DE69015964T2

DE69015964T2 - Verfahren und Zusammensetzungen, die bestimmte Lysozyme und Endoglycosidase verwenden.

Info

Publication number: DE69015964T2
Application number: DE69015964T
Authority: DE
Inventors: Richard Shepard Carpenter; Ann Margaret Wolff
Original assignee: Procter and Gamble Co
Current assignee: Procter and Gamble Co
Priority date: 1989-10-27
Filing date: 1990-10-16
Publication date: 1995-08-17
Anticipated expiration: 2010-10-17
Also published as: AU650431B2; DE69015964D1; US5041236A; AU6559690A; MX173541B; EP0425019A1; EP0425019B1; CA2028560A1; CN1051299A; JPH03169806A; CA2028560C; NZ235851A; JP2922282B2; ES2066111T3; MY130047A; BR9005448A; PH26918A; KR910008121A

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft antimikrobielle Zusammensetzungen und Verfahren, die Wiederkäuermagen-Lysozym und bestimmte Endoglycosidasen verwenden. Insbesondere betrifft sie antimikrobielle Zusammensetzungen und Verfahren für die Zerstörung oder Entfernung von Mikroben durch die Behandlung mit antimikrobiellen Zusammensetzungen, die Wiederkäuermagen-Lysozym und Endo-β-N-acetylglucosaminidase oder Endoglycopeptidase umfassen.

Hintergrund der Erfindung

Lysozym ist ein Mucopeptid-Glycohydrolaseenzym, das 1,4-B-Bindungen zwischen N-Acetylmuraminsäure und N-Acetylglucosamin hydrolysiert und das auf diese Weise die Zellwände bestimmter Mikroben zerstört. Im Handel erhältliches Lysozym wurde zum Beispiel in Zahnputzmittel, Kaugummis und Kontaktlinsenreiniger verwendet.
Wiederkäuermagen-Lysozym ist ein Lysozym, das für die Magenschleimhaut von Säugem mit Vorderdarm charakteristisch ist. Es wird offensichtlich nicht häufig kommerziell verwendet. Endo-β-N-acetylglucosaminidasen wurden im allgemeinen als analytische Instrumente für die Strukturanalyse von Kohlenhydraten und/oder von Glycoproteinen verwendet. Wir stellten fest, daß die antimikrobielle Wirksamkeit von Wiederkäuermagen-Lysozym plus Endo-β-N-acetylglucosaminidase und/oder Endoglycopeptidase größer ist als die antimikrobielle Wirksamkeit jedes Enzyms allein.
Die Verwendung von Lysozym in Gemischen zur Anwendung als Bakteriostatika wurde bei Zahnspülungen erwähnt (US-Patent 4,355,022, Rabussay, erteilt am 19. Oktober 1982). Rabussay offenbart ein Verfahren zur Entfernung von Plaque und Zahnstein, umfassend die Anwendung einer Lysozym-enthaltenden Lösung (0,1 ml/mg) und wahlweise auch die Anwendung von Lipasen, Phospholipasen, Carbohydrasen und/oder Proteasen. Ein das Gemisch umfassendes Zahnbehandlungsmittel wird ebenfalls durch Rabussay offenbart. Die Carbohydrase ist eine allgemeine Klasse von Enzymen, zu der die Endoglycosidase gehort.
Das Australische Patent 8548514 von Neeser, 1. Mai 1986, offenbart eine antibakterielle Zusammensetzung, die ein Glycopeptid (I) und/oder ein Oligosaccharid enthalt. Bei der Herstellung wird ein Glykoprotein (A), das von Pflanzen stammt, mit einem proteolytischen Enzym gespalten, dann wird das Glycopeptidprodukt wahlweise durch die Behandlung mit Endo-β-N-acetylglucosaminidase-H in Oligosaccharide umgewandelt. Das Produkt kann dann mit einer Exo-α-Mannosidase gespalten werden, wobei vorzugsweise die α-1-2-Bindungen zwischen den Mannoseresten gespalten werden. Es wird beansprucht, daß das isolierte Glycopeptid (I) gegen pathogene Bakterien mit Fimbrien des Typs I wirksam ist (z.B. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium oder Shigella flexneri).
Das Japanische Patent 62 044 180, offengelegt am 26. Februar 1987, offenbart eine Endo- β-N-acetylglucosaminidase (I), die mit der N,N'-Diacetylchitobiose-Struktur des Asparagin-gebundenen Zuckers des Glykoproteins reagiert, wobei die β-4-Bindung von N- Acetylglucosamin hydrolysiert und das Oligosaccharid aus dem Glycoprotein isoliert wird. Sie weist eine solche Substratspezifität auf, daß (I) mit einer komplexen Mannoseart oder mit einer Mischart der Asparagin-gebundenen Saccharinketten und mit angelagerten Produkten reagiert. Das Enzym wird aus Canavalia gladiata DC gewonnen. Es ist für die Erforschung der biologischen Aktivität der Zuckerkettenanteile der Glycoproteine nützlich. Jedoch wurde eine Steigerung der Wiederkäuermagen-Lysozm-Wirkung durch die Endoglcosidasewirkung nicht beschrieben.
Drei gleichzeitig anhängige US-Patentanmeldungen, die am gleichen Tag wie diese Patentanmeldung eingereicht wurden, beschreiben Verfahren und Formulierungen, die Endoglycosidasen vom Typ II umfassen, eine Gruppe, welche die vorliegenden Endoglycosidasen einschließt. Die erste gleichzeitig anhängige Patentanmeldung mit dem Titel "Method and Formulation Employing Type II Endoglycosidase", deren Erfinder R.S. Carpenter, A.M. Wolff, P.J. Lad und I.J. Goldstein sind, beschreibt Typ II-Endoglycosidasen für die Entfernung von Glykosid-enthaltenden Substanzen. Die zweite gleichzeitig anhängige Patentanmeldung mit dem Titel "Method Employing Type II Endoglycosidase", deren Erfinder R.S. Carpenter, A.M. Wolff und P.J. Lad sind, beschreibt Typ II- Endoglycosidasen für die Entfernung von Mikroorganismen. Die dritte gleichzeitig anhängige Patentanmeldung mit dem Titel "Antimicrobial Method and Formulation Employing Type II Endoglycosidase and Antimicrobial Agent", deren Erfinder R.S. Carpenter, A.M. Wolff und P.J. Lad sind, beschreibt die Kombination von Typ II-Endoglycosidasen und antimikrobiellen Mitteln. Die vorliegende Patentanmeldung beschreibt einen exemplarischen Vorteil, der sich aus der Kombination von Wiederkäuermagen- Lysozym mit Endo-β-N-acetylglucosaminidase und/oder Endoglycopeptidase ergibt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung stellt antimikrobielle Zusammensetzungen vor, die Endo-β-N-acetylglucosaminidase und/oder Endoglycopeptidase sowie Wiederkäuermagen-Lysozym umfassen. Bevorzugt werden Endo-H, -D oder -F und PNGase F oder A. Ein besonders bevorzugtes Lysozym ist Rinder-Lysozym, das über die Hefe Pichia pastoris gentechnisch hergestellt wurde. Es wird bevorzugt, daß die Zusammensetzungen ein Waschmitteltensid umfassen. Verfahren zur Zerstörung und/oder Entfernung von Mikroben durch die Behandlung mit Endo-β-N-acetylglucosaminidase und/oder Endoglycopeptidase sowie Wiederkäuermagen-Lysozym sind ebenfalls eingeschlossen.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Kombination von Wiederkäuermagen-Lysozym mit bestimmten Endoglycosidasen für die überraschende Wirksamkeit gegen Mikroben. Antimikrobielle Zusammensetzungen und Verfahren, welche die Kombination verwenden, sind eingeschlossen.

A. Endoglycosidasen

Endoglycosidasen sind Glycohydrolaseenzyme, die innere glycosidische Bindungen in einem Substrat spalten. Die hier verwendeten Endoglycosidasen stammen aus zwei der drei Hauptgruppen der gegenwärtig bekannten Endoglycosidasen. Die hier bevorzugte erste Gruppe ist die Endo-β-N-acetylglucosaminidase, die spezifisch ist für Di- N-acetylchitobioseeinheiten im Kern von Asparagin ("Asn")-gebundenen Oligosaccharidketten. Vgl. Thotakura N.R. et al., "Enzymatic Deglycosylation of Glycoproteins", Methods in Enzymology, Bd. 138, 350-359. Die bekannten Endo-β-N-acetylglucosaminidasen schließen Endo-D aus Diplococcus pneumoniae, Endo-H aus Streptomyces griseus und Endo-F aus Flavobacterium meningosepticum ein. Endo-H wurde auch in Eschericha coli (Robbins P.W. et al., Journal of Biological Chemistry, Bd. 259 (1984), 7517) und Bacillus kloniert.
Die hier verwendete zweite Gruppe ist die Endoglycopeptidase, bezeichnet als N-Glycosidase oder Glycopetidase oder Peptid-N-glycosidase. Diese hydrolysiert N-Acetylglucosaminylasparagin-Bindungen. Die PNGase-Enzyme sind Endoglycopeptidasen. Die andere Endoglycopeptidaseart, Peptid-O-Glycosidase (Endo-N-acetyl-α- D-galactosaminidase aus D. pneumoniae), die N-Acetylgalactosaminylserin/threonin-Bindungen spaltet, weist engere Substratspezifitäten auf und ist hier nicht von Interesse.
Die besonders nützlichen PNGasen, die hier verwendet werden, sind PNGase A aus Mandelemulsin und PNGase F aus Flavobacterium meningosepticum. Diese wurden aber erst kürzlich isoliert und charakterisiert. Vgl. vorstehend Methods in Enzymology, Bd. 138, 351.
Die dritte Hauptgruppe der Endoglycosidasen ist die Endo-β-N-galactosidase aus Diplococcus pneumoniae, die galactosidische Bindungen in prosthetischen Gruppen von Oligosacchariden des Poly(N-acetyl-galactosamin)-Typs hydrolysiert. Vgl. vorstehend Methods in Enzymology, Bd. 138, 351. Weder diese noch Exo-Glycosidasen, die eher äußere als innere glycosidische Bindungen spalten, sind hier von Interesse.
Endo-β-N-acetylglucosaminidase und/oder Endoglycopeptidase ist die erste Komponente der vorliegenden Zusammensetzungen. Hier werden Endo-H, Endo-D, Endo-F, PNGase A und PNGase F bevorzugt verwendet. Stärker bevorzugt werden Endo-H, Endo-F und PNGase F. Besonders bevorzugt wird Endo-H.
Obwohl die unmittelbar vorstehend genannten Endoglycosidasen in gereinigter Form im Handel erhältlich sind, wurden sie in der Vergangenheit meistens in akademischen Studien verwendet. Endo-β-N-acetylglucosaminidasen wurden zur Definition von Strukturmerkmalen der Kohlehydratketten von Glycoproteinen verwendet. Vgl. Hughes R.C., The Glycoproteins (1983), 24. Sie waren bisher im allgemeinen praktisch nicht in großen Mengen verfugbar und werden in Verbraucherprodukten nicht verwendet.
Endo-H, Endo-F, Endo-D und PNGase F können von Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianaplois, IN, bezogen werden. Endo-H, das ein pH-Optimum von 5,0 aufweist, "hydrolysiert Glycoproteine und Glycopeptide mit einer sehr hohen Glyconspezifizität, dies erfordert das Tetrasaccharid Man α1 -- > 3 Man α1 -- > 6 Man β1 -- > 4 GlcNAc (der α-Mannosylrest am nicht-reduzierenden Ende kann an der C-2-Position durch andere Zucker substituiert werden), und mit einer höheren Glyconspezifizität als das D-Enzym. Es hydrolysiert die Zuckerketten mit N-Acetylglucosamin, N-Acetylglucosaminit und GlcNA -- > Asn, wie Aglyconeinheiten, aber es kann nicht auf jene mit Fuc α1 -- > 6 GlcNAc und Fuc α1 -- > 6 GlcNAc -- > Asn" einwirken." Biochemica Information (1987), Boehringer Mannheim, unter "Endo-H". Endo-H, kloniert von S. plicatus aus S. lividans, mit einem pH-Optimum zwischen 5,0 und 7,5 sowie mit der gleichen Substratspezifität wie vorstehend beschrieben, ist ebenfalls im Handel erhältlich.
Endo-D, das ein pH-Optimum von 6,5 aufweist, "hydrolysiert Glycoproteine und Glycopeptide mit einer sehr hohen Glyconspezifität, dies erfordert das Trisaccharid Man α1 -- > 3 Man β1 -- > 4 GlcNAc (der Mannosylrest am nicht-reduzierenden Ende sollte nicht durch andere Zucker substituiert sein), und mit einer eher breiten Aglyconspezifität, d.h. es hydrolysiert Zuckerketten, die auch an N-Acetylglucosamin, Fuc α1 -- > 6 GlcNAc, GlcNAc -- > Asn und Fuc α1 -- > 6 GlcNAc -- > Asn gebunden sind." Biochemica Information (1987), Boehringer Mannheim, unter "Endo-D".
Endo-F, das ein pH-Optimum von 5,0 aufweist, "spaltet N-Glycane innerhalb der Chitobiose, wobei ein Molekül N-Acetyl-glucosamin am Asparagin verbleibt. Es spaltet insbesondere N-Glycane 'komplexer Mannose'-Arten. Es spaltet mit einer viel niedrigen Rate auch einige 'Hybride' und komplexe zweifach verzweigte N-Glycane. Drei- und vierfach verzweigte komplexe N-Glycane werden nicht gespalten". Biochemica Information (1987), Boehringer Mannheim, unter "Endo-F".
Endo-F ist auch als ein Gemisch mit PNGase F erhältlich. Bei diesem Gemisch "werden die Enzymaktivitäten durch den pH-Wert kontrolliert". Bei pH 4,0 ist nur die Endo-F- Aktivität "wirksam, wobei ein Octapeptid-GlcNAc und ein Oligosaccharid-GlcNAc aus Eieralbumin freigesetzt werden. Bei pH 9,3 erfolgt die Spaltung überwiegend durch das Peptid N-Glycosidase F an der Glycosylaminbindung, wobei ein Octapeptid und ein Oligosaccharid-GlcNAc-GlcNAc freigesetzt wird. Dieses letztere Oligosaccharid wird dann durch Endo-F zu Oligosaccharid-GlcNAc plus GlcNAc hydrolysiert." Biochemica Information (1987), Boehringer Mannheim, unter "Endo-F".
PNGase F, mit einem pH-Optimum zwischen 5,0 und 7,0, hydrolysiert "N-Glycanarten zwischen Asparagin und der Kohlehydrateinheit, so daß sowohl Amino- als auch Carboxylgruppen in der Peptidbindung vorliegen". Vgl. Biochemica Information (1987), Boehringer Mannheim, unter "PNGase F".
Gemäß Thotakura et al., Methods in Enzymology, Bd. 138, 354-355, liegt das pH- Optimum für Endo-H, Endo-F und PNGase A zwischen 4 und 5, während das Optimum für PNGase F etwa 8,5 ist. Sie stellten fest, daß Zitrat die PNGase F-Aktivität vollständig hemmt, daß nicht-ionische Detergentien diese Endoglycosidasen stabilisieren und daß die PNGasen A und F ähnliche Substratspezifitäten aufweisen, obwohl PNGase F offensichtlich wirksamer ist.
Sowohl Endo-H als auch Endo-F spaltet komplexe Mannosestrukturen. Endo-F kann auch zweifach verzweigte komplexe Strukturen bei einer niedrigeren Rate spalten, aber es spaltet keine Oligosaccharidketten mit einem in zwei Teile geteilten β-1,4-N-Acetylglucosamin. Methods in Enzymology, Bd. 138, 355.
Das Substrat für Endo-H und -F ist:
Die Spaltstelle wird durch den Pfeil angezeigt. GlcNAc bedeutet N-Acetylglukuronsäure.
Es wurde berichtet, daß Endo-H Lipid-gebundene Oligosaccharide (Chalifour R.J. et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, Bd. 229 (1983), 386-394) und Di-N-Acetylchitobiose-Bindungen in Oligosacchariden und Glycoproteinen spaltet (Tarenton A.L. et al., Journal of Biological Chemistry, Bd. 249 (1974), 811-817).
Das Substrat für PNGase F ist:
Die Spaltstelle wird durch den Pfeil angezeigt. Die PNGasen F und A können höhere Mannosestrukturen oder komplexe vielfach verzweigte Oligosaccharidketten spalten, einschließlich zwei- oder vierfach verzweigten Strukturen, ausgenommen, wenn sie sich an den Amino- oder Carboxyenden befinden. Methods in Enzymoloy, Bd. 138, 355. PNGase F benötigt mindestens einen Di-N-acetylchitobiose-Kern. Laemmli U.K., Nature, Bd. 227 (1970), 680.
Die Konzentration der Endoglycosidase und die Dauer der Inkubationszeit, die für die Deglycosylierung notwendig ist, ist von der Art des Substrats abhängig.
Für die erfindungsgemäßen Endoglycosidasen wurde jüngst gezeigt, daß sie Glycosidenthaltende Substanzen entfernen und Mikroorganismen, insbesondere Pilze, auf Oberflächen zerstören und/oder entfernen sowie zusammen mit anderen antimikrobiellen Mitteln einen überraschenden Vorteil bieten.

B. Wiederkäuermagen-Lysozym

Die zweite Komponente der vorliegenden Zusammensetzungen ist Magen-Lysozym aus Wiederkäuern, einschließlich Rinder-Lysozym. Ein Wiederkäuer ist ein wiederkäuendes Säugetier mit einem Pansen (Vorderdarm). Im Vorderdarm, der als anaerobe Fermentationskammer wirkt, befinden sich Mikroben, die Zellulose spalten. Vaughan T.A., Mammalogy, 2. Auflage, WB Saunders Co., Philadelphia, 1978. Viele dieser Mikroben gelangen in den Magen, wo sie verdaut werden. Eine spezifische Enzymart, die in hohen Mengen in der Wiederkäuermagen-Schleimhaut gefunden wurde und die hilft diese Mikroben zu verdauen, ist Lysozym c. Dobson D.E. et al., "Stomach Lysozymes of Ruminants", Journal of Biological Chemistry, Bd. 259 (1984), 11607-11625, hier unter Bezugnahme eingeschlossen. Lysozym c ist ungewöhnlich resistent gegenüber einer Inaktivierung durch Pepsin und ist bei einem niedrigeren pH-Wert wirksam als andere Nicht-Wiederkäuer-Lysozyme. Journal of Biological Chemistry, Bd. 259, Seiten 11607 und 11617. Es wurde der Beweis erbracht, daß diese Wiederkäuermagen-Lysozyme c funktionell erheblich unterschiedlicher sind als herkömmliche Säuger-Lysozyme c, vermutlich als Ergebnis der Evolution in der spezialisierten Wiederkäuermagen-Umgebung. Journal of Biological Chemistry, Bd. 259, 11608.
Wiederkäuermagen-Lysozym c wird hier bevorzugt verwendet. Stärker bevorzugt werden die drei nahe verwandten Lysozyme c (1,2 & 3), die aus der Magenschleimhaut der Kuh isoliert und in The Journal of Biological Chemistry, Bd. 259, 11619-11625, einschließlich ergänzendem Material, hier unter Bezugnahme eingeschlossen, beschrieben wurden. Diese ähneln Lysozymen c bekannter Aminosäurezusammensetzungen, da sie acht 1/2- Cystinreste und einen hohen Anteil von Tryptophan aufweisen, obwohl sich die Lysozyme c von anderen bekannten Lysozymen c in ihrem niedrigen Arginingehalt unterscheiden. Journal of Biological Chemistry, Bd. 259, 11625, und ergänzendes Material. Die Aminosäuresequenz von 129 Aminosäuren wurde für ein Lysozym c, bezeichnet als c2, der drei nahe verwandten Magen-Lysozyme c der Kuh bestimmt. Es unterscheidet sich von den anderen bekannten Lysozymen c an den Positionen 39-60, eine Aminosäuredeletion einschließend. Journal of Biological Chemistry, Bd. 259, 11617. Das hier besonders bevorzugte Lysozym unter den drei Magen-Lysozymen der Kuh ist das Magen-Lysozym c2 der Kuh. Kuh- oder Rinder-Lysozym c2 weist ein Molekulargewicht von 14.389 auf. Journal of Biological Chemistry, Bd. 259, 11626, und ergänzendes Material.
Rindermagen-Lysozym c2 weist eine höhere Resistenz gegenüber Proteasen und einen stärker sauren und engeren pH-Bereich als Hühnereiweiß-Lysozym auf. Journal of Biological Chemistry, Bd. 259, 11607. Rinder (Kuhmagen)-Lysozym wurde als antimikrobielles Mittel bei sauren pH-Werten oder als Tierfutterzusatz vorgeschlagen, obwohl es gegenwärtig nicht häufig in kommerziellem Gebrauch ist. Digan M.E. et al., "Continuous Production of a Novel Lysozyme via Secretion from the Yeast, Pichia pastoris", Biotechnology, Bd. 2 (1989), 160-164, das hier unter Bezugnahme eingeschlossen ist.
Vor kurzem wurde Rinder-Lysozym c2 gentechnisch aus der Hefe Pichia pastoris hergestellt. Die Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. of LaJolla, Californien, stellte dieses Lysozym gentechnisch durch Clonieren einer cDNA für Rinder-Lysozym c2 her und exprimierte sein Proteinprodukt durch Sekretion unter Verwendung seiner nativen Signalsequenz in Pichia pastoris. Biotechnology, Bd. 2, 160. Die biologische Aktivitat des rekombinanten Produkts wird beibehalten und es wird erwartet, daß ein kosteneffizientes Produkt in einem großen Volumen hergestellt wird. Biotechnology, Bd. 2, 160 und 163.
Rekombinantes Rinder-Lysozym, insbesondere aus der Hefe Pichia pastoris, wird hier besonders bevorzugt verwendet. Gentechnisch hergestelltes Rinder-Lysozym c2 aus Pichia pastoris ist insbesondere vielseitig, da es gegenüber oberflächenaktiven Mitteln stabil ist.
Gram-positive Bakterien sind empfindlicher gegen die Lysozym-Wirkung als Gramnegative Bakterien. Staphylococcus aureus ist ein Gram-positives Bakterium, das trotzdem weniger empfindlich gegen Lysozym ist, wahrscheinlich weil es unterschiedliche Zucker in seinem Zellwandglycopeptid aufweist. Davis et al., Principles of Microbiology and Immunology (1968), Harper & Row, New York, 118-119. In der vorliegenden Erfindung zerstört die Kombination von Endo-β-N-acetylglucosaminidase und/oder Endoglycopeptidase (vorzugsweise Endo-H) sowie Wiederkäuermagen-Lysozym (vorzugsweise rekombinantes Rinder-Lysozym aus Pichia pastoris) S. aureus-Bakterien stark (vgl. Beispiele). Zusätzlich reduziert die vorstehende Kombination unerwartet und erheblich Kolonien von Escherichia coli, einem gewöhnlich Gram-negativen Organismus, obwohl die einzelnen Enzyme dies nicht tun (vgl. Beispiele). Sogar für Staphylococcus epidermidis, einem Gram-positiven Bakterium, das durch Lysozym oder Endo-H getrennt ungünstig beeinflußt wird, zeigt die Kombination der zwei Enzyme eine größere ungünstige Wirkung als jedes Enzym für sich allein. Zusätzlich zu Bakterien sind die vorliegenden Zusammensetzungen gegen Pilze und Hefen wirksam, obwohl man annimmt, daß dies eher der Endoglycosidase, insbesondere Endo-H, zuzuschreiben ist als nur der Kombination der Endoglycosidase mit Lysozym.

B. Zusammensetzungen

Hier eingeschlossen sind antimikrobielle Zusammensetzungen, die Wiederkäuermagen-Lysozym sowie Endo-β-N-acetylglucosaminidase und/oder Endoglycopeptidase umfassen. Bevorzugt werden Rindermagen-Lysozyme c und eine oder mehrere der folgenden Verbindungen: Endo-H, Endo-F, Endo-D, PNGase A und PNGase F. Stärker bevorzugt werden Lysozym c2 und Endo-H oder PNGase F. Besonders bevorzugt werden rekombinantes Rinder-Lysozym aus Pichia pastoris und Endo-H.
Es wird bevorzugt, daß das Gewichtsverhältnis von Wiederkäuermagen-Lysozym zu Endo-β-N-acetylglucosaminidase oder Endoglycopeptidase etwa 1:4 bis 4:1 ist, vorzugsweise etwa 2:1 bis 1:2. Für Endo-H und das rekombinante Rinder-Lysozym aus Pichia pastoris wird ein Verhältnis von 1:1 besonders bevorzugt.
Die Zusammensetzungen umfassen hier vorzugsweise etwa 1 bis 1000 ppm, vorzugsweise etwa 50 bis 400 ppm, Wiederkäuermagen-Lysozym und etwa 1 bis 1200 ppm, vorzugsweise etwa 50 bis 400 ppm, Endo-β-N-acetylglucosaminidase oder Endoglycopeptidase.
Die hier besonders bevorzugten Zusammensetzungen umfassen etwa 80 bis 150 ppm Endo-H und etwa 80 bis 150 ppm des rekombinantem Rinder-Lysozyms.
Die antimikrobiellen Zusammensetzungen liegen hier vorzugsweise als Mundspülmittel, Gebißreiniger, Zahnputzmittel, Wäschewaschmittel, Konservierungsmittel, Flüssigseife, Kontaktlinsenreiniger oder Hautreiniger vor. Diese werden nachstehend ausführlicher beschrieben. Stärker bevorzugt liegen die Zusammensetzungen als Gebißreiniger, Zahnputzmittel, Mundspülmittel, Konservierungsmittel, Flüssigseife oder Wäschewaschmittel vor. Besonders bevorzugt wird ein Wäschwaschmittel, insbesondere ein flüssiges Universalwäschewaschmittel.
Die antimikrobiellen Zusammensetzungen umfassen hier vorzugsweise etwa 0,1 bis 60 Gew.-% eines Waschmitteltensids. Die Waschmitteltenside sind anionische, nichtionische, kationische, ampholytische und/oder zwitterionische oberflächenaktive Mittel, vorzugsweise nichtionische und/oder anionische oberflächenaktive Mittel. Ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel wird besonders bevorzugt.
Die vorliegenden Zusammensetzungen können als Wäschewaschmittel formuliert werden, wie jene, die in den US-Patenten 4,507,219; 4,318,818; 4,605,509 und 4,412,934 offenbart wurden; als Reiniger für harte Oberflächen, wie jene, die in den US-Patenten 4,414,128; 3,679,608; 3,985,668 und 4,005,027 offenbart wurden; als Seifenstücke, wie jene, die in den US-Patenten 3,993,772 und 3,070,547 offenbart wurden; als Shampoos, wie jene, die in den US-Patenten 4,345,080; 4,704,272 und 4,741,855 offenbart wurden; als Anti-Akneprodukte, wie jene, die in den US-Patenten 4,318,907 und 4,608,370 offenbart wurden, und als orale Zusammensetzungen, wie jene, die im US-Patent 4,684,518 offenbart wurden. Diese sind hier unter Bezugnahme eingeschlossen.
Wo die antimikrobielle Zusammensetzung bevorzugt ein Mundspülmittel, Gebißreiniger oder ein Zahnputzmittel ist, umfaßt sie vorzugsweise etwa 1 bis 150 ppm an jeweils Endo-H oder PNGase F und Rinder-Lysozym c2. Das gleiche gilt für den Fall, wo die antimikrobielle Zusammensetzung ein Kontaktlinsenreiniger ist.
Wo die antimikrobielle Zusammensetzung ein flüssiges oder granuläres Wäschewaschmittel ist, umfaßt sie vorzugsweise etwa 2 bis 250 ppm an jeweils Endo-H und rekombinantem Rinder-Lysozym c2 sowie etwa 1 bis 90 Gew.-% eines Waschmitteltensids, gewählt aus der anionische, nichtionische, kationische, ampholytische und zwitterionische oberflächenaktive Mittel umfassenden Gruppe. Bevorzugte Wäschewaschmittelzusammensetzungen umfassen vorzugsweise etwa 5 bis 50, besonders bevorzugt 10 bis 40 Gew.-% des vorstehenden Waschmitteltensids.
Oberflächenaktive Mittel, die in Waschmittelzusammensetzungen nützlich sind, schließen hier gut bekannte, synthetische, anionische, nichtionische, kationische, amphotere und zwitterionische oberflächenaktive Mittel ein. Typische Beispiele sind Alkylbenzolsulfonate, Alkyl- und Alkylethersulfate, Paraffinsulfonate, Olefinsulfonate, alkoxylierte (insbesondere ethoxylierte) Alkohole und Alkyphenole, Aminoxide, α-Sulfonate von Fettsäuren und Fettsäureestern, Alkylbetaine und ähnliche, die auf dem Waschmittelfachgebiet gut bekannt sind. Im allgemeinen enthalten solche Waschmitteltenside eine Alkylgruppe im C&sub9;-C&sub1;&sub8;-Bereich. Die anionischen Waschmitteltenside können in Form ihrer Natrium-, Kalium- oder Triethanolammoniumsalze verwendet werden; die nichtionischen enthalten im allgemeinen etwa 5 bis etwa 17 Ethylenoxidgruppen. Bei Zusammensetzungen des vorliegenden Typs werden insbesondere C&sub1;&sub1;-C&sub1;&sub6;-Alkylbenzolsulfonate, C&sub1;&sub2;-C&sub1;&sub8;-Paraffinsulfonate und C&sub1;&sub0;-C&sub1;&sub6;-Alkylsulfate bevorzugt, die 0 bis etwa 4 Ethylenoxideinheiten enthalten.
Eine ausführliche Liste der geeigneten oberflächenaktiven Mittel für die vorliegenden Zusammensetzungen findet man im US-Patent 3,936,537, Baskerville, erteilt am 3. Februar 1976, das hier unter Bezugnahme eingeschlossen ist. Kommerzielle Quellen für solche oberflächenaktive Mittel findet man in McCutcheon's Emulsifiers and Detergents, North American Edition, 1984, McCutcheon Division, MC Publishing Company, das hier ebenfalls unter Bezugnahme eingeschlossen ist.
Nützliche Waschmittelbuilder für die Waschmittelzusammensetzungen umfassen alle üblichen anorganischen und organischen, wasserlöslichen Buildersalze sowie verschiedene wasserunlösliche und sogenannte "geimpfte" Builder ("seeded" builders). Die vorliegenden Wäschewaschmittelzusammensetzungen umfassen vorzugsweise etwa 1 Gew.-% bis etwa 75 Gew.-% Waschmittelbuilder, stärker bevorzugt etwa 5 Gew.-% bis etwa 40 Gew.-% und besonders bevorzugt etwa 10 Gew.-% bis etwa 20 Gew.-%.
Nichtbegrenzende Beispiele geeigneter wasserlöslicher, anorganischer, alkalischer Waschmittelbuildersalze umfassen die Alkalimetallcarbonate, -borate, -phosphate, -polyphosphate, -tripolyphosphate, -bicarbonate, -silikate und -sulfate. Spezifische Beispiele solcher Salze umfassen die Natrium- und Kaliumtetraborate, -bicarbonate, -carbonate, - tripolyphosphä, -pyrophosphate und hexametaphosphate.
Beispiele geeigneter organischer, alkalischer Waschmittelbuildersalze sind: (1) wasserlosliche Aminopolyacetate, z. B. Natrium und Kaliumethylendiamintetraacetate, Nitrilotriacetate und N-(2-Hydroxyethyl)nitrilodiacetate, (2) wasserlosliche Salze von Phytinsaure, z.B. Natrium und Kaliumphytate, (3) wasserlosliche Polyphosphonate, einschließlich Natrium-, Kalium- und Lithiumsalze von Ethan-1-hydroxy-1,1-diphosphonsäure, Natrium-, Kalium- und Lithiumsalze von Methylendiphosphonsaure und ahnliches.
Geimpfte Builder umfassen solche Substanzen wie Natriumcarbonat oder Natriumsilikat, welche mit Calciumcarbonat oder Bariumsulfat geimpft bzw. als Keimbildner versehen sind. Wasserhaltiges Natriumzeolith A mit einer Partikelgröße von weniger als etwa 5 Mikron ist insbesondere wunschenswert.
Eine ausführliche Liste geeigneter Waschmittelbuilder findet man im US-Patent 3,936,537, das hier unter Bezugnahme eingeschlossen ist. Bevorzugte Builder sind Fettsäuren, Polycarbonate, Polyphosphate und Gemische davon.
Wahlweise Komponenten einer Waschmittelzusammensetzung umfassen Enzyme (z.B. Proteasen und Amylasen), Persauerstoffbleichmittel und Bleichmittelaktivatoren, Halogenbleichmittel (z.B. Natrium- und Kaliumdichlorisocyanurate), Schmutzabweisungsmittel (z. B. Methylzellulose), Schmutzsuspensions- bzw. Schmutztragemittel (z. B. Natriumcarboxymethylzellulose), Gewebeaufheller, Enzymstabilisatoren, Farbschutzstoffe, Schaumverstärker oder Schaumhemmstoffe, Antikorrosionsmittel, Farbstoffe, Füllstoffe, keimtötende Mittel, Mittel zur pH-Einstellung, Nichtbuilder-Alkalinitätsquellen und ähnliches.
Die antimikrobielle Zusammensetzung kann auch ein Konservierungsmittel sein, zum Beispiel in einem Shampoo oder Kosmetikum, wie einer Gesichtscreme, oder in einem Lebensmittel oder Getränk. Sie wird vorzugsweise in einem Kosmetikum oder Shampoo in einer Menge von etwa 50 bis 400 ppm an jeweils Rinder-Lysozym c2 und Endo-H (vorzugsweise) oder PNGase F verwendet.
Erfindungsgemäße Zusammensetzungen können in Form eines Shampoos vorliegen. Diese Shampoos umfassen typischerweise etwa 5 Gew.-% bis etwa 60 Gew.-% eines synthetischen oberflächenaktiven Mittels und den Rest Wasser. Geeignete oberflächenaktive Mittel umfassen Ammoniumlaurylsulfat, Ammoniumlaurethsulfat, Triethylaminlaurylsulfat, Triethanolaminlaurylsulfat, Triethanolaminlaurethsulfat, Monoethanolaminlaurylsulfat, Monoethanolaminlaurethsulfat, Diethanolaminlaurylsulfat, Diethanolaminlaurethsulfat, Laurin-monoglycerdnatriumsulfat, Natriumlaurylsulfat, Natriumlaurethsulfat, Kaliumlaurylsulfat, Kaliumlaurethsulfat, Laurylsarkosin, Cocoylsarkosin, Ammoniumcocoyl sulfat, Ammoniumlauroylsulfat, Natriumcocoylsulfat, Natriumlauroylsulfat, Kaliumcocoylsulfat, Kaliumlauroylsulfat, Triethanolaminlauroylsulfat, Triethanolaminlauroylsulfat, Monoethanolamincocoylsulfat, Monoethanolaminlauroylsulfat, Natriumtridecylbenzolsulfonat und Natriumdodecylbenzolsulfonat.
Diese Shampoos konnen eine Vielzahl wahlweiser Komponenten enthalten. Solche her kommlichen wahlweisen Bestandteile sind dem Fachmann gut bekannt, z.B. Konservie rungsmittel, wie Benzylalkohol, Ethylparaben, Propylparaben und Imidazolidinylharnstoff, kationische oberflachenaktive Mittel, wie Cetyltrimethylammoniumchloride, Lauryltrimethylammoniumchlorid, Tricetylmethylammoniumchlorid, Stearyldimethylbenzylammoniumchlorid und Di(partiell hydrierter Talg)-dimethylammoniumchlorid; Verdickungsmittel und die Viskosität modifizierende Stoffe, wie ein Diethanolamid einer langkettigen Fettsäure (z.B. PRG 3-Lauramid), Blockpolymere von Ethylenoxid und Propylenoxid, Natriumchlorid, Natriumsulfat, Polyvinylalkohol, Ethylalkohol und wasserlösliche Polymere, wie Xanthangummi, Hydroxyethylzellulose, Guargummi und Stärke; Mittel zur pH-Einstellung, wie Zitronensäure, Bernsteinsäure, Phosphorsäure, Natriumhydroxid und Natriumcarbonat; Parfume, Farbstoffe und/oder Komplexbildner, wie Dinatriumethylendiamintetraacetat. Solche Mittel werden im allgemeinen einzeln in einer Menge von etwa 0,01 bis etwa 10 Gew.-%, vorzugsweise etwa 0,5 bis etwa 5,0 Gew.-%, der Zusammensetzung verwendet.
Wo die antimikrobielle Zusammensetzung eine flüssige Handseife ist, umfaßt sie etwa 50 bis 400 ppm an jeweils Endo-H oder PNGase F und Rinder-Lysozym c2 sowie etwa 10 bis 40 Gew.-% eines Waschmitteltensids (wie vorstehend für die Waschmittelzusammensetzungen beschrieben).
Die antimikrobielle Zusammensetzung kann ein Hautreiniger sein, der vorzugsweise etwa 80 bis 150 ppm an jeweils Endo-H und rekombinantem Rinder-Lysozym aus Pichia pastoris umfaßt.
Weitere Bestandteile, die mit diesen Enzymen unverträglich sind, sollten nicht verwendet werden. Der pH-Wert dieser Zusammensetzungen ist vorzugsweise 5 bis 8, stärker bevorzugt 5,5 bis 7, und besonders bevorzugt 6,5 bis 7,5. Die Enzyme sollten der Zusammensetzung auf eine Weise zugegeben werden, die nicht zu ihrer Inaktivierung fuhrt.

D. Methoden

Zusammen mit antimikrobiellen Zusammensetzungen sind hier Verfahren für die Zerstörung oder Entfernung von Mikroben eingeschlossen. Diese Verfahren umfassen die Behandlung mit Rindermagen-Lysozym und Endo-β-N-acetylglucosaminidase und/oder Endoglycopetidase, vorzugsweise durch Anwendung einer Zusammensetzung, die diese Enzyme umfaßt. Bevorzugt werden Rindermagen-Lysozyme c und eine Endoglycosidase ausgewählt aus der Endo-H, Endo-F, Endo-D, PNGase A und PNGase F umfassenden Gruppe. Die Zusammensetzung zur Behandlung umfaßt vorzugsweise Rinder-Lysozym c2 sowie Endo-H und/oder PNGase F. Besonders bevorzugt wird rekombinantes Rinder- Lysozym aus Pichia pastoris und Endo-H. Die bevorzugte Behandlung umfaßt die Anwendung einer Zusammensetzung, die Endo-H und/oder PNGase F sowie rekombinates Rinder-Lysozym aus Pichia pastoris umfaßt.
Diese Enzyme sollten in einer Konzentration verwendet werden, die ausreichend ist, um eine antimikrobielle Wirkung zu erzielen. Die Menge der Endoglycosidase oder des Lysozyms bei der Behandlung ist im allgemeinen geringer als die Menge, die für das gleiche Enzym erforderlich ist, um die gleiche antimikrobielle Wirkung zu erzielen, wenn es alleine verwendet wird. Ohne an die Theorie gebunden zu sein, nimmt man an, daß ein Synergismus zwischen den zwei Enzymarten besteht, d.h. die Wirkung von Endoglycosidase und Lysozym, insbesondere von Endo-H und rekombinantem Rinder-Lysozym c2, ist stärker als additiv.
Das vorliegende Verfahren betrifft vorzugsweise die Zerstörung oder Entfernung von Bakterien, besonders bevorzugt von Gram-positiven Bakterien, vorzugsweise durch eine Zusammensetzung, die etwa 1 bis 1200 ppm (vorzugsweise etwa 50 bis 400 ppm) Endo- β-N-acetylglucosaminidase oder Endoglycopetidase (besonders bevorzugt Endo-H) und etwa 1 bis 1000 ppm (vorzugsweise etwa 50 bis 400 ppm) Wiederkäuermagen-Lysozym c (besonders bevorzugt rekombinantes Rinder-Lysozym aus Pichia pastoris) umfaßt. Es wird erwartet, daß das vorliegende Verfahren auch gegen Pilze und Hefen wirksam ist, obwohl dies wahrscheinlich eher auf Endo-H zuhckzufuhren ist als auf die Kombination mit Lysozym.
Das Verhältnis von Wiederkäuermagen-Lysozym zu Endo-β-N-acetylglucosaminidase/Endoglycopetidase beträgt etwa 1:4 bis 4:1, vorzugsweise etwa 1:2 bis 2:1, besonders bevorzugt etwa 1:1.
Das vorliegende Verfahren (und die Zusammensetzung) wird besonders für die Zerstörung von Staphylococcus aureus und/oder Escherichia coli bevorzugt, vorzugsweise durch eine Zusammensetzung, die etwa 50 bis 400 ppm, besonders bevorzugt etwa 100 bis 150 ppm, an jeweils Endo-H und rekombinantem Rinder-Lysozym umfaßt.
Das Verfahren umfaßt vorzugsweise das Waschen oder Spülen einer Mikroben-aufweisenden Oberfläche mit einer Zusammensetzung, die Wiederkäuermagen-Lysozym sowie Endo-β-N-acetylglucosaminidase und/oder Endoglycopetidase umfaßt. Abhängig von der Art der Oberfläche und der angewendeten Behandlung kann die Oberfläche dann mit Wasser gespült und/oder von Hand mit einem Tuch abgewischt werden. Die Oberfläche, die die Mikroben festhält, kann beispielsweise Zähne oder Gebisse, die Mundhöhle, Gewebe, Haut oder Kontaktlinsen umfassen. Die Zusammensetzung ist vorzugsweise ein Mundspülmittel, Gebißreiniger, Zahnputzmittel, Wäschwaschmittel, Konservierungsmittel, Kontaktlinsenreiniger, Flüssigseife oder Hautreiniger (vgl. vorstehend), stärker bevorzugt ein Gebißreiniger, Mundspülmittel, Konservierungsmittel, Flüssigseife oder Wäschewaschmittel, besonders bevorzugt ein Wäschewaschmittel, und insbesondere ein flussiges Universalwaschewaschmittel. Die Zusammensetzung umfaßt vorzugsweise etwa 1 bis 90 Gew.-%, stärker bevorzugt etwa 5 bis 50 Gew.-%, besonders bevorzugt 10 bis 40 Gew.-% eines oberflächenaktiven Mittels, gewählt aus der anionische, nichtionische, kationische, ampholytische und zwitterionische oberflächenaktive Mittel umfassenden Gruppe, vorzugsweise ein anionisches und/oder nichtionisches oberflächenaktives Mittel.
Das Verfahren sollte auf eine Weise ausgefuhrt werden, die nicht zur Deaktivierung der Enzyme fuhrt.
Die Zusammensetzungen können auch periodisch zur Entfernung und Verhütung von mikrobiellem Wachstum verwendet werden, zum Beispiel durch den täglichen Gebrauch der Mundspülmittelzusammensetzungen. Es kann wunschenswert sein, den antimikrobiellen Zusammensetzungen zu erlauben, in dem Bereich, der behandelt wird, für einen bestimmten Zeitraum nach der Anwendung zu verbleiben, zum Beispiel durch Spülen für 30 Sekunden mit den Mundspülmittelzusammensetzungen.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren. Sie sollen den Schutzumfang der Erfindung nicht begrenzen. Alle Anteile, Prozente und Verhältnisse sind, wenn nicht anders angegeben, Gewichtsangaben.

Beispiel I

Wirkung von Rinder-Lysozym und Endo-H auf E. coli

Proben einer 4-Stunden alten Kulturbrühe von Escherichia coli werden mit den folgenden Lösungen für 2 Stunden behandelt:
1) 0,2 M Na-Zitratpuffer, pH 7,0;
2) 0,2 M Na-Zitratpuffer, pH 7,0, plus 200 ppm an jeweils Rinder-Lysozym und Endo-H, pH 7,0;
3) #1 plus 200 ppm Rinder-Lysozym, pH 7,0;
4) #1 plus 200 ppm Endo-H, pH 5,5.
Das Rinder-Lysozym ist rekombinantes Rinder-Lysozym aus Pichia pastoris. Man nimmt an, daß dieses Rinder-Lysozym allein oder in Kombination mit Endo-H bei pH 7,0 am besten wirksam ist. Endo-H ist rekombinantes Endo-H aus E. coli. Man nimmt an, daß Endo-H allein bei einem pH-Wert von 5,5 optimal wirksam ist.
Verdünnungsreihen der Behandlungsproben werden ausplattiert, über Nacht bei 37ºC inkubiert und nach Kolonien abgesucht, die gezählt werden.
Die abschließenden Koloniezählungen für die Behandlungen ergaben die folgenden Ergebnisse:
1) Puffer allein 1,5 x 10&sup6; Kolonien
2) Rinder-Lysozym/Endo-H 5,2 x 10&sup4; Kolonien
3) Rinder-Lysozym allein 1,8 x 10&sup6; Kolonien
4) Endo-H allein 1,2 x 10&sup6; Kolonien
5 Das vorstehende Experiment wird mit jeweils 100 ppm Rinder-Lysozym und Endo-H in #2 wiederholt.
1) 0,2 M Na-Zitratpuffer, pH 7,0;
2) 0,2 M Na-Zitratpuffer, pH 7,0, plus 100 ppm an jeweils Rinder-Lysozym und Endo-H, pH 7,0;
3) #1 plus 200 ppm Rinder-Lysozym, pH 7,0;
4) #1 plus 200 ppm Endo-H, pH 5,5.
Die abschließenden Koloniezählungen für die Behandlungen ergaben die folgenden Ergebnisse:
1) Puffer allein 0,3 x 10&sup6; Kolonien
2) Rinder-Lysozym/Endo-H 3,8 x 10³ Kolonien
3) Rinder-Lysozym allein 6,6 x 10&sup5; Kolonien
4) Endo-H allein 8,7 x 10&sup5; Kolonien
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß Rinder-Lysozym und Endo-H erheblich wirksamer sind gegen E. coli als Rinder-Lysozym allein oder Endo-H allein. Die Kombination ergibt eine zwei- bis dreifache logarithmische Reduzierung der Bakterien, verglichen entweder mit dem Enzym allein oder mit dem Puffer. Die Kombination bietet auch Vorteile für unterschiedliche Inkubationszeitperioden, zum Beispiel von 30 Minuten bis 7 Stunden.

Beispiel II

Wirkung von Rinder-Lysozym und Endo-H auf S. epidermidis

Proben einer 4-Stunden alten Kulturbrühe von Staphylococcus epidermidis werden mit den folgenden Lösungen für 6 Stunden behandelt:
1) 0,2 M Na-Zitratpuffer, pH 7,0;
2) 0,2 M Na-Zitratpuffer, pH 7,0, plus 100 ppm an jeweils Rinder-Lysozym und Endo-H, pH 7,0;
3) #1 plus 100 ppm Rinder-Lysozym, pH 7,0;
4) #1 plus 100 ppm Endo-H, pH 5,5.
Das Rinder-Lysozym ist rekombinantes Rinder-Lysozym aus Pichia pastoris. Man nimmt an, daß dieses Rinder-Lysozym allein oder in Kombination mit Endo-H bei pH 7,0 am besten wirksam ist. Das Endo-H ist rekombinantes Endo-H aus E. coli. Man nimmt an, daß Endo-H allein bei einem pH-Wert von 5,5 optimal wirksam ist.
Verdünnungsreihen der Behandlungsproben werden ausplattiert, über Nacht bei 37ºC inkubiert und nach Kolonien abgesucht, die gezählt werden.
Die abschließenden Koloniezählungen für die Behandlungen ergaben die folgenden Ergebnisse:
1) Puffer allein 1,1 x 10&sup5; Kolonien
2) Rinder-Lysozym/Endo-H 5,8 x 10³ Kolonien
3) Rinder-Lysozym allein 1,0 x 10&sup4; Kolonien
4) Endo-H allein 3,9 x 10&sup4; Kolonien
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß Rinder-Lysozym und Endo-H (jeweils 100 ppm) erheblich wirksamer sind gegen S. epidermidis als Rinder-Lysozym allein (100 ppm) oder Endo-H allein (100 ppm). Die Kombination bietet auch Vorteile für unterschiedliche Inkubationszeitperioden, zum Beispiel von 30 Minuten bis 7 Stunden.

Beispiel III

Wirkung von Endo-H/Rinder-Lysozym auf die S. aureus-Morphologie

Eine 4-Stunden alte Kulturbrühe von Staphylococcus aureus (ATCC #6341) wird aufgeteilt und mit den folgenden wirksamen Lösungen für 2 Stunden bei 37ºC behandelt:
1) 0,2 M Na-Zitratpuffer, pH 7,0;
2) #1 plus Rinder-Lysozym, 200 ppm, und Endo-H, 200 ppm, pH 7,0;
3) #1 plus Rinder-Lysozym, 400 ppm, pH 7,0;
4) #1 plus Endo-H, 400 ppm, pH 7,0.
Nach der Behandlung werden die Proben auf Formvar-beschichtete Gitter aufgebracht und mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie untersucht. Nach den mikrographischen Darstellungen zerstört weder die Pufferkontrolle noch die Enzyme allein den S. aureus-Mikroorganismus. Wenn die Enzyme jedoch kombiniert werden, werden die behandelten Mikroorganismen stark kondensiert und/oder zerstört.

Beispiel IV

Wirksamkeit von Rinder-Lysozym/Endo-H im Vergleich mit anderen Lysozymen/Endo-H

Eine in der logarithmischen Phase befindliche Kultur von Escherichia coli (083 K.H. 81) wird aufgeteilt und mit unterschiedlichen Lysozym/Endo-H-Kombinationen für 2 und 4 Stunden bei 37ºC behandelt.
Am Ende der Behandlungszeiten werden Aliquots jedes Versuchs in phosphatgepufferter Kochsalzlösung seriell verdünnt und auf Trypticase-Sojabohnen-Agar ausplattiert. Die Platten werden über Nacht bei 37ºC inkubiert und die Kolonienzahl wird abgelesen. Ergebnisse: Behandlung Zeit Koloniezahl a) 0,2 M Na-Zitratpuffer, pH 7,0 b) 0,2 M Na-Zitratpuffer + 200 ppm Rinder-Lysozym, pH 7,0 c) 0,2 M Na-Zitratpuffer + 200 ppm Rinder-Lysozym + 200 ppm Endo-H, pH 7,0 d) 0,2 M Na-Zitratpuffer + 200 ppm Mutanolysin + 200 ppm Endo-H, pH 7,0 e) 0,2 M Na-Zitratpuffer + 200 ppm Hühereiweißlysozym + 200 ppm Endo-H, pH 7,0 g) 0,2 M Na-Zitratpuffer + 200 ppm Rinder-Lysozym, pH 7,0 h) 0,2 M Na-Zitratpuffer + 200 ppm Rinder-Lysozym + 200 ppm Endo-H, pH 7,0 i) 0,2 M Na-Zitratpuffer + 200 ppm Mutanolysin + 200 ppm Endo-H, pH 7,0 j) 0,2 M Na-Zitratpuffer + 200 ppm Hühereiweißlysozym + 200 ppm Endo-H, pH 7,0
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Kombination von Rinder-Lysozym und Endo-H eine signifikante bakterielle Reduktion ergibt. Diese Reduktion ist viel größer als bei jeder anderen getesteten Lysozym/Endo-H-Kombination.
Wenn das Experiment mit den doppelten Kontrollkonzentrationen, z.B. 400 ppm der verschiedenen Lysozyme allein, wiederholt wird, ergibt die Kombination von Rinder-Lysozym und Endo-H trotzdem eine bakterielle Reduktion.

Beispiel V

Wäschwaschmittel, das Endo-H und Rinder-Lysozym enthält

Eine flüssige Universalwäschewaschmittelzusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist folgende: Bestandteil Wirkstoff in Gew.- % lineare C&sub1;&sub3;-Alkylbenzolsulfonsäure C&sub1;&sub4;&submin;&sub1;&sub5;-Alkylpolyethoxylat-(2,25)-sulfonsäure 1,2-Propandiol Natriumdiethylentriaminpentaacetat Monoethanolamin C&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub3;-Alkohoipolyethoxylat (6,5) Ethanol Natriumhydroxid Kaliumhydroxid C&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub4;-Fettsäure Zitronensäure Calciumformiat C&sub1;&sub2;-Alkyltrimethylammoniumchlorid Tetraethylenpentaminethoxylat (15-18) Wasser Farbstoff Parfum Protease* Endo-H Rinder-Lysozym** * mg wirksames Enzym/g @ 34 mg aktives Enzym/g Stamm) ** 4,0 Einheiten/Mikrogramm ± 25%
Die vorstehend aufgefuhrten Bestandteile werden einem Mischtank mit einem einzelnen Rührwerk zugegeben. Bevor die Enzyme, der Farbstoff und das Parfum zugegeben werden, wird der pH-Wert des Gemisches so eingestellt, daß eine Lösung von 10 Gew.-% in Wasser bei 20ºC einen pH-Wert von 8,5 aufweist.
Diese Zusammensetzung fuhrt zur Entfernung und Verhütung von Mikroben, insbesondere von Bakterien, die mit Wäscheverschmutzungen assoziiert sind, wenn sie unmittelbar nach der Herstellung getestet wird. Dieser Umfang der Entfernung und Verhütung ist besser als jener, der durch flüssige Universalwaschmittel ohne Endo-H/Rinder-Lysozym bereitgestellt wird.

Beispiel VI

Shampoo mit Konservierungsmittel

Diese Antischuppenshampoozusammensetzung bleibt in größerem Maße frei von einer Bakterien- oder Pilzkontaminierung und/oder für einen längeren Zeitraum als eine Zubereitung ohne Endo-H/Rinder-Lysozym.

Beispiel VII

Flüssigseife

Eine erfindungsgemäße Flüssigseifenzusammensetzung ist die folgende: Bestandteil Wirkstoff in Gew.-% Ammoniumlaurylsulfat Natriumalkylsarkosinat Kokoamidopropylbetain Kokosnußfettsäure Ethylendiamintetraessigsäure Ammoniumsulfat Parfüm Farbstoff Wasser Endo-H Rinder-Lysozym** ** 4,0 Einheiten/Mikrogramm ± 25%
Die vorstehend aufgeführten Bestandteile werden in der Reihenfolge, in der sie vorstehend erscheinen, einem Mischtank mit einem einzelnen Rührwerk zugegeben. Bevor die Enzyme, der Farbstoff und das Parfum zugegeben werden, wird der pH-Wert des Gemisches so eingestellt, daß eine Lösung von 10 Gew.-% in Wasser bei 20ºC einen pH-Wert von etwa 6,5 aufweist.
Diese Zusammensetzung zeigt eine antimikrobielle Wirkung zur Entfernung der gewöhnlichen Hautflora.

Beispiel VIII

Tablettengebißreiniger

Natriumbicarbonat, Natriumperboratmonohydrat, Weinsäure, Natriumtripolyphosphat, Sulphaminsäure, Polyethylenglykol (20 M) und Ethylendiamintetraacetat werden getrennt durch Fluidifizierung bzw. Aufwirbelung in einem Heißuftbett bei 60-65ºC während 30 Minuten granuliert. Derartige Granulate werden dann schleudernd mit den anderen Bestandteilen gemischt, um ein "Erstschicht"-Gemisch und ein "Zweitschicht"-Gemisch herzustellen, wobei das "Erstschicht"-Gemisch die folgende Zusammensetzung hat: Gew.-% Natriumbicarbonat Weinsäure Kaliummonopersulphat Sulphaminsäure Dinatriumpyrophosphat Natriumcarbonat Polyethylenglykol (20 M) Natriumsulphat Pfefferminzpulver Siliziumdioxid Natriumdodecylbenzolsulphonat
und das "Zweitschicht"-Gemisch weist die folgende Zusammensetzung auf: Gew.-% Natriumperboratmonohydrat Kaliummonopersulphat Natriumbicarbonat Natriumtripolyphosphat Natriumbicarbonat/Farbstoff Trilon B Natriumcarbonat Polyethylenglykol (20 M) Siliziumdioxid Pfefferminzpulver Wasag-Ester Gehärtete Triglyzeride Natriumdodecylbenzolsulphonat Succinatdetergens Farbstoff Endo-H Rinder-Lysozym** ** 4,0 Einheiten/Mikrogramm ± 25%
Durch Pressen in einer rotierenden HORN-Tablettenpresse mit 39 Stationen wird eine Tablette hergestellt. Das Pressen erfolgt in zwei Stufen. Zuerst wird die "zweite Schicht", blaues Gemisch, durch Stampfen zu einem sehr niedrigen Preßgrad verpreßt (10 kN pro Tablette). Die "erste Schicht", weißes Gemisch, wird dann eingefullt und zu 70 kN pro Tablette verpreßt. Auf diese Weise wird eine Tablette von 4 Gramm hergestellt, die 2,7 Gramm des blauen Gemisches und 1,3 Gramm des weißen Gemisches enthält.
Die Tabletten werden durch den Verbraucher in Wasser gelöst und die Gebisse werden dann gereinigt, indem sie in das Wasser, das den Gebißreiniger enthält, gelegt und dann abgespült werden.
Modifikationen der vorstehenden bevorzugten Ausführungsformen, die für den Fachmann naheliegend sind, sind im Schutzumfang dieser Erfindung eingeschlossen.

Claims

1. Antimikrobielle Zusammensetzung, umfassend ein Wiederkäuermagen- Lysozym, vorzugsweise Wiederkäuermagen-Lysozym c, und Endo-β-N-acetylglucosaminidase oder Endoglycopeptidase, wobei die Endo-J3 -N-acetylglucosaminidase Endo-F, Endo-D oder Endo-H ist, und die Endoglycopeptidase PNGase F oder PNGase A ist.

2. Antimikrobielle Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Gewichtsverhältnis von Wiederkäuermagen-Lysozym zu Endo-β-N-acetylglucosaminidase oder Endoglycopeptidase 1:4 bis 4:1, vorzugsweise 2:1 bis 1:2, beträgt.

3. Antimikrobielle Zusammensetzung nach mindestens einem der vorangehenden Anspruche, umfassend 1 bis 1000 ppm, vorzugsweise 50 bis 400 ppm des Wiederkauermagen-Lysozyms c, vorzugsweise Rinder-Lysozym c2, umd 1 bis 1200 ppm Endo-β-N-acetylglucosaminidase oder Endoglycopeptidase.

4. Antimikrobielle Zusammensetzung nach mindestens einem der vorangehenden Anspruche, umfassend 80 bis 150 ppm an jeweils Endo-H und rekombinantem Rinder-Lysozym aus Pichia pastoris.

5. Antimikrobielle Zusammensetzung nach mindestens einem der vorangehenden Anspruche, wobei die Zusammensetzung aus der Mundspülmittel, Gebißreiniger, Zahnputzmittel, Wäschewaschmittel, Konservierungsmittel, Kontaktlinsenreiniger, Flüssigseffe und Hautreiniger umfassenden Gruppe gewählt ist.

6. Antimikrobielle Zusammensetzung nach mindestens einem der vorangehenden Anspruche, umfassend weiterhin 1 bis 90 Gew.-% eines Waschmitteltensids, gewahlt aus der anionische, nichtionische, kationische, ampholytische und zwitterlonische oberflächenaktive Mittel umfassend en Gruppe.

7. Antimikrobielle Zusammensetzung nach mindestens einem der vorangehenden Anspruche, wobei die Zusammensetzung ein Mundspülmittel, Gebißreiniger oder Zahnputzmittel ist, umfassend 1 bis 150 ppm an jeweils Endo-H oder PNGase F und Rinder-Lysozym c2.

8. Antimikrobielle Zusammensetzung nach mindestens einem der vorangehenden Anspruche, wobei die Zusammensetzung ein flussiges oder granuläres Wäschewaschmittel ist, umfassend 2 bis 250 ppm jeweils an Endo-H und rekombinantem Rinder-Lysozym c2, und 5 bis 50 Gew.-% eines Waschmitteltensids, gewählt aus der anionische, nichtionische, kationische, ampholytische und zwitterionische oberflachenaktive Mittel umfassenden Gruppe.

9. Antimikrobielle Zusammensetzung nach mindestens einem der vorangehenden Anspruche, wobei die Zusammensetzung ein Konservierungsmittel für ein Shampoo oder ein Kosmetlkum ist.

10. Antimikrobielle Zusammensetzung nach mindestens einem der vorangehenden Anspruche, wobei die Zusammensetzung eine flüssige Handseife ist, umfassend weiterhin 10 bis 40 Gew.-% eines Waschmitteltensids, gewählt aus der anionische, nichtionische, kationische, ampholytische und zwitterionische oberflachenaktive Mittel umfassenden Gruppe.

11. Antimikrobielle Zusammensetzung nach mindestens einem der vorangehenden Anspruche zur Verwendung als Mundspülmittel, Gebißreiniger, Zahnputzmittel, Waschewaschmittel, Konservierungsmittel, Kontaktlinsenreiniger, Flussigseffe oder Hautreiniger.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei die Zusammensetzung Wiederkäuermagen-Lysozym c und eine Endoglycosidase, welche aus der Endo-H (bevorzugt), Endo-F, Endo-D, PNGase A und PNGase F (bevorzugt) umfassenden

Gruppe gewählt ist, umfaßt, und wobei das Gewlchtsverhältnis des Wiederkäuermagen-Lysozyms c zu Endoglycosidase in der Zusammensetzung vorzugsweise 1:4 bis 4:1, weiter vorzugsweise 1:2 bis 2:1, betragt.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Zusammensetzung 1 bis 1200 ppm,vorzugsweise 100 bis 150 ppm, Endo-H und 1 bis 1000 ppm, vorzugsweise 100 bis 150 ppm rekombinantes Rinder-Lysozym aus Pichia pastoris umfaßt.