DE10362020B4 - Testsystem zur Untersuchung der Biofilmhydrolyse - Google Patents

Abstract

Testsystem zur Untersuchung der Biofilmhydrolyse, dadurch gekennzeichnet, daß mit einer Mischpopulation aus repräsentativen, durch DNA-Analyse taxanomisch gruppierten Mikroorganismen, die in Haushaltsbiofilmen auftreten, ein Biofilm angezüchtet wird, der mit der jeweils zu untersuchenden Enzymzubereitung inkubiert wird und anschließend mit biochemischen und optischen Methoden auf die gegebenenfalls erfolgte Hydrolyse untersucht wird.

Description

• Die Erfindung betrifft ein Testsystem zur Untersuchung der Biofilmhydrolyse, bei dem aus repräsentativen, auch in Haushaltsbiofilmen auftretenden Mikroorganismen ein Biofilm gezüchtet wird, der anschließend dem auf seine Wirksamkeit hin zu untersuchenden enzymhaltigen Reinigungsmittel ausgesetzt wird.
• Als Biofilm bezeichnet man den Bewuchs von Oberflächen durch Mikroben und vor allem die von ihnen kollektiv abgegebene und sie umhüllende gallertartige Schutzschicht. Dieser Schleim ist gleichzeitig der Grund dafür, daß unter realen Bedingungen lebende Bakterien, wie auch andere Biofilme produzierende Mikroorganismen, wesentlich widerstandsfähiger gegenüber – auch biozidhaltigen – Reinigungsmitteln sind als Laborkulturen, die normalerweise aus einzelnen frei schwimmenden Bakterien, sog. planktonischen Zellen, bestehen. Biofilme führen in technischen Systemen zu massiven Beeinträchtigungen und können in der Medizin hartnäckige Infektionen hervorrufen, die gegenüber herkömmlichen Antibiotika weitgehend resistent sind. Im Haushalt sind die durch Biofilme hervorgerufenen Beeinträchtigungen sowohl hygienischer als auch ästhetischer Natur.
• Die Bekämpfung von Biofilmen durch Biozide ist nur bedingt möglich, da die größtenteils aus Polysacchariden bestehende Schleimmatrix die Zellen vor der Einwirkung der Biozide schützt (sog. Pseudoresistenz). Um überhaupt eine Wirkung zu erzielen, müßten die Biozide daher wesentlich höher dosiert eingesetzt werden, als es für eine vergleichbare Menge unassoziiert vorliegender Bakterien vonnöten wäre. Der Einsatz von Bioziden im Haushalt ist jedoch unter ökologischen Gesichtspunkten ungünstig, so daß die Bestrebungen eher dahin gehen, Reinigungsmittel mit nur geringen Konzentrationen oder völlig ohne Biozide bereitzustellen. Dies ließ sich jedoch bislang nicht mit dem Wunsch nach einer möglichst vollständigen Entfernung bakterieller Biofilme – und damit optimaler Hygiene – in Einklang bringen.
• Die europäische Patentschrift EP 946 207 B1 (entspr. WO 98/26807 A1 ) lehrt die enzymatische Behandlung von Biofilmen mit Kombinationen aus Hydrolasen, die zur Ablösung und Entfernung der Biofilme von der Oberfläche dienen, und Oxidoreductasen, die die enthaltenen Bakterien abtöten. Mit diesen Systemen werden harte Oberflächen aus den unterschiedlichsten Materialien in verschiedenen industriellen Bereichen, beispielsweise Kühltürmen, Molkereibetrieben oder Chemieanlagen, gereinigt und desinfiziert, aber auch weiche Oberflächen wie Haut, Haare oder Textilien.
• EP 388 115 A1 befaßt sich mit der Zerstörung und Entfernung von Schleim auf industriellen, wasserumspülten Oberflächen. Hierzu werden Glucanasen, Cellulasen, Amylasen und/oder Proteasen eingesetzt, die gezielt die Polysaccharide der Schleimmatrix zersetzen; anschließend sollen die nunmehr zugänglichen Mikroorganismen der Wirkung von Bioziden ausgesetzt werden.
• In der WO 01/09295 A1 werden Enzyme mit einer β-(1,6)-Endoglucanaseaktivität sowie entsprechende DNA-Sequenzen beansprucht, weiterhin eine Enzymzubereitung zum Abbau β-1,6-glucanhaltiger Materialien und ihre Verwendung. Die β-(1,6)-Endoglucanasen dienen auch zur Entfernung von Biofilmen von verschiedenen Oberflächen. Hauptsächlich befaßt sich diese spanische Schrift jedoch mit dem Abbau der β-1,6-glucanreichen Zellwand bestimmter Pilze.
• Auch die WO-Schrift 96/36569 A1 beschreibt eine enzymatische Methode zur Entfernung von Biofilmen. Hierbei wird eine Mannanase, gegebenenfalls in Kombination mit mindestens einem weiteren Enzym, eingesetzt, um in industriellen wasserführenden Systemen die Schleimbildung zu vermeiden und bestehenden Schleim zu entfernen. Gemäß WO 96/17632 A1 kann diese Aufgabe auch mit Kombinationen kurzkettiger Glykolkomponenten mit mindestens einem Enzym aus der Gruppe Polysaccharidasen, Proteasen, Lipasen und Glycoproteasen gelöst werden.
• Die internationale Anmeldung WO 01/53010 A1 lehrt ebenfalls einen enzymatischen Prozeß zur Entfernung von Biofilmen von verschiedenen mit Wasser oder wäßrigen Lösungen umspülten Oberflächen in industriellen Systemen sowie im medizinischen Bereich, wobei sich die Biofilme sowohl oberhalb der Wasseroberfläche, also an fest/flüssig/Luft-Grenzflächen, als auch unter Wasser, an fest/flüssig-Grenzflächen, befinden. Bei den eingesetzten Enzymen handelt es sich um Carbohydrasen oder Proteasen, Kombinationen aus diesen beiden Enzymen sind ebenfalls möglich. Gegebenenfalls kann die Reinigungslösung neben den genannten Enzymen weitere Aktivstoffe wie Korrosionsinhibitoren, Tenside, Biozide etc. enthalten.
• Die Wirksamkeit der in der Literatur beschriebenen Systeme wurde stets nur an Biofilmen getestet, die im Labor gezüchtet waren und nur von einigen wenigen ausgewählten Bakterienarten gebildet wurden, so daß diese Systeme nur bedingt auf reale Bedingungen übertragbar sind.
• Die Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein Testsystem bereitzustellen, welches die Überprüfung der Wirksamkeit von Reinigungsmitteln gegenüber Biofilmen auf harten Oberflächen in zuverlässiger und reproduzierbarer Weise ermöglicht.
• Die Zusammensetzung bakterieller Biofilme auf Haushaltsoberflächen ist bislang wenig erforscht worden; die wenigen Forschungsergebnisse erlauben auch keine Aussage über etwaige Unterschiede zwischen Biofilmen auf Flächen in der Industrie und in Privathaushalten. Entsprechend war auch die Beurteilung der Wirksamkeit eines Mittels problematisch und die Vergleichbarkeit einzelner Ergebnisse keineswegs immer gegeben.
• Daher wurden zunächst Versuche zur Charakterisierung von WC-Biofilmen unternommen. Anhand der erhaltenen Ergebnisse wurden dann Modellbiofilme aus mehreren Mikroorganismen gezüchtet, die die tatsächlichen Verhältnisse auf Haushaltsoberflächen genauer widerspiegeln als die bislang meist untersuchten Biofilme aus einzelnen im Labor verfügbaren Bakterienstämmen. Mit diesen Modellbiofilmen lag nun erstmals ein zuverlässiges Testsystem vor, welches zur Überprüfung der Wirksamkeit von Reinigungsmitteln mit oder ohne Biozide gegenüber Biofilmen auf harten Oberflächen im Haushalt geeignet ist.
• Diese Modellbiofilme wurden dann der Wirkung verschiedener Enzyme ausgesetzt, um den Abbau zu untersuchen; dabei wurde überraschend festgestellt, daß bereits die Wirkung der Polysaccharidasen und/oder der Proteasen ausreicht, um den Biofilm aufzubrechen und die Zellen abzulösen. Diese können dann einfach abgespült werden, so daß es im Gegensatz zu den im Stand der Technik beschriebenen Methoden zur Entfernung von Biofilmen keiner bakterientötenden Oxidoreductasen oder stärkeren Biozide bedarf. Es ist daher eine umweltschonende Methode zur Reinigung und Desinfektion vor allem feuchter, wasserumspülter Oberflächen im Haushalt zugänglich geworden.
• Zur Überprüfung der Wirksamkeit der Mittel gegenüber Biofilmen wurden nach einer detaillierten Untersuchung von WC-Biofilmen entsprechende Testsysteme aufgebaut. Bislang war im Gegensatz zu industriellen Systemen die Struktur von Biofilmen auf Haushaltsoberflächen wenig erforscht. Während Finch et al. (J. Appl. Bacteriology, 45, 357–364, 1978) überwiegend gram-positive Micrococci und Bacilli im und am WC fanden, wurden von Scott et al. (J. Hygiene, 89, 279–293, 1982) überwiegend gram-negative Enterobacterien, daneben vereinzelt Pseudomonaden und Staphylococcen, bei ihrer Untersuchung des Hygienestatus von 250 Haushalten gefunden. Beide Untersuchungen bezogen sich jedoch weder thematisch noch durch die Art der Probenahme speziell auf die Haushaltsbiofilmen zugrundeliegenden Mikroorganismen. Mit einem anderen Probenahmesystem konnten Pitts et al. (Biofouling, 13, 19–30, 1998) in 3 Haushalten 50 verschiedene mikrobielle Isolate nachweisen, von denen einige gram-negativ waren (hierbei handelte es sich vor allem um Pseudomonaden), andere gram-positiv, einige konnten zudem nicht charakterisiert werden.
• Da also die Zusammensetzung bakterieller Biofilme auf Haushaltsoberflächen bislang wenig erforscht war und die wenigen Forschungsergebnisse auch keine Aussage über etwaige Unterschiede zwischen Biofilmen auf Flächen in der Industrie und in Privathaushalten erlaubten, wurden zunächst Versuche zur Charakterisierung von WC-Biofilmen unternommen. Anhand der erhaltenen Ergebnisse wurden dann Modellbiofilme aus mehreren Mikroorganismen gezüchtet, die die tatsächlichen Verhältnisse auf Haushaltsoberflächen genauer widerspiegeln als die bislang meist untersuchten Biofilme aus einzelnen im Labor verfügbaren Bakterienstämmen. Diese Modellbiofilme wurden dann der Wirkung verschiedener Enzyme ausgesetzt.
• Charakterisierung von WC-Biofilmen
• Die Probenahme erfolgte durch mechanische Entfernung des Belags, der sich unter dem Toilettenrand befand, an verschiedenen WC-Standorten. Aus der Biomasse wurde die DNA direkt nach einer Standardmethode extrahiert (DNA Tissue Kit der Firma Qiagen, Hilden). Die vorliegenden 16 S-RNA-Genfragmente wurden mittels PCR-Methoden unter Einsatz zweier spezifischer Primer (mt12S/1: GTG GAT CCA GGA TTA GAT ACC C; SSU2: ACT GGT ACC TTG TTA CGA CTT) amplifiziert und in den Vektor pGEM-Teasy (Firma Promega) kloniert. Die Sequenzierung der Fragmente einzelner Klone erfolgte nach Standardmethoden.
• Die Identifizierung der Keime erfolgte nach Abgleich mit der Sequenzdatenbank BLAST N2.2.1. Die gefundenen Isolate sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1: Keime aus Haushaltstoiletten

  	Organismen	Accession number	Identität (bp)	Identität (%)	Standort	Taxonomie
  1	Nitrosomonas spec.	AF272418	387/392	98	1	β-Proteobakterien
  2	Aeromicrobium erythreum	AF005021	471/484	97	1	Actinobakterien
  3	Agrobacterium sanguineum	AB021493	460/462	99	1	α-Proteobakterien
  	α-Proteobacterium	APR271042	460/462	99
  	Porphyrobacter neustonensis	AB033327	460/462	99
  4	Rhodanobacter lindanoclasticus	AF039167	464/466	99	1	γ-Proteobakterien
  5	Rhodanobacter lindanoclasticus	AF039167	461/463	99	1	γ-Proteobakterien
  6	Cellulomonas cellasea	X79459	452/464	97	1	Actinobakterien
  7	Unidentified bacterium wb 1	AF317774	458/462	99	1	α-Proteobakterien
  	Mesorhizobium sp. USDA 4003	AF282929	458/462	99
  	Rhizobium sp. CJ15	U50168	458/462	99
  8	Knoellina sinensis	AJ294413	458/463	98	1	Actinobakterien
  9	Uncultured bacterium GKS2-106	AJ290025	433/460	94	1	CFB
  10	Uncultured sludge bacterium S6	AF234751	437/461	94	1	Grampositive
  11	Uncultured eubacterium WD2106	AJ292671	463/464	99	1	β-Proteobakterien
  	Uncultured eubacterium WD2109	AJ292646	463/464	99
  	Uncultured eubacterium WD289	AJ292645	463/464	99
  12	Dermacoccus nishinomiyaensis	X87757	447/460	97	1	Actinobakterien
  13	Unidentified bacterium wb1_I18	AF317774	460/460	100	1	α-Proteobakterien
  	α-Proteobacterium ,Mena 25/4-1'	Y11584	460/460	100
  14	Brachybacterium tyrofermentans	X91657	451/460	98	1	Actinobakterien
  15	Brevundimonas sp.	AJ227800	472/473	99	2	α-Proteobakterien
  	Brevundimonas vesicularis	AJ227780	472/473	99
  16	Afipia genosp. 9 strain G8993	U87780	464/464	100	2	α-Proteobakterien
  	Afipia genosp. 9 strain G8990	U87779	464/464	100
  17	Bradyrhizobium japonicum strain USDA 59	AF293378	469/479	97	2	α-Proteobakterien
  	Rhodopseudomonas sp. g-c	AF123086	469/479	97
  	Afipia genosp. 4 strain G7812	U87770	469/479	97
  18	Stenotrophomonas sp. BO	AF156709	466/472	98	2	γ-Proteobakterien
  19	Bradyrhizobium japonicum strain USDA 59	AF293378	468/479	97	2	α-Proteobakterien
  	Rhodopseudomonas sp. g-c	AF123086	468/479	97
  	Afipia genosp. 4 strain G7812	U87770	468/479	97
  20	Xanthomonas campestris	AF290420	385/387	99	2	γ-Proteobakterien
  	Xanthomonas albinileans	X95918	385/387	99
  21	Caulobacter spec.	AF245033	410/421	97	2	α-Proteobakterien
  22	α-Proteobacterium MBIC1549	AB017110	470/490	95	2	α-Proteobakterien
  23	Sphingobacterium mizutae	M58796	437/446	97	2	CFB
  24	Sphingobacterium mizutae	D14024	447/460	97	2	CFB
  25	Leucobacter komagatae	D45063	451/463	97	2	Actinobakterien
  26	Stenotrophomonas maltophila Isolat VUN 10,075	AF100733	461/461	100	2	γ-Proteobakterien
  27	Pseudomonas pavonaceae	D84019	463/463	100	2	γ-Proteobakterien

  (Angegeben ist jeweils der nächstähnliche Datenbankeintrag)
• Aus dieser Tabelle geht hervor, daß die Diversität sehr groß war. Es wurden an beiden Standorten Vertreter aus fast allen taxonomischen Gruppen nachgewiesen.
• Dabei wurden lediglich zwei Isolate doppelt gefunden. Die taxonomische Zuordnung der Isolate ergab sich wie folgt:

  α-Proteobacterien:	9
  β-Proteobacterien:	2
  γ-Proteobacterien:	6
  CFB-Gruppe:	3
  Actinobakterien (Gram-positive):	7

• Aufbau des Testsystems
• Basierend auf der Erkenntnis, daß Haushalts- und WC-Biofilme offenbar nicht überwiegend aus Enterobakterien bestehen, sondern vielmehr eine breite Diversität bezüglich der Mikroorganismen aufweisen, wurde ein Biofilmtestsystem aufgebaut, das Vertreter aller taxonomisch relevanten Gruppen enthalten sollte. Dabei wurden möglichst Organismen verwendet, die als gute Biofilmbildner auftreten und zudem in definierter Form von Stammsammlungen bezogen werden können. So wurden Modellbiofilme mit einer Mischpopulation angezogen, bestehend aus:

  Dermacoccus nishinomiyaensis	DSM Nr. 20448	(Actinobacterium)
  Bradyrhizobium japonicum	DSM Nr. 1982	(α-Proteobacterium)
  Aquabacterium commune	DSM Nr. 11901	(β-Proteobacterium)
  Xanthomonas campestris	DSM Nr. 1526	(γ-Proteobacterium)

  (DSM: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)
• Anzucht der Stämme:
• D. nishinomiyaensis, B. japonicum und X. campestris wurden in 50 ml Flüssigkultur (pro Liter 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl) bei 30°C und 150 rpm für 16 h inkubiert.
• Angeimpft wurde mit einer Einzelkolonie von einer Agarplatte (pro Liter 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 10 g Agarose).
• A. commune wächst in 50 ml CASO-Medium (Merck) (pro Liter 17 g Pepton aus Casein, 3 g Pepton aus Soja, 5 g NaCl, 2,5 g D(+)-Glucose, 2,5 g di-Kaliumhydrogenphosphat), das 1:10 mit DGHM-Wasser (Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie, DIN 10511 (5,3 ml 6,71% CaCl₂·2H₂O-Lösung, 1,52 ml 10% MgSO₄·7H₂O-Lösung, 1000 ml H₂O_bidest)) verdünnt wurde (Inkubation 2 Tage bei 28°C, 100 rpm). Angeimpft wurde mit einer Einzelkolonie von Plate Count-Agar.
• Die optische Dichte (600 nm) der Kulturen nach 16 h betrug:

  Dermacoccus nishinomiyaensis	7,2
  Bradyrhizobium japonicum	6,6
  Aquabacterium commune	0,33
  Xanthomonas campestris	2,5

• Anschließend wurden die Kulturen zusammengegeben, gemischt und mit 50% sterilem Glycerin versetzt, so daß die Endkonzentration 10% Glycerin betrug. Der Kultur-Mix wurde portioniert und bei –20°C eingefroren.
• Die Anzucht des Biofilms erfolgte in 48 well-Mikrotiterplatten.
• Je 750 μl TBY-Medium wurden mit je 75 μl der wie oben zubereiteten Mischung aus Biofilm produzierenden Kulturen pro well versetzt, die Platten wurden mit Airpore-Sheets (Qiagen) und Kunststoffdeckel verschlossen. Anschließend wurde bei 30°C und 60 rpm für 66 h inkubiert, der Überstand vorsichtig abgesaugt und die Platten bei Raumtemperatur mindestens 24 h getrocknet.
• Diese Platten dienten als Substrat für die Untersuchung der enzymatischen Hydrolyse.
• Hydrolyse von Biofilmen
• Die Abkürzungen „M” und „mM” stehen im Folgenden für die Einheiten mol/l bzw. mmol/l, bezeichnen also Molaritäten; die Bezeichnung „Unit” steht für „Einheit”. Die Abkürzung „Uhb” steht für „Protease-Einheit”.
• Nach der Trocknung wurde der Biofilm mit der enzymhaltigen Lösung inkubiert. Es wurden je 1 ml pro well bei einer Konzentration von 2,5 mg/ml bzw. 50 μl/ml bei Flüssigenzymen eingesetzt. Die Inkubation erfolgte bei 30°C und 450 rpm für 16 h entweder bei pH 4 (62 ml 0,1 M Citronensäure, 38 ml 0,2 M Na₂HPO₄·2H₂O, 0,02% NaN₃) oder bei pH 7,4 (1 × PBS (Phosphate Buffered Saline, Gibco)) (pro Liter 0,21 g KH₂PO₄, 9,00 g NaCl, 0,726 g Na₂HPO₄·7H₂O, 0,02% NaN₃). Danach wurde der Überstand abgesaugt und einmal mit PBS pH 7,4 gewaschen. Nach dem Anfärben mit einer 0,01%igen Lösung von Safranin O (15 Minuten bei Raumtemperatur) wurde der Überstand erneut abgesaugt. Der Farbstoff wurde daraufhin 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln (600 rpm) in Dimethylsulfoxid extrahiert; eine Extinktionsmessung erfolgte in der Mikrotiterplatte bei 492 nm.
• Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Angegeben sind die Extinktion E nach Inkubation eines Biofilms mit einem Enzym (E_Ink), die Extinktion bei einer Referenzplatte ohne Enzymbehandlung (E_Ref) und die prozentuale Entfernung des Biofilms bei den verschiedenen Enzymen. Bei pH 4 wurden Biofilmablösungen im Bereich von 9 bis 70% beobachtet, bei pH 7,4 wurden 11 bis 62% der Biofilme entfernt.
• Bei den eingesetzten Enzymen handelte es sich um die folgenden: (Angegeben sind die Einsatzmengen pro ml Inkubationslösung. Die Angabe der Units bezieht sich auf die jeweiligen Herstellerangaben.)
  Corolase^® PN-L (saure Protease, AB Enzymes, vormals Röhm Enzyme; E. C. 3.4.21.63) Einsatz je ml: 15 Uhb
  Dextranase 3F (ASA Enzyme; E. C. 3.2.1.11), Einsatz je ml: 1500 Units
  Cellulase aus A. niger (Sigma C1184, E. C. 3.2.1.4) Einsatz je ml: 1.25 Units
  Acid Xylanase P (AB Enzymes, E. C. 3.2.1.8) Einsatz je ml: 304 kUnits
  Econase BG 300 (β-Glucanase, AB Enzymes, E. C. 3.2.1.6.) Einsatz je ml: 15 kUnits Tabelle 2: Entfernung von Biofilmen durch Enzyme

  	pH 4			pH 7,4
  Enzym	EInk	ERef	Biofilmentfernung [%]	EInk	ERef	Biofilmentfernung [%]
  Corolase	0,885	1,343	34,1	0,453	1,210	62,6
  Dextranase	1,195	1,311	8,8	0,877	1,144	23,3
  Cellulase	1,237	1,366	9,4	1,027	1,154	11,0
  Glucanase	0,656	1,414	53,6	0,493	0,863	42,9
  Xylanase	0,406	1,375	70,5	0,923	1,164	20,7

• Als besonders vorteilhaft erwiesen sich die Xylanase und die Glucanase bei pH 4 sowie die Corolase und wiederum die Glucanase bei pH 7,4
• Eine weitere Steigerung läßt sich durch eine Kombination aus verschiedenen Enzymaktivitäten erzielen. Dabei können einerseits einzelne Enzyme gezielt miteinander gemischt werden, wodurch sich teilweise deutliche Leistungssteigerungen erzielen lassen, andererseits sind aber auch kommerziell erhältliche Enzymgemische für den erfindungsgemäßen Einsatz geeignet. Beispielhaft sei hier das von der Firma Novozyme angebotene Viscozyme^® genannt, eine flüssige Enzymzubereitung aus Aspergillus sp., die aus verschiedenen Polysaccharidasen zusammengesetzt ist, u. a. aus Arabanase, Cellulase, β-Glucanase, Hemicellulase und Xylanase.
• Untersuchung zur Stabilität in WC-Reinigerformulierungen
• Es wurden verschiedene Reinigungsmittel hergestellt, die Enzyme zur Biofilmentfernung enthielten. (Angabe in % (w/v), Ausnahme gekennzeichnet)

  Rezeptur	E1	E2	E3	E4	E5
  C8-10-Alkylpolyglucosid, DP 1,5	3,00%	3,00%	1,20%	3,50%	3,00%
  C12-14-Fettalkoholsulfat-Na	-	-	1,00%	2,50%	-
  Natriumcitrat	-	-	1,60%	1,10%	-
  Citronensäure·1H2O	3,00%	-	3,00%	4,60%	-
  Ethanol	-	-	-	0,50%	-
  Milchsäure	-	3,00%	-	-	1,60%
  Salicylsäure	-	-	0,2%	-	-
  Ameisensäure	-	-	-	-	0,35%
  Natriumformiat	-	-	-	-	2,04%
  Xanthan Gum	-	-	0,25%	0,25%	-
  Parfüm	0,3	0,3%	0,40%	0,30%	0,30%
  Farbstoff	0,012%	0,012%	< 0,01%	< 0,001%	-
  Natriumhydroxid	0,83%	0,81%	-	-	1,20%
  Isobutan Propan n-Butan	-	-	4,30% 1,40% 0,30%	-	-
  flüssige Enzymzubereitung (Corolase PN-L, 250 Uhb/g)) (in % v/v)	2,5%	2,5%	2,5%	2,5%	2,5%
  Wasser	Ad 100%	ad 100%	ad 100%	ad 100%	ad 100%
  pH-Wert	4,2	4,2	3,4	3,0	3,8

• Dabei handelte es sich bei E1 und E2 um flüssige WC-Reiniger, bei E3 um einen WC-Reiniger in Aerosolform, bei E4 um ein Badreiniger-Konzentrat und bei E5 um einen Badreiniger zur Dosierung mit einer Schaumpistole. Alle zeigten eine gute Reinigungsleistung und insbesondere eine gute Biofilmablösung.
• Die Stabilität des Enzyms in der Reinigerformulierung wurde folgendermaßen bestimmt:
  Zur Kontrolle wurde das Enzym einem 100 mM Na-Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) in einer Konzentration von 2,5% zugesetzt. Die Reinigerformulierungen bzw. Kontrolllösung wurden für jeweils 10 bzw. 30 Minuten bei 40°C inkubiert. Je 1 μl der Proben wurden anschließend im Aktivitätstest nach Del Mar et al. (Del Mar et al, 1979, Anal. Biochem. 99, 316–320) unter Verwendung des synthetischen Substrates AAPF (Ala-Ala-Pro-Phe-Nitroanilid) eingesetzt und die Aktivität gemessen in μmol/ml·min bestimmt: Tabelle 3: Stabilität von Corolase in Reinigern (Angaben in μmol/ml·min)

  	10 min, 40°C	30 min, 40°C
  Phosphatpuffer	607 ± 1,4	612 ± 24,2
  E1	587 ± 29,9	460 ± 12,6
  E2	545 ± 91,5	516 ± 76,9

Claims (2)

1. Testsystem zur Untersuchung der Biofilmhydrolyse, dadurch gekennzeichnet, daß mit einer Mischpopulation aus repräsentativen, durch DNA-Analyse taxanomisch gruppierten Mikroorganismen, die in Haushaltsbiofilmen auftreten, ein Biofilm angezüchtet wird, der mit der jeweils zu untersuchenden Enzymzubereitung inkubiert wird und anschließend mit biochemischen und optischen Methoden auf die gegebenenfalls erfolgte Hydrolyse untersucht wird.
2. Testsystem gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es einen oder mehrere Organismen der Gattungen Dermacoccus, Bradyrhizobium, Aquabacterium und Xanthomonas, insbesondere der Species Dermacoccus nishinomiyaensis, Bradyrhizobium japonicum, Aquabacterium commune und Xanthomonas campestris enthält.