DE2651200A1

DE2651200A1 - Neuraminidase und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2651200A1
Application number: DE19762651200
Authority: DE
Inventors: Michael Flashner; Stuart W Tanenbaum
Original assignee: Research Foundation of State University of New York; New York University NYU
Current assignee: Research Foundation of State University of New York; New York University NYU
Priority date: 1976-11-01
Filing date: 1976-11-10
Publication date: 1978-05-11
Also published as: CA1102724A; JPS6056473B2; JPS5356386A; US4071408A

Description

Außerzellulare Neuraminidase (NANAase) wird durch den Mikroorganismus Arthro-

(ATCCNo. 31 253)
bacter sialophilum sp.nov./ hergestellt. Das Enzym wird durch verschiedene Glycoproteine aus diesem Mikroorganismus induziert. Der bevorzugte Enzymanreger ist ein heißer Wasserextrakt eines eßbaren Vogelnestes, der mild säurebehandelt worden ist. Die Mikroorganismen werden nach einem aeroben Wachstum in einem vollständigen Medium relativ einfacher Zusammensetzung geerntet, gewaschen, mit Salz sahockbehandelt ("salt-shocked") und in eine Mineralsalzlösung eingeführt, was zu einer leichten Enzyminduktion führt. Die gebildete NANAase wird durch Ammoniumsulf atf raktionierung, DEAE Cellulose« Chromatographie, Gelfiltration und Ultrafiltration. Weiter kann das Enzym leicht aus konzentrierten Lösungen kristallisiert werden. Scheibengelelektrophoresen bei saurem und basischem pH-Wert zeigten ein wesentliches Proteinband, Das vorherrschende Protein enthielt ,.NANAase Aktivität. Die NANAase hat ein offensichtliches Molekulargewicht von 87 000 Dalton. Das gereinigte Enzym hat ein pH Optimum von 5-6» ein offensichtliches K von 2,08 mg/ecm für

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Collocalia Mucoid und 23,3 χ 10 M für N-Acetylneuraminlaetose und ist gegen Ca Ionen und EDTA unempfindlich. Untersuchungen der spezifischen Bindungen unter Verwendung von N-Acetylneuraminlactose und Colominsäure zeigten, daß die NANAase (p(,2-3), (^,2-6) oder (o(,2-8) Bindungen hydrolysiert. Der oben genannte Mikroorganismus produziert etwa 5 mg NANAase/l Induktionmedium und ist eine ausgezeichnete Quelle zur Herstellung relativ großer Mengen homogener NANAase.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Neuraminidasen; sie richtet sich einerseits auf die Herstellung von Meuraminidasen sowie auf die aus einem spezifischen Mikroorganismus hergestellten Neuraminidasen. Weiter bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Materialien, die in Kombination mit einem spezibesonderen Mikroorganismus oder einer Variante oder einem Derivat desselben zur Herstellung von extrazellularer Neuraminidase geeignet sind.

Neuraminidasen sind zum Ändern und/oder Modifizieren von Kohlehydraten und Zelloberflächen, zur Behandlung oder Regression von festen Tumoren verwendet worden und sind für immunologische und Geburtenkontrolluntersuchungen und -zwecke geeignet. Andere Verwendungszwecke der Neuraminidasen sind bekannt; vgl. z.B. die US PS 3 259 550,· die hiermit in die vorliegende Anmeldung mit aufgenommen wird.

Die bisher zur Herstellung von Neuraminidasen verwendeten Mikroorganismen oder bakteriellen Quellen sind menschliche Pathogene* Diese Mikroorganismen oder Quellen erfordern relativ komplexe Wachstumsmedien und -bedingungen und liefern nur geringe Mengen des gewünschten Enzyms, der Neuraminidase. Weiterhin sind die produzierten Neuraminidasen gewöhnlich mit Glycohydrolasen, Proteasen, Phospholipasen und Hämolysinen verunreinigt, und diese Verunreinigungen sind nur schwer von den erhaltenen Neuraminidasen zu entfernen.

