DE69024324T2

DE69024324T2 - Verfahren unter Verwendung von Endoglycosidase vom Typ II

Info

Publication number: DE69024324T2
Application number: DE69024324T
Authority: DE
Inventors: Richard Shepard Carpenter; Pushkaraj Jogannath Lad; Ann Margaret Wolff
Original assignee: Procter and Gamble Co; Genencor International Inc
Current assignee: Procter and Gamble Co; Danisco US Inc
Priority date: 1989-10-27
Filing date: 1990-10-16
Publication date: 1996-10-17
Anticipated expiration: 2010-10-17
Also published as: US5258304A; JPH03244696A; CA2028553A1; BR9005445A; JP2898078B2; CA2028553C; AU6559490A; KR910008118A; AU633373B2; FI905301A0; PE15291A1; DE69024324D1; EP0425017A2; AR245772A1; NZ235854A; CN1052505A; EP0425017B1; FI98929B; PH30980A; DK0425017T3

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Entfernung von Mikroorganismen, wie Bakterien, von Oberflächen durch die Behandlung mit Endoglykosidase vom Typ II allein oder in Verbindung mit anderen Enzymen und/oder Waschmitteln.

Hintergrund der Erfindung

Die Verwendung von Enzymen zur Entfernung von Flecken, umfassend Proteine und/oder Kohlehydrate, in Verbindung mit verschiedenen Waschmitteln ist auf dem Fachgebiet der Wasch- und Keinigungsmittelzubereitungen gut bekannt. Solche Enzymzubereitungen werden zur Entfernung verschiedener Arten von Flecken von weichen Oberflächen wie Stoff und harten Oberflächen wie Porzellan und Metall entwickelt. So wurde zum Beispiel über Proteasen berichtet, wie Trypsin, Pankreatin, Papain und Bromelain, die in Waschmittelzubereitungen zur Entfernung von Proteinflecken mit wechselndem Erfolg verwendet wurden. Andererseits wurden spezifische Glykosidasen, wie Cellulase, Lysozym, Amylase und Glucanase, mit verschiedenen Waschmitteln zur Entfernung von bestimmten Kohlehydratflecken zubereitet. Andere Waschmittelzubereitungen vereinten Proteasen und Glykosidasen zur Fleckenbehandlung.
Einige der in Waschmittelzubereitungen verwendeten Glykosidasen, z.B. β-Amylase, α-Galactosidase und β-Galactosidase, sind Exoglykosidasen, die einen oder mehrere terminale Reste von einem Oligosaccharid oder Polysaccharid abspalten. Andere Glykosidasen, z.B. Cellulase und α-Amylase, sind Endoglykosidasen, die mit spezifischen internen Bindungen innerhalb eines Oligo- oder Polysaccharidsubstrats reaktiv sind. Solche Endoglykosidasen werden hier als Endoglykosidasen vom Typ I bezeichnet. Während Waschmittelzubereitungen mit einer oder mehreren Proteasen und/oder Glykosidasen (einschließlich Endoglykosidasen vom Typ I) eine stark verbesserte Fleckenentfernung aufweisen, hinterlassen viele Flecken, z.B. Blut, Kot und Körperschmutzflecken, nach der Behandlung oft einen Restfleck.
Auf dem Fachgebiet der Kontaktlinsenreinigung wurden entsprechende Enzym/Waschmittelzubereitungen verwendet, um harte und weiche Kontaktlinsen zu reinigen und zu sterilisieren. In vielen Fällen wurden diese Zubereitungen zum Abbau des Biofilms verwendet, welcher sich auf der Oberfläche von Kontaktlinsen bildet und der von verschiedenen ophthalmologischen Krankheitserregern, wie Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus epidermidis, verwendet wird, um sich an solche Linsen zu binden. Vgl. z.B. Duran J.A. et al., Arch. Ophthalmol 105 (1987), 106-109; Stern G.A. et al., Ophthalmology 94 (1987), 115-119 (welche über die Behandlung von mit Mucin überzogenen Kontaktlinsen mit verschiedenen Enzymen, wie Pankreatin, Papain, Trypsin und Neuraminidase, zur Hemmung der Pseudomonas-Anhaftung berichten), und Slucher M.M. et al., Arch. Ophthalmol 105 (1987), 110-115.
Die Verwendung von Biofilmen zur mikrobiellen Adhäsion ist nicht auf Kontaktlinsen beschränkt. So wurde berichtet, daß Streptococcus mutans extrazelluläre Polysaccharide zur Anhaftung an den Zahnschmelz verwendet. Die EPO-Veröffentlichung Nr. 0195672 berichtet über die Verwendung von α-1,3-Glucanase oder α-1,6-Glucanase zur Spaltung der extrazellulären Polysaccharide, welche von Streptococcus mutans zur Anhaftung an den Zahnschmelz verwendet werden.
Über die Wirkung bestimmter Enzyme auf an Glasoberflächen anhaftenden Zellen wurde auch von Danielsson A. et al. berichtet, Botanica Marina 20 (1977), 13-17. Wie darin berichtet, ließ man aus Meerwasser isolierte Pseudomonas-Arten sich auf Objektträgern aus Glas anhaften. Danach wurden die Objektträger entweder mit Pronase, Trypsin, α-Amylase (eine Endoglykosidase vom Typ I) oder Lysozym (auch eine Endoglykosidase vom Typ I) behandelt. In diesem Bericht führte die Behandlung mit den proteolytischen Enzymen Pronase und Trypsin zur Freisetzung eines Teils der Population der gebundenen Bakterien, während das zellzerstörende Enzym Lysozym im Vergleich zu den proteolytischen Enzymen eine verringerte Aktivität zeigte. Die α-Amylase soll überhaupt keine Wirkung aufgewiesen haben.
Zusätzlich zur Anhaftung von Mikroorganismen an Kontaktlinsen, Zahnschmelz und Glasoberflächen sind viele andere Oberflächen ein Subjekt der mikrobiellen Anhaftung. Vgl. z.B. Marrie T.J. et al., J. Clin. Microbiology 19 (1984), 991-914 (bakterielle Anhaftung an Herzschrittmacherableitungen und -netzteile); Freimer N.B. et al., Acta. Path. Microbiol. Scand. Sectb. 86 (1978), 53-57 (Bindung von Mikroorganismen an Makrophagen), und Mirelman et al., Tokai J. Exp. Clin. Med. 7 (1982), 77-183 (mikrobielle Anhaftung an Säugerschleimhautoberflächen). Verschiedene Mechanismen wurde vorgeschlagen, um die Adhäsion von Mikroorganismen, wie Bakterien, an nicht biologischen festen Oberflächen zu beschreiben. Vgl. z.B. Fletcher M., Microbiological Sciences 4 (1987), 133-136, und Duddridge J.E. et al., Factors Affecting the Adhesion of Bacteria to Surfaces in Microbial Corrosion (1983), Delco Printing Co., Ltd., 28-35. Während diese Literaturstellen die mikrobielle Anhaftung an verschiedene Oberflächen und die Faktoren diskutieren, die bei einer solchen Bindung beteiligt sein können, diskutieren sie nicht die Regulierung des mikrobiellen Wachstums auf solchen Oberflächen oder deren Entfernung davon.
Die hier verwendeten Endoglykosidasen vom Typ II sind eine Kategorie von Endoglykosidasen, welche spezifische interne glykosidische Bindungen spalten können, die in Glykoproteinen nachgewiesenen wurden. Diese Endoglykosidasen spalten die gesamte oder einen Anteil der Kohlehydrateinheit eines Glykoproteins abhängig von der Lage der reaktiven glykosidischen Bindung im Glykoprotein ab. Beispiele umfassen Endo- β-N-acetylglucosaminidasen (Endo-D, Endo-H, Endo-L, Endo-CI, Endo-CII, Endo-F-Gal- Typ und Endo-F), Endo-α-N-acetylgalactosaminidase und Endo-β-N-galactosidasen. Vgl. z.B. Tarentino A.L. et al., Biochem. 24 (1985), 4665-4671; Arakawa M. et al., J. Biochem. 76 (1974), 307-317; Plummer T.H. et al., J. Biochem. 259 (1984), 10700-10704; Tarentino A.L. et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 67 (1975), 455-462; und Trimble R.B. et al., Anal. Biochem. 141 (1984), 515-522; sowie "Glycoprotein and Proteoglycan Techniques"von Beeley J.G. (1985), Kapitel 6, 153-300, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford. Zusätzlich zur Spezifität für die internen glykosidischen Bindungen von Glykoproteinen wies mindestens eine Endoglykosidase (Endo-β-N- acetylglucosaminidase H) auch eine Spezifität auf, welche die Spaltung von Lipid-gebundenen Oligosacchariden bewirkt (Chalifour R.J. et al., Archives of Biochem. and Biophys. 229 (1983), 386-394) und welche die Spaltung von Di-N-acetylchitobiose-Bindungen in Oligosacchariden und Glykoproteinen bewirken soll (Tarentino A.L. et al., J. Biol. Chem. 249 (1974), 811-817).
Im allgemeinen wurden solche Endoglykosidasen vom Typ II hauptsächlich für analytische Zwecke verwendet, z.B. zur Bestimmung der Protein- oder Kohlehydratsequenz und/oder der Struktur und Funktion spezifischer Glykoproteine. Vgl. z.B. Hsieh P. et al., J. Biolchem. 258 (1982), 2555-2561, und Geyar R. et al., Eur. J. Biochem. 143 (1984), 531-539. In einem vor kurzem erschienenen Bericht wurde über die Verwendung einer Endoglykosidase vom Typ II zur Analyse eines Glykoproteinantigens von Leishmania mexicana amazonensis berichtet. Chin Shen Chang et al., Mol. Biochem. Parasitol 18 (1986), 197-210. Dieses Glykoproteinantigen wurde zuerst immunologisch an Immunobeads gebunden. Nach der Umsetzung des immunologisch gebundenen Glykoproteins mit analytischen Mengen von Endo-H wurden die Immunobeads gewaschen und bei der Präparation für die Polyacrylamidgelelektrophorese in 1% SDS enthaltendem Puffer gekocht. Diese Analyse zeigte eine Abnahme des Molekulargewichts, die auf die Abspaltung des Kohlehydrats aus dem immunologisch gebundenen Glykoproteinantigen zurückzuführen ist.
Endoglykosidasen vom Typ II wurden jedoch nicht zur Entfernung von Stoffen, einschließlich Glykoproteinen und Glykolipiden, von Oberflächen von Materialien, wie Stoff, Kontaktlinsen, Metallen, Keramik, Zellen, Gewebe und ähnlichem, verwendet. Noch wurden sie zur Bekämpfüng des Mikroorganismuswachstums in einer Suspension oder auf solchen Oberflächen verwendet.
Glykosidasen wurden in Verbindung mit anderen Enzymen zur Entfernung verschiedener Substanzen verwendet. Bei Anderson et al., Biochem. J. 90 (1964), 30, werden β-Glykosidasen als Kohlehydrat-metabolisierende Enzyme beschrieben. Bei Khorlin et al., FEBS Letters 8 (1979), 17, und Haskell et al., J. Med. Chem. 13 (1970), 48, werden Neuraminidase (N-Acetylneuraminiatglykohydrolase)-Inhibitoren als mögliche antivirale, antibakterielle Mittel angesehen. Bei Chaiet et al., Appl. Microbiol. 20 (1970), 421, wird beschrieben, wie Dextranase die Hydrolyse des bakteriellen Polysaccharids Dextran (α-1,6-Glucan) zu Isomaltoseresten katalysiert. Bei Chipman et al., Science 165 (1969), 454, und Montague, Biochem. Biophys. Acta. 86 (1964), 588, wird beschrieben, wie Lysozym (Muramidase) die glykosidische Bindungen in der Mucopolysaccharidzellwandstruktur einer Vielzahl von Mikroben hydrolysiert. Die Hemmung von Lysozym durch D-Glucosamin-Derivate wird bei Neuberger et al., Nature 215 (1967), 524, beschrieben.
Endoglykosidasen vom Typ II, wie Endo-β-N-acetylglucosaminidase-H, -D, -F und/oder PNGaseF, wurden jedoch vorher nicht mit antimikrobiellen Mitteln zur Bildung von antimikrobiellen Zusammensetzungen kombiniert.
Die vorstehend diskutierten Literaturstellen werden nur wegen ihrer Offenlegung vor dem Einreichungsdatum des vorliegenden Falls aufgeführt.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein erfindungsgemäßes Ziel ist die Bereitstellung von Verfahren unter Verwendung von Endoglykosidasen vom Typ II allein oder in Verbindung mit anderen Enzymen, Waschmitteln, Reinigungsmitteln, Tensiden und/oder Disulfid-spaltenden Mitteln, um die Entfernung von Mikroorganismen, wie Bakterien, von der Oberfläche von Materialien, wie Stoff, Kontaktlinsen, Metallen, Keramik, Zellen, Gewebe und ähnlichem, zu erleichtern.
Gemäß diesem Ziel umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Freisetzung mindestens eines Teils eines Mikroorganismus von einer Oberfläche, an der er gebunden ist. Der Mikroorganismus ist zum Teil durch eine mit einer Endoglykosidase vom Typ II reaktiven Bindung an die Oberfläche gebunden. Das Verfahren umfaßt die Spaltung dieser Bindung mit einer Endoglykosidase vom Typ II, um mindestens einen Teil des Mikroorganismus von der Oberfläche freizusetzen. Ein zweites Enzym, ein Waschmittel und/oder ein Tensid kann in Verbindung mit diesem Verfahren verwendet werden, um den abgespaltenen Teil des Mikroorganismus von der Oberfläche zu entfernen.
Bei den obigen Verfahren kann ein Disulfid-spaltendes Reagens verwendet werden, um das mit dem Mikroorganismus assoziierte Protein zu denaturieren, wodurch die Spaltung durch eine Endoglykosidase vom Typ II oder ein zweites Enzym oder die Entfernung durch ein Waschmittel und/oder ein Tensid erleichtert wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 veranschaulicht die gemeinsame Kernstruktur von N-gebundenen und O-gebundenen Glykoproteinen.
Figur 2 veranschaulicht die Substrate und bekannte Spaltstellen für verschiedene Endoglykosidasen vom Typ II.
Figur 3 ist eine allgemeine Darstellung der Proteinaminosäuren, der Kohlehydratreste und der Spaltstellen von Figur 2.
Figur 4 veranschaulicht die Kernstruktur eines N-gebundenen Glykoproteins, die Spaltstelle einer Endoglykosidase vom Typ II und die Beziehung zwischen den Protein- und Kohlehydrateinheiten sowie die nach der Spaltung mit einer Endoglykosidase vom Typ II erzeugten Aglykon- und Kohlehydratanteile.
Die Figuren 5A-5E veranschaulichen verschiedene Mechanismen, wodurch eine Glykosid-enthaltende Substanz, Mikroorganismen oder Stoffe, die mit einer Endoglykosidase vom Typ II reaktive sind, von einer Oberfläche durch die Behandlung mit einer Endoglykosidase vom Typ II allein oder in Verbindung mit einem zweiten Enzym freigesetzt werden können.
Die Figuren 6A und 6B sind elektronenmikrographische Darstellungen (8100x) von Nylonmustern, die mit Kot gefärbt und entweder mit oder ohne Endo-H behandelt wurden.
Die Figuren 7A bis 7H sind elektronenmikrographische Darstellungen (5000x), welche die Wirkung von Endo-H und von anderen Carbohydrase-Enzymen auf mit Kot gefärbte Baumwollmuster zeigen.
Die Figuren 8, 9, 10A und 10B demonstrieren die Wirkung verschiedener Konzentrationen von Endo-H und Chlorhexidin, allein oder in Kombination, auf die Lebensfähigkeit von E. coli.
Die Figuren 11 und 12 beweisen, daß eine Endo-H enthaltende Waschmittelzusammensetzung bei der Entfernung von S. aureus von Schweinehaut wirksamer ist als eine Waschmittelzusammensetzung, die kein Endo-H enthält.
Figur 13 zeigt, daß Endo-H bei der Entfernung von Schimmel von einem Duschvorhang wirksamer ist als Wasser oder eine Waschmittelzusammensetzung. Die mittlere Photographie zeigt einen Teil des Duschvorhangs. Die anderen vier Photographien sind Vergrößerungen der entsprechenden Quadranten der mittleren Aufnahme.
Figur 14 demonstriert die antimikrobielle Wirkung von Endo-H in Verbindung mit unterschiedlichen antimikrobiellen Mitteln.
Die Figuren 15A-B und 16A-B zeigen die Wirkung von Endo-H auf unterschiedliche Hefearten.
Die Figuren 17 und 18 demonstrieren die verstärkte Entfernung von Kot von Windelmaterial durch eine Endo-H enthaltende Waschmittelzusammensetzung.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Endoglykosidasen vom Typ II und Zubereitungen, welche solche Endoglykosidasen verwenden, werden bei den erfindungsgemäßen Verfahren zur Freisetzung und/oder Entfernung von mit Endoglykosidasen vom Typ II reaktiven Substanzen von einer Oberfläche verwendet. Der Mechanismus dieser Reaktivität ist nicht mit Sicherheit bekannt. In einigen Fällen sind solche Stoffe Glykoside oder Glykosid-enthaltende Substanzen, von denen man annimmt, daß sie glykosidische Bindungen aufweisen, die bekannte Spaltstellen für Endoglykosidasen vom Typ II sind, oder Bindungen, welche mit solchen Spaltstellen nahe verwandt sind.
Der hier verwendete Begriff "Endoglykosidasen vom Typ II" bezieht sich auf Enzyme, welche Bindungen an oder nahe der Verbindung der Protein- und Kohlehydrateinheiten eines Glykoproteins spalten können. Vorzugsweise können solche Endoglykosidasen vom Typ II mindestens eine glykosidische Bindung innerhalb von etwa drei glykosidischen Bindungen der Protein-Kohlehydrateinheit-Verbindung spalten (einschließlich der glykosidischen Bindung, welche die Protein-Kohlehydrat-Verbindungsstelle umfaßt). Besonders bevorzugt befinden sich solche glykosidische Bindungen innerhalb von etwa zwei glykosidischen Bindungen der Protein-Kohlehydrateinheit-Einheit (vgl. Figuren 1, 2 und 3).
Endoglykosidasen vom Typ II werden auch durch ihre Spezifitäten für die in Figur 1 für die bekannten Kernstrukturen von N- und O-gebundenen Glykoproteinen dargestellten einzelnen glykosidischen Bindungen definiert. Diese entsprechen den glykosidischen Bindungen zwischen den Aminosäuren Serin, Threonin oder Asparagin und dem ersten Kohlehydratrest und den glykosidischen Bindungen zwischen mindestens den ersten, zweiten und dritten Kohlehydratresten. Obwohl diese Kernstruktur nachstehend ausführlicher in Hinsicht auf die spezifischen glykosidischen Bindungen beschrieben wird, die in bekannten Kernstrukturen vorliegen, sollen solche spezifische Bindungen diese Definition der Endoglykosidasen vom Typ II nicht begrenzen. Demgemäß definieren alle möglichen glykosidischen Bindungen zwischen diesen Aminosäuren und Kohlehydratresten die Kernstruktur des zur Identifizierung der Endoglykosidasen vom Typ II verwendeten N- und O-gebundenen Glykoproteins.
Endoglykosidasen vom Typ II werden durch die derzeitige Kenntnis der Glykoproteinkernstruktur und der Spezifität der bekannten Endoglykosidasen für solche Kernstrukturen nicht begrenzt. Ein Vergleich der Kernstrukturen in Figur 1 mit den bekannten Substraten für Endoglykosidasen vom Typ II in Figur 2 zeigt, daß Endoglykosidasen vom Typ II für jede der möglichen Spaltstellen in den Kernstrukturen in Figur 1, falls sie existieren, noch nicht identifiziert wurden. Außerdem können auch andere Kernstrukturen existieren, die noch nicht identifiziert wurden. Endoglykosidasen, die mit Bindungen in solchen noch unbekannten Kernstrukturen reaktive sind, sind ebenfalls Endoglykosidasen vom Typ II. Demgemäß sind die glykosidischen Bindungen in Glykoproteinen, welche Endoglykosidasen vom Typ II definieren, nicht auf jene begrenzt, die sich innerhalb der ersten drei glykosidischen Bindungen befinden, welche der Proteineinheit des Glykoproteins am nächsten kommen, sondern können entferntere glykosidische Bindungen in der Kernstruktur, z.B. die vierte oder fünfte glykosidische Bindung von der Proteineinheit, abhängig von der identifizierten Kernstruktur umfassen.
Die Spezifität für die Kernstruktur der Glykoproteine stellt eine einfache Definition der Endoglykosidasen vom Typ II bereit, welche sie von Endoglykosidasen vom Typ I unterscheidet. Endoglykosidasen vom Typ I spalten spezifische Bindungen in Oligo- oder Polysacchariden, aber sind im allgemeinen nicht mit jenen glykosidischen Bindungen der Kernstruktur in Glykoproteinen reaktiv, die Endoglykosidasen vom Typ II definieren.
Beispiele von Endoglykosidasen vom Typ I und die Bindungen, mit denen sie reaktiv sind, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 Endoglykosidase vom Typ Substrat Oligo- oder Polysaccharid α-Amylase Cellulase Hyaluronidase Lysozyme: Hühnereiweiß-Lysozym T4-Lysozym Mutanolysin Pullulanase * GlcA bedeutet D-Glucuronsäure. MurNAc entspricht N-Acetylmuraminsäure. I zeigt die Spaltstelle an.
Spezifische glykosidische Bindungen in Glykoproteinen, welche Endoglykosidasen vom Typ II definieren und die bevorzugte Endoglykosidasen vom Typ II identifizieren, sind in Figur 2 dargestellt. Die Spaltstellen werden durch einen senkrechten Pfeil angezeigt. Eine allgemeine Darstellung der Proteinaminosäuren, der Kohlehydratreste und der Spaltstellen von Figur 2 wird in Figur 3 gezeigt. Man erkennt, daß Endoglykosidasen vom Typ II vorzugsweise die ersten, zweiten oder dritten glykosidischen Bindungen in N- oder O-gebundenen Glykoproteinen spalten. Diese Bindungen umfassen die glykosidischen Bindungen (1) zwischen Asparagin, Serin oder Threonin in der Proteineinheit und dem ersten Kohlehydratrest, (2) zwischen den Kohlehydratresten 1 und 2 bzw. (3) zwischen den Kohlehydratresten 2 und 3. Diese Spezifität wird hauptsächlich durch die Kohlenhydratsequenz des Glykoproteins definiert, wobei die Spezifität und Reaktivität in einem gewissen Umfang durch die Proteineinheit des Glykoproteins beeinflußt wird. Folglich können Endoglykosidasen vom Typ II in Hinsicht auf die glykosidischen Bindungen 2 und 3 (welche nur die glykosidischen Bindungen zwischen Kohlehydratresten umfassend) mit identischen oder ähnlichen glykosidischen Bindungen reaktiv sein, die in anderen Bereichen eines Glykoproteins vorliegen, möglicherweise weit entfernt von der Verbindung der Protein- und Kohlehydrateinheiten des Glykoproteins.
Eine Anwendung der vorstehenden Definition auf ein bestimmtes Glykoprotein veranschaulicht sie. Rinderthyroglobulin wurde unter Verwendung von Endo-β-N-acetylglucosaminidase-H (Endo-H), α-Mannosidase und β-Mannosidase analysiert. Tarentino A.L. et al., J. Biol. Chem. 218 (1973), 5547. Endo-H hydrolysiert die glykosidische Bindung zwischen den zwei N-Acetyl-D-glucosaminen, wobei eines von ihnen an einen Asparaginrest in der Proteineinheit des Thyroglobulins N-gebunden ist. Der nach der Behandlung mit Endo-H freigesetzte Oligosaccharid- oder Kohlehydratanteil des Thyroglobulins wurde ebenfalls mit α- und β-Mannosidase behandelt. Da keines dieser Enzyme eine Spezifität für die Substrate besitzt, welche jenen in den Figuren 1, 2 oder 3 entsprechen, sind sie keine Endoglykosidasen vom Typ II und können entweder als Exoglykosidase oder Endoglykosidase vom Typ I charakterisiert werden. Die Spezifität von Endo-H entspricht der in Figur 2 für Endo-H aufgeführten, und Endo-H ist deshalb eine Endoglykosidase vom Typ II. Dies ist natürlich eine unbedeutende Anwendung. Aber, wenn eine neue Endoglykosidase (z.B. Endo-X) entdeckt wird, welche auch diese Spezifität oder eine oder mehrere der anderen Spezifitäten in den Figuren 1, 2 oder 3 aufweist, wäre Endo-X auch eine Endoglykosidase vom Typ II.
Diese Definition einer Endoglykosidase vom Typ II, welche auf ihrer Spezifität für Glykoproteine basiert, sollte jedoch nicht auf den durch Endoglykosidasen vom Typ II verwendeten Mechanismus zur Freisetzung und/oder Entfernung einer Substanz von einer Oberfläche begrenzt werden. Während in einigen Fällen angenommen wird, daß Endoglykosidasen vom Typ II mindestens einen Teil eines Glykosids von einer Oberfläche durch die Reaktion mit einer glykosidischen Bindung in dem Glykosid abspalten, ist die Erfindung nicht auf eine solche Abspaltung begrenzt. Die Wirkung der Endoglykosidasen vom Typ II wird eher funktionell durch ihre Fähigkeit definiert, mindestens einen Teil einer beliebigen Substanz abzuspalten, die mit einer Endoglykosidase vom Typ II reaktiv ist.
Der hier verwendete Begriff "Endoglykosidase" umfaßt Endoglykosidasen vom Typ I und Typ II.
Der hier verwendete Begriff "Glykosid" bezieht sich auf ein Polymer, das einen oder mehrere "Kohlehydratanteile" kovalent an einen "Aglykonanteil" über eine glykosidische Bindung gebunden hat. Diese Definition des Glykosids leitet sich von der üblichen Definition des Glykosids ab, welche sich auf eine Verbindung bezieht, die aus der Hydrolyse eines Zuckers und eines Aglykons hervorgeht, wobei das Aglykon die aus einer solchen Hydrolyse resultierende nicht-Zucker-Verbindung ist. Gemäß der hier verwendeten Definition erzeugt ein Glykosid ein Aglykon und einen Oligo- oder Polysaccharidkohlehydratanteil, wenn es durch eine Endoglykosidase vom Typ II gespalten wird. Die Aglykon-Einheit jedoch ist nicht auf eine nicht-Zucker-Verbindung begrenzt, da Endoglykosidasen vom Typ II ein Glykosid hydrolysieren können, wobei ein Aglykonanteil erzeugt wird, der abhängig von der Spaltstelle der Endoglykosidase vom Typ II eine oder mehrere Zuckerreste enthält. Weiterhin kann der Aglykonanteil wie bei Peptidoglykanen völlig komplex sein, worin vemetzte Peptide vorliegen können, die an eine Kohlehydratmatrix gebunden sind. Folglich umfassen Glykoside Glykoproteine, Glykolipide oder Peptidoglykane, die nach der Behandlung mit einer Endoglykosidase vom Typ II einen Kohlehydratanteil und einen Aglykonanteil erzeugen, wobei der Kohlehydratanteil und der Aglykonanteil durch die Spaltstelle der Endoglykosidase vom Typ II definiert wird. Diese Definition des Glykosids wird aus der folgenden Diskussion deutlich.
Der hier verwendete Begriff "Glykoprotein" bezieht sich auf ein Glykosid, welches ein oder mehrere Oligo- oder Polysaccharide kovalent an ein Peptid oder Protein gebunden aufweist. Oligo- und Polysaccharide werden hier manchmal als "Kohlehydrateinheiten" bezeichnet. Solche Kohlehydrateinheiten können sich jedoch von dem "Kohlehydratanteil" eines Glykosids unterscheiden. Wie in Figur 4 dargestellt, umfaßt eine Kohlenhydrateinheit das gesamte Oligo- oder Polysaccharid, welches an eine zweite Molekülklasse gebunden ist, z.B. an ein Protein oder Peptid, wie in einem Glykoprotein, oder an ein Lipid, wie in einem Glykolipid. Wenn die Endoglykosidase vom Typ II die Kohlehydrateinheit an ihrer Verbindungsstelle mit zum Beispiel einem Protein spaltet dann ist die Kohlehydrateinheit identisch mit dem Kohlehydratanteil eines Glykosids. Wenn jedoch die Endoglykosidase vom Typ II die Glykosideinheit an einer glykosidischen Bindung innerhalb der Kohlehydrateinheit spaltet, dann wird der durch eine solche Spaltung gebildete Kohlehydratanteil des Glykosids weniger als die gesamte Kohlehydrateinheit umfassen. Dieser Unterschied ist in Figur 4 für eine durch den Pfeil angezeigte Spaltstelle einer Endoglykosidase vom Typ II dargestellt.
Die Kohlehydrateinheiten eines Glykoproteins können Oligosaccharide mit 1 bis 10 Kohlehydratresten (Zucker) oder kurze Polysaccharide sein, welche üblicherweise zwischen 10 bis 25 Kohlehydratreste enthalten. Viele Glykoproteine werden von höheren Organismen, wie Eukaryonten, einschließlich Hefe und Säugerzellen, hergestellt. Die Bindung zwischen der Kohlehydrateinheit und der Peptid- oder Proteineinheit eines Glykoproteins ist eine glykosidische Bindung, welche aus einer Kondensationsreaktion zwischen einer Aminosäureseitenkette der Proteineinheit und dem anomeren Kohlenstoffatom an dem ersten Rest der Kohlehydrateinheit hervorgeht. Solche glykosidische Bindungen in Säugerglykoproteinen sind entweder N-glykosidische Bindungen (Kohlehydrat gebunden an das Amidostickstoffatom von Asparagin) oder O-glykosidische Bindungen (Kohlehydrat gebunden an das Hydroxysauerstoffatom von Serin oder Threonin).
Die Kohlehydratreste (Monosaccharide) einer Kohlehydrateinheit (Oligo- oder Polysaccharid) können auf viele unterschiedliche Weisen miteinander verbunden sein. So können solche Kohlehydrateinheiten unverzweigte lineare Strukturen oder komplexe verzweigte Strukturen sein. Im allgemeinen ist jedoch ein jeder der Kohlehydratreste in der Kohlehydrateinheit durch eine glykosidische Bindung verknüpft, wobei das anomere Kohlenstoffatom eines Kohlehydratrestes mit dem Hydroxylkohlenstoffatom in einem anderen Kohlehydratrest kondensiert ist. Solche glykosidische Bindungen können abhängig von der Konfiguration des anomeren Kohlenstoffatoms entweder vom alpha- oder beta-Typ sein. Das anomere Kohlenstoffatom eines Restes kann mit einem beliebigen Hydroxylkohlenstoffatom in einem anderen Kohlehydratrest eine chemische Bindung eingehen. Folglich rührt die Komplexität vieler Glykoproteine von den vielen unterschiedlichen glykosidischen Bindungen her, welche in den Kohlehydrateinheiten solcher Moleküle vorliegen.
Viele Membranglykoproteine tragen Asparagin-gebundene Kohlehydrateinheiten (Kohlenhydrateinheiten gebunden an Asparagin in einem Peptid über eine N-glykosidische Bindung). Die Struktur solcher Asparagin-gebundener Glykoproteine können sehr komplex sein. Vgl. z.B. Schachterh, Clinical Biochemistry 17 (1984), 3-14. Die Struktur vieler dieser Asparagin-gebundenen Membranglykoproteine aus einer Vielzahl von Quellen (z.B. Erythocytenplasmamembranglykoproteine, virale Hüllglykoproteine) sowie die Struktur von löslichen Nicht-Membran-Glykoproteinen zeigt, daß die zwei Glykoproteintypen viele Strukturmerkmale gemeinsam haben. Id. bei 3. Die gemeinsame Kernstruktur von solchen Asparagin-gebundenen Glykoproteinen ist in den Figuren 1 und 4 dargestellt, wobei GlcNAc N-Acetyl-D-glucosamin und Man Mannose bedeuten. Die Bezeichnungen α1-6, α1-3 und β1-4 beschreiben die Art der glykosidischen Bindung zwischen den verschiedenen Kohlehydratresten. Diese Kernbindung bildet die Grundlage zahlreicher Glykoproteine mit einer beliebigen Anzahl von an den Kern gebundenen Kohlehydratresten. Id. bei 5. O-gebundene Glykoproteine enthalten eine Kernstruktur, worin die Proteineinheit des Glykoproteins an die Kohlehydrateinheit über die Hydroxylgruppe von entweder Serin oder Threonin gekoppelt ist. Ein gemeinsames Merkmal dieser Kernstruktur ist die Gegenwart von an Serin oder Threonin gebundenem N-Acetyl-D-galactosamin (GalNAc). Andere Einzelheiten solcher Glykoproteine sind in Figur 1 dargestellt, wobei NeuAc N-Acetylneuraminsäure, Gal Galaktose und L-Fuc L-Fucose bedeuten. Wenn Gal der zweite Kohlehydratrest ist, ist die glykosidische Bindung zwischen GalNAc und Gal üblicherweise vom β1-3-Typ. Für eine Übersicht der Strukturbiosynthese und der Funktion der Glykoproteine, einschließlich N- und O-gebundenem Glykoprotein, vgl. Berger E.G. et al., Experimetia 38 (1982), 1229-1258.
Niedere Organismen wie Prokaryonten, z.B. die Bakterien E. coli, Pseudomonas-Arten, Bacillen-Arten, produzieren eher Peptidoglykane als Glykoproteine. Peptidoglykane findet man in den Bakterienzellwänden und sie weisen üblicherweise ein Polysaccharidgerüst von N-Acetylglucosamin und N-Acetylmuraminsäure auf, die miteinander abwechseln. Peptidseitenketten sind manchmal mit den N-Acetylmuraminsäureresten assoziiert, wobei vernetzende Peptidbrücken oft zwischen den Peptidseitenketten eingeschoben sind. Die Zellwand von Gram-positiven Bakterien umfaßt üblicherweise etwa 10% Peptidoglykan, während die Zellwand Gram-negativer Bakterien typischerweise einen Peptidoglykangehalt von etwa 50% aufweisen.
Jedoch sind Peptidoglykane keine Glykoproteine, so daß spezifische glykosidische Bindungen in Glykoproteinen zur Definition der Klasse von Endoglykosidasen vom Typ II verwendet werden. Folglich ist Endo-H eine Endoglykosidase vom Typ II, da sie die glykosidische Bindung zwischen den zwei N-Acetylglucosaminzuckerresten spaltet, die in einigen Glykoproteinen vorliegen, welche N-gebundene Oligosaccharid enthalten. Vgl. Figur 4. Jedoch kann Endo-H auch eine noch nicht definierte Reaktivität mit Petidoglykan aufweisen, da es fähig ist, die Entfernung von Kot von einer Oberfläche wie Stoffmustern zu erleichtern. Es ist bekannt, daß solche Fäkalien Peptidoglykane enthalten, die mit Darmbakterien assoziiert sind. Lysozyme sind Enzyme, die mit Peptidoglykan reaktiv sind. Lysozyme, wie Hühnereiweißlysozym, T4-Lysozym und Mutanolysin (Goodman et al., J. Bacteriol 146 (1981), 755), sind jedoch keine Endoglykosidasen vom Typ II, da sie keine wesentliche Reaktivität mit den in N- und O-gebundenen Glykoproteinen vorliegenden einzigartigen glykosidischen Bindungen zeigen, welche zur Definition von Endoglykosidasen vom Typ II verwendet werden. Sie sind jedoch mit Petidoglykanen reaktiv, wobei Disaccharide von N-Acetylglucosamin und N-Acetylmuraminsäure erzeugt werden, die gebundene Peptidseitenketten enthalten. So werden Lysozyme geeigneter als Endoglykosidasen vom Typ I charakterisiert. Folglich, auch obwohl sich Lysozyme und Endo-H in der Reaktivität mit Peptidoglykanen überschneiden, sind sie in Hinsicht auf die Spezifität von Endo-H für und das deutliche Fehlen der Reaktivität von Lysozym mit den glykosidischen Bindungen in Glykoproteinen, welche Endoglykosidasen vom Typ II definieren, zum größten Teil gegenseitig exklusiv.
Der hier verwendete Begriff eine "Glykosid-enthaltende Substanz" oder eine "Glykoprotein-enthaltende Substanz" bezieht sich auf ein Glykosid oder Glykoprotein allein oder ein Glykosid oder Glykoprotein, welches mit einer anderen Komponente kombiniert ist. Folglich umfassen Glykosid-enthaltende Substanzen Glykoside wie Glykoproteinenzyme, z.B. alkalische Phosphatase, Bromelain, Carboxypeptidase-Y; Glykoproteinhormone, z.B. Choriongonatotropin, Erythropoietin; Lektine, z.B. diejenigen, welche von Kartoffel und Sojabohne abgeleitet werden; Serumglykoproteine, z.B. IgG-Immunglobulin, Thyroglobulin, Prothrombin, und gemischte Glykoproteine, wie Hämoglobin und Interferon; und komplexe Kohlehydrate. Beispiele von Glykosiden, die mit einer anderen Komponente kombiniert sind, schließen Membranbestandteile umfassende Glykoproteine ein, z.B. von menschlichen Erythrocyten enthaltenes Glykophorin, vom Grippevirus enthaltenes Hämagglutinin, in Rinderretina enthaltenes Rhodopsin und von Fibroblasten enthaltenes Collagen. Weitere Glykosid-enthaltende Substanzen umfassen Virushüllglykoproteine und fäkale Stoffe, welche zum Teil mit Darmbakterien assoziierte Peptidoglykane enthalten. Folglich werden Viren, Fibroblasten oder Kot als Glykosid-enthaltende Substanzen angesehen.
Der hier verwendete Begriff ein "Mikroorganismus" (manchmal bezeichnet als Glykosid- enthaltender Mikroorganismus) bezieht sich auf einen Mikroorganismus, der von der Oberfläche eines Stoffes, an den er gebunden ist, durch eine Endoglykosidase vom Typ II abgespalten werden kann. Beispiele schließen die Darmbakterien ein, welche in Kot vorliegen, und Bakterien, die gewöhnlich Kontaktlinsen kontaminieren. Andere Beispiele umfassen Pilze und Algen, welche von einer Oberfläche durch Endoglykosidasen vom Typ II abgespalten werden können.
Der hier verwendete Begriff "in vitro" bezieht sich auf die Umgebung in der die erfindungsgemäßen Verfahren und Methoden durchgeführt werden. Er wird nur zur Unterscheidung von dem Begriff "in vivo" verwendet, der die Umgebung beschreibt, in der Endoglykosidasen vom Typ II natürlicherweise vorkommen, z.B. in Organismen, welche natürlicherweise eine Endoglykosidase vom Typ II produzieren. Demgemäß ist ein in vitro-Verfahren, das eine Endoglykosidase vom Typ II verwendet, eine Methode oder ein Verfahren, welches in der Natur nicht vorkommt. Jedoch begrenzt der Begriff in vitro solche Verfahren nicht auf das "Reagenzglas" oder schließt solche Verfahren von der Durchführung am oder im lebenden Organismus aus. Die erfindungsgemäßen Verfahren können auf eine Vielzahl von anderen Oberflächen als Glas angewendet werden, einschließlich Stoff, Kontaktlinsen, Metalloberflächen, Keramikoberflächen, Zelloberflächen, Plastikoberflächen oder Gewebe. Außerdem können solche in vitro-Verfahren zum Beispiel, wie nachstehend ausführlicher beschrieben, in der Mundhöhle des Menschen durchgeführt werden.
Einige bekannte Endoglykosidasen vom Typ II sind in Tabelle II zusammen mit dem natürlichen biologischen Ursprung solcher Enzyme aufgeführt. Die Spaltstellen für einige Endoglykosidasen vom Typ II sind in Figur 2 dargestellt. Vgl. "Glycoprotein and Proteoglycan Techniques" von Beeley J.G. (1985), Kapitel 6, 153-300, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford. Eine nicht in Tabelle II aufgeführte Endoglykosidase vom Typ II ist Glykopeptidase F, welche auch manchmal als PNGaseF bezeichnet wird. PNGaseF kann aus Flavobacterium menigosepticum erhalten werden. Sie ist auch im Handel von Boehringer Mannheim Biochemical, Indianapolis, Indiana, erhältlich. Tabelle II Enzyme Herkunft Typische Substrate Endo-β-N-acetylglycosaminidasen Endo-α-N-cetylgalactosaminidase Endo-β-N-galactosidasen Diplococcus pneumoniae Streptomyces plicatus Streptomyces griseus Clostridium perfringens Sporotricum dimorphosphosphorum Flavobacterium meninogosepticum Escherichia freundii Flavobacterium keratolyticus N-gebundener Komplextyp (pheriphere Zucker entfernt) N-gebundene Typen mit hohem Mannosegehalt und Hybridtypen nur N-gebundener niedermolekulargewichtiger Typ N-gebundener Komplextyp (periphere Zucker entfernt) N-gebundene Typ mit hohem Mannosegehalt N-gebundener Komplextyp (nur zweifach verzweigt benötigt ein terminales Gal) N-gebundene Typen mit hohem Mannosegehalt und Komplextypen O-gebunden, nur Gal-α1-3GalNAc1 Blutgruppendeterminanten A und B Keratansulphat und Oligosaccharide, welche die Sequenz R GlcNAc-β1-3Gal-β1-4GlcNAc (oder Glc) enthalten.
Man erkennt, daß Endo-H, -F, -D -CI und Endo-F-Gal-Typ die zweite glykosidische Bindung in einem Glykoprotein spalten. Beim Endo-F-Gal-Typ befindet sich diese glykosidische Bindung zwischen GlcNAc und Gal. Für Endo-H, -F, -D und -CI erfolgt die Spaltung zwischen zwei GlcNAc umfassenden Resten, wobei die Spezifität durch die Substituenten U, V, W, X, Y und Z definiert wird.
Endo-H spaltet N-gebundene Glykoproteine mit einem hohen Mannosegehalt. So umfaßt in Figur 2 W 2-150 Mannosereste, Y umfaßt 1-2 Mannosereste und X, Z, V und U bedeuten H (Wasserstoffatom). Endo-H spaltet auch Hybridstrukturen, worin W 1-2 Mannosereste umfaßt und worin Y und/oder Z NeuNAc-Gal-GlcNAc oder entsprechende Strukturen umfassen und worin V H oder GlcNAc umfaßt. Endo-H ist die bevorzugte Endoglykosidase vom Typ II, die bei den erfindungsgemäßen Zubereitungen und Verfahren verwendet wird.
Endo-D und Endo-CI weisen ähnliche Reaktivitäten auf obwohl sich diese Enzyme von unterschiedlichen Quellen ableiten. Endo-D und Endo-CI reagieren mit N-gebundenen Oligosacchariden von Glykoproteinen und spalten eine Struktur mit einem hohen Mannosegehalt mit mehr als einem 5-Mannosekohlehydratrest, in diesem Fall umfaßt X Mannose, gebunden an die Kernstruktur über eine α1-3-glykosidische Bindung, W umfaßt Mannose, gebunden an die Kerustruktur über eine α1-6-glykosidische Bindung, und die restlichen Substituenten in Figur 2 sind H. Endo-D spaltet auch einen Kernbereich einer Komplex- oder Hybridstruktur nach der Entfernung der meisten verzweigten Reste durch Exoglykosidasen, in diesem Fall umfaßt in Figur 2 Y H oder GlcNAc und U umfaßt H oder Fucose.
Die Endoglykosidase Endo-F reagiert mit N-gebundenen Glykoproteinen mit einem hohen Mannosegehalt, wobei in Figur 2 X und Y einen oder mehrere Mannosereste darstellen und die restlichen Substituenten H sind. Endo-F spaltet auch zweifach verzweigte Hybridstrukturen, worin X und W Mannose umfassen, gebunden an die Kernstruktur über α1-3- und α1-6-glykosidische Bindungen, und worin Y NeuNAc-Gal- GlcNAc oder eine entsprechende Struktur einschließt und U H oder Fucose umfaßt. Zweifach verzweigte Komplexstrukturen werden ebenfalls von Endo-F gespalten. Solche Strukturen umfassen die Substratkernstruktur für Endo-F in Figur 2, worin X und Y NeuNAc-Gal-GlcNAc oder entsprechende Strukturen umfassen und U H oder Fucose umfaßt.
Endo-L weist eine ähnliche Reaktivität bei der Spaltung der zweiten glykosidischen Bindung in N-gebundenen Glykoproteinen auf Niedermolekulargewichtige Substrate umfassen spezifischerweise Man-GlcNAc-GlcNAc-Asn. Endo-CII zeigt eine ähnliche Spezifität wie Endo-H. Endo-α-N-acetylgalactosaminidase hydrolysiert Glykoproteine, die an Serin oder Threonin O-gebundene Oligosaccharide enthalten, wobei GlcNAc und Gal die ersten zwei Kohlehydratreste sind. Die Spezifität von Endo-β-N-galactosidase ist ebenfalls in Figur 2 dargestellt, wobei R&sub1; einen der Mannosereste darstellen kann, von denen aus Verzweigungen in der Kohlehydrateinheit gebildet werden können.
Die Glykosidase vom Typ II Glykopeptidase F (PNGaseF) spaltet die erste glykosidische Bindung in N-gebundenen Glykoproteinen zwischen Asparagin und GlcNAc. Sie spaltet Strukturen mit einem hohen Mannosegehalt, worin W, X und Y einen oder mehrere Mannosereste und V und Z H umfassen, wobei Fucose im ersten Kohlehydratrest GlcNAc fehlt. Sie spaltet auch Hybridstrukturen, worin W und X Mannose, Y und/oder Z NeuNAc-Gal-GlcNAc oder eine entsprechende Struktur umfassen und worin V H oder GlcNAc umfaßt, wobei Fucose üblicherweise im ersten Kohlehydratrest fehlt. Komplexe Strukturen werden auch von Glykopeptidase F gespalten. Solche Strukturen umfassen die in Figur 2 dargestellte Kernstruktur, worin Y und W NeuNAc-Gal-GlcNAc oder eine entsprechende Struktur und X und Z H, NeuNAc-Gal-GlcNAc oder eine entsprechende Struktur umfassen und worin V H oder GlcNAc umfaßt, und Fucose manchmal im ersten Kohlehydratrest GlcNAc vorliegt.
Es ist bekannt, daß Endo-β-N-galactosidase glykosidische Bindungen innerhalb von Oligosacchariden an einem Glykoprotein oder Glykolipid spaltet. Ein typisches Glykoproteinsubstrat ist zusammen mit der Spaltstelle für Endo-β-N-galactosidase in Figur 2 dargestellt, wobei R&sub2; Protein, Lipid oder Kohlehydrat bedeutet und R&sub1; ein Zuckerrest oder ein Wasserstoffatom ist.
Natürlich wird die Erfindung nicht durch die derzeit bekannte Spezifität der Endoglykosidasen begrenzt. Bis jetzt waren die im Handel erhältlichen Endoglykosidasen wegen ihren verhältnismäßig geringen Expressionsmengen in ihren natürlich vorkommenden Quellen teuer. Demgemäß wurde die Reaktivität solcher Enzyme nicht weiter untersucht. Jedoch wurden mit dem Aufkommen der molekularen Klonierungstechnik größere Mengen der Endoglykosidase verfügbar gemacht oder werden verfügbar gemacht, so daß eine andere Reaktivität und Spezifität für diese oder andere Endoglykosidasen entdeckt werden kann. Eine solche Reaktivität ist im Schutzumfang der Erfindung eingeschlossen.
Demgemäß bezieht sich der hier verwendete Begriff eine "mit Endoglykosidase vom Typ II reaktive Substanz" (auch bezeichnet als "Typ II-reaktive Substanz" oder als Substanz, die eine "Typ II-reaktive Bindung" enthält) auf jede Substanz, die mit einer Endoglykosidase vom Typ II reaktiv ist. Typ II-reaktive Substanzen umfassen natürlich Glykosid- enthaltende Substanzen und Glykoprotein. Ebenfalls eingeschlossen sind jedoch (1) andere noch unbekannte mit einer Endoglykosidase vom Typ II reaktive Substrate, mit einer anderen als einer glykosidischen Bindung, und (2) Multikomponentenaggreagate, welche Komponenten mit Typ II-reaktiven Bindungen enthalten.
Zum Beispiel können Mikroorganismen, wie Bakterien, von Oberflächen durch die Behandlung mit Endo-H entfernt werden. Es ist derzeit nicht bekannt, wie es zu diesem Ergebnis kommt. Es ist nicht bekannt, ob Bakterien Bindungen enthalten, die üblicherweise mit Endo-H reaktiv sind, und die Einzelheiten ihrer Bindung an Oberflächen, andere Mikroorganismen und andere Stoffe sind nicht gut verstanden. Dennoch wurde eine Entfernung von Bakterien durch Endo-H beobachtet.
Ferner können andere Flecken komplexe Aggregate von Stoffen umfassen, wobei einige von ihnen oder alle mit einer Endoglykosidase vom Typ II reaktiv sind. Der Begriff Typ II-reaktive Substanz schließt alle solche Situationen ein. Folglich umfassen die Anwendungen der Endoglykosidase vom Typ II (1) die Reinigung von Oberflächen, welche Typ II-reaktive Substanzen enthalten, (2) die Behandlung von Typ II-reaktiven Substanzen, um einer Anhaflung an eine Oberfläche vorzubeugen und (3) die Behandlung von Typ II- reaktiven Substanzen, wie Mikroorganismen, zur Erzeugung einer antimikrobiellen Wirkung.
Die erfindungsgemäß verwendeten Bndoglykosidasen vom Typ II können aus den in Tabelle II aufgeführten Organismen gemäß den dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Einige der Endoglykosidasen vom Typ II in Tabelle II, z.B. Endo-H aus Streptomyces plicatus (zunächst als Streptomyces griseus klassifiziert) und in S. plicatus oder S. lividans hergestellt und Endo-D aus Diplococcus pneumoniae, sind im Handel von Boehringer Mannheim Biochemical, Indianapolis, IN, erhältlich. Neben den im Handel erhältlichen Präparaten kann Endo-H aus E. coli-Bakterien, die mit einem Plasmid transformiert wurden, welches das Endo-H codierende Gen aus Streptomyces plicatus und den Promotor der alkalischen Phosphatase trägt (Oka T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 7212-7216), durch Verfahren erhalten werden, die jenen entsprechen, welche für die Klonierung und Expression von Endo-H aus Streptomyces plicatus in E. coli beschrieben wurden (Robbins et al., J. Biol. Chem. 256 (1981), 10 640). Vgl. auch Trumbly R.J. et al., J. Biol. Chem. 260 (1985), 5638. Endo-H kann auch aus gentechnisch veränderten Streptomyces-Zellen abgeleitet werden, die so verändert wurden, daß sie Endo-H aus Streptomyces plicatus exprimieren (EPO-Veröffentlichung Nr. 0179449, 30. April 1986). Alternativ kann Endo-H durch jede geeignete Wirtszelle, wie Bacillus subtilis, unter Anwendung von Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Die Aminosäure- und DNA-Sequenz von Endo-H für S. plicatus (S. griseus) wurde veröffentlicht. Robbins P.W. et al., J. Biol. Chem. 259 (1984), 7577-7583.
Die in den folgenden Beispielen verwendete Endo-H wurde im Handel erworben oder aus transformierten E. coli- oder B. subtilis-Wirten erhalten, die so verändert wurden, daß sie Endo-H aus S. plicatus exprimieren.
Eine Einheit der Endo-H-Aktivität entspricht der Enzymmenge, die zur Freisetzung von 1 µMol (³H)-Dansyl-Asn-GlcNAc aus (³H)-Dansyl-Asn-(GlcNAc)&sub4;-(Man)&sub6; bei pH 5,5 bei 37ºC in einer Minute erforderlich ist. Tarentino A. et al., Methods in Enzymology 50 (1978), 574. Die Aktivitätseinheit anderer Endoglykosidasen vom Typ II werden durch ein geeignetes Substrat entsprechend definiert.
Natürlich können andere Endoglykosidasen vom Typ II existieren, die noch nicht identifiziert wurden. Solche Endoglykosidasen vom Typ II sowie die hier beschriebenen, einschließlich alleler Variationen und gentechnischer Modifikationen solcher Endoglykosidasen, sind im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Glykoside und Glykosid-enthaltende Substanzen werden oft an eine große Vielzahl von Oberflächen gebunden. So können zum Beispiel Glykoproteine, wie jene, die mit Blut assoziiert sind (z.B. glykosyliertes Hämoglobin) die Oberflächen von für Kleidung oder Wäsche verwendeten Geweben färben. Solche Flecken waren bisher gegen eine vollständige Entfernung durch die Behandlung mit Waschmitteln oder Waschmitteln in Verbindung mit verschiedenen Enzymen, welche die erfindungsgemäß verwendeten Endoglykosidasen nicht umfassen, sehr beständig. Ein weitere Glykosid-enthaltende Substanz, die Oberflächen wie Gewebe färbt und die ebenfalls durch bekannte Techniken schwierig zu entfernen ist, ist Kot. Solche Kotflecken umfassen verschiedene Glykoside und Glykosid- enthaltende Substanzen, die mit Darmbakterien (z.B. Peptidoglykane), katabolischen Ausscheidungen, einschließlich Glykoproteinen, und nicht absorbierten Nährstoffen assoziiert sind.
Andere Oberflächen, an die Glykoside oder Glykosid-enthaltende Substanzen gebunden werden können, schließen die Oberflächen von harten und weichen Kontaktlinsen ein. Weiche Kontaktlinsen sind üblicherweise hydrophile, vernetzte Polymere mit einer Hydrogelstruktur oder sie werden aus Silikonpolymeren hergestellt. Vgl. z.B. die US- Patente Nrn. 3,403,393 und 2,976,576. Andererseits werden harte Kontaktlinsen üblicherweise aus Methacrylat- oder Methylmethacrylatpolymeren hergestellt. Andere Oberflächen umfassen natürlich vorkommende Biofilme, Herzschrittmacherleitungen und -netzteile, Zell- und Schleimhautoberflächen, Zahnschmelz, zur Entfernung von Bakterien verwendete Filter und bestimmte Materialien bei der Nahrungsmittelverarbeitung; Chemikalien; Filter von Klimaanlagen; die Oberflächen von verschiedenen einer wäßrigen Umgebung ausgesetzten Bauelementen, z.B. Boote und Bootsstege; Kunststoff und -Zusammensetzungen wie Resopal; und Metall oder Metallegierungen wie Stahl oder Aluminium.
Wie nachstehend ausführlicher dargestellt, verstärken Endoglykosidasen vom Typ II allein oder in Verbindung mit einem zweiten Enzym, z.B. Subtilisin, entweder mit oder ohne einem Waschmittel, wirksam die Entfernung von Blut- und Kotflecken von Stoffmustern. Es ist nicht genau bekannt, wie solche Flecken an solchen Mustern haften. Jedoch legt die verstärkte Entfernung solcher Substanzen aus diesen Mustern durch Endoglykosidasen vom Typ II allein oder in Verbindung mit anderen Mitteln nahe, daß mindestens eine glykosidische Bindung zwischen dem Gewebe und dem Anteil des Flecks eingeschoben ist, der nach der Behandlung mit einer Endoglykosidase vom Typ II freigesetzt wird. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse werden die folgenden Mechanismen der Bindung der Glykosid-enthaltenden Substanzen an eine Oberfläche und der Freisetzung und/oder Entfernung solcher Stoffe durch eine Endoglykosidase vom Typ II vorgeschlagen. Diese vorgeschlagenen Mechanismen begrenzen jedoch nicht den Schutzumfang der Erfindung.

Figuren

So kann, wie in Figur 5A gezeigt, eine Glykosid-enthaltende Substanz durch eine andere als eine immunologische Bindung an eine Oberfläche gebunden werden. In dieser Hinsicht ist eine "immunologische Bindung" eine Bindung, die zwischen einem Antigen und einem für dieses Antigen spezifischen Antikörper (polyklonal oder monoklonal) vorliegt. Wie in Figur 5A gezeigt, weist die Glykosid-enthaltende Substanz einen proximalen an die Oberfläche gebunden Anteil auf und von dem proximalen Anteil erstreckt sich ein distaler Anteil nach außen hin. Die proximalen und distalen Anteile sind über eine glykosidische Bindung verknüpft, die mit einer Endoglykosidase vom Typ II reaktiv ist. Wie außerdem in Figur 5A gezeigt, wird der distale Anteil der Glykosid-enthaltenden Substanz von dem proximalen Anteil der Glykosid-enthaltenden Substanz "freigesetzt", wenn die Substanz mit einer Endoglykosidase vom Typ II behandelt wurde. Wenn dieser distale Anteil nicht anders an die Oberfläche gebunden ist, wird er auch leicht von der Oberfläche "entfernt" und mit einer Flüssigkeit abgewaschen.
In Figur 5B ist eine Glykosid-enthaltende Substanz, in diesem Fall ein Glykoprotein, der eine Kohlehydrateinheit und eine Proteineinheit enthält, gebunden an eine Oberfläche dargestellt. Diese Glykosid-enthaltende Substanz enthält außerdem einen Kohlehydratanteil und einen Aglykonanteil, die durch eine mit einer Endoglykosidase vom Typ II reaktiven glykosidischen Bindung miteinander verknüpft sind. In diesem besonderen Fall ist die Glykosid-enthaltende Substanz über den Kohlehydratanteil der Glykosid-enthaltenden Substanz an die Oberfläche gebunden. Wenn die Substanz mit einer Endoglykosidase vom Typ II behandelt wird, wird der Aglykonanteil von dem Kohlehydratanteil der Glykosid-enthaltenden Substanz freigesetzt. Wie in Figur 5A, wird der Aglykonanteil, wenn er nicht weiterhin an die Oberfläche durch andere Mittel gebunden ist, ebenfalls von der Oberfläche entfernt.
Figur 5C veranschaulicht die Situation, in der eine Glykosid-enthaltende Substanz durch mindestens zwei Bindungspunkte gebunden ist. Wie gezeigt, liegt eine glykosidische Bindung zwischen der Oberfläche und der Glykosid-enthaltenden Substanz vor. Zusätzlich liegt auch eine zweite mit einem zweiten Enzym reaktive Bindung zwischen der Oberfläche und dem zu entfernenden Anteil der Glykosid-enthaltenden Substanz vor. Wenn die Substanz nur mit einer Endoglykosidase vom Typ II behandelt wird, wird der Anteil der Glykosid-enthaltenden Substanz, der sich distal von der ersten glykosidischen Bindung befindet, von der Oberfläche mindestens in dem Ausmaß freigesetzt, in dem er über die erste glykosidische Bindung gebunden war. Wenn die Substanz mit einem zweiten mit der zweiten dargestellten Bindung reaktiven Enzym behandelt wird, wird der Anteil der Glykosid-enthaltenden Substanz von der Oberfläche freigesetzt, der sich distal von der ersten glykosidischen Bindung und der zweiten Bindung befindet. Wenn dieser distale Anteil nicht anders an die Oberfläche gebunden ist, d.h. durch andere Kontaktpunkte, die mit anderen Enzymen reaktiv sein können oder empfindlich gegen Waschmittel und/oder Tenside sind, wird dieser distale Anteil wirksam von der Oberfläche entfernt.
Figur 5D zeigt einen Mikroorganismus, der mindestens über einen Teil des Glykosidanteils des Mikroorganismus an eine Oberfläche gebunden ist. Der Glykosidanteil enthält eine mit einer Endoglykosidase vom Typ II reaktive glykosidische Bindung. Ein distal von der glykosidischen Bindung abgespalteter Anteil des Mikroorganismus wird von der Oberfläche freigesetzt, wenn er mit einer Endoglykosidase vom Typ II behandelt wird. Wenn dieser abgespaltene Teil nicht anders an die Oberfläche gebunden ist, wird er ebenfalls von der Oberfläche entfernt. Jedoch können mehrere Kontaktpunkte vorliegen, die eine weitere Behandlung mit anderen Enzymen und/oder einem Waschmittel oder Tensid erforderlich machen.
In Figur 5E ist ein mit einer Endoglykosidase vom Typ II reaktive Substanz gebunden an eine Oberfläche dargestellt. Diese Typ II-reaktive Substanz weist einen proximalen Anteil auf, der an die Oberfläche gebunden ist, und einen distalen Anteil, der sich vom proximalen Anteil nach außen hin erstreckt. Die proximalen und distalen Anteile sind durch eine Typ II-reaktive Bindung verknüpft, die auf eine mit einer Endoglykosidase vom Typ II reaktiven Bindung hinweist. Wenn die Substanz mit einer Endoglykosidase vom Typ II behandelt wird, wird der distale Anteil der Typ II-reaktiven Substanz von dem proximalen Anteil der Typ II-reaktiven Substanz "freigesetzt". Es ist selbstverständlich, daß Typ II- reaktive Substanzen Moleküle, Mikroorganismen oder Aggregate verschiedener Komponenten umfassen können, die an eine Oberfläche binden können. Wenn der distale Anteil der Typ II-reaktiven Substanz nicht durch andere Mittel an die Oberfläche gebunden ist, wird er ebenfalls leicht von der Oberfläche "entfernt" und kann mit einer Flüssigkeit abgewaschen werden.
Die Menge der Endoglykosidase vom Typ II, welche dazu verwendet wird, die Entfernung der in den Figuren identifizierten Substanzen zu bewirken, wird funktionell als eine zur Entfernung des bestimmten Stoffs von einer Oberfläche "wirksame Menge" definiert. Diese Menge kann abhängig von dem zu behandelnden Stoff und der zu behandelnden Oberfläche variieren. Übliche Mengen werden hier in Hinsicht auf die spezifischen beschriebenen Ausführungsformen offengelegt.

Zweite Enzyme

Der Begriff "zweite Enzyme" umfaßt Proteasen, Lipasen, Glykosidasen, wie Lysozym, und Kombinationen davon. Verschiedene Proteasen, die mit einer Endoglykosidase vom Typ II kombiniert werden können, schließen Subtilisin, Bromilain, Papain, Trypsin, Chymotrypsin, Pankreatin, Lysozym und Kombinationen davon ein. Solche Enzyme können aus natürlichen Quellen abgeleitet werden, z.B. Subtilisin aus Bacillus subtilis, oder aus gentechnisch hergestellten Klonen, z.B. Subtilisin und veränderte Subtilisine, wie in der EPO-Veröffentlichung Nr. 0130756 beschrieben. Vgl. auch Wells J.A. et al., Nucleic Acids Res. 11 (1983), 7911-7915; Yang M. et al., J. Bacteriology 160 (1984), 15- 21; Estell D.A. et al., J. Biochemical Chemistry 260 (1985), 6518-6521. Viele solcher Enzyme sind natürlich im Handel erhältlich.
Ergänzend hierzu können Endoglykosidasen vom Typ II mit Lipasen kombiniert werden, wie Lipasen aus Bakterien, Säugern und Pilzen und Kombinationen davon.
Glykosidasen, die als zweites Enzym verwendet werden können, umfassen Exoglykosidasen, eine zweite Endoglykosidase vom Typ II und Endoglykosidasen vom Typ I. Beispiele umfassen α- und β-Amylase, Cellulase, Pektinase, Hemicellulase, Dextranase, verschiedene Glucanasen und ähnliche sowie Kombinationen davon.
Außerdem kann eine Endoglykosidase vom Typ II mit mehr als einem Enzym der obigen Klasse der zweiten Enzyme kombiniert werden, um die Entfernung einer Glykosid-enthaltenden Substanz von einer Oberfläche zu vereinfachen.
Wenn eine Endoglykosidase vom Typ II mit einem oder mehreren zweiten Enzymen kombiniert wird, beträgt das Verhältnis von Endoglykosidase vom Typ II zu zweitem Enzym vorzugsweise 0,01 bis 100 und besonders bevorzugt 1 zu 1.

Disulfid-spaltende Reagenzien

Endoglykosidasen vom Typ II können auch in Verbindung mit Waschmitteln, entweder allein oder in Verbindung mit einem oder mehreren zweiten Enzymen und/oder Disulfidspaltenden Reagenzien, zur Herstellung einer Waschmittelzubereitung verwendet werden. Stoffe, die Disulfidbrücken spalten können, sind verschiedenartig, aber sie lassen sich im allgemeinen in drei Kategorien einteilen: Oxidationsmittel, Reduktionsmittel und diverse weitere Substrate, wie jene, die durch Fumarsäure und Natriumsulfit veranschaulicht werden. Geeignete Oxidationsmittel umfassen Wasserstoffperoxid, Perameisensäure, Natriumperborat und oxidierende Bleichmittel. Wirksame Reduktionsmittel umfassen Dithiothreit (DTT), β-Mercaptoethanol (BME) oder Natriumborhydrid.
Andere Disulfid-Spaltreagenzien, die nicht einfach zu klassifizieren sind, umfassen Quecksilber-(II)-chlorid, Nitroprussid, Tributylphosphin und Phosphothiolat. Ein besonders nützliches Spaltreagens ist Natriumsulfit, das die Sulfitolyse des Disulfids gemäß der Reaktion: R-S-S-R + SO&sub3;&supmin;² R-S-SO&sub3;&supmin;² + &supmin;SR bewirkt. Das Gleichgewicht dieser Reaktion kann durch Entfernen des Thiolanions unter Verwendung von Schwermetallionen oder Oxidationsmitteln verschoben werden. Die Oxidationskraft kann durch Belüftung oder ein Oxidationsmittel, wie CuSO&sub4; oder Natriumperborat, bereitgestellt werden.
Die obige Liste von Stoffen, die Disulfide spalten können, ist nicht abschließend und enthält umgekehrt Substanzen, die wirksam aber nicht notwendigerweise für ein kommerzielles Produkt geeignet sind. Um kommerziell erfolgreich zu sein, muß der zugesetzte Stoff verhältnismäßig billig sein und darf keine unerwünschten Eigenschaften für seine beabsichtigte Anwendung aufweisen. Zum Beispiel, während die Verwendung von Quecksilber-(II)-chlorid bei der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich wäre, wäre sie für übliche, für den kommerziellen Gebrauch beabsichtigte Waschmittelprodukte nicht geeignet. β-Mercaptoethanol und DTT sind kommerziell geeignet, aber sie weisen widerwärtige Gerüche auf. Deshalb sind Natriumsulfit (vorzugsweise in Verbindung mit einem Oxidationsmittel) oder Wasserstoffperoxid, die billig und verhältnismäßig sicher sind, besonders bevorzugte Stoffe für eine kommerzielle Zubereitung. Eine Übersicht der zur Spaltung der Disulfidbrücken nützlichen Stoffe findet man zum Beispiel in Chemical Modification of Proteins (1971), Means G.E. et al., Hrsg., Holden-Day, Inc. San Fransico, CA, Kapitel 8, und in Chemical Reagents for Protein Modification (1984), Lundbald K.L. et al., Hrsg., CRC-Press, Inc., Boca Raton, FL, Kapitel 7.
Üblicherweise stellt die Endoglykosidase vom Typ II allein oder in Verbindung mit einem oder mehreren zweiten Enzymen 0,01-3% (Gew./Gew.) der erfindungsgemäßen Waschmittelzusammensetzungen und kann Disulfid-Spaltreagenzien im Bereich von etwa 10-40% (Gew./Gew.) davon enthalten. Die vorliegenden Mengen hängen natürlich von der Art der Endoglykosidase (und dem zweiten Enzym, falls verwendet) und dem Disulfid-Spaltreagens, der Verdünnung des Waschmittels in der Waschlösung und den Waschbedingungen ab. Jedoch sind die angegebenen Bereich allgemeinen üblich.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Oberflächen mit daran gebundenen Glykoprotein-enthaltenden Substanzen mit der Kombination (gleichzeitig oder aufeinanderfolgend) eines Disulfid-Spaltreagens, einer Endoglykosidase vom Typ II und einem zweiten Enzym bei einem geeigneten pH-Wert und einer geeigneten Temperatur während eines geeigneten Zeitraums behandelt. Diese Bedingungen sind natürlich je nach Wunsch variabel und die Wahl der Endoglykosidase vom Typ II, der Protease und des Disulfid- spaltenden Stoffs hängt in einem gewissen Umfang von dieser Auswahl ab. Jedoch sind einfache Bedingungen häufig pH-Werte zwischen 5 und 12 sowie Temperaturen von 20- 55ºC, insbesondere im Bereich von 40-55ºC, und Reaktionszeiten von bis zu 20 Minuten, üblicherweise sind Reaktionszeiten im Bereich von 10-15 Minuten typisch und werden bevorzugt. Die bevorzugten Reaktionszeiten und -temperaturen entsprechen jenen, die in Haushaltswaschmaschinen, in Waschsalons in der Nachbarschaft und bei professionellen Waschdiensten im allgemeinen verwendet werden, da das Verfahren, um kommerziell anwendbar zu sein, unter Bedingungen durchgeführt werden muß, die üblicherweise für den Verbraucher verfügbar sind.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform werden herkömmliche Waschverfahren unter Verwendung von im Handel erhältlichen Waschmitteln angewendet und die Endoglykosidase vom Typ II, das zweite Enzym und der Disulfid-spaltende Stoff werden häufig, entweder getrennt oder zusammen, ähnlich wie bei Verfahren, bei denen ein Bleichmittel verwendet wird, als Zusatz bereitgestellt. So kann dieser zusammen mit einem Waschmittel zu Beginn des Waschzyklus oder an einigen dazwischenliegenden Stellen zugegeben werden, zum Beispiel nachdem etwa die Hälfte des Waschzyklus beendet ist. Unter Annahme einer Verdünnung einer festen oder flüssigen Waschmittelzusammensetzung von etwa 1:500 (etwa 2 mg/ml des Feststoffs) können bei dieser Anwendungsart beliebige Mengen der Endoglykosidase vom Typ II, des zweiten Enzyms und der Disulfid-Spaltreagenzien zugegeben werden, ohne daß durch diese Verdünnung die obere Grenze vorgeschrieben wird (falls die Endoglykosidase vom Typ II, das zweite Enzym und das Disulfid-spaltende Reagens der Waschmittelzusammensetzung von Anfang an zugegeben worden waren und falls zum Beispiel das Disulfid-spaltende Reagens 50% der Zusammensetzung ausmacht, würden nur 1 mg/ml in der fertigen Waschlösung vorliegen. Außerdem, falls diese Stoffe getrennt zugegeben werden, können Mengen zugegeben werden, die für die bestimmte Endoglykosidase vom Typ II, das Disulfid-spaltenden Reagens und das zweite Enzym am wirksamsten sind.).
Im Hinblick auf die Endoglykosidase vom Typ II und das zweiten Enzym sind üblicherweise nur sehr geringe Mengen erforderlich. Typischerweise werden die Endoglykosidase vom Typ II und das zweite Enzym bis zu einer Endkonzentration von etwa 1-500 µg/ml der Waschlösung für ein jedes Enzym zugegeben. Im Fall des Disulfid-spaltenden Reagens können jedoch größere Mengen als die durch die Verdünnung des Waschmittels erlaubten wünschenswert sein. Zum Beispiel kann die Spaltung der Disulfidbrücken unter Verwendung von Borhydrid mit Konzentrationen höher als 0,2 M Reagens in Gegenwart entsprechender Puffermengen in einfacher Weise ausgeführt werden (Lundbald R.L. et al., Chemical Reagents for Protein Modification, a.a.O.).
Obwohl solche großen Mengen üblich sind, sind sie nicht notwendigerweise erforderlich und niedrigere Konzentrationen sind ebenfalls wirksam. Die Sulfitolyse wird üblicherweise bei Natriumsulfitkonzentrationen im Bereich von 0,1 M ausgeführt, obwohl so niedrige Konzentrationen wie 0,01 M und niedriger auch verwendet werden können. DTT ist wirksam, wenn es in Konzentrationen im Bereich von 0,02-0,1 M zugegeben wird. Kurz zusammengefaßt kann die Konzentration des Disulfid-Spaltreagens innerhalb eines weiten Bereichs für eines dieser Reagenzien variiert werden und die Wirksamkeit aufrechterhalten werden. Die optimale Konzentration für eine bestimmte Anwendung hängt natürlich von der Art des Flecks und der Art des Reagens sowie von den Bedingungen des Waschverfahrens ab, einschließlich der Zeit, Temperatur und dem pH-Wert.
Bei einem anderen und üblicheren Verfahren werden die Endoglykosidase vom Typ II, das zweite Enzym und der Disulfid-spaltende Stoff der Ausgangswaschmittelzusammensetzung zugegeben und das Verfahren wird als Standardwaschverfahren unter Verwendung dieser modifizierten Waschmittel durchgeführt. Unter diesen Verhältnissen ent spricht die Waschmittelzusammensetzung der vorstehend beschriebenen, aber die Menge der Zusammensetzung kann auch in einem Bereich von etwa 0,5 mg/ml bis 10 mg/ml oder mehr der Waschlösung variiert werden, wieder abhängig von den Bedingungen der Waschlösung und dem -verfahren und der Löslichkeit der Waschmittelkomponenten. In allen Fällen begrenzt die Einbeziehung der Endoglykosidase vom Typ II, des Disulfid- Spaltreagens und des zweiten Enzyms in das Waschmittel die Konzentrationen dieser Komponenten entsprechend der Verdünnung des Waschmittels. So, auch wenn eine 1:100 Verdünnung verwendet wird (10 mg/ml) und das Disulfid-Spaltreagens zum Beispiel auf 50% der Waschmittelzusammensetzung begrenzt wird, ist eine maximale Konzentration von 5 mg/ml des Disulfid-Spaltreagens in der resultierenden Waschlösung eine Obergrenze. Üblicherweise beträgt die Konzentration des Disulfid-Spaltreagens im Waschmittel natürlich weniger als 50%, wobei auch niedrigere Konzentrationen des Disulfid- Spaltreagens vorgeschrieben sein können.
Die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittelzusammensetzungen enthalten meistens waschaktive Substanzen, verhältnismäßig kleine Mengen des Disulfid-Spaltreagens, falls verwendet, und sehr kleine Mengen der Endoglykosidase vom Typ II und des zweiten Enzyms, falls verwendet, was im Hinblick auf die Kosten der Enzymkomponenten insbesondere wünschenswert ist. So enthält das Präparat im allgemeinen 60-90% waschaktive Substanzen, einschließlich herkömmlicher kommerzieller Waschmittelzusätze, wie Tensid-Builder und Weißmacher, 0,01-3% Endoglykosidase vom Typ II und zweites Enzym und etwa 10-40% Disulfid-Spaltreagens.
Natürlich ist es auch möglich nur einen dieser drei Zusätze dem Ausgangswaschmittel zuzugeben und die anderen getrennt der Waschflüssigkeit zuzusetzen. Insbesondere kann Endoglykosidase vom Typ II bei einem Vorwaschverfahren zugegeben werden, gefolgt von einem Waschmittel, welches das zweite Enzym enthält, oder die Zugabe des Endoglykosidase enthaltenden Waschmittels kann der Behandlung mit dem zweiten Enzym folgen oder ihr vorausgehen.

Reinigungszusammensetzungen

Endo-D, -F, und -H sind bevorzugte Endoglykosidasen vom Typ II für die Verwendung in Reinigungszusammensetzungen. Endo-H wird besonders bevorzugt.
Für die Entfernung der Glykosid-enthaltenden Substanzen umfassen die vorliegenden Zusammensetzungen abhängig von der Art der Zusammensetzung vorzugsweise 0,1 ppm (Teile pro Million) bis 1200 ppm, stärker bevorzugt 1 ppm bis 1000 ppm und besonders bevorzugt 20 ppm bis 200 ppm Endoglykosidase vom Typ II. Reinigungszusammensetzungen werden bevorzugt. Wäschewaschmittelzusammensetzungen werden hier besonders bevorzugt verwendet und umfassen vorzugsweise 0,1 ppm bis 1200 ppm Endoglykosidase vom Typ II, vorzugsweise 20 ppm bis 200 ppm Endo-D, -F oder -H, besonders bevorzugt 50 ppm bis 125 ppm Endo-H.
Wenn die Zusammensetzungen zur Kontrolle oder Entfernung von Mikroorganismen verwendet werden, umfassen sie vorzugsweise 0,1 ppm bis 1200 ppm, stärker bevorzugt 1 ppm bis 1000 ppm und besonders bevorzugt 20 ppm bis 400 ppm Endoglykosidase vom Typ II, vorzugsweise Endo-H. Reinigungszusammensetzungen werden bevorzugt und umfassen vorzugsweise die gleichen Mengen Endoglykosidase vom Typ II, vorzugsweise Endo-H.
Nachstehend werden Zusammensetzungstypen vorgeschlagen, die Endoglykosidase vom Typ II zur Entfernung von Glykosid-enthaltenden Substanzen und/oder von Mikroorganismen umfassen. Die Zusammensetzungen können auf jede beliebige Weise hergestellt und verwendet werden, welche die Enzymaktivität nicht zerstört. Sie können aus beliebigen Bestandteilen zusammengesetzt sein, welche die Aktivität des Enzyms nicht übermäßig hemmen. Die Zusammensetzungen können Wäschewaschmittel, Geschirrspülmittel, Reinigungsmittel für harte Oberflächen, Zahnschmelzreinigungsmittel, Flüssigseifen und Seifenstücke, Anti-Akne-Zusammensetzungen, transpirationshemmende Mittel, Shampoos, Gesichtscremes, Konservierungsmittel für Obst- und Gemüseoberflächen oder Gewebeerweichungsmittel sein.
Zusätzlich zur Reinigung von Geweben unter Verwendung von herkömmlichen Zyklen in Waschmaschinen können die vorliegenden Reinigungszusammensetzungen auch zur Entfernung von Glykosid-enthaltenden Substanzen und/oder von Mikroorganismen von anderen Oberflächen, wie Metallen und Metallegierungen, wie man sie bei chirurgischen Instrumenten, Pipelines, Metallbehältern und ähnlichem findet; Kunststoff; und Materialgemischen, wie Resopal; und den Oberflächen von Booten, Bootsstegen und ähnlichem verwendet werden. Abhängig von der einzelnen Anwendung kann die Zusammensetzung eine Endoglykosidase vom Typ II allein oder in Verbindung mit einem Disulfid-Spaltreagens, einem zweiten Enzym und/oder einem Waschmitteltensid umfassen.
Endoglykosidase vom Typ II kann auch in einer Zusammensetzung zur Entfernung von Glykosid-enthaltenden Substanzen und/oder von Mikroorganismen, einschließlich Hefen, Pilzen, Algen und Bakterien, von "biologischen Oberflächen", wie Oberflächen der Haut, Hautporen, Haar, Haarfollikel und Gewebe, zubereitet werden. So kann der Fachmann auf dem Fachgebiet der Shampoozubereitungen, Haarpflegemittelzubereitungen, Seifenzubereitungen und der Medizinwissenschaften die vorstehende Offenlegung für Waschmittelzubereitungen ohne weiters übertragen, um eine Endoglykosidase vom Typ II bei solchen Anwendungen einzusetzen. Die so zubereiteten Zusammensetzungen sind bei der Entfernung von Glykosid-enthaltenden Substanzen nützlich, die sich an solche Oberflächen binden können.
Endoglykosidase vom Typ II kann auch in einer Zusammensetzung zur Entfernung von Glykosid-enthaltenden Substanzen und/oder von Mikroorganismen, insbesondere von Hefe und Pilzen, von Oberflächen von Pflanzen, wie Früchten und Gemüse, zubereitet werden. Solche Zusammensetzungen umfassen vorzugsweise nichtionische Tenside.
Ergänzend hierzu kann die Endoglykosidase vom Typ II in einer dem Fachmann bekannten Weise in Deodorantzusammensetzungen zubereitet werden, um Glykosid-enthaltende Substanzen und/oder Mikroorganismen zu entfernen, die für unerwünschte Gerüche verantwortlich sind. Solche Deodorantzusammensetzungen, die eine Endoglykosidase vom Typ II verwenden, können Modifikationen der Zubereitungen für Stifte, Cremes und Sprühdeodorants umfassen, die dem Fachmann bekannt sind.
Außerdem kann eine Endoglykosidase vom Typ II zur Behandlung von Akne zubereitet werden, welche üblicherweise aus einer Entzündung resultiert, mindestens in dem Ausmaß, daß Glykosid-enthaltende Substanzen und/oder Mikroorganismen, die für eine solche Entzündung verantwortlich oder daran beteiligt sind, an eine Oberfläche gebunden sind. Wie bei den vorstehenden Zubereitungen kann der Fachmann bekannte Aknezubereitungen modifizieren, um eine Endoglykosidase vom Typ II allein oder in Verbindung mit anderen Enzymen, Waschmitteln und/oder Tensiden beizumischen.
Wenn eine Endoglykosidase vom Typ II zur Behandlung von Kontaktlinsen verwendet wird, wird sie geeigneterweise in einer Konzentration von etwa 0,1-20 µg/ml in den Reinigungszusammensetzungen verwendet und die Konzentration eines zweiten Enzyms, wie eine Protease, liegt in dem gleichen Bereich, falls solche zweiten Enzyme verwendet werden. Die Behandlungszeiten können im Bereich von etwa fünf Minuten bis etwa 15 Stunden variieren, aber eine günstige Standardreinigungszeitraum ist über Nacht, so daß der Träger die Linsen einweichen lassen kann während er schläft. Eine Vielzahl von Protokollen ist geeignet, aber eines, das insbesondere bevorzugt wird, ist die Verwendung einer einzelnen Lösung, welche eine Endoglykosidase vom Typ II und das zweite Enzym (falls verwendet) enthält, welche 10 Minuten bis zwei Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur einwirkt, oder ein Einweichzeitraum von 10 Minuten bis zwei Stunden in Gegenwart der Endoglykosidase vom Typ II-Lösung, gefolgt von einer entsprechenden Behandlung über Nacht mit einer ein zweites Enzym enthaltenden Lösung.
Bevorzugte, allgemein geeignete zweite Enzyme für Kontaktlinsenzubereitungen umfassen Proteasen wie Papain, Pankreatin und Subtilisin. Die bevorzugte Endoglykosidase vom Typ II ist Endo-H aus Streptomyces plicatus. Als einzelnes zweites Enzym kann eine Protease verwendet werden oder die Zusammensetzung kann eine Mischung aus zweiten Enzymen enthalten.
Ergänzend hierzu können die Kontaktlinsenzusammensetzungen zusätzliche Komponenten umfassen, welche den gesamten enzymatischen Abbau unterstützen. Unter diesen sind insbesondere Disulfid-Spaltreagenzien nützlich, wie 2-Mercaptoethanol, Cysteinhydrochlorid, Dithiothreit, Dithioeryit, Natriumbisulfat, Natriummetabisulfit oder Thioharnstoff, allgemein bevorzugt in einem Bereich von 0,01 bis 5 Gew.-% und vorzugsweise in einem Bereich von 0,05 bis 1 Gew.-%. Zusätzlich können in der Zusammensetzung Waschmitteln eingeschlossen sein, um die Benetzung der Linsen mit der enzymhaltigen Lösung zu unterstützen. Geeignete Detergentien umfassen Natriumdodecylsulfat, Natriummonolaurat, nichtionische Tenside, wie Alkoholethoxylate (z.B. Polyethoxyethanol), anionische Tenside, wie Ethersulfate, lineare Alkylbenzolsulfonate oder Natriumlaurylsulfat.
Geeignete Puffer und Stabilisierungsmittel für die Kontaktlinsenreinigung können ebenfalls verwendet werden und umfassend Natrium- oder Kaliumcitrat, Citronensäure, Borsäure, Natrium-EDTA, verschiedene Phosphatpuffergemische und NaHCO&sub3;. Im allgemeinen können Puffer und Stabilisierungsmittel in Mengen im Bereich von etwa 0,001 bis etwa 2,5 Gew.-% und vorzugsweise im Bereich von etwa 0,1 bis 1 Gew.-% verwendet werden. Es ist selbstverständlich, daß die vorstehende Beschreibung der Mengen der verschiedenen Verbindungen, welche erfindungsgemäß zur Reinigung von Kontaktlinsen verwendet werden können, als Prozentsatz der Bestandteile in Lösung angegeben werden (Gew./Vol.). Die Zubereitung kann auch in Form von einer oder mehreren herkömmlichen festen Dosierungsformen vorliegen, wie Tabletten, die für die Verwendung einer abgemessenen Menge in einem geeigneten Lösungsmittel wie Wasser geeignet sind. Der Prozentsatz der Zusammensetzung der festen Dosierungsformen wird so gewählt, daß, wenn in einem vorgegebenen Volumen von Wasser gelöst, die Lösung einen Prozentsatz der Zusammensetzung innerhalb der in der Beschreibung angegebenen Bereiche aufweist. Falls feste Dosierungsformen verwendet werden, kann die Zubereitung herkömmliche Gleitmittel, Bindemittel und Excipienten einschließen, umfassend Glycerin, Sorbit, Borsäure, Propylenglykol, Polyethylenglykole, Dextran, Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose, wasserlösliche Salze von Carboxymethylcellulose oder natürlich vorkommende hydrophile Verbindungen, wie Gelatine, Alginate, Tragant, Pektin, Gummi arabicum und lösliche Stärken.
Übliche bei der Reinigung von Kontaktlinsen nützliche Zusammensetzungen und Protokolle schließen die folgenden ein:
1. Die Zusammensetzung enthält 1 - 100 µg/ml Endoglykosidase vom Typ II. Die Linsen werden entfernt und mit der Lösung für einen Zeitraum während 12 Stunden bei 22ºC in Kontakt gebracht. Die Linsen werden aus der Reinigungslösung entfernt und abgespült.
2. Lösung A enthält 10 µg/ml Endoglykosidase vom Typ II; Lösung B enthält 5 µg/ml Subtilisin. Die Linsen werden in Lösung A während 30 Minuten bei 25ºC eingeweicht, entfernt und in Lösung B während 10 Stunden bei 25ºC eingetaucht.
3. Die Reinigungslösung enthält 10 µg/ml der Protease Pepsin und 10 µg/ml Endoglykosidase vom Typ II. Die Linsen werden in dieser Lösung während 5 Stunden bei 20ºC eingeweicht.
4. Die Reinigungslösung enthält 5 µg/ml Subtilisin, 5 µg/ml Endoglykosidase vom Typ II und 10 mM 2-Mercaptoethanol. Die Linsen werden in dieser Lösung während 5 Stunden bei 30ºC eingeweicht.
5. Die Reinigungslösung enthält 7 µg/ml Subtilisin, 3 µg/ml Endoglykosidase vom Typ II, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 2% Natriumdodecylsulfat (SDS). Die Linsen werden in dieser Lösung während 3 Stunden bei 20ºC eingeweicht.
6. Die Reinigungslösung enthält 4 µg/ml Subtilisin, 2 µg/ml Trypsin, 10 µg/ml Endoglykosidase vom Typ II und 2% SDS. Die Linsen werden in dieser Lösung während 7 Stunden bei 20ºC eingeweicht.
7. Lösung A enthält 4 µg/ml Subtilisin und 2 µg/ml Trypsin in 2% SDS. Lösung B enthält 10 µg/ml Endoglykosidase vom Typ II plus 10 mM 2-Mercaptoethanol. Die Linsen werden in Lösung B während 20 Minuten bei 30ºC eingetaucht und dann in Lösung A während 6 Stunden bei 25ºC.
Bei allen vorstehenden Beispielen werden die Linsen gründlich in physiologischer Kochsalzlösung gespült bevor sie wieder in die Augen des Trägers eingesetzt werden.
Die vorliegenden Zusammensetzungen können in einer Vielzahl von physikalischen Formen zubereitet werden, einschließlich Flüssigkeiten, Gelen, Pasten und festen Teilchen, wie Pulver und Granulat. Die Zusammensetzungen können als Wäschewaschmittel zubereitet werden, wie in den US-Patenten 4,507,219, 4,318,818, 4,605,509 und 4,412,934 beschrieben; als Geschirrspülwaschmittel, wie in den US-Patenten 4,714,562, 3,630,923, 4,133,779, 4,316,824 und 4,555,360 beschrieben; als Reinigungsmittel für harte Oberflächen, wie in den US-Patenten 4,414,128, 3,679,608, 3,985,668 und 4,005,027 offenbart; als Gewebeerweichungsmittel, wie in den US-Patenten 3,944,694, 4,073,996, 4,424,134 und 4,661,269 beschrieben; als Seifenstücke, wie in den US-Patenten 3,993,722 und 3,070,547 beschrieben; als Shampoos, wie in den US-Patenten 4,345,080, 4,704,272 und 4,741,855 offenbart; als transpirationshemmende Mittel, wie in dem US-Patent 4,725,432 offenbart; als Anti-Akne-Produkte, wie in den US-Patenten 4,318,907 und 4,608,370 beschrieben; und als orale Zusammensetzungen, wie im US-Patent 4,684,518 offenbart. Die vorstehenden Patente sind hier unter Bezugnahme eingeschlossen.
Die Zusammensetzungen weisen für eine gute Enzymleistung vorzugsweise einen pH-Wert von 4 bis 10, stärker bevorzugt von 5 bis 8, auf.
Laboruntersuchungen über die Entfernung von Mikroorganismen zeigten, daß, um eine wirksame Entfernung zu erzielen, das Spülen der die Mikroorganismen festhaltenden Oberfläche in einigen Fällen ein physikalisches oder chemisches Verfahren zur Entfernung der Mikroorganismen erfordert. Die getesteten Mikroorganismen umfassen:
Escherichia coli einschließlich Fimbrien-Typ 1 und 3
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Serratia marcescens
Streptococcus mutans
Streptococcus sanguis
Bacillus sp.
Candida sp.
Aspergillus sp.
Bei der Entfernung von Bakterien wie E. coli können die an die Oberfläche gebundenen Mikroorganismen zum Beispiel mit Endo-H behandelt und dann durch ein chemisches Verfahren, z.B. durch die Behandlung mit einem antimikrobiellen Mittel, oder durch ein physikalisches Verfahren, z.B. durch Spülen mit Wasser oder durch Abwischen von Hand, entfernt werden. Für Flüssigseifen und Seifenstücke, Zahnschmelzreinigungsmittel, transpirationshemmende Mittel, geruchshemmende Gewebeerweichungsmittel und Anti- Akne-Zusammensetzungen wird bevorzugt, daß die Zusammensetzung zusätzlich zu Endo-H ein antimikrobielles Mittel enthält, wie Irgasan (Ciba-Geigy) oder Chlorhexidin. Ein antimikrobielles Mittel ist in der Zusammensetzung (zum Beispiel einem Reinigungsmittel für harte Oberflächen) nicht erforderlich, wenn ein physikalisches Verfahren, wie Spülen mit Wasser oder Abwischen von Hand, durchgeführt wird.
Hier werden Waschmittelreinigungszusammensetzungen bevorzugt, insbesondere granuläre und flüssige Wäschewaschmittelzusammensetzungen. Diese Wäschewaschmittelzusammensetzungen umfassen vorzugsweise 1 bis 90 Gew.-%, stärker bevorzugt 5 bis 50 Gew.-% und besonders bevorzugt 10 bis 40 Gew.-% Waschmitteltenside.
Tenside, welche in den vorliegenden Waschmittelzusammensetzungen nützlich sind, umfassen bekannte synthetische anionische, nichtionische, amphotere und zwitterionische Tenside. Typische Tenside sind Alkylbenzolsulfonate, Alkyl- und Alkylethersulfate, Paraffinsulfonate, Olefinsulfonate, alkoxylierte (insbesondere ethoxylierte) Alkohole und Alkylphenole, Aminoxide, alpha-Sulfonate von Fettsäuren und Fettsäureestern und Alkylbetaine, welche auf dem Waschmittelfachgebiet gut bekannt sind. Im allgemeinen enthalten solche Reinigungstenside eine Alkylgruppe im Bereich von C&sub9;-C&sub1;&sub8;. Die anionischen Reinigungstenside können in Form ihrer Natrium-, Kalium- oder Triethanolammoniumsalze verwendet werden. Die nichtionischen Tenside enthalten im allgemeinen 5 bis 17 Ethylenoxidgruppen. C&sub1;&sub1;-C&sub1;&sub6;-Alkylbenzolsulfonate, C&sub1;&sub2;-C&sub1;&sub8;-Paraffinsulfonate und -Alkylsulfate werden in den Zusammensetzungen des vorliegenden Typs besonders bevorzugt.
Eine ausführliche Liste der für die vorliegenden Zusammensetzungen geeigneten Tenside findet man im US-Patent 3,936,537, Baskerville, erteilt am 3. Februar 1976, welches hier unter Bezugnahme eingeschlossen ist. Kommerzielle Quellen solcher Tenside findet man bei McCutcheon, Emulsifier and Detergents, Nordamerika Auflage (1984), McCutcheon Division, MC-Publishing Company, hier unter Bezugnahme ebenfalls eingeschlossen.
Für die vorliegenden Zusammensetzungen nützliche Waschmittelbuilder umfassen ein beliebiges der üblichen anorganischen und organischen wasserlöslichen Buildersalze sowie verschiedene wasserunlösliche Builder und sogenannte "geimpfte" Builder ("seeded builders"). Die vorliegenden Wäschewaschmittelzusammensetzungen umfassen vorzugsweise etwa 1 bis 75 Gew.-%, stärker bevorzugt 5 bis 40 Gew.-% und besonders bevorzugt 10 bis 20 Gew.-% Waschmittelbuilder. Diese Zusammensetzungen weisen vorzugsweise einen pH-Wert von 6 bis 10 auf.
Nichtbegrenzende Beispiele geeigneter wasserlöslicher, anorganischer, alkalischer Buildersalze umfassen die Alkalimetallcarbonate, -borate, -phosphate, -polyphosphate, -tripolyphosphate, -bicarbonate, -silikate und -sulfate. Spezifische Beispiele solcher Salze umfassen die Natrium- und Kaliumtetraborate, -bicarbonate, -carbonate, -tripolyphosphate, -pyrophosphate und -hexametaphosphate.
Beispiele geeigneter organischer, alkalischer Waschmittelbuildersalze sind: (1) wasserlösliche Aminopolyacetate, z.B. Natrium- und Kaliumethylendiamintetraacetate, Nitrilotriacetate und N-(2-hydroxyethyl)nitrilodiacetate; (2) wasserlösliche Salze von Phytinsäure, z.B. Natrium- und Kaliumphytate; (3) wasserlösliche Polyphosphate, umfassend Natrium-, Kalium- und Lithiumsalze von Ethan-1-hydroxy-1,1-diphosphonsäure und Natrium-, Kalium- und Lithiumsalze von Methylendiphosphonsäure.
"Geimpfte" Builder umfassen solche Stoffe wie Natriumcarbonat und Natriumsilikat, geimpft mit Calciumcarbonat oder Banumsulfat. Hydratisierter Natriumzeolit A mit einer Teilchengröße von weniger als 5 µm (Mikron) wird besonders bevorzugt.
Eine ausführliche Liste geeigneter Waschmittelbuilder findet man im US-Patent 3,936,537, welches hier unter Bezugnahme eingeschlossen ist. Bevorzugte Builder sind Fettsäuren, Polycarboxylate, Polyphosphate und Mischungen davon.
Wahlweise eingesetzte Komponenten der Waschmittelzusammensetzung umfassen Enzyme (z.B. Proteasen und Amylasen), Peroxyd-Bleichmittel und Bleichmittelaktivatoren, Halogenbleichmittel (z.B. Natrium- und Kaliumdichlorisocyanurate), feste Freisetzungsmittel (z.B. Methylcellulose), feste Suspensionsmittel (z.B. Natriumcarboxymethylcellulose), Gewebeaufheller, Enzymstabilisierungsmittel, Farbschutzstoffe, Schaumverbesserer oder Schaumhemmstoffe, Korrosionsschutzmittel, Farbstoffe, Füllstoffe, Entkeimungsmittel, Mittel zur pH-Einstellung und Nicht-Builder-Alkalinitätsquellen.

Endoglykosidase plus antimikrobielle Mittel

Von den Endoglykosidasen vom Typ II werden Endo-β-N-acetylglucosaminidase-H, -D, -F und/oder PNGaseF zur Zubereitung von antimikrobiellen Zusammensetzungen und zur Verwendung bei den vorliegenden antimikrobiellen Verfahren bevorzugt. Endo-H wird besonders bevorzugt.
Wenn Endoglykosidase vom Typ II allein verwendet wird, wird sie so zubereitet, daß ihre Konzentration eine antimikrobielle Wirkung erzeugt. Wenn die antimikrobielle Zusammensetzung mindestens zwei unterschiedliche Komponenten umfaßt, d.h. eine Endoglykosidase vom Typ II und ein oder mehrere antimikrobielle Mittel, liegt eine jede der Komponenten in einer Konzentration vor, die ausreichend ist, um eine antimikrobielle Wirkung zu erzielen. Die Menge mindestens einer Komponente in diesen Zusammensetzungen beträgt im allgemeinen weniger als die Menge, die für diese Komponente erforderlich ist, um die gleiche antimikrobielle Wirkung zu erzielen, wenn sie in einer entsprechenden Zusammensetzung allein verwendet wird.
Der hier verwendete Begriff "antimikrobielle Wirkung" schließt die Entfernung, das Abtöten, die Wachstumshemmung, die Veränderung der gesamten Morphologie, die Protoblastenbildung und/oder die Zerstörung der Zellwand eines Mikroorganismus ein, wenn er mit einer Endoglykosidase vom Typ II allein oder in Verbindung mit einer zweiten ein antimikrobielles Mittel umfassenden Komponente in Kontakt gebracht wird.
Der hier verwendete Begriff "antimikrobielles Verfahren" bezieht sich auf ein Verfahren, welches eine antimikrobielle Wirkung erzielt. Unter einem Gesichtspunkt der Erfindung bewirkt das antimikrobielle Verfahren das Abtöten von Mikroorganismen, die Hemmung des Mikroorganismuswachstums und/oder Veränderungen der gesamten Morphologie des Mikroorganismus. Unter einem anderen erfindungsgemäßen Gesichtspunkt bewirkt das antimikrobielle Verfahren zur Entfernung eines Mikroorganismus von einer Oberfläche. Bei den antimikrobiellen Verfahren zur Entfernung von Mikroorganismen von Oberflächen wird die Oberfläche mit dem antimikrobiellen Mittel und der Endoglykosidase vom Typ II eher bevorzugt gleichzeitig behandelt, als mit dem zusätzlichen antimikrobiellen Mittel unmittelbar nach der Behandlung mit der Endoglykosidase vom Typ II. Bei einigen Anwendungen der antimikrobiellen Verfahren kann eine kombinierte Wirkung erzielt werden, z.B. kann das Abtöten und/oder die Wachstumshemmung in Verbindung mit der Entfernung von Mikroorganismen von einer Oberfläche erfolgen.
Der hier verwendete Begriff "antimikrobielle Zusammensetzung" bezieht sich auf eine Zusammensetzung, die mindestens zwei unterschiedliche Komponenten enthält: eine Endoglykosidase vom Typ II und eine unterschiedliche ein antimikrobielles Mittel umfassende Komponente. Solche antimikrobielle Zusammensetzungen besitzen abhängig von der Menge und der Wahl der Endoglykosidase vom Typ II und dem antimikrobiellen Mittel variable antimikrobielle Wirkungen. Beobachtete antimikrobielle Wirkungen umfassen das Abtöten von Mikroorganismen und/oder die Hemmung des Mikroorganismuswachstums, die Entfernung von Mikroorganismen von einer Oberfläche und die Vorbeugung vor der Mikroorganismusanhaftung an Oberflächen.
Der hier verwendete Begriff "antimikrobiell wirksame Konzentration" der Endoglykosidase vom Typ II bezieht sich im allgemeinen auf die Endkonzentration der Endoglykosidase vom Typ II, die allein zum Inkontaktbringen mit einem Mikroorganismus verwendet wird, um eine antimikrobielle Wirkung zu erzielen.
Der hier verwendete Begriff "antimikrobielles Mittel" bezieht sich auf eine zweite unterschiedliche Komponente einer antimikrobiellen Zusammensetzung. Solche antimikrobiellen Mittel sind im allgemeinen Antibiotika und umfassen Mittel, die Mikroorganismen abtöten, und diejenigen, welche das Wachstum von Mikroorganismen hemmen. Beispiele solcher antimikrobieller Mittel umfassen Bakterizide, Fungizide und Algizide, wobei jedes von ihnen Bakterien, Pilze, bzw. Algen abtötet oder deren Wachstum hemmen kann. Bakterizide umfassen Verbindungen wie Chlorhexidin, 2,4,4'Trichlor-2'hydroxydiphenylether, Triclocarban , Penicilline, Tetracyclin und Bacitracin . Fungizide umfassen Nystatin , Amphotericin B , Benomyl , Captan und Dichloran . Andere Beispiele antimikrobieller Mittel umfassen Tensid-stabile antimikrobielle Enzyme, wie Tensid-stabile β-1,3-Glucanasen, Lysozyme, Proteasen und Chitinasen, sowie Waschmitteltenside, wie dem Fachmann bekannte anionische, nichtionische, zwitterionische, ampholytische und kationische Tenside. Die letzteren sollten in einer Menge verwendet werden, die ausreichend ist, um eine antimikrobielle Wirkung zu erzielen. Die vorstehenden durch allgemeine Bezeichnungen oder Handelsmarken ausgewiesenen antimikrobiellen Mittel entsprechen Zusammensetzungen im Merck Index, 10. Auflage (1983), Merck & Co., Inc., Rahway, N.J.
Endoglykosidasen vom Typ II, die sich von der ersten Komponente der antimikrobiellen Zusammensetzungen unterscheiden, können ebenfalls als antimikrobielles Mittel verwendet werden. Folglich, wenn Endoglykosidasen vom Typ II selbst antimikrobielle Mittel sind (z.B. jene, die eine antimikrobielle Wirkung, wie morphologische Veränderungen oder Protoblastenbildung, erzielen können), können sie zur Bildung einer antimikrobiellen Zusammensetzung mit einer unterschiedlichen Endoglykosidase vom Typ II kombiniert werden. Antimikrobielle Zusammensetzungen können deshalb eine oder mehrere unterschiedliche Endoglykosidasen vom Typ II mit oder ohne einem oder mehreren antimikrobiellen Mitteln einschließen, die keine Endoglykosidase vom Typ II umfassen.
Bevorzugte antimikrobielle Mittel für die erfindungsgemäße Verwendung sind Chlorhexidin, 2,4,4'Trichlor-2'hydroxydiphenylether, Triclocarban , Nystatin , Amphotericin B sowie antibiotische, anionische und nichtionische Waschmitteltenside. Ein Tensid- stabiles antimikrobielles Lysozym wird in der US-A-5041236 mit dem Titel "Methods and Compositions Employing Certain Lysozymes and Endoglycosidases" im Namen von Richard S. Carpenter und Ann M. Wolff offenbart, welches gleichzeitig mit dieser Anmeldung eingereicht wurde. Andere Lysozyme, z.B. Hühnereiweißlysozym, wurden in Verbindung mit Endo-H verwendet, um antimikrobielle Wirkungen zu erzielen, wenn auch in einem geringeren Umfang und mit einer Variabilität der erhaltenen Ergebnisse.
Die erfindungsgemäßen antimikrobiellen Zusammensetzungen und Verfahren können eine antimikrobielle Wirkung auf einen großen Bereich von Mikroorganismen ausüben, einschließlich Gram-positiver und -negativer Bakterien, Pilze und Algen. Solche Bakterien umfassen Escherichia coli, Streptococcus mutans, Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus aureus. Solche Pilze umfassen Hefen, wie Candida und Saccharomyces und Arten, sowie filamentöse Pilze, wie Aspergillus, Sporobolomyces, Basidiobolus und Entomophthora.
Ein besonderer Vorteil der Kombination einer Endoglykosidase vom Typ II (z.B. Endo-H, -D, -F und/oder PNGaseF) mit einem antimikrobiellen Mittel ist, daß eine geringere Menge des antimikrobiellen Mittels verwendet werden kann, um eine antimikrobielle Wirkung zu erzielen. Unter einigen erfindungsgemäßen Gesichtspunkten erzielt das antimikrobielle Mittel eine antimikrobielle Wirkung, wenn es zusammen mit einer Endoglykosidase vom Typ II verwendet wird, umfassend die Entfernung von an Oberflächen gebundenen Mikroorganismen oder die Vorbeugung vor deren Anhaftung an solche Oberflächen. Unter anderen Gesichtspunkten wird eine negative Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen oder die Mikroorganismusmorphologie erzielt.
Eine Oberflächenbehandlung(en) mit einer Endoglykosidase vom Typ II und einem antimikrobiellen Mittel kann periodisch durchgeführt werden, um einem weiteren Wachstum oder einer Bindung oder Adhäsion von Mikroorganismen an die der Behandlung ausgesetzten Oberflächen vorzubeugen.
Unter den Endoglykosidasen vom Typ II werden Endo-H, -D, -F und/oder PNGaseF bevorzugt. Unter diesen wird Endo-H besonders bevorzugt. Im allgemeinen ist eine antimikrobiell wirksame Menge der Endoglykosidasen vom Typ II zur Verwendung in Verbindung mit antimikrobiellen Mitteln 1 bis 1200 ppm Endo-H, -D, -F und/oder PNGaseF, vorzugsweise 1 bis 1200 ppm Endo-H, stärker bevorzugt 20 bis 1000 ppm Endo-H und besonders bevorzugt 50 bis 400 ppm Endo-H. Die verwendete Menge ist abhängig von der Art der Behandlung und von der Expositionsmenge mit der die Oberfläche oder der Mikroorganismus behandelt werden soll. Im allgemeinen ist eine wirksame Menge des antimikrobiellen Mittels, die von dem verwendeten Mittel abhängt, 0,5 bis 1200 ppm, vorzugsweise 2 bis 1200 ppm und stärker bevorzugt 5 bis 350 ppm Chlorhexidin oder 2,4,4'Trichlor-2'hydroxydiphenylether oder 0,5 bis 100 ppm Nystatin .
Wenn eine Endoglykosidase vom Typ II allein zum Abtöten und/oder zur Hemmung von Mikroorganismen verwendet wird, ist im allgemeinen die Verwendung einer wesentlich größeren Menge von Endoglykosidase vom Typ II erforderlich. Beispielsweise wurde gezeigt, daß 100 ppm bis 1000 ppm Endo-H die Lebensfähigkeit von Hefezellen, die solchen Konzentrationen ausgesetzt wurden, wesentlich verringern. Wenn Hefezellen weniger als 100 ppm ausgesetzt wurden, wurde jedoch keine signifikante Verringerung der Lebensfähigkeit beobachtet. Obwohl die untere Grenze von Endo-H, die notwendig ist, um die Lebensfähigkeit von Hefe ungünstig zu beeinflussen, noch nicht bestimmt wurde, nimmt man an, daß die untere Grenze ihrer antimikrobiell wirksamen Konzentration zwischen 10 und 100 ppm liegt. Man nimmt an, daß entsprechende Mengen von Endo-H nützlich sind, um andere Mikroorganismen, wie Algen und Pilze, abzutöten und/oder zu hemmen. Die genaue Wirkung von Endo-H und anderen Endoglykosidasen vom Typ II auf diese und andere Organismen, z.B. Bakterien, falls nicht in Verbindung mit antimikrobiellen Mitteln verwendet, wurde noch nicht bestimmt. Der Bereich von antimikrobiell wirksamen Konzentrationen der Endoglykosidase vom Typ II zur Verwendung gegen solche Organismen kann jedoch routinemäßig bestimmt werden.
Die erfindungsgemäßen antimikrobiellen Verfahren und Zusammensetzungen weisen eine große Anwendbarkeit auf und umfassen antimikrobielle Verfahren und Zusammensetzungen für die Körperpflege, Gesundheitsvorsorge und für Reinigungszwecke in Haushalt und Industrie. Folglich können solche Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden, um eine antimikrobielle Mundspülung, ein Zahnputzmittel oder einen Gebißreiniger sowie antimikrobielle flüssige oder feste Hand- oder Körperseifen, ein Anti- Akne-Medikament, ein Deodorant, ein Shampoo und Gesichtscremes und Zusammensetzungen zur Wundreinigung oder zur Unterdrückung von Infektionen zuzubereiten und anzuwenden. Typische Anwendungen im Haushalt umfassen antimikrobielle Reinigungsprodukte, wie Flüssigseife, Reinigungsmittel für harte Oberflächen und flüssige und granuläre Wäschewaschmittel. Antimikrobielle Hochleistungswaschmittelzusammensetzungen können auch für den industriellen Gebrauch zubereitet werden.
Chlorhexidin ist ein wirksames orales antibakterielles Mittel und wird für dentale Anwendungen bevorzugt. 2,4,4'Trichlor-2'hydroxydiphenylether ist erhältlich als Irgasan DP-300 von Ciba-Geigy und ist ein Breitband-Bakteriostatikum, das bei der Körperpflege und bei Anwendungen auf dem Gebiet der Wäschereinigung wirksam ist. Triclocarban von Monsanto ist ein in Seifestücken nützliches Bakteriostatikum. Traditionelle Antibiotika können hier ebenfalls als zusätzliches antimikrobielles Mittel verwendet werden. Schließlich können Tensid-stabile antimikrobielle Enzyme bei Anwendungen auf dem Gebiet der Zahnpflege und zur Konservierung von Shampoos und anderen tensidhaltigen Zubereitungen verwendet werden. Ein bevorzugtes Tensid-stabiles Enzym ist das Lysozym, welches in der vorher angegebenen gleichzeitig anhängigen Anmeldung im Namen von Carpenter und Wolff offenbart wurde. Die Tensidstabilität von antimikrobiellen Enzyme kann hier durch die Beibehaltung der Aktivität in Gegenwart von zum Beispiel typischen Mengen von Alkylethersulfat oder linearem Alkylbenzolsulfat beurteilt werden.
Die antimikrobielle Zusammensetzung kann zubereitet werden als antimikrobielle Mundspülung, Zahnputzmittel oder Gebißreiniger. Die Behandlung von Mikroorganismen zum Erzielen einer antimikrobiellen Wirkung (z.B. zur Entfernung von Mikroorganismen von oder zur Vorbeugung vor der Anhaftung von Mikroorganismen an natürliche oder synthetische, weiche und/oder harte Oberflächen in der Mundhöhle oder zum Abtöten von Mikroorganismen in der Mundhöhle oder um deren Wachstum in der Mundhöhle zu hemmen) umfaßt dann im wesentlichen das Spülen mit einer antimikrobiellen Mundspülung, die Reinigung der Zähne mit einem antimikrobiellen Zahnputzmittel und/oder die Reinigung von Gebissen mit einem antimikrobiellen Gebißreiniger. Die antimikrobielle Mundspülung, das Zahnputzmittel und die Gebißreiniger umfassen hier vorzugsweise Endo-H und Chlorhexidin und/oder ein tensidstabiles antimikrobielles Enzym als antimikrobielles Mittel. Wenn Chlorhexidin verwendet wird, umfaßt die antimikrobielle Mundspülung, das Zahnputzmittel oder der Gebißreiniger vorzugsweise 50 bis 1200 ppm Endo-H und etwa 50 bis 350 ppm Chlorhexidin. Wenn ein tensidstabiles antimikrobielles Enzym verwendet wird, umfaßt die antimikrobielle Mundspülung, das Zahnputzmittel oder der Gebißreiniger vorzugsweise 50 bis 150 ppm Endo-H und 50 bis 1000 ppm Tensid-stabiles antimikrobielles Enzym.
Die antimikrobiellen Zusammensetzungen können auch als antimikrobielle Körperpflegeprodukte oder als Haushaltsreiniger zubereitet werden. In solchen Produkten wird Endo-H vorzugsweise in einer Konzentration von 1 bis 1200 ppm verwendet. Das in diesen Produkten verwendete antimikrobielle Mittel ist vorzugsweise Chiorhexidin, besonders bevorzugt in einer Konzentration von 150 bis 1200 ppm, oder 2,4,4'Trichlor-2'hydroxydiphenylether, welches besonders bevorzugt in einer Konzentration von 2 bis 500 ppm verwendet wird. Bevorzugte Körperpflegeprodukte und Haushaltsreiniger sind Flüssighandseifen, Reiniger für harte Oberflächen, Wäschewaschmittel und Shampoo (nachstehend beschrieben).
Eine bevorzugte antimikrobielle Flüssighandseife umfaßt etwa 50 bis 400 ppm Endo-H, 5 bis 100 ppm 2,4,4'Trichlor-2'hydroxydiphenylether und vorzugsweise 1 bis 40 Gew.-% Waschmitteltensid. Vorzugsweise werden 2 bis 20 Gew.-% und besonders bevorzugt 3 bis 10 Gew.-% Waschmitteltensid verwendet, das vorzugsweise aus der Gruppe gewählt ist, die aus anionischen, nichtionischen, zwitterionischen, ampholytischen und kationischen Tensiden besteht. Die Flüssighandseife kann ferner einen Weichmacher (bis zu etwa 30 Gew.-%) und geringe Mengen Parfüm, Farbstoff, Lösungsmittel und Trübungsmittel umfassen.
Die antimikrobiellen Reinigungsmittel für harte Oberflächen können Glasreiniger, Schleifmittel für harte Oberflächen, Scheuermittel oder Toilettenreiniger sein. Diese sollten im wesentlichen frei von Hypochlorid-erzeugenden Bleichmitteln und anderen Endoglykosidase-unverträglichen Bestandteilen sein. Ein bevorzugtes Reinigungsmittel für harte Oberflächen umfaßt 100 bis 1000 ppm Endo-H und antimikrobielles Mittel und 0,1 bis 20 Gew.-% Waschmitteltensid. 2 bis 10 Gew.-% eines Waschmitteltensids werden besonders bevorzugt, das vorzugsweise aus der Gruppe gewählt ist, die aus anionischen, nichtionischen, zwitterionischen, ampholytischen und kationischen Tensiden besteht. Die erfindungsgemäßen antimikrobiellen Reinigungsmittel für harte Oberflächen umfassen außerdem wahlweise ein Schleifmittel, einen Builder, ein Verdünnungsmittel, ein Lösungsmittel, ein Suspensionsmitttel (wie Ton, Carboxymethylcellulose und Polyacrylat), ein Parfüm und/oder einen Farbstoff.
Die vorliegenden antimikrobiellen Wäschewaschmittel umfassen zusätzlich zu einer Endoglykosidase vom Typ II und einem antimikrobiellen Mittel vorzugsweise 1 bis 99 Gew.-%, stärker bevorzugt 5 bis 60 Gew.-% und besonders bevorzugt 10 bis 40 Gew.-% eines Waschmitteltensids, das vorzugsweise aus der Gruppe gewählt ist, die aus anionischen, nichtionischen, zwitterionischen, ampholytischen und kationischen Tensiden besteht. Ein bevorzugtes flüssiges oder granuläres, antimikrobielles Wäschewaschmittel umfaßt 2 bis 250 ppm Endo-H, etwa 2,5 bis 40 ppm 2,4,4'Trichlor-2'hydroxydiphenylether und 1 bis 99 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 60 Gew.-%, Waschmitteltensid. Die vorliegenden antimikrobiellen Wäschwaschmittel umfassen außerdem wahlweise einen Builder, ein Parfüm, ein Bleichmittel, ein Verdünnungsmittel, einen Schaumhemmstoff, einen Farbstoff, einen Aufheller, ein Schmutzsuspendiermittel, Hilfsmittel, welche die Schmutzneuablagerung hemmen, Weichmacher und/oder Schmutzfreisetzungsmittel.
Das hier verwendete antimikrobielle Shampoo umfaßt vorzugsweise Endo-H, ein antimikrobielles Mittel und 5 bis 60 Gew.-% Waschmitteltensid, das vorzugsweise aus der Gruppe gewählt ist, die aus Laurylsulfat, Isoethionat, Acylamidobetain, Alkylglycerylethersulfonat und Alkylethersulfat besteht. Wahlweise Bestandteile sind Schaumverbesserer, Pflegemittel, Farbstoffe, Färbemittel, Parfüm und/oder Antischuppenmittel.
Die vorliegenden antimikrobiellen Zusammensetzungen können auch in Form eines Konservierungsmittels oder eines Mikroorganismusbekämpfüngsmittels zur Behandlung von Pflanzenoberflächen vorliegen. Bevorzugt werden ein Konservierungsmittel für die Oberflächen von Früchten und Gemüse oder ein antimikrobielles Produkt zur Bekämpfung von Mikroorganismen, das auf Nutzfrüchte anwendbar ist. Das letztere liegt vorzugsweise in Form einer Lösung vor, die auf Nutzfrüchte, wie Mais, Zitrusfrüchte, Weizen, Tabak, Sojabohnen, Tomaten und Erdbeeren zur Bekämpfung von und zur Vorbeugung vor Mikroorganismuswachstum gesprüht wird.

Beispiel 1

Entfernung von Blut und Kot von Gewebe

Einzelne mit Blut und Kot gefärbte Muster (Baumwollgewebe) wurden mit im Handel erhältlichen Waschmitteln in einer automatischen Waschmaschine mit einem Warmwaschzyklus (etwa 37ºC) gewaschen. Die Muster wurden dann gespült und luftgetrocknet. Im Anschluß daran wurden sie mit verschiedenen Mengen und Arten von Endoglykosidase [(0,005 U Endo-D (Boehringer Mannheim Biochemical) oder Endo-H (Boehringer Mannheim Biochemical aus S. griseus, Katalognr. 752 967) und 0,25 U N-Glycanase (PNGaseF oder Peptidendoglykosidase-F), Genzyme, Boston, MA] in 0,75 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,0, bei 37ºC während 30 Minuten in einem Teströhrchen inkubiert. Die Kontrolle enthielt Puffer, aber keine Endoglykosidase. Nach der Inkubation wurden der Kontrolle und den enzymhaltigen Proben 0,25 ml einer Waschmittellösung (1:125 Verdünnung einer im Handel erhältlichen Flüssigwaschmittelzusammensetzung, die keine Farbstoffe, Parfüme, Enzyme oder Aufheller enthält, in 1 M Tris-HCl, pH 7,5) zugegeben, die 80 µg Subtilisin BPN'/ml enthielt, und die Röhrchen wurden weitere 20 Minuten inkubiert. Nach dieser Behandlung wurden die Röhrchen zentrifugiert und der Proteingehalt in den Überständen wurde durch eine Extinktionsmessung bei 280 nm bestimmt. Für jede Behandlung wurde ein als Kontrollmessung dienender Reaktionsansatz hergestellt, der während des Tests kein Muster enthielt. Die Nullwerte wurden von der Extinktion der behandelten Proben subtrahiert, um die Freisetzung von Material, das bei 280 nm absorbiert, während der Inkubation zu bestimmen. Eine höhere Extinktion entspricht einer verstärkten Freisetzung von Protein von den Fasern. Die Ergebnisse sind in Tabelle III aufgeführt. Tabelle III Behandlung Extinktion bei 280 nm Blutfleck Kotfleck Kontrolle Endo-D Endo-H N-Glycanase
Diese Ergebnisse legen nahe, daß die Endoglykosidasen Endo-D und Endo-H in Verbindung mit dem zweiten Enzym Subtilisin im Vergleich zur Kontrolle die Freisetzung von Material, das bei 280 nm absorbiert, von den mit Blut gefärbten Mustern verstärkten. Außerdem zeigten Endo-D und Endo-H sowie N-Glycanase eine Verstärkung bei der Freisetzung von Material, das bei 280 nm absorbiert, von den mit Kot gefärbten Mustern.

Beispiel 2

Wirkung von Endo-H auf die Entfernung von Kotflecken

Dieses Beispiel entspricht Beispiel 1, jedoch wurde es unter Verwendung von mit Kot gefärbten Mustern durchgeflihrt, die aus Nylongewebe hergestellt wurden. Die Muster wurden in einer Waschmittellösung gewaschen, gespült und getrocknet. Das Waschmittel war ein im Handel erhältliches Flüssigwaschmittel, das keine Enzyme, Aufheller, Farbstoffe oder Parfüme enthält. Ein Satz der Muster wurde aufbewahrt und als "unbehandelte Kontrolle" bezeichnet. Diese Muster wurden wie die Probenmuster behandelt, mit dem Unterschied, daß sie nicht mit Endo-H behandelt wurden. Die Probenmuster wurden mit 0,01 U Endo-H (Boehringer Mannheim Biochemical, Katalognr. 752 967) in Puffer (10 mM Na-Acetat, pH 6,0) bei 37ºC während 15 Minuten inkubiert. Im Anschluß daran wurden 0,25 ml der Waschmittellösung (1:125 Verdünnung in 1,0 M Tris-HCl, pH 7,5) zugegeben und die Muster wurden weitere 15 Minuten inkubiert. Danach wurden die Röhrchen zentrifugiert und die Überstände wurden durch Absaugen entfernt. Die Muster wurden luftgetrocknet. Die Fasern der Muster wurden nach einer kritischen-Punkt- Trocknung durch Rasterelektronenmikroskop untersucht. Eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines mit Kot gefarbten Muster, das mit einem Waschmittel gewaschen wurde, wird in Figur 6A gezeigt. Man erkennt stäbchenförmige Bakterien und einzelne Substanzen auf der Oberfläche des Gewebes. Figur 6B zeigt ein mit Endo-H und Waschmittel behandeltes Muster. Diese Figur zeigt ein gleichmäßig sauberes Gewebe, das beweist, daß Endo-H und das Waschmittel die Entfernung von einzelnen Substanzen und Bakterientrümmern vereinfachen.

Beispiel 3

Wirkung von Endo-F auf Kotflecken

Mit Kot gefärbte Muster (1 Inch Durchmesser) wurden in einer Waschmittellösung gewaschen, gespült und getrocknet. Die Muster wurden in Viertel geschnitten und in den folgenden Experimenten verwendet.
Die Muster wurden in 1 ml 10 mM Natriumacetatpuffer (pH 5,5) mit oder ohne Endo-F (Boehringer Mannheim Biochemical) (0,15 Einheiten) während 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Röhrchen wurden während acht Minuten zentrifugiert. Die Überstände wurden entfernt und die Extinktion eines jeden Überstandes wurde bei 280 nm bestimmt. Durch Subtraktion der geeigneten Nullwerte (vgl. Beispiel 1) wurde die Veränderung der Extinktion bei 280 um (A280) bestimmt. Eine höhere Extinktion schließt die Erhöhung der aus den Mustern freigesetzten Menge von Protein oder von Material ein, das bei 280 nm absorbiert. Für die Kontrollen betrug die durchschnittliche Änderung der A280 0,93. Für mit Endo-F behandelte Muster betrug die durchschnittliche Änderung der A280 1,05. Dies zeigte, daß Endo-F die Wirksamkeit der Kotfleckenentfernung erhöht.
Die Muster wurden in 0,75 ml 10 mM Natriumacetatpuffer (pH 5,5) mit oder ohne Endo-F (0,15 Einheiten) während 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nach dieser Behandlung wurden 0,25 ml Waschmittellösung (in 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5) zugegeben, die 10 µg der Protease Subtilisin BPN' enthielt, und die Röhrchen wurden weitere 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Danach wurden die Röhrchen zentrifügiert, die Überstände wurden entfernt und die Extinktion bei 280 nm bestimmt. Bei der Kontrolle (kein Endo-F) betrug die durchschnittliche Änderung der A280 1,08, während die mit Endo-F behandelte Probe eine Änderung der A280 von 1,36 aufwies. Dies zeigte, daß die Wirkung von Endo-F durch die Gegenwart des Waschmittels verstärkt wurde.
Ein zu "B" entsprechendes Experiment wurde durchgeführt, mit dem Unterschied, daß die Waschmittellösung 10 mM 2-Mercaptoethanol anstelle von Subtilisin enthielt. Die durchschnittliche Änderung der A280 für die Kontrolle betrug 1,05, während die mit Endo-F behandelte Probe eine Änderung der A280 von 1,24 aufwies. Diese Ergebnisse demonstrierten die Fähigkeit von Endo-F in Gegenwart von Disulfid-Spaltreagenzien Kotflecken zu entfernen.
Ein zu "B" entsprechendes Experiment wurde durchgeführt, mit der Unterschied, daß die Waschmittellösung 10 mM 2-Mercaptoethanol und 10 µg Subtilisin BPN' enthielt. Die durchschnittliche Änderung der A280 für die Kontrolle betrug 1,14, während die mit Endo-F behandelte Probe eine Änderung der A280 von 1,29 aufwies. Diese Ergebnisse zeigten, daß Endo-F Kotflecken in Gegenwart eines Waschmittels, einer Protease und einem Disulfid-Spaltreagens (2-Mercaptoethanol) entfernen kann.

Beispiel 4

Vergleich von Endo-H mit anderen Enzymen

Experimente, welche denen in Teil B von Beispiel 3 beschriebenen entsprechen, wurden mit Endo-H (Boehringer Mannheim Biochemical, Katalognr. 100 119) und anderen Carbohydrase-Enzymen wiederholt, mit der Unterschied, daß keine Protease wie Subtilisin verwendet wurde. Die Änderungen der A280 wurden bestimmt und die Fasern wurden durch Rasterelektronenmikroskopie untersucht. Die Entfernung von einzelnen Bakterien oder Bakterientrümmern von Gewebe wurde mit Endo-H und "Lyse auslösenden Enzymen" ("Lysing Enzymes") (ein Gemisch aus Proteasen und Glykonasen, bezogen von Sigma Chemical Company) beobachtet. Jedoch zeigten die Enzyme Lysozym, α-Glykosidase, β-Glucosidase und β-Glucorinadase nur einen geringen oder gar keinen Vorteil (Ergebnisse nicht aufgeführt). Die elektronenmikroskopischen Ergebnisse für dieses Experiment zur Behandlung mit oder ohne den vorstehenden Enzymen sind in den Figuren 7A bis 7H dargestellt. Figur 7A ist eine Kontrolle, welche nicht mit Endoglykosidase behandelt wurde. Figur 7B ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines mit Lysozym behandelten Musters; Figur 7C ist ein mit Endo-H behandeltes Muster; Figur 7D ist ein mit α-Glykosidase behandeltes Muster; Figur 7E ist ein mit β-Glucosidase behandeltes Muster; Figur 7F ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme einer mit "Lyse auslösenden Enzymen" behandelten Faser; Figur 7G ist eine elektronenmikroskopisehe Aufnahme eines mit β-Glucorinadase behandelten Musters; und Figur 7H ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines mit Chitinase behandelten Musters. Es ist zu erkennen, daß das mit Endo-H behandelte Muster (Figur 7C) von dem Kotfleck völlig gereinigt wurde. Entsprechende Ergebnisse wurden für die Muster erhalten, die mit "Lyse auslösenden Enzymen" behandelten wurden, wie in Figur 7F gezeigt.

Beispiel 5

Entfernung von Bakterien von einer festen Oberfläche

Um die Wirkung von Endo-H auf die Entfernung von Bakterien von festen Oberflächen (Glas) zu testen, wurde das folgende Protokoll angewendet. Trypticase-Sojabrühe (TSB) (10 ml) wurde mit einer Mikroorganismusart (Staphylocccus aureus ATCC-Kultur #6538 oder Escherichia coli ATCC-Kultur #10536) aus einer Stammschrägkultur beimpft und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Eine Suspension von etwa 10&sup8; Zellen/ml wurde hergestellt und 100 µl dieser Suspension wurde innerhalb des auf einen Objektträger aus Glas eingeritzten Kreises aufgetragen. Ein jeder Objektträger wurde während 5 Minuten bei 37ºC in einem Trockenschrank inkubiert, danach wurde die überschüssige Mikroorganismuslösung durch Klopfen entfernt. Die Objektträger wurden dann mit 100 µl sterilem destilliertem Wasser gespült. Die überschüssige Lösung und die ungebundenen Organismen wurden im Anschluß daran durch Klopfen entfernt.
Nachdem sich die Bakterien an die Objektträger aus Glas angehaftet hatten (2 oder mehr Stunden bei 37ºC) wurden 100 µl der folgenden Lösungen auf einzelne Objektträger aufgebracht: (a) 10 mM Acetatpuffer (pH 5,5), (b) 10 mM Acetatpuffer (pH 5,5) + 1 ppm Endo-H (Boehringer Mannheim Biochemical, Katalognr. 100 119), (c) Waschmittellösung, (d) Waschmittellösung + 1 ppm Endo-H. Ein Objektträgersatz wurde als unbehandelte Kontrollen aufbewahrt und mit keiner der Lösungen behandelt. Die nicht als Kontrolle dienenden Objektträger wurden dann während 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nach diesem Inkubationszeitraum wurden die Lösungen durch Klopfen entfernt. Die Objektträger wurden im Anschluß daran mit 100 µl sterilem destilliertem Wasser gespült und bei Kaumtemperatur luftgetrocknet. Die nach dieser Behandlung verbleibenden Bakterien wurden hitzefixiert und mit einem Gram-Standardfärbeverfahren gefärbt. Die Objektträger wurden dann mit einem Lichtmikroskop untersucht (Hellfeldbeleuchtung, 125x Vergrößerung) und die Anzahl von Organismen/Feld wurde bestimmt. Zwanzig Felder wurden für einen jeden Objektträger gezählt, daraus wurde die durchschnittliche Anzahl der Organismen/Feld berechnet.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
A. Für Staphylococcus aureus
i) keine Behandlung > 100 Organismen/Feld
ii) Puffer > 100 Organismen/Feld
iii) Puffer + Endo-H < 10 Organismen/Feld
iv) Waschmittellösung > 100 Organismen/Feld
v) Waschmittel + Endo-H < 10 Organismen/Feld
Diese Ergebnisse zeigen, daß Endo-H-Puffer allein oder in Verbindung mit dem Waschmittel die Anzahl der auf den Objektträgern aus Glas verbliebenen S. aureus- Bakterien im Vergleich zur Behandlung mit dem Waschmittel allein um das 10fache verringert.
B. Für Escherichia coli
i) keine Behandlung > 100 Organismen/Feld
ii) Puffer > 100 Organismen/Feld
iii) Puffer + Endo-H > 100 Organismen/Feld
iv) Waschmittel > 100 Organismen/Feld
v) Waschmittel + Endo-H < 10 Organismen/Feld
Diese Ergebnisse zeigen, daß Endo-H in Verbindung mit einem Waschmittel die Anzahl der auf den Objektträgern aus Glas verbliebenen E. coli-Bakterien im Vergleich zur Behandlung mit dem Waschmittel allein um das 10fache verringert.

Beispiel 6

Entfernung von Bakterien von einer festen Oberfläche

Ein zu Beispiel 5 entsprechendes Experiment wurde mit zwei schleimproduzierenden Staphylococcus aureus-Kulturen (gekennzeichnet durch ihre Fähigkeit an Polystyrolröhrchen zu binden) durchgeführt. Mikroskopobjekträger wurden mit einer Nagelfeile mit zwei Kreisen ( 1,7 cm Durchmesser) modifiziert. Eine Übernachtkultur der Organismen wurden 1:10 mit 1 %iger Peptonlösung verdünnt. Die verdünnte Kultur (100 µl) wurden in die Kreise eingebracht. Die Objektträger wurden in 150 cm große Petrischalen überführt und bei 37ºC inkubiert. Nach einem Inkubationszeitraum von zwei Stunden wurden die Objektträger mit destilliertem Wasser gespült und wie in Beispiel 5 bei drei unterschiedlichen Bedingungen behandelt (A. Natriumacetatpuffer, B. Waschmittel und C. Waschmittel plus 1-µg Endo-H/ml). Endo-H wurde aus E. coli-Bakterien erhalten, die transformiert wurden, um Endo-H aus S. plicatus zu produzieren. Nach einem Inkubationszeitraum von 15 Minuten wurden die Objekttrager mit destilliertem Wasser gespült und Gram-gefärbt. Die Anzahl der Bakterien wurde unter dem Mikroskop pro Feld bei 100facher Vergrößerung für 20 Felder gezählt. Die Ergebnisse werden als durchschnittliche Anzahl von Zellen pro Feld angegeben. Bedingung Kultur Kontrolle Waschmittel Waschmittel + Endo-H

Beispiel 7

Entfernung von Bakterien von einer Stoffoberfläche

Um die Wirkung von Endo-H auf die Entfernung von Bakterien von einer Stoffoberfläche zu testen, wurde das folgende Protokoll angewendet. Staphylococcus aureus (ATCC 6538) und Staphylococcus epidermidis (ATCC 155) wurden getrennt in 5 ml Luria-Brühe gezüchtet und man ließ sie bei 37ºC während 12 Stunden wachsen. Die Kulturen wurden dann zu 30 ml 0,2 M Natriumcitratpuffer (pH 5,5) bei etwa 10³ Zellen/ml in zwei 100 ml Schüttelflaschen gegeben. Zwölf Stoffmuster (0,5 x 0,5 Inch große Baumwollmuster) wurden den Flaschen nach dem Beimpfen ebenfalls zugegeben. Nach einer Inkubation bei 37ºC während zwei Stunden unter vorsichtigem Drehen (150 Upm) wurden die Muster in sterile Röhrchen überführt und dreimal mit 200 mM Natriumcitrat (pH 5,5) enthaltendem Puffer gewaschen, der vorher durch eine 0,22 µm (Mikron)-Filtration sterilisiert wurde. Sechs Muster wurden dann in eine Schüttelflasche eingebracht, die 0,5 mg/ml Endo-H in 30 ml Citratpuffer enthielt, und sechs Muster wurden in eine Schüttelflasche eingebracht, welche nur Citratpuffer als Kontrolle enthielt. Endo-H wurde aus E. coli-Bakterien erhalten, die Endo-H aus S. plicatus produzieren. Nach einer Inkubation von 1,5 Stunden bei 37ºC unter vorsichtigem Drehen (100 Upm) wurden die Muster in sterile Röhrchen überführt und wie vorher beschrieben gewaschen. Im Anschluß daran wurden die Muster vorsichtig auf Trypticase-Sojaagarplatten gelegt und mit ausreichend flüssigem Trypticase- Sojaagar überlagert, um die Muster zu bedecken. Nach dem Trocknen der Platten wurden sie bei 37ºC während 18 Stunden inkubiert und die Kolonien von Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis auf der Stoffoberfläche wurden unter Verwendung eines Präpariermikroskops gezählt.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
A. Für Staphylococcus aureus
Kontrolle 103 ± 24 Kolonien pro Muster
Endo-H 53 ± 18 Kolonien pro Muster
Dies entspricht einer Abnahnne der Bakterienkolonien durch die Endo-H-Behandlung von 49%.
B. Für Staphylococcus epidermidis
Kontrolle 57 ± 11 Kolonien pro Muster
Endo-H 16 ± 10 Kolonien pro Muster
Dies entspricht einer Abnahme der Bakterienkolonien durch die Endo-H-Behandlung von 72%.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Endo-H-Behandlung die Anzahl der an eine Stoffoberfläche gebundenen Bakterien signifikant verringert.

Beispiel 8

Bindung von Endo-H an Bakterien

Das folgende Experiment wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Endoglykosidase vom Typ II Endo-H mit einer Oberflächenkomponente der Bakterien Staphylococcus aureus und Streptococcus mutans in Wechselwirkung tritt. Eine solche Wechselwirkung wurde nachgewiesen. Obwohl hier nicht vollständig charakterisiert, war diese Wechselwirkung vorher nicht bekannt und kann die Grundlage der vorstehend beschriebenen Fähigkeit von Endo-H bilden, solche Bakterien von einer Oberfläche zu entfernen.
Endo-H aus transformierten E. coli-Bakterien, welches durch die Modifikation der von Trimble R.J. et al. in J. Biol. Chem. 260 (1985), 5638-5690, beschriebenen Verfahren gereinigt wurde, wurde gemäß dem von Updyke T.V. und Nicolson G.L. in Methods in Enzymology 121 (1986), 717-725, beschriebenen Verfahren mit Biotin markiert. Nach einer solchen Markierung behielt Endo-H den größten Teil seiner Reaktivität mit dem Glykoprotein Ovalbumin bei.
Übernachtkulturen von Staphylococcus aureus (ATCC 6538), gezüchtet in Luria-Brühe, und Streptococcus mutans (ATCC 27607), gezüchtet in Difo-Infusionsmedien für Gehirn und Herz, wurden zentrifugiert und dreimal mit 200 mM Natriumcitratpuffer (pH 5,5) gewaschen und in dem gleichen Puffer bis zu einer Konzentration von etwa 10&sup9; Zellen/ml verdünnt. Aliquots von 0,5 ml wurden in 31,5 ml-Eppendorf-Röhrchen überführt und unter verschiedenen Bedingungen und bei verschiedenen Zeiten inkubiert. Röhrchen Zellen 2% BSA Biotinyliertes Endo-H 0,2 M Natriumcitrat (pH 5,5) Inkubationszeitraum (min.)
Die Inkubation erfolgte bei Raumtemperatur unter Verwendung eines Schwenkarms mit langsamer Geschwindigkeit während entweder 2 oder 30 Minuten. BSA (Rinderserumalbumin), verdünnt in Tris-gepufferter Kochsalzlösung, wurde als Kontrollösung verwendet, um einer unspezifischen Proteinbindung an die Zellen vorzubeugen. Nach der Inkubation wurden die Röhrchen zentrifugiert und die Überstände wurden verworfen. Die Zellen wurden durch die Zugabe von 1 ml BSA zu den Zellen, gründliches Mischen mit einem Vortexgerät, Zentrifugieren und Verwerfen des Überstands zweimal mit einer 2%igen BSA-Lösung gewaschen. Den gewaschenen Zellen wurden 0,5 ml Streptavidin- HRP zugegeben (Streptavidin-markierte Meerrettichperoxidase, Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.) und anschließend wurden die Zellen während 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Röhrchen wurden erneut zentrifügiert und wie vorher beschrieben gewaschen. Der Nachweis der Endo-H-Bindung an die Bakterienzellen erfolgte durch den Nachweis von HRP-Streptavidin, das sich sehr fest an das an die Zellen gebundene biotinylierte Endo-H bindet. Der HRP-Nachweis erfolgte durch die Zugabe von 0,5 ml des HRP-Substrats OPD (O-Phenylendiamin), das in Wasserstoffperoxid enthaltendem Citratphosphatpuffer verdünnt wurde. Die Chromogenbildung wurde mit 2 M H&sub2;SO&sub4; eine Minute nach der Zugabe von OPD gestoppt. Die Zellen wurden abzentrifugiert und der Überstand wurde bei 490 nm gemessen.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
A. Für Staphylococcus aureus Kontrolle Endo-H, Minuten
B. Für Streptococcus mutans Kontrolle Endo-H, Minuten
Diese Ergebnisse zeigen, daß eine Bindung von Endo-H an die Bakterien Staphylococcus aureus und Streptococcus mutans erfolgt. Die Daten zeigen, daß der größte Teil von Endo-H, der an die Zellen bindet, in den ersten zwei Minuten oder davor mit den Zellen in Kontakt tritt. Die bei Streptococcus mutans erhaltene höhere Extinktion könnte eine größere Bindungsrate von Endo-H anzeigen.

Beispiel 9

Erfindungsgemäße flüssige Hochleistungswäschewaschmittelzusammensetzung: Komponente Wirkstoff (Gew.-%) Lineare C&sub1;&sub3;-Alkylbenzolsulfonsäure C&sub1;&sub4;-C&sub1;&sub5;-Alkylpolyethoxylat-(2,25)-sulfonsäure 1,2-Propandiol Natriumdiethylentriaminpentaacetat Monoethanolamin C&sub1;&sub2;-C&sub1;&sub3;-Alkoholpolyethoxylat (6,5)* Ethanol Kaliumhydroxid Natriumhydroxid C&sub1;&sub2;-C&sub1;&sub4;-Fettsäure Citronensäure Calciumformiat Natriumformiat C&sub1;&sub2;-Alkyltrimethylammoniumchlorid Tetraethylenpentaminethoxylat (15-18) Wasser Farbstoff Parfüm Protease** Endoglykosidase-H

Anmerkungen:

(*) Alkohol und monoethoxylierter Alkohol wurden entfernt.
(**) mg wirksames Enzym/g (@34 mg wirksames Enzym/g Stammlösung)
Die vorstehend aufgeführten Bestandteile wurden einem Mischtank mit einem Einzelrührwerk in der Reihenfolge in der sie erscheinen zugegeben. Bevor das Protease-Enzym, der Farbstoff und das Parfüm zugegeben werden, wird der pH-Wert des Gemisches so eingestellt, daß eine Lösung mit 10 Gew.-% in Wasser bei 20ºC einen pH-Wert von etwa 8,5 aufweist.
Diese Zusammensetzung ergibt eine überlegene Reinigung von kohlehydrathaltigen Flecken, auch im Vergleich zu Waschmitteln, die Protease und/oder Amylase enthalten.

Beispiel 10

Anmerkungen:

(*) Alkohol und monoethoxylierter Alkohol wurden entfernt.
(**) mg wirksames Enzym/g (@ 34 mg wirksames Enzym/g Stammlösung)
Die vorstehend aufgeführten Bestandteile wurden einem Mischtank mit einem Einzelrührwerk in der Reihenfolge in der sie erscheinen zugegeben. Bevor das Protease-Enzym, der Farbstoff und das Parfüm zugegeben werden, wird der pH-Wert des Gemisches so eingestellt, daß eine Lösung mit 10 Gew.-% in Wasser bei 20ºC einen pH-Wert von etwa 8,5 aufweist.
Diese Zusammensetzung stellt eine überlegene Reinigung von kohlehydrathaltigen Flecken, insbesondere von Kotflecken, bereit.
Andere erfindungsgemäße Zusammensetzungen erhält man, wenn die Menge von Endo-H auf 0,40 mg/ml und die Wassermenge auf 35,72 verringert und 1% Irgasan (ein Bakteriozid von Ciba-Geigy) zugegeben wird.

Beispiel 11

Erfindungsgemäße Flüssigseifenzusammensetzung: Komponente Wirkstoff (Gew.-%) Ammoniumlaurylsulfat Natriumlaurylsarcosinat Cocamidopropylbetain Kokosnußfettsäure Quaternäres Amin Ethylendiamintetraessigsäure Ammoniumsulfat Parfüm Kathon Wasser Endoglykosidase-H Triclocarban
Die vorstehend aufgeführten Bestandteile wurden einem Mischtank mit einem Einzelrührwerk in der Reihenfolge in der sie erscheinen zugegeben.
Dieses Zusammensetzung stellt eine bakterienhemmende Wirkung zur Entfernung der üblichen Hautflora bereit, auch im Vergleich zu bakterienhemmenden Seifen, die keine Endoglykosidase enthalten.

Beispiel 12

Erfindungsgemäßes Reinigungsmittel für harte Oberflächen: Komponente Wirkstoff (Gew.-%) Künstliche Körperflüssigkeitsphase (spezifische Dichte 1,1) Barasum NAS-100 (Natriumsaponitton) Tetrakaliumpyrophosphat Trikaliumphosphat Natriumhypochlorid-Bleichmittel Natriumlaurylalkylsulfat-Tensid Farbstoff und Parfüm Endoglykosidase-H Enthärtetes Wasser Schleifmittel (Schaumperlit, spezifische Dichte 2,0, Durchschnittsteilchendurchmesser 50 µm (Mikrons)) Hercoflat-135-Füllstoff (pulverisiertes Polypropylen, spezifische Dichte 0,9, Durchschnittsteilchendurchmesser 35 µm (Mikrons))
Verhältnis des durchschnittlichen Teilchendurchmessers von Schleifmittel/Füllstoff = 1,43:1
Die Zusammensetzung wird hergestellt, indem Tetrakaliumpyrophosphat, Trikaliumphosphat, Natriumsaponitton, Farbstoff, Parfüm und entionisiertes Wasser durch verhältnismäßig starkes Rühren unter Ausnutzen von Scherkräften in dem Ausmaß gemischt werden, der erforderlich ist, um eine künstliche Körperflüssigkeitsphase zuzubereiten. Im Anschluß daran wird das Alkylsulfat-Tensid diesem Gemisch zugegeben, gefolgt von dem Polypropylen-Füllstoff. Eine getrennte wäßrige Aufschlämmung von Natriumhypochlorit und Perlit-Schleifmittel wird hergestellt und dann mit der künstlichen Körperflüssigkeitsphase vermischt, während sie unter geringem Rühren unter Ausnutzen von Scherkräften verflüssigt wird. Die erhaltene Scheuermittelzusammensetzung ist künstlich verdickt, d.h. Gel-ähnlich im Ruhezustand, aber leicht durch die Einwirkung von Scherkräften verflüssigbar. Eine solche Zusammensetzung ist besonders wirksam zur Entfernung von Flecken und Schmutz von harten Oberflächen.

Beispiel 13

Erfindungsgemäße Shampoozusammensetzung: Komponente Menge Ammoniumalkykulfat (29%ige wäßrige Lösung) Zinkpyridinethioninkristalle von Beispiel I des US-Patents 4,345,080 Kokosnußmonoethanolamid Ethylenglykoldistearat Natriumcitrat Citronensäure Farbstofflösung Parfüm Endoglykosidase-H Wasser

Beispiel 14

Ein erfindungsgemäßer transpirationshemmender Stift wird aus den folgenden Komponenten hergestellt: Komponente Menge Cyclomethicon Fluid-AP Stearylalkohol Castorwachs Talkum Zirkonium/Aluminium/Glycerin-Komplex Geruch überdeckendes Mittel C&sub2;&sub0;-Alkohol Pyridoxalphosphat Endoglykosidase-H

Beispiel 15

Erfindungsgemäße Flüssigseifenzusammensetzung: Komponente Wirkstoff (Gew.-%) Ammoniumlaurylsulfat Natriumlaurylsarcosinat Cocamidopropylbetain Kokosnußfettsäure Ethylendiamintetraessigsäure Ammoniumsulfat Parfüm Farbstoff Wasser Endo-H 2,4,4'Trichlor-2'hydroxydiphenylether
Die vorstehend aufgeführten Bestandteile wurden einem Mischtank mit einem Einzelrührwerk in der Reihenfolge in der sie erscheinen zugegeben. Bevor der Farbstoff und das Parfüm zugegeben werden, wird der pH-Wert des Gemisches so eingestellt, daß eine Lösung mit 10 Gew.-% in Wasser bei 20ºC einen pH-Wert von etwa 6,5 aufweist.
Diese Zusammensetzung stellt eine antibakterielle Wirkung zur Entfernung der üblichen Hautflora bereit.

Beispiel 16

Erfindungsgemäßes Reinigungsmittel für harte Oberflächen: Komponente Wirkstoff (Gew.-%) Natriumlaurylalkylsulfat Natriumalkylsulfat Butylcarbit Natriumbicarbonat Citronensäure Formaldehyd Parfüm Tartratmono/disuccinat Endo-H Wasser
Die vorstehend aufgeführten Bestandteile wurden einem Mischtank mit einem Einzelrührwerk in der Reihenfolge in der sie erscheinen zugegeben. Bevor das Parfüm zugegeben werden, wird der pH-Wert des Gemisches so eingestellt, daß eine Lösung mit 10 Gew.-% in Wasser bei 20ºC einen pH-Wert von etwa 7 aufweist.
Die Zusammensetzung ist wirksam zur Entfernung von Seifenschaum und Schimmel von harten Oberflächen und sie ist wirksamer als ein Reinigungsmittel ohne Endoglykosidase.

Beispiel 17

Zusammensetzung zur Reinigung und/oder Konservierung von ganzen Früchten, Gemüse oder anderen Pflanzenoberflächen: Komponente Wirkstoff (Gew.-%) Wasser C&sub1;&sub2;-C&sub1;&sub3;-Alkoholpolyethoxylat (6,5) Endo-H
Diese Zusammensetzung wird durch Mischen von Alkoholpolyethoxylat und Endo-H in Wasser in ihren jeweiligen Mengen und durch Einstellen des pH-Werts zwischen 6-7 hergestellt. Die fertige Zusammensetzung ist, wenn auf Pflanzenoberflächen wie ganze Früchte oder Gemüse gesprüht, bei der Vorbeugung vor mikrobiellem Wachstum auf diesen Oberflächen nützlich.

Beispiel 18

Potenzierung der bakterioziden Wirkung eines Bakteriostatikums durch Endo-H

Eine Übernachtkultur von Escherichia coli wurde in einer frischen Nährbrühe verdünnt und während vier Stunden bei 37ºC gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifügieren gewonnen und in 0,2 M Natriumcitratpuffer (SCB) (pH 5,5) gewaschen. Nach dem Abzentrifügieren wurden die Zellen in SCB resuspendiert. Die folgenden Röhrchen wurden angesetzt (in doppelter Ausfertigung): Bedingung Endo-H Chlorhexidin Wasser Kontrolle Chlorhexidin Endo-H + Chlorhexidin
Endo-H wurde aus E. coli-Bakterien erhalten, die Endo-H aus S. plicatus produzieren. Einem jeden Röhrchen wurden 790 µl der Zellsuspension zugegeben (Endvolumen nun 1 ml) und Proben von 10 µl wurden als 0 Minutenkontrolle entnommen. Die Röhrchen wurden bei 37ºC in einem Rotationsschüttler inkubiert und nach einer und drei Stunden wurden Proben von 10 µl entnommen. Die 10 µl-Aliquots wurden mit 990 µl PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) gemischt (10&supmin;² Verdünnung) und weiter aufeinanderfolgend (1:10) in PBS (100 µl in 990 µl PBS) verdünnt. 10 µl einer jeden verdünnten Lösung wurden auf Luria-Bertani-Agarplatten ausplattiert. Die Platten wurden bei 37ºC über Nacht inkubiert und die Kolonien wurden im Anschluß daran gezählt. Die Anzahl der Kolonie-bildenden Bakterien in den Röhrchen wurde entsprechend den hergestellten Verdünnungen berechnet und der Logarithmus dieser Zahl wurde für weitere graphische Darstellungen und Berechnungen verwendet. Bedingung Minuten-Kontrolle Stunde (log tote Bakterien) Kontrolle Endo-H Chlorhexidin Endo-H + Chlorhexidin
Diese Ergebnisse sind in Figur 8 graphisch dargestellt. Wie zu erkennen, verstärken 200 ppm Endo-H die bakteriozide Wirkung von 50 ppm Chlorhexidin.
Entsprechende Ergebnisse erhielt man für leicht unterschiedliche Konzentrationen von Chlorhexidin und Endo-H, deren Wirkung über einen Zeitraum von einer Stunde gemessen wurde. Diese Ergebnisse werden in Figur 9 veranschaulicht. Man erkennt, daß 140 ppm Endo-H die Wirksamkeit von 40 ppm Chlorhexidin verstärken.
Um diese Wirkung weiter zu untersuchen, wurde ein ähnliches Experiment unter Verwendung von 20 ppm Chlorhexidin (Endkonzentration) mit variierenden Konzentrationen von Endo-H durchgeführt. Diese Ergebnisse sind in den Figuren 10A und 10B dargestellt.
Diese Diagramme geben die Änderung des Logarithmus der Kolonie-bildenden Einheiten (CFU) an. Man erkennt, daß eine verhältnismäßig lineare Beziehung zwischen der zugesetzten Menge von Endo-H bis etwa 280 ppm Endo-H vorliegt. Weitere Erhöhungen der Endo-H-Konzentration verstärken die ungünstige Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Bakterien bis mindestens 1000 ppm Endo-H in Verbindung mit 20 ppm Chlorhexidin.

Beispiel 19

Wirkung von Endo-H allein und in Verbindung mit einem Bakteriostatikum auf die Lebensfähigkeit von Pilzen

Eine sich in der logarithmischen Phase befindliche Kultur von Candida albicans wurde gezüchtet, in frischem Wachstumsmedium verdünnt und mit 0, 1, 10, 100 und 1000 ppm Endo-H (Endkonzentration) während 4 Stunden unter Schütteln bei 37ºC behandelt. Endo-H wurde aus Bacillus subtilis-Bakterien erhalten, die transformiert wurden, um Endo-H aus S. plicatus zu produzieren. Ein-, zehn- und hundertfache Verdünnungen wurden hergestellt und ausplattiert, um die Anzahl der lebensfähigen Zellen zu bestimmen. Eine Konzentration von 0 bis 10 ppm Endo-H verringerte die Lebensfähigkeit der Zellen nicht signifikant, obwohl in einem Fall 10 ppm Endo-H die Lebensfähigkeit nach einem Inkubationszeitraum von 18 Stunden auf etwa 36% verringerte. Jedoch verringern Konzentrationen von 100 ppm bis 1000 ppm Endo-H die Anzahl der gewonnenen lebensfähigen Zellen auf etwa 50% bzw. 88%, verglichen mit der Kontrolle, die nicht mit Endo-H behandelt wurde, wenn die Zellen während vier Stunden behandelt wurden.
In einem getrennten Experiment wurde eine Kultur von Candida albicans gezüchtet, in frischem Medium verdünnt und mit 2,5 µg/ml Nystatin zusätzlich zu entweder 0, 1, 10, 100 oder 1000 ppm Endo-H (Endkonzentration) während 18 Stunden unter Schütteln bei 37ºC inkubiert. Ein-, zehn-, einhundert- und eintausendfache Verdünnungen wurden hergestellt und ausplattiert, um die Anzahl der lebensfähigen Zellen zu bestimmen. Endo-H verringerte die Anzahl der gewonnenen lebensfähigen Zellen im Vergleich zu den mit Nystatin allein erhaltenen Ergebnissen wie folgt: ppm Endo-H % Reduktion
Es wird deutlich, daß so wenig wie 1 ppm Endo-H die mycozide Wirkung von Nystahn signifikant verstärkt, während 10 ppm und 100 ppm Endo-H praktisch alle Pilze abtötet, welche die Behandlung mit Nystatin allein überlebt haben.
Ein ähnliches Experiment wurde unter Verwendung von Amphotericin B bei einer Konzentration von 0,5 Mikrogramm pro ml während drei Stunden durchgeführt. Die Ergebnisse waren wie folgt: ppm Endo-H % Reduktion der Lebensfähigkeit
Man erkennt, daß eine Konzentration von 100 ppm Endo-H die mycozide Wirkung von Amphotericin B verstärkt.

Beispiel 20

Antimikrobielle Wirkung von Endo-H allein und in Verbindung mit einem Lysozym

Eine 48-Stunden Subkultur von E. coli (ATCC 31617) wurde zur Überprüfung der Wirkung des Lysozyms Mutanolysin (Sigma Chemical Co.) allein oder in Verbindung mit einem Waschmittel und/oder Endo-H verwendet. Endo-H wurde aus E. coli-Bakterien erhalten, die zur Produktion von Endo-H aus S. plicatus transformiert wurden. Das folgende Protokoll und die Ergebnisse wurden nach einer Behandlung während zwei Stunden bei 37ºC erhalten: Mutanolysin Natriumcitrat pH Tide Endo-H Ergebnisse Kontrolle Fimbrien, dichte Zellwand Fimbrien, Zellkondensation Verlust der Fimbrien Wenige Zellen, einige leere Zellhüllen ("ghosts"), Zellwandzerstörung einige Fimbrien Zellen weisen beeinträchtigte Form auf (kondensiert), aber noch vorhanden
Wie zu erkennen, war die gesamte Morphologie der Bakterien, die Endo-H und Mutanolysin entweder mit ohne Waschmittel bei verschiedenen pH-Werten ausgesetzt waren, signifikant verändert. Die drastischsten Wirkungen traten bei pH 7 auf, wenn Endo-H allein oder in Verbindung mit dem Waschmittel verwendet wurde. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde jedoch anscheinend nicht beeinflußt. Endo-H und Mutanolysin verminderten im Vergleich zu einem Kontrollpuffer nicht die Anzahl der in einem Ausplattierungsexperiment erhaltenen Kolonien.

Beispiel 21

Entfernung von Bakterien von Glasoberflächen durch Endo-H und PNGaseF

Escherichia coli (ATCC 31617) und Staphylococcus epidermidis (ATCC 155) wurden zum Beimpfen von Objektträgern aus Glas verwendet. Jeder Objektträger wies zwei eingeritzte Kreise auf und ein jeder wurde mit E. coli oder S. epidermidis beimpft. Man inkubierte die Bakterien bei 37ºC während zwei Stunden.
Nach dem Spülen mit destilliertem Wasser wurden die Objektträger entweder mit 1) PBS- Puffer, 2) Endo-H (100 ppm) in PBS-Puffer oder 3) PNGaseF (100 ppm) in PBS-Puffer behandelt. Endo-H wurde aus B. coli-Bakterien erhalten, die Endo-H aus S. plicatus produzieren. Nach 30 Minuten bei 37ºC wurden die Objektträger in destilliertem Wasser gespült. Nach der Gramfärbung wurden die Objektträger mit Hellfeldoptik in einem Lichtmikroskop beurteilt.
Beim Kontrollpuffer war die Anzahl der auf dem Objektträger verbleibenden Bakterien größer als 100 pro Feld. Die mit Endo-H behandelten Objektträger wiesen weit weniger Bakterien auf. Bei S. epidermidis wurden nur etwa 1 bis 3 Bakterien pro Feld beobachtet. Bei E. coli wurden etwa 5 bis 10 Bakterien pro Feld beobachtet. Bei mit PNGaseF behandelten Objektträgern wurde eine geringe Anzahl von Bakterien für S. epidermidis als auch E. coli beobachtet (etwa 20 pro Feld).
Diese Ergebnisse zeigen, daß PNGaseF Bakterien von Glasoberflächen entfernen kann, wenn auch nicht so wirksam wie Endo-H.

Beispiel 22

Tablettenförmiger Gebißreiniger mit Endo-H

Natriumbicarbonat, Natriumperboratmonohydrat, Weinsäure, Natriumtripolyphosphat, Sulphaminsäure, Polyethylenglykol (Mol.gew. 20 000) und Ethylendiamintetraacetat werden getrennt durch Fluidifizierung bzw. Aufwirbelung in einem Heißluftbett bei 60- 65ºC während 30 Minuten granuliert. Derartige Granulate werden dann schleudernd mit den anderen Bestandteilen gemischt, um ein "Erstschicht"-Gemisch und ein "Zweitschicht"-Gemisch herzustellen, wobei das "Erstschicht"-Gemisch die folgende Zusammensetzung hat: Gew.-% Natriumbicarbonat Weinsäure Kaliummonopersulphat Sulphaminsäure Dinatriumpyrophosphat Natrinmcarbonat Polyethylenglykol Natriumsulphat Pfefferminzpulver Siliziumdioxid Natriumdodecylbenzolsulphonat
und das "Zweitschicht"-Gemisch weist die folgende Zusammensetzung auf: Gew.-% Natriumperboratmonohydrat Kaliummonopersulphat Natriumbicarbonat Natriumtripolyphosphat Natriumbicarbonat/Farbstoff Trilon B Natriumcarbonat Polyethylenglykol Siliziumdioxid Pfefferminzpulver Wasag-Ester 7 Wasag-Ester 15 Gehärtete Triglyzeride Natriumdodecylbenzolsulphonat Succinatdetergens Blue Lake Nr.1 Endo-H
Durch Pressen in einer rotierenden HORN-Tablettenpresse mit 39 Stationen wird eine Tablette hergestellt. Das Pressen erfolgt in zwei Stufen. Zuerst wird die "zweite Schicht", blaues Gemisch, durch Stampfen zu einem sehr niedrigen Preßgrad verpreßt (10 kN pro Tablette). Die "erste Schicht", weißes Gemisch, wird dann eingefüllt und zu 70 kN pro Tablette verpreßt. Auf diese Weise wird eine Tablette von 4 Gramm hergestellt, die 2,7 Gramm des blauen Gemisches und 1,3 Gramm des weißen Gemisches enthält.
Die Tabletten werden durch den Verbraucher zur Reinigung der in Wasser gelegten Gebisse in Wasser gelöst.

Beispiel 23

Lichtschutzcreme mit Endo-H

Ein Öl-in-Wasser-Sonnenfilteremulsionsgrundstoff wurde aus den folgenden Bestandteilen hergestellt, die durch ihre chemischen Bezeichnung oder die Bezeichnung der Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association (CTFA) gekennzeichnet sind: Bestandteil Gew.-% Wasserphase: Methylparaben (Konservierungsmittel) Pantethin (Feuchtigkeitspräparat) Carbomer 934 (Verdickungsmittel) Natriumhydroxid 10% (Neutralisationsmittel) Endo-H Gereinigtes Wasser Ölphase Schweres Mineralöl Stearinsäure, doppel gepreßt (anionischer Emulgator) Cholesterin (Hilfsemulgator) Cetylalkohol (Hilfsemulgator) Castoröl (Weichmacher) Cetylpalmitat (Weichmacher) Octyldimetyl-PABA (UV-Absorptionsmittel) Propylparaben (Konservierungsmittel)
Wasser und die Bestandteile der Wasserphase, außer der wäßrigen Lösung von Endo-H und Natriumhydroxid, werden in ein mit einem mechanischen Rührwerk ausgerüstetes Mischgefäß gefüllt und unter Erhitzen auf etwa 75-80ºC gemischt, wobei eine einheitliche wäßrige Dispersion gebildet wird. Im Anschluß daran wird die Natriumhydroxidlösung zugegeben und mit der wäßrigen Phase vermischt, um das saure Carbomer-Verdickungsmittel zu neutralisieren.
Das Mineralöl und die Bestandteile der Ölphase werden in ein separates Mischgefäß gefüllt und unter Erhitzen auf etwa 80-82ºC gemischt, wobei eine einheitliche Ölphase gebildet wird. Die erhitzte Ölphase wird der erhitzten Wasserphase unter Verwendung einer Hochgeschwindigkeitsdispersionsvorrichtung langsam zugegeben. Der Mischvorgang wird fortgesetzt bis eine homogene Öl/Wasser-Emulsion erhalten wird. Die Emulsion wird auf Raumtemperatur abgekühlt. Falls gewünscht, werden wahlweise Färbemittel, wie wasserlösliche Farbstoffe, vorzugsweise mit der Emulsion bei etwa 45-50ºC vermischt und Duftöle werden vorzugsweise bei etwa 35-40ºC zugegeben. Endo-H wird der Emulsion bei etwa 35-40ºC zugesetzt.

Beispiel 24

Entfernung von S. aureus von Schweinehaut

Schweinehaut wird mit S. aureus (1,2 x 10&sup7; Kolonien/ml) durch Sprühen von 0,1 cm³ der Kultur auf die Hautoberfläche beimpft. Man ließ die Organismen sich auf der Haut während zwei Stunden bei Raumtemperatur absetzen. Je zwei Stücke Schweinehaut wurden dann während 30 Sekunden wie folgt behandelt:
1) unbehandelte Kontrolle
2) Wasser allein
3) 10%ige Seifenlösung
4) #3 + Endo-H (20 ppm)
5) 20 ppm Endo-H in Puffer
Endo-H wurde aus E. coli-Bakterien erhalten, die zur Produktion von Endo-H aus S. plicatus transformiert wurden. Nach der Behandlung wurden die Proben in destilliertem Wasser gespült und in 2% Osmiumtetraoxid überführt und anschließend in Ryter-Kellenberger-Fixativ fixiert. Die Proben wurden dann entweder in Osmium oder Thiosemicarbizon verarbeitet. Nach einer kritischen-Punkt-Trocknung wurden alle Proben im Rasterelektronenmikroskop (SEM) untersucht und mikrographische Darstellungen angefertigt.
S. aureus-Kolonien wurden häufig auf den unbehandelten, mit Wasser behandelten oder mit normaler Seife behandelten Proben gefunden. Vgl. z.B. Figur 11, welche die Wirkung der Behandlung mit flüssiger Handseife veranschaulicht. Die mit Endo-H behandelten Proben zeigten einen signifikanten Verlust von Organismen. Vgl. z.B. Figur 12, welche die Entfernung von S. aureus von Schweinehaut veranschaulicht, wenn sie mit flüssiger Handseife plus Endo-H behandelt wurde.

Beispiel 25

Entfernung von Schimmel von einem Duschvorhang

Ein Plastikduschvorhang wurde mit Leitungswasser befeuchtet und während 3 Wochen dunkel aufbewahrt. Danach wurde eine kleine Probe des mit Schimmel bedeckten Vorhangs wie folgt behandelt:
1) destilliertes Wasser
2) + 2000 ppm Joy-Waschmittel
3) + 1000 ppm Endo-H
4) unbehandelt
Endo-H wurde aus E. coli-Bakterien erhalten, die zur Produktion von Endo-H aus S. plicatus transformiert wurden. Die Behandlungen dauerten 15-20 Sekunden bei Raumtemperatur. Der Duschvorhang wurde nach der Behandlung mit einem Baumwolltupfer abgewischt.
Figur 13 veranschaulicht der erhaltenen Ergebnisse. Die unbehandelte Kontrolle (Foto rechts unten - unterer rechter Quadrant der mittleren Photographie) zeigte makroskopisch als auch mikroskopisch viele Schimmelpilze und Schimmelpartikel.
Die mit destilliertem Wasser behandelte Kontrolle (Foto oben rechts - oberer rechter Quadrant der mittleren Photographie) wies weniger Organismen au{ obwohl noch Partikel zurückblieben und eine Entfärbung zu erkennen war.
Die Joy-behandelte Kontrolle (Foto unten links - unterer linker Quadrant der mittleren Photographie) wies weniger Organismen auf als die mit Wasser behandelte Probe, aber eine Entfärbung war noch erkennbar.
Die mit Endo-H behandelte Probe (Foto oben links - oberer linker Quadrant der mittleren Photographie) war sowohl frei von Organismen als auch frei von Entfärbungen.

Beispiel 26

Entfernung von Bakterien von Gewebe

Gewebemuster wurden entsprechend der Größe einer Petrischale in Stücke geschnitten. Zusätzliches Gewebe wurde zugegeben, um eine Gewebeprobe zu erhalten, die 5% des Gewebemusters entspricht (diese wurde nicht beimpft). Die Muster wurden in einem Autoklav während 15 Minuten bei 15 lbs bei 121ºC sterilisiert. Für eine jede Behandlung ist eine Gewebeprobe erforderlich. Glaskügelchen (40 g) und 100 ml 0,2 M Citratpuffer (pH 7,0) wurden in 250 ml-Erlenmeyerkolben eingebracht. Die Kolben wurden mit Gummistopfen und Aluminiumfolie verschlossen und in einem Autoklav sterilisiert. E. coli-Bakterien wurden in frischer Nährbrühe subkultiviert und während 48 Stunden bei 37ºC inkubiert. Trypticase-Sojaagarplanen halber Stärke (10 g/500 ml) wurden hergestellt und sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde Tetrazolium (1 ml/Liter) zugegeben. Die Agarplatten wurden wie folgt beimpft:
1. aufeinanderfolgende Verdünnungen der 48-Stunden-Kultur wurden hergestellt (1:10 und 10fache Verdünnungen über drei weitere Röhrchen in Peptonwasser);
2. danach wurde jedes Muster mit 2 ml der letzten Verdünnung (10&sup4;) beimpft.
3. Die Muster wurden dann bei 37ºC während zwei Stunden inkubiert (zwei Muster/Behandlung).
Nach der Inkubation wurden die Muster wie folgt gewaschen:

Waschen

100 ml steriler 0,2 M Citratpuffer (pH 7,0) + 40 g Glaskügelchen + die in Figur 14 beschriebene Behandlung (wobei AWA Endo-H ist, die aus E. coli-Bakterien erhalten wurde, welche zur Produktion von Endo-H aus S. plicatus transformiert wurden) in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben (steril). Zwei beimpfte Muster + steriles Gewebe zur Herstellung einer Gewebeprobe, die 5% des Musters entspricht, wurden bei 95ºF während 12 Minuten unter Schütteln gewaschen.

Spülen

Nach dem Waschen wurden die Muster durch Zugabe von 100 ml zweifach destilliertem/entionisiertem Wasser + 40 g Glaskügelchen in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben (steril) bei Raumtemperatur während zwei Minuten unter Schütteln gespült.
Die Gewebemuster wurden dann in Petrischalen gelegt und mit 3 ml Trypricase-Sojaagar halber Stärke mit Tetrazolium überlagert. Nach einem Inkubationszeitraum von 48 Stunden wurden die Kolonien gezählt.
Die Ergebnisse sind in Figur 15 aufgeführt. Diese Ergebnisse zeigen, daß 2% Irgasan plus Liquid-Tide eine doppelte logarithmische Abnahme des Bakterienwachstums ergibt, verglichen mit Tide allein. Die Zugabe von 40 ppm Endo-H verringert das Bakterienwachstum jedoch um eine weitere logarithmische Einheit.

Beispiel 27

Wirkung von Endo-H auf Hefe

Brühekulturen (18 Stunden) von Candida albicans und Sacchromyces cerevisiae wurden behandelt mit:
1) 0,2 M Natriumcitratpuffer, pH 5,5;
2) #1 plus 200 ppm Endo-H (aus E. coli die Endo-H aus S. plicatus produzieren).
Die Behandlungen dauerten 2 Stunden bei 37ºC.
Nach der Behandlung wurde jeweils ein Aliquot auf ein Formvar-beschichtetes 200- Maschen-Kupfergitter aufgetragen und durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht. Photomikrographische Aufnahmen der Untersuchungen wurden gemacht und werden in den Figuren 15 und 16 gezeigt.
Wie aus Figur 15A ersichtlich, wiesen mit Puffer allein behandelte Candida-Zellen einen guten morphologischen Zustand auf. Wie in Figur 15B gezeigt, flossen aus mit Endo-H behandelten Candida-Zellen sehr schnell Stoffe aus und sie verloren ihre strukturelle Integrität.
Mit Puffer allein behandelte Sacchromyces-Zellen wiesen einen guten morphologischen Zustand auf, wie in Figur 16A zu erkennen ist. Wenn die Zellen mit Endo-H behandelt wurden, blieben nur sehr begrenzte Stücke von Membranmaterial zurück. Vgl. Figur 16B.

Beispiel 28

Wirkung von Endo-H und Lysozym auf die Lebensfähigkeit von E. coli

Eine Kultur von E. coli-K12, welche in Laurie-Brühe (LB) über Nacht gezüchtet wurde, wurde 1:1000 in LB verdünnt und während 4 Stunden bei 37ºC erneut gezüchtet. Die Zellen wurden abzentrifugiert, gewaschen und in 0,1 M Natriumacetatpuffer (NA), pH 5,5, resuspendiert. Acht Röhrchen wurden wie folgt angesetzt: Röhrchennummer µl Zellen µl NA-Puffer µl Endo-H (1 mg/ml)
Endo-H wurde aus E. coli-Bakterien erhalten, die zur Produktion von Endo-H aus S. plicatus transformiert wurden. Die Röhrchen wurden während einer Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Röhrchen wurden zentrifugiert, gewaschen und in 8,00 µl 0,1 M Natriumphosphatpuffer (NP), pH 7,2, resuspendiert, der 0,1 M EDTA enthielt. Die Puffer- oder Hühnereiweißlysozymlösung wurden den Röhrchen wie folgt zugegeben: Röhrchennummer µl NP-Puffer µl Lysozym (1 mg/ml)
Zu diesem Zeitpunkt wurden Aliquots entnommen, um die Kolonie-bildenden Einheiten (CFU) zu bestimmen (Spalte A). Nach einem Inkubationszeitraum von einer Stunde bei 37ºC wurden Aliquots zur Bestimmung der CFUs verwendet (Spalte B). Der Logarithmus der Kolonie-bildenden Einheiten wurde berechnet. Die logarithmische Abnahme der CFUs wurde bestimmt, indem B von A subtrahiert wurde. Die Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt: Log CFUs Bedingung log. Änderung der CFUs Kontrolle Endo-H Lysozym Endo-H + Lysozym
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Kombination von Endo-H und Lysozym die Lebensfähigkeit von E. coli-Bakterien im Vergleich zu Endo-H oder Lysozym allein vermindert.

Beispiel 29

Vergleich der Wirkung von Endo-H mit T4- oder Hühnereiweiß-Lysozym auf die Lebensfähigkeit von E. coli

E. coli-Zellen wurden gewaschen und in 0,1 M Natriumacetatpuffer (pH 5,5) suspendiert. Die Zellen wurden in zwei Röhrchen aliquotiert (10 ml). Dem einem Röhrchen wurde nur Puffer (Kontrolle) und dem anderen Endo-H zugegeben (behandelt). Endo-H wurde aus B. subtilis-Bakterien erhalten, die zur Produktion von Endo-H aus S. plicatus transformiert wurden. Die Zellen wurden während einer Stunde bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert, gewaschen und in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,2) resuspendiert. Die Zellen wurden gleichmäßig aliquotiert und entweder mit Puffer oder Lysozym inkubiert. Hühnereiweiß- (HL) und T4- (TL) Lysozyme wurden in diesem Experiment verglichen. Die Röhrchen wurden während 1,5 Stunden inkubiert. Die Proben wurden verdünnt und zur CFU-Bestimmung davor (A) und danach (B) ausplattiert. Der Logarithmus der CFUs wurde bestimmt. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten: Inkubationsbedingung Log. CFUs Erste Zweite log. Änderung der CFUs Endo-H
Diese Ergebnisse zeigen, daß T4-Lysozym ebenfalls bei der Verminderung der Lebensfähigkeit von E. coli-Zellen in Verbindung mit Endo-H wirksam ist.

Beispiel 30

Behandlung von verschmutztem Windelmaterial mit Endo-H

Von einer verschmutzten Windel wurden Proben gewonnen. Jede Probe wurde geteilt. Die linke Seite der Probe wurde in 2000 ppm Tide und 1 ppm BPN' (Subtilisin-Protease aus Bacillus amyloliquifaciens) gewaschen. Die rechte Seite wurde in 2000 ppm Tide, 1 ppm BPN' und 40 ppm Endo-H (Boehringer Mannheim Biochemical, Katalognr. 100 119) gewaschen. Jede Probe wurde während 12 Minuten bei 95ºF gewaschen. Die Ergebnisse der zwei Experimente sind in den Figuren 17 und 18 dargestellt. Wie zu erkennen, enthält das Windelmaterial auf der rechten Seite der Figuren 17 und 18 wesentlich weniger fäkale Stoffe, verglichen mit der Tide-Protease-behandelten Windel, die in den Figuren 17 und 18 links gezeigt wird.
Alle hier angeführten Literaturstellen sind hier unter Bezugnahme ausdrücklich eingeschlossen.

Claims

1. Verfahren zur Freisetzung mindestens eines Teils eines Mikroorganismus von einer Oberfläche, an der er mindestens zum Teil durch eine reaktive Bindung des Typs II gebunden ist, welches Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß es darin besteht, die reaktive Bindung des Typs II mit einer Endoglykosidase des Typs II in Kontakt zu bringen, um mindestens einen Teil des Mikroorganismus von der Oberfläche freizusetzen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Mikroorganismus ein Prokaryot, vorzugsweise ein Bakterium ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Mikroorganismus ein Eukaryot, vorzugsweise ein Fungus ist.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Anteil des Mikroorganismus, der von der Oberfläche freigesetzt wird, mit einer Waschlösung in Kontakt gebracht wird, um diesen Anteil von der Oberfläche in die Waschlösung zu entfernen.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Anteil des Mikroorganismus, der von der Oberfläche freigesetzt wird, mit einer ein Waschmittel enthaltenden Flüssigkeit in Kontakt gebracht wird, um diesen Anteil von der Oberfläche in die Flüssigkeit zu entfernen.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Endoglykosidase des Typs II aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Endo-b-N-acetylglucosaminidase, Endo- a-N-acetylgalactosaminidase und Endo-b-N-galactosidase besteht.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Endoglykosidase des Typs II aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Endo-D, Endo-H, Endo-L, Endo-CI, Endo- CII, Endo-F-Gal-Typ, Endo-F und PNGaseF besteht.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Endoglykosidase des Typs II Endo-H ist.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches darin besteht, die Oberfläche des Mikroorganismus mit einem zweiten Enzym in Kontakt zu bringen, das die Endoglykosidase des Typs II nicht umfaßt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin das zweite Enzym eine Protease ist.