittel keine lytische Wirkung auf den Organismus. Es ist auch offensichtlich, daß lytisches Enzym aus G102-3 gute lytische Aktivität sowohl in Pulverwaschmittei (Beispiel VII) als auch in Flüssigwaschmittel ausdrückt. Eine synergistische Wirkung von lytischem Enzym aus G102-3 mit Savinase oder Esperase auf die Lyse von Staphylococcus aureus scheint im Wisk erhalten worden zu sein. Tabelle VII % Lyse Bedingung Waschmittel allein Savinase + Waschmittel Esperase + Waschmittel lytisches Enzym + Waschmittel lytisches Enzym + Savinase + Waschmittel lytisches Enzym + Esperase + Waschmittel

BEISPIEL IX

Mikroorganismen, die als Pathogene, Opportunisten, gewöhnliche Haut- und/oder Kleidungskontaminaten und/oder als durch Eiweiß-Lysozym schwierig zu lysierend bekannt sind, wurden als die Substratorganismen für lytisches Enzym aus Stamm G102-3 und lytisches Enzym aus Stamm D38-3 getestet. Übliche Haut - und/oder Kleidungskontaminaten wurden in unserem Labor isoliert und als NOVO 1, 8, 12, 13 bezeichnet. Ein Vergleich wurde angestellt zwischen der Wirkung von 1 mg/ml Eiweiß-Lysozym (Sigma) und derjenigen von 1 mg Lyophil aus Rohfermentationsbrühe/ml Reaktionsmischung. Wie in Tabelle VIII dargestellt, ist in den meisten Fällen von Stamm G102-3 produziertes lytisches Enzym sehr viel wirkungsvoller als das Eiweiß-Lysozym, wohingegen lytisches Enzym aus D38-3 als extrem potent gegenüber Pseudomonas aeruginosa-Zellen nachgewiesen ist. Tabelle VIII Substratorganismus lytisches Enzym aus G102-3 (% Lyse) lytisches Enzym aus D38-3 (% Lyse) Eiweiß-Lysozym (% Lyse) Lactobacillus plantarum (ATCC 8014) Micrococcus kristinae (ATCC 27570) Micrococcus sedentarius (ATCC 14392) Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) Streptococcus faecium (ATCC 8043) Staphylococcus aureus (ATCC 6538) Staphylococcus aureus (NOVO-1) Micrococcus epidermidis (NOVO-8) Micrococcus sp. (NOVO-12) Campylobacter fetus (ATCC 27374) Corynebacterium liquefaciens (ATCC 14929) Eschericia coli (ATCC 26) Klebsiella pneunoiniae (ATCC 13882) Legionella pneumophila (ATCC 33152) Listeria innocua Salmonella arizona (ATCC 12323) Streptococcus lactis (ATCC 11454) Vibrio parahaemolyticus (ATCC 35117)

BEISPIEL X

Das von Stamm G102-3 produzierte lytische Enzym wurde identifiziert als eine Mischung von Enzymen, nämlich N-Acetylmuramidase, Chitinase und Laminarinase, wohingegen das von Stamm D38-3 produzierte lytische Enzym Chitinase und Laminarinase enthielt.
Ihre individuelle Enzymaktivität aus Fermentationsbrühe von Beispiel I ist in Tabelle IX tabelliert. Tabelle IX G102-3-Enzym (u/l) D38-3-Enzym (u/l) N-Acetylmuramidase Chitinase Laminarinase

Claims

1. Eine bakteriolytische Enzymzubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein aus einem Nocardiopsis-Stamm gewinnbares bakteriolytiches Enzym umfaßt, daß sie die Fähigkeit hat, bakterielle Zellwände von Micrococcus sedentarius, Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus zu hydrolysieren daß sie einen optimalen pH in Bereich 5-8 hat, daß sie wenigstens 50% Aktivität im pH-Bereich 6,3-8,2 hat und daß sie eine optimale Temperatur im Bereich 40-60ºC hat.

2. Die Enzymzubereitung nach Anspruch 1, wobei der Nocardiopsis-Stamm ein Stamm von N. dassonvillei ist, vorzugsweise NRRL 18349, NRRL 18350 oder NRRL 18364.

3. Die Enzymzubereitung nach Anspruch 1 oder 2, die einen optimalen pH im Bereich 7-8 hat und eine Aktivität bei pH 9 hat, die wenigstens 80% der Aktivität bei pH 7,5 ist.

4. Die Enzymzubereitung nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, außerdem gekennzeichnet durch die Fähigkeit, bakterielle Zellwände von Micrococcus kristinae zu hydrolysieren.

5. Die Enzymzubereitung nach Anspruch 4, wobei der Nocardiopsis-Stamm N. dassonvillei NRRL 18349 ist.

6. Die Enzymzubereitung nach Anspruch 5, die ein lytisches Enzym mit einer relativen Molekülmasse von 24.000 bzw. 26.000 und einem isoelektrischen Punkt von 8,3 bzw. wenigstens 9,5 umfaßt.

7. Die Enzymzubereitung nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, die außerdem eine alkalische Bacillus-Protease umfaßt.

8. Die Mischenzymzubereitung nach Anspruch 7, die von 50.000 bis 1 Millionen Einheiten bakteriolytisches Enzym pro Gramm Zusatzstof f und von 0,5 bis etwa 3,0 Anson-Einheiten Protease pro Gramm Zusatzstoff umfaßt.

9. Die Enzymzubereitung nach irgendeinem vorangehenden Anspruch in der Form eines Waschmittelzusatzstoffes vorzugsweise in der Form eines nicht-staubenden Granulates oder einer stabilisierten Flüssigkeit.

10. Ein Verfahren zur Herstellung des bakteriolytischen Enzyms nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, welches Kultivieren eines ein bakteriolytisches Enzym produzierenden Stammes von Nocardionsis unter aeroben Bedingungen in einem Nährstoffmedium, das assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphorquellen enthält, und anschließendes Gewinnen des Enzyms aus der Kulturbrühe umfaßt.

11. Ein Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Stamm zu N. dassonvillei gehört.

12. Ein Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Stamm NRRL 18349, NRRL 18350, NRRL 18364 oder eine Mutante oder Variante derselben ist.

13. Eine biologisch reine Kultur eines Nocardiopsis-Stammes, der in der Lage ist, das bakteriolytische Enzym nach Anspruch 1, 3, 4 oder 6 zu produzieren.

14. Die Kultur nach Anspruch 13, wobei der Stamm zu N. dassonvillei gehört.

15. Eine Kultur nach Anspruch 14 von Stamm NRRL 18349, NRRL 18350, NRRL 18364 oder einer Mutanten oder Varianten derselben.

16. Eine Waschmittelzusammensetzung, die die bakteriolytische Enzymzubereitung nach einem der Ansprüche 1-9 umfaßt.

17. Eine Waschmittelzusammensetzung nach Anspruch 16, die 1000-20.000 Einheiten bakteriolytisches Enzym pro Gramm Waschmittel umfaßt.

18. Eine Waschmittelzusammensetzung nach Anspruch 16 oder 17, die außerdem 0,001 bis 0,5 Anson-Einheiten alkalische Bacillus-Protease pro Gramm Waschmittel umfaßt.

19. Verwendung der Enzymzubereitung nach einem der Ansprüche 1-9 zum Hydrolysieren bakterieller Zellwände.

20. Verwendung nach Anspruch 19 zur Verringerung der Zahl schädlicher Bakterien.

21. Verwendung nach Anspruch 20 als ein Nahrungsmittelkonservierungsstoff, zur Desinfektion bei der Nahrungsmittelverarbeitung, bei der Wasserbehandlung, bei der Desinfektion von Krankenhausinstrumenten oder zur Verringerung des Körpergeruchs von Kleidung.

22. Verwendung nach Anspruch 20 zur Verringerung des Körpergeruchs von Kleidung durch Waschen oder Spülen der Kleidung in einem Waschmittel enthaltenden Waschwasser oder in einem waschmittelfreien Spülwasser, das die Enzymzubereitung enthält.

23. Verwendung nach einem der Ansprüche 19-22, wobei das Wasch- oder Spülwasser 1000-20.000 Einheiten bakteriolytisches Enzym pro Liter enthält.

24. Verwendung nach einem der Ansprüche 19-23, wobei das Wasch- oder Spülwasser außerdem eine alkalische Bacillus-Protease umfaßt, vorzugsweise in einem Aktivitätsniveau von 0,02-0,15 Anson-Einheiten pro Liter.

25. Verwendung nach Anspruch 19 bei der Verarbeitung von bakterieller Zellmasse.

26. Verwendung nach Anspruch 25 bei der Behandlung von Aktivschlamm, bei der Protoplastenbildung oder bei der Gewinnung von intrazellulär sekretierten Verbindungen.

27. Ein Körperdeodorant, das die bakteriolytische Enzymzubereitung nach einem der Ansprüche 1-9 umfaßt.