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Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung von Neuraminidase aus einem nicht bekannten oder als menschliches Pathogen angesehenen Mikroorganismus in hoher Ausbeute und mit verbesserter Reinheit und/oder Homogenität. Erfindungsgemäß sollen weiterhin Materialien geschaffen werden, die zur Herstellung von Neuraminidase in relativ hoher Ausbeute aus einem besonderen Mikroorganismus, der extrazellulare Neuraminidase produzieren kann, geeignet sind.

Es wurde gefunden, daß der Mikroorganismus Arthrobacter sialophilum sp.nov. oder eine Variante oder ein Derivat desselben in der Lage ist, erhebliche Mengen an Neuraminidase, z.B. etwa 100 Mal mehr Enzym, zu bilden, als durch den Mikroorganismus Clostridium perfrängens,gebildet wird, wobei letztgenannter Mikroorganismus großtechnisch zur Herstellung und Isolierung dieses Enzyms verwendet wird.

Neuraminidase (NANAase) E.C. 3*2.1.18 wird erfindungsgemäß hergestellt, indem man den Mikroorganismus A. sialophilum sp.nov. oder eine Variante oder ein Derivat desselben in einem tryptonhefeextrakthaltigen Medium züchtet und dann die geernteten Zellen auf Neuraminidase induziert.

Neuraminidase wird aus dem Mikroorganismus durch verschiedene Glycoproteine und niedrig molekulare Glycopeptide mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 500-50 000, vorzugsweise zwischen 1000-10 000, induziert. Es wurde festgestellt, daß das Enzym in Abwesenheit der Anreger (" inducers" ) oder in Anwesenheit von Chloramphenicol oder Chlortetracyclin nicht gebildet wird. Die erfindungsgemäß

■ ("sialic acid») geeigneten Materialien oder Anreger umfassen verschiedene Sialsäure/enthaltende Glycoproteine. Erfindungsgemäß wird vorzugsweise als Enzymanreger ein heißer Viasserextrakt eines eßbaren Vogelnestes, nämlich Collocaliamucoid, verwendet.

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Das Enzym NANAase wurde durch Aimnoniumsulfatfraktionierung, DEAE Cellulose-Chromatographie und Gelfiltration 70-fach gereinigt. Die Scheibengelelektrophorese bei sauren und basischem pH-Wert zeigte ein wesentliches Proteinband mit verschiedenen geringfügigen Veranreiniguageiv Das vorherrschende Protein enthielt jedoch die gesamte NANAase Aktivität. Die gebildete NANAase hat ein Molekulargewicht von 87 000 Dal ton gemäß Gelfiltrationschromatographie auf einer kalibrierten Sephadex-Kolonne. Das gereinigte Enzym hat ein pH Optimum von 5-6, ein offensichtliches K von etwa 2,08 mg/ccm für Collacalia-mucoid und 3,3 x 1O~^J für N-Acetylneuraminlactose und ist gegen Ca Ionen und EDTA unempfindlich. Untersuchungen bezüglich der Bindungsspezifität unter Verwendung

(ⁿ coXominic acid") von N-Acetylneuraminlactose und Colominsäure/zeigten, daß NANAase (of,2-3),

((X,2-6) oder (c^.,2-8) Bindungen hydrolysieren kann.

Neben den hohen Ausbeuten an NANAase aus dem erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismus sind insbesondere von wirtschaftlichem Interesse die anderen wünschenswerten Eigenschaften dieses Mikroorganismus, wie Nicht-Pathogenizität, schnelles aerobes Wachstum in definierten Medien, hohe Enzyminduzierbarkeit ohne merkliche Bildung anderer Glycohydrolasen und Proteasen und die relativ leichte Gewinnung und Reinigung der erhaltenen NANAase.

Die in den obigen Verfahren verwendeten Reagenzien umfassen Sephadex G-lj50 oder G-200 (Pharmacia), DEAE-Cellulose (Reeve Angel), N-Acetylneutraminlactose (Beef colostrum), N-Acetylenuraminsäure, Fötuin und submaxillares Mucin von der Firma Sigma Chemical Co. sowie Colominsäure von der Firma Calciochem. Alle anderen Chemikalien sind von üblicher "reagent-grade" Qualität.

Glycoproteisherstellung»Rohes "eßbares Vogelnest" wurde zu einem feinen Pulver vermählen und in einer Endkonzentration von *(■ # (Gew./Vol.) in Leitungswasser

eingeweicht. Die Suspension wurde 5 Stunden zum Rückfluß erhitzt, filtriert und dann per se verwendet. Das "säure-sbehandelte Vogelnest" erhielt man,

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indera man das Vogelnest mit H₂SO₁^ auf. Q,O5N brachte und dann 1,5 Stunden auf

80°C. erhitzte. Es wird darauf hingewiesen, daß Temperatur und pH-Wert für eine optimale Anregung entscheidend sind. Nach dem Abkühlen wurde der pH-Wert mit gesättigtem Ba(OH)₂ auf 7,0 eingestellt und das ausgefallene BaSQ^ durch Zentrifugieren entfernt. Collocalia-nmcoid wurde im wesentlichen gemäß Howe et al (Howe, Lee und Rose, 1961, "Gollocalia mucoid: a substrate for myxovirus neuraminidase",(Arch.Biochem.Beiophys. 95:512-520,) hergestellt. Bei dieser Herstellung wurde das rohe Vogelnestperkolat 3 Stunden bei 60 C. behandelt und dann gegen glasdestilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Kulturmedien Das vollständige Medium ¹¹TYE" wurde durch 1 # (Gew./Vol) Baktotrypton-0,50 % (Gew./Vol) Hefeextrakt gebildet. Reime Kulturen wurden auf TYE Agar gehalten. Das Mindestmedium war die von Adams (Adams, 1959 "Bacteriophages" , Seite 446, Interscience Publishers, New York) im einzelnen beschriebene "M-9" Lösung, die auf einen Natriumchloridgehalt modifiziert war. Die Zusammensetzung war wie folgt: Na₂HPOjL = 5,8 g; KH₂POk = 3»0 g; NaCl = 0,5 g; NH^Cl = 1,0 g; MgSO^ = 0,12 g; gelöst pro 1 deionisiertes Wasser. Für bestimmte Induktionsversuche wurden 2- bis 10-fache Konzentrationen an M-9, die als "2x" bis "1Ox" bezeichnet wurden, verwendet. Der Organismus wurde anfänglich in einer Rotationsschüttelvorrichtung (150 rpm) in TYE 15 Stunden bei 30°C. gezüchtet. Die gesammelten Zellen wurden mit sterilem Q,°0-$igem NaCl gewaschen, erneut in einem entsprechenden Mehrfachen des M-9 Medium auf eine endgültige Konzentration von etwa 10 Zellen/ecm suspendiert und in der Kälte gelagert. In allen Versuchen erfolgte die Enzyminduktion dann in 2x M-9 Medium durch Verdünnen der salzgeschockten Zellen auf eine endgültige Zellkonzentration von etwa 3 x 10 Zellen/'ccm mit dem entsprechenden Anregerpräparat. Heuraminidase und verwandte Bestimmungen Die Aktivität der Enzympräparate wurde wie folgt bestimmt: eine Reaktionsmischung, die 40 /uMol Citrat-Phosphat-Puffer (pH 6,0), I₉O mg Collocalia-mucoid und die Ensyrafraktion in einem endgültigen Volumen von O₅ 50 ecm enthielt, wurde bei 3? C. bebrütet. Nach 5 und

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10 Minuten wurden Aliquote von 0,20 ecm abgezogen und die N-Acetylneuraminsäure bestimmt. In allen Versuchen wurden für jeden Extrakt "Nullpunkt"-Bestimmungen gemacht. Eine Einheit an Enzymaktivität ist definiert als diejenige Menge, die 1 luMol N-Acetylneuraminsäure pro Minute aus de; Mucoidpräparat unter den oben angegebenen Bedingungen des Standardversuches freisetzt. Die spezifische Aktivität wird als Einheiten/mg Protein ausgedrückt. Das Protein wurde mit kristallinera Rindsrserumialbumin als Standard bestimmt. Weiter- wurden N-Acetylneuraminatpyruvatlyase-Bestimmungen durchgeführt . DMA Isolierung und Analyse des GC Molprozentsatzes Das endgültige Präparat hatte ein 26Ό/280 Verhältnis von 2,17. Der GC Molprozentsatz wurde durch schwimmende Dichteversuche ("buoyant density experiments") nit eiier Beckman Ultrazentrifuge, Modell E, bestimmt, die mit einem photoelektrischer Raster und Multiplexer versehen war. Als Markierung wurde das Bacteriophagum PM2 DNA (schwimmende Dichte = 1,696) verwendet. Dieser sekundäre Standard war vorher gegen M. lysodeikticus DMA kalibriert worden. Es wurden die

korrigierten schwimmenden Dichtmfür A. sialophilum berechnet. Elektrophorese

Die Scheibengelelektrophorese erfolgte bei k C. für 120 Minuten in Trisglyeän- oder Essigsäure-ß-Alanin-Puffersystemen in 6,0 % Polyacrylamidgel (Gabriel, I971, "Analytical disc gel electrophoresis", Seite 5^5-57Qi in W.B. Jakoby (ed.) "Methods in Enzymol.", Bd. 22, Academic Press, New York), Die Gele wurden ¥> Minuten unter Rühren in 12,5 # TCA eingeweicht und 1 Stunde bei 80°C. mit 0,050- $igem Coomassie Brilliantblau in 12,5 % TCA angefärbt und durch 4-8-stündiges Eintauchen in 10-$ TCA in der Dunkelheit entfärbt» Obgleich Schwierigkeiten bein Färben bakterieller Neuraminidasen berichtet wurden (Geisow, 1975 "An improved methodfor purifying sialidase" Biochem.J. 151:181-183» Hatton und Regoeczi, 1973 "A simple method for the purification of commercial neuraminidase free from proteases" Biochim.Biophys.Acta, 3²7: 11^-120), lieferte das oben beschriebene Verfahren scharfe blaue Bänder auch mit nur 10 mg Neuraminidase.

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Zur Bestimmung der Neuraminidaseaktivität wurden ungefärbte Scheibengelreplikeri in Abschnitte von je 2,0 mm Dicke (unter Verwendung einer von der Firma Biorad erhältlichen Vorrichtung) geschnitten. Dann wurde jeder Abschnitt über Nacht in O₁OlOM Citrat-Phosphat-Puffer (pH 6,0) bebrütet und die Neuraminidaseaktivität bestimmt, indem man Aliquote in Collocalia-mucoid 60 Minuten bei 37 C. bebrütete. Die Gele können auch rait MPN (Tuppy und Palese, 1969i "A chromogenic Substrate for the investigation of neuraminidase¹¹, FEBS Letts. 2'· ?2—75) gefärbt werden, wobei MPN Methoxyphenyl-N-acetyl-^-neuraminat bedeutet. Molekulargewichtbestimmung

Das Molekulargewicht der Neuraminidase wurde nach dem Verfahren von Andrews (Andrews, 1965» "The gel filtration behavior of proteins related to their molecular weights over a wide range", Biochem.J. j?6:595-606) geschätzt. Eine 1,5 x 90 cm Kolonne als Sephadex G-150 wurde mit 0,01OM Citrat-Phosphat-Puffer (pH 6,0) äquilibriert und bei einer Fließgeschwindigkeit von 12 ccm/std betrieben. Die Kalibrierungsstandards umfaßten V'-Globulin, Rinderserumalbumin_r Ghymotrypsinogen, Myoglobin und Cytochrom C. Diese Bestimmungen erfolgten bei

Wachstumseigenschaften von A» sialophilum

Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, erfolgte das Wachstum des Mikroorganismus auf verschiedenen Glycoproteinen, die als einzige Kohlenstoff- und.Stickstoff quellen verwendet wurden. Dies stimmt mit der bereits-.berichteten breiten Vielseitigkeit katabolischer Arthrobacter Enzyme überein. Obgleich Collocalia-mucoid anfanglich zur Selektion von A. sialophilum verwendet wurde, erhielt man die beste Neuraminidaseproduktion bezüglich der Enzymaktivität mit dem rohen Vogelnestextrakt.. Die anderen Sialoproteine sind mittelmäßige Stimulatoren der Enzymaktivität. Der Gegensatz zwischen Collocalia-mucoid und dem rohen, undialysierten Präparat bezüglich der Neuraminidaseproduktion kann die Entfernung der niedriger molekularen, komplexen Anregermaterialien -widerspiegeln.

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0,132	0,3^9
0,004	0,025
0,0?8	0,243
0,036	0,157

Tabelle 1

Aktivität einer Neuraminidase aus Zellen, die mit Glycoproteinen als einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle gezüchtet sind

Glycoprotein Aktivitätj spezif. Aktivität; Einheiten/ecm Sinh./mg Protein

roher Vogelnestextrakt Collocalia-mucoid submaxillares Mucin Fötuin

Die Zellen wurden 22 Stundenin 10 ecm M~9 Medium gezüchtet, das das entsprechende Glycoprotein in einer Endkonzentration von 0,050 $ enthielt, zentrifugiert und die Aktivität der Neuramindase im Wachstumsfiltr.at wie oben bestimmt.

Wurden über Nacht Kulturen von A. sialophilum in TYE gezüchtet, mit Kochsalzlösung gewaschen und erneut in 2 χ M-9 Mischung suspendiert, so wurde gemäß Tabelle 2 isi Gegensatz zum oben Gesagten gefunden, daß nur der rohe Vogelnestextrakt oder seine Umwandlungsprodukte als Anreger wirkten. Wurden diese Zellen jedoch 2 Stunden einer 10 χ M-9 Mischung bei k°G. ausgesetzt, dann wurde nicht nur die Stimulation der Enzyraaktivitat mit den oben genannten Glycoproteinpräparaten verbessert, sondern auch Fötuin und submaxillares Mucin induzierten die Enzymbildung. Es wird darauf hingewiesen, daß in beiden Versuchen das tatsächliche Induktionverfahren in 2 χ M-9 erfolgte. Daher wurden die A. sialophilum Zellen vor den Induktionen mit Io χ M-9 salzgeschockt. Obgleich berichtet wird, das N-Acetylncuraminsäure oder N-Acetylmannosarain gute Anreger für bakterielle Neuraminidase sind, waren diese Monosaccharide unter den genannten Bedingungen mit A* sialophilum nicht wirksam. Die offensichtliche hohe spezifische Aktivität mit N-Acetylneuraminsäure in den mit 10 χ M-9 behandelten Zellen zeigt aufgrund der schlechten Gesamtaktivität eine niedrige meßbare Proteinkonsentration anstelle einer verstärkten Enzymsynthese. Keine Neuraminldaseaktivität wurde in nicht-induzierten Zellen oder im Wachstraasfiltrat aus in TYE gezüchteten Zellen festgestellt.

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Tabelle 2

Zusatz

roher Vogelnestextrakt
Collocalia-mucoidsäuröbeh.Vogelnest
Fötuin

submax ill .Muc in
°5 N-Acetylneuraminsäure
to N-Acetylmannosamin

_» Kontrolle
co

	Stimulierung	Einn/ecm	der Neuraminidaseaktivität in Austauschmedien	10	xM-9^b	spezif. Aktivität
2	x M-9^a	0,03		Konzentr.	Aktivität	Einh./mg Protein
Konzentr. Aktivität	0,03	spezif. Aktivität	mg/ecm	Einh./ccm	0,11
mg/ ecm	0,0ό	Einh./mg Protein	1,20	0,09	0,21
0,16	0,0	0,22	0,40	0,04	1,25
0,16	0,0	0,20	0,53	0,29	0,04
0,16	0,0	0,48	0,40	0,56	0,11
0,16	0,0	0,0	0,40	■ 0,29	3,73
0,03	0,0	0,0	4,0	0,05	0,23
0,16	0,0	4,0	0,01	0,0
0,16	0,0		0,0
	0,0

^; die Zellen wurden 18 std in TYE gezüchtet, mit 0,9 # NaCl gewaschen, erneut in 2 χ M-9 suspendiert und 18 std bei 4⁰C. gelagert. Die Enzyrainduktion erfolgte mit dem angegebenen Substrat 6 std bei 30 C. in 2 χ M-9 bei einer Zellenzahl von 3,3 x 10 Zellen/ecm. Die Neuraminidaseaktivität wurde wie oben gemessen.

b = die Zellen wurden 15 std in TYE gezüchtet, mit 0,90 # NaCl gewaschen, erneut in 10 χ M-9 suspendiert und 18 std bei 4,C. gelagert. Die Enzyminduktion erfolgte mit dem angegebenen Substrat 10 std bei 30 C. in 2 χ M-9 beieiner Zellenzahl von 1,4 χ Kr Zellen/ecm.

Filtrate des Austauschmediums ("replacement medium filtrates"), erhalten aus den mit säurebjshandeltem Vogelnestextrakt induzierten Zellen, wurden auf die Anwesenheit anderer Glycohydrolasen mit entsprechenden tf- und ß-f-Nitrophenylketosiden getestet. Es wurden weder (^-Mannosidase-, c*- und ß-Galactosidase-, ^- und ß-Glucosidase-, ^- und ß-Fucosidase-, N-Acetyl-ß-galactosamidase- noch N-Acetyl-^glucosamidase Wirksamkeiten festgestellte.

Daß die obigen Beobachtungen eine tatsächliche spezifische Neuraminidaseinduktion zeigen, wurde durch eine Versuchsreihe unterstützt, in welcher Austauschkulturen mit säurebehandeltem Vogelnestextrakt durch Antibiotika ergänzt wurden. Wie aus Tabelle 3 ersichtlich, unterdrückten Inhibitoren der Proteinsynthese, wie Chloramphenicol oder Chlortetracyclän, das Auftreten einer Snzymaktivität vollständig, während Penicillin und Neomycin keine Inhibitorwirkung zeigten. Wiederum wurde festgestellt, daß keine Neuraminidaseaktivität im unergänzten Salzmedium beobachtet werden konnte. Diese Daten zeigen, daß die Akkumulierung der Meuraminidase durch diesen Mikroorganismus de novo eine Proteinsynthese und nicht die Freisetzung eines vorgebildeten Enzyms widergibt.

Die Unmöglichkeit zur Feststellung einer Neuraminidaseaktivität in Zellen, die mit Inhibitoren der Proteinsynthese behandelt wurden, legt das Fehlen irgendeiner wesentlichen Menge an vorgebildetem Enzym nahe. Es erfolgten Messungen des intra- und extrazellularen Maßes bzw. Wertes an Neuraminidase an Zellen, die mit säurebehandeltem Vogelnestextrakt induziert worden waren» Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt,mit 0,9 $> NaCl gewaschen, in 0,1OM Citrat-Phosphat-Puffer (pH 6,0) suspendiert und schallbehandelt. Der Zellabfