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Präparat zur Xundpflege und zum Verhindern der Bildung von Zahnbelg
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Präparat zur Mundpflege und zum Verhindern
der Bildung von Zahnbelag auf Zähnen, Zahnfleisch und Zahnersatz Beläge (Plaques)
auf Zähnen, Zahnfleisch und Zahnersatz sind nicht allein aus hygienisohen Gründen
unschön, es besteht vielmehr eine enge Beziehung zwishen dem Auftreten von Zahnbelag
und Karies. Mit letzterer wiederum sind oft Sekundärinfekte gekoppelt.
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Das Plaquematerial besteht zum überwiegenden Teil aus hochmolekularen
unlöslichen und/oder viskosen Polysacchariden - meist Dextranen und Lävanen - ,
die von kariogenen Streptokokken vornehmlich aus Saccharose synthetisiert werden
(1a-c).
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1) Gibbons, R.J.et al. a irchs oral Biol.11, 549-560 (1966) b)Archs
oral Biol.'12, 11-24 (1967) c)Archs oral Biol.j2, 1249-1262 (1968).
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Kariogene Streptokokken bilden hieraus ein Vielfaches an Plaquematerial
als vergleichsweise aus Glucose, oder aus Glucose und Fruktose (Invertzucker). im
geringsten ist die Polysaccharidbildung aus Invertzucker (2).
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Saccharose ist andererseits in sehr vielen Nahrungs- und Genußmitteln,
z. B. in Backwaren, Süßigkeiten und Getränken oft in recht hoher Konzentration enthalten.
la ist erwiesen, daß bei saccharosereicher Ernährung Plaque-Bildung durch kariogene
Streptokokken und Kariesentwicklung Hand in Hand gehen, daß Plaque-Bildung und Kariesentwicklung
jedoch sehr gering sind, wenn Saccharose beispielsweise durch Glucose ersetzt wird
(3a,b; 4a,b; 5).
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Dieses aus Polysacchariden bestehende Plaquematerial haftet fest an
Zahnoberflächen und läßt sich nur schwer mechanisch entfernen. Lls Folge entstehen
kariöse Läsionen unter dem Zahnbelag.
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Die Entfernung der Beläge und akkumulierter Nahrungsmittelbestandteile
durch Enzyme ist mehrfach vorgeschlagen worden. Amylasen und Proteasen sind zwar
geeignet, Nahrungsmittelreste zu lösen, greifen das Plaquematerial selbst jedoch
nicht an, da Amylasen diese Polysaccharidtypen nicht hydrolysieren können. Einige
Autoren konnten den Abbau von Plaquematerial des Dextrantypus durch Dextranase aus
Penicillium funiculosum zeigen (6,7). Dieses Enzym wird induktiv vom genannten Schimmelpilz
gebildet (8) und baut zwar homologes Dextran (Induktor-Dextran) gut ab, seine Wirkung
auf heterologe Dextrane ist jedoch unterschiedlich.
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Fitzgerald et al. (7) fanden, daß Plaquematerial verschiedener kariogener
Streptokokkenstämme z.T. gut, z.T. mäßig und z.T. gar nicht hydrolysiert wird. Ibgosohen
davon, daß Plaquematerial vom Lävantypus nicht erfaßt wird, bleibt die Verwendung
dieser Dextranase bisher insofern unbefriedigend, als das Enzym nicht alle Dextranvariationen,
die von kariogenen Streptokokken gebildet werden, löst.
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2) Gibbons, R.J. et al. irchs oral Biol. 12, 11-24 (1967) 3) Fitzgerald,
R.J. et al. a) J.im.dent. las. 61, 9-19 (1960) b) J.dent.Res. 39, 932-935 (1960)
4) Krasse, B., a) Archs oral Biol. 10, 215-221 (1965) oral Archs al Biol. 10, 223-236
(1965) 5) Guggenheim, B. et al. Helv. odont. Acta 10, 100-113 (1966) 6) Gibbons,
R.J. et al. Archs oral Biol. 12, 11-24 (1967) 7) Pitsgerald, R.J. et al. Arohs oral
Biol. 1, 125-128 (1968) 8) Tsuchiys et al. J. Baut. 64, 513-519 (1952).
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Es wurde nun gefunden, daß es weitaus sinnvoller und wirksamer ist,
die Polysaccharidbildung durch kariogene Streptokokken "a priori" dadurch zu unterbinden,
daß ihnen der Zucker dntzogen wird, aus dem sie das Plaquematerial vorzugsweise
synthetisieren. Dieser Zucker ist Saccharose.
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Saccharose wird durch d-Glucosidasen oder ß-Fructosidasen (Saccharasen,
Invertasen) in Glucose und Fructose gespalten. Saccharose kann auch durch geeignete
Transglucosidasen oder Transfructosidasen in andere lösliche Saccharide überführt
werden (9).
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Gegenstand der Erfindung ist ein Präparat zur Mundpflege und zum Verhindern
der Bildung von Zahnbelag auf Zähnen, Zahnfleisch und Zahnersatz, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß es Saccharose spaltende Enzyme und gegebenenfalls einen Trägerstoff enthält.
Durch das erfindungsgemäße Präparat wird oral vorliegende Saccharose zu Glucose
und Fructose gespalten und somit den Polysaccharid bildenden kariogenen Streptokokken
das Substrat zur Plaquebildung entzogen. Der besondere Vorteil des vorgeschlagenen
Verfahrens liegt dabei darin, daß die Polysaccharid- und Plaquebildung generell
verhindert wird, gleichgültig, ob es sich dabei um dextranähnliche Polysaccharide,
lävanähnliche Polysaccharide oder um Polysaccharide handelt, die einen Mischtyp
beider darstellen bzw. andere Bindungstypen enthalten.
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Die Enzyme können Trägerstoffen, z.B. Zahnpasta, Kaugummi, Mundwasser,
Einreibmitteln, Mundspray, Lutschtabletten, Wasser, Getränken bzw. anderen geeigneten
Trägern zugesetzt werden. Die Enzymkonzentration soll dabei so hoch liegen, daß
vorhandene Saccharose gespalten wird. Wird bei.
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spielsseise ß-Fructosidase vervendet, so genügt schon eine Enzymkonzentration
von 0,4 . 10 3 Weidenhagen-Einheiten (WE) pro g oder ml Träger (10). Einem Zusatz
höherer Enzymkonzentrationen steht nichts entgegen, z.B. etwa bis zu 5 WE pro g
oder ml Trägerstoff.
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Durch die Verschiedenheit der Trägerstoffe und durch die unterschiedlichen
Bedingungen, denen diese vor Verwendung unterworfen sein können, 9) Reed, G. Enzymes
in Food Processing, Academic Press New York, s. 69-73, 102-108 (1966) 10) Eine Xeidenhagen-Einheit
(WE) - Enzymmenge, die unter Testbedingungen eine 5 Xige Saccharosespaltung in 1
Min bewirkt.
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kann es erforderlich sein, die Enzymkonzentrationen in einem weiten
Bereich zu variieren.
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Die empfohlene Enzymkonzentration bezieht sich auf ein ß-Fructosidase-Präparat
der Fa. Merck, Darmstadt, Saccharase (Invertase, ß-Fructosidase) Nr. 7683 20 Weidenhagen-Einheiten/g.
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Die Erfindung beschränkt sich nicht allein auf die Anwendung des genannten
Enzyms; es ist selbstverständlich, daß bei Verwendung anderer Saccharose eliminierender
Enzyme oder anderer Enzympräparate andere iktivitätsangaben und Enzymkonzentrationen
notwendig werden. Die Kontaktzeit, während der die Enzyme enthaltenden Trägerstoffe
normalerweise mit Mundraum und Zähnen in Berührung bleiben, reicht an sich für die
erwünschte Wirkung aus. Längere Kontaktzeiten erhöhen die Wirksamkeit, sie ergeben
sich beispielsweise dadurch, daß nach Gebrauch oraler Mittel oder Präparate der
Xundraum nicht mit Wasser gespült wird.
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Die Trägerstoffe als solche können von konventioneller Zusammensetzung
sein und übliche Wirkstoffzusätze enthalten. Daneben können die Trägerstoffe enthalten:
1. Enzyme oder Enzymkombinationen, die zur Entfernung von Belägen und/ oder akkumulierter
liahrungsmittelbestandteile geeignet sind (z.B0 Dextranasen,. Enzymkomplexe ex origine
enthaltend Dextranasen und Imylasen, Lavanasen, Amylasen, Proteasen usw.); 2. Geeignete
Glycosylakzeptoren, durch deren Ansesenheit die Bildung unlöslicher Polysaccharide
beeinflußt werden kann (z.B. niedermolekulare Dextrane, Lävane oder andere Akzeptoren).
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3. Serologisch aktive Komponenten (z.B. Antiseren oder entsprechende
Zubereitungen, die beispielsweise Dextran- oder Lävansucrasen kariogener Streptokokken
oder die Organismen selbst inhibieren).
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Die unter 1 bis 3 genannten Stoffe oder solche, die in ähnlicher Weise
wirkten, können einzeln oder in Kombination im Trägerstoff enthalten sein.
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Trägerstoffe mit den unter 1) genannten Enzymzusätzen können im Rahmen
der vorliegenden Erfindung insbesondere dann zweckmäßig sein, wenn es erwünscht
ist, nicht nur das Entstehen von Plaquematerial auf den Zähnen zu verhindern, sondern
auch die Entfernung bereits vorhandener Beläge zu
bewirken. Trägerstoffe
mit den unter 2) und 3) genannten Zusätzen ergänzen direkt oder indirekt die Wirkung
der erfindungsgemäß verwendeten Saccharose spaltenden Enzyme.
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Das Vorkommen, die Isolation und die Identifizierung kariogener Streptokokken
sind mehrfach beschrieben worden (11-13). Hiernach ist das Vorkommen dieser Organismen
bei Individuen, die Karies aufweisen, generell verbreitet (12), die Organismen gehören
hinsichtlich ihrer typischen biochemischen und pathogenen Fähigkeiten einer Gruppe
an und machen im Plaquematerial-oft über 50 y der Gesamtpopulation aus (13). Auf
geeigneten Kulturmedien lassen sich kariogene Streptokokken eindeutig identifizieren
(11-13).
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Aus Plaquemategial kariöser Zähne von 11 Personen wurden 14 polysaccharidbilden
de treptokokkenstämme auf die von (13) angegebene Art und Weise isoliert und identifiziert.
Alle Stämme bildeten auf saccharosehaltigen festen Nährböden die für Karies induzierende
Streptokokken typischen Kolonieformen (11,13) und in flüssiger Kultur auf Saccharose
an Gefäßwandungen und an in die Kulturlösung eintauchenden Glasstäben stark haftende
Beläge. Für Stammkulturen und zur Polysaccharidbildung wurde das von (14) angegebene
Basal-Medium (Trypticase (B.B.L.) 2 %, NaCl 0,2 %, K2HP04 0,3 %, EH2P04 0,2 %, K2CQ)
0,1 %, MgS04 0,012 %, MnSO4 0,0015 %) mit 0,5 %, bzw. 5 % oder 10 % Saccharose verwendet
und nach der dort beschriebenen Methode gearbeitet. Von einigen Stämmen wurden die
auf Basalmedium mit 5 ffi Saccharose gebildeten löslichen und unlöslichen Polysaccharide
isoliert und gereinigt und mit Dextranasen verschiedener Herkunft inkubiert. Am
geeignetsten zum Abbau erwies sich hierbei und bei in situ gebildetem unlöslichem
Plaquematerial ein Hefeemzymkomplex, der ex origine Dextranasen und Amylasen enthielt.
Ein Verfahren zur Herstellung dieser Enzyme aus Hefen ist Gegenstand der Patentanmeldung
P 1908225.8. Die gelchromatographische Analyse der Abbauprodukte (Trenel, G. et
al, FEBS Letters 2, Seite 74-76, 1968) ergab, daß das Plaquematerial zum großen
Teil aus dextranähnlichen Polysacchariden besteht. Handelsübliche Amylasen zeigten
keinen Abbau.
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11) De Stoppelaar, J.D. irchs oral Biol. 2 1199-1201 (1967) 12) Gibbons,
R.J. et al. Arche oral Biol. 12, 1013-1014,(1967) 13) Jordan, H.V. et al. Ärchs
oral Biol. 2 919-9a?, (1968) 14) Gibbons, R.J. et al. Archs oral BiolJ 132 1249-1262
(1968).
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Die Streptokokkenstämme werden in der folgenden Tabelle I genannt
und sind in der Organismensammlung des Biologischen Laboratoriums der VLB im Institut
für Gärungsgewerbe und Biotechnologie, Berlin 65; hinterlegt.
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Daß Saccharose spaltende Enzyme die Polysaccharidbildung und Ablagerung
der im Voraufgehenden charakterisierten Streptokokkenstämme unterbinden, wird in
den folgenden Beispielen gezeigt.
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Beispiel 1 Je fünf Kulturröhrchen mit einhängendem Glasstab enthaltend
9,5 ml steriles Basal-Medium mit 5 % Saccharose wurden mit 0,1 ml Stammkulturlösung
der aufgeführten Stämme beimpft. Zu jeweils drei Röhrchen der Fünffachansätze wurden
4 Stunden später 0,4 ml steriler ß-Fructosidaselösungen (Präparat Merck 7683) unterschiedlicher
Enzymkonzentration gegeben. Das vierte Kulturröhrchen (Kontrolle 2) wurde jeweils
mit 0,4 ml sterilen destillierten Wassers auf ein Gesamtvolumen von 10 ml gebracht,
und das fünfte Röhrchen (Kontrolle 1) erhielt schließlich 0,4 ml hitzeinaktivierter
ß-Fructosidaselösung der höchsten verwendeten Enzymkonzentration zugesetzt. Alle
Ansätze wurden 48 Stunden bei 370 C bebrütet und dann ausgewertet. Die Ergebnisse
sind in Tabelle I zusammengefaßt: Tabelle I Ohne aktive B-Fructo- Zusatz aktiver
B-Pructosidase sidase Kontrolle 1 Kontrolle 2 0,0083 WS 0,000332 WE 0,000156 WE
Stamm inaktivier- ohne je ml je ml Kul- je ml Sulte ß-Fruc- Zusatz Kultur- turlösung
turlösung tosidase lösung EIa 3 3 0 0 1 Al 3 3 0 0 0 XL 3 3 0 0 1 PF IIa 2 2 0 0
0 Wib 2 2 0 0 0 Bib 3 3 0 0 1 DOI 3 3 0 0 1 NI 2 2 0 0 0 H 3 3 0 0 0 PJ 2 2 0 0
0 3 3 3 0 0 1 WKC 2 2 0 0 Q C 3 3 0 0 1 3A 3 3 0 0 1 Es bedeutent 0-keine Polysaccharidbildung,
Kulturlösung dünnflüssig -Spuren von Polysaccharid, jedoch keine Beläge an Wandungen
oder Glasstab 2-Intensive Polycaccharidbildung, Beläge an Wandungen und Glasstab,
Kulturlösung viscos.
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3-sehr intensive Polysaccharidbildung, starke Beläge an Wandungen
und Glasstab, Kulturlösung fadenziehend.
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Beispiel 2 Von allen o.a. Streptckokkenstämmen wurden Gußplatten (oben
aufgeführtes Basal-Medium mit 10 % Saccharose und 2 % Agar, überschichtet mit 0,5
ml 103-fach verdünnter Impfkultur) hergestellt, bis zum Abtrocknen der Platten 4
Stunden bei 370 C bebrütet, dann Löcher von 7 mm in den Nährboden gestanzt und hier
hinein 0,04 ml ß-Fructosidaselösung (Präparat Merok 7683) enthaltend 6,64 . 10 -3
WE pipettiert. Als Kontrolle diente ein Loch, dem die gleiche zuvor hitzeinaktivierte
Enzymmenge zugegeben wurde. Die Platten wurden 48 Stunden bei 370 C bebrütet.
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Dieser Lochplattentest ergab, daß sich bei allen Stämmen um das Loch,
dem die aktive Enzymlosung zugegeben worden war, hinsichtlich der Polysehr saccharidbildung
ein ausgeprägter Hemmhof bildete, in dessen Bereich nur kleine polysaccharidfreie
Kolonien wuchsen, während bei der Kontrolle stets polysaccharidbildende Kolonien
bis unmittelbar an den Lochrand gewachsen waren.
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Beispiel 3 Wie in Beispiel 1 beschrieben wurden Kulturansätze-bereitet
und beimpft.
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Diese bestanden aus Kontrolle 1 mit Zusatz, Kontrolle 2 ohne Zusatz
inaktivierten Enzyms und einem weiteren Kulturröhrchen, dem 0,4 mlo(-Glucosidaselösung
zugegeben wurde. Es wurden hierzu verwendet: CC-Glucosidase 1s Spritamylase Novo
II, Novo Industri Ab, Kopenhagen. Standard-Aktivität des Präparates 523 Spritamylase
Einheiten/ml .X-Olucosidase 2t Diazyme L 30 liquid, Mildes Lab. Inc., Elkhart -Indiana
USA.
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Standard-Aktivität des Präparates 30 Diazyme Einheiten/ml Diese Enzyme,
wie auch das schon genannte ß-Fructosidase-Präparat der Fa. Merck, wurden auf Antibiotika-Wirkung
geprüft und als frei von solcher befunden.
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Diese Enzymkonzentrationen im 10 ml-Ansatz betrugen für i-Glucosidase
1 2,1 Einheiten/ml, für<-Glucosidase 2 0,012 Einheiten/ml. Die Ansätze wurden
48 Stunden bei 370 C bebrütet und dann ausgewertet.
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Alle Stämme Polysaccharid bildender kariogener Streptokokken bildeten
in den Kontrollröhrchen intensiv unlösliche und hochmolekulare viskose Polysaccharide.
In den jeweils mit oC-Glucosidase versetzten Kulturröhrchen konnten weder die Bildung
unlöslicher Beläge noch hochmolekularer viskoser Polysaccharide festgestllt werden.
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Beispiel 4 Unter den in Tabelle I genannten Stämmen wurde der Stamm
DOI, der sich u.a. durch die intensive Bildung besonders zäh haftender Polysaccharidbeläge
auszeichnete, ausgewählt, um die ohne Zusatz bzw. bei Zusatz unterschiedlicher ß-Fructosidasemengen
(Präparat Merck 7683) gebildeten unlöslichen Beläge und löslichen Polysaccharide
quantitativ zu bestimmen.
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Hierbei wurde wie in Beispiel 1 beschrieben Verfahren. Nach 48stündiger
0 Bebrütung bei 37 C wurden alle Ansätze zentrifugiert und das Trockengewicht des
so abgetrennten Unlöslichen bestimmt. Der Überstand wurde abgemessen und mit dem
0,8-fachen dieses Volumens an Aceton versetzt, entstehender Niederschlag erneut
abzentrifugiert und wiederum dessen Trockengewicht ermittelt. Die Ergebnisse sind
in Tabelle II zusammengestellt.
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Tabelle II Quantitative Bestimmung unlöslichen Plaquematerials und
löslicher Polysaccharide bei verschiedenen ß-Fruotosidase-Eonzentrationen, Stamm
DOl Wi nhagen Einheiten Plaquematerial, Polysaccharide, (WE) pro ml Xulturlö- unlöslicher
Anteil löslicher Anteil sung mg/ml % von Marx. mg/mlvon Max.
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Kontrolle 1 mit inaktivierten Enzymen 30,8 98,7 3s15 100 Kontrolle
2 ohne Zusatz 31,2 100 2,94 94 0,0083 0,78 2,5 0,98 31,3 0,00166 pos78 2,5 0,97
31 0,000664 0,75 2,4 0,97 31 0,000332 0,67 2,15 0,89 28,4 0,000166 2,76 8,9 0,50
16 0,0000996 5,12 16,4 2,25 72 0,0000664 6,45 20,7 4,9 (156,7) Aus dem Ansatz enthaltend
0,000332 E/ml Kulturlösung wurde ein Präparat angelegt und einem Präparat aus der
Kontrolle 1 gegenübergestellt. Ohne Enzymzusatz waren die Streptokokken in eine
dichte, zähe gallertartige Polysaccharidmasse eingebettet, mit Enzymzusatz dagegen
lagen alle Zellen frei ohne Polysaccharidumhüllung.
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Aus den Ergebnissen wird deutlich, daß schon sehr geringe Mengen an
ß-Fructosidase die Bildung unlöslicher und löslicher Polysaccharide praktisch vollständig
verhindert. Hierdurch kann ein Faktor, der bedeutenden Einfluß auf die Entstehung
und Entwicklung von Zahnkaries hat, beseitigt werden. Gleichzeitig werden damit
Sekundärinfekte bekämpft, die oft als Folge mangelnder Muadhygiene entstehen.
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Patentansprüche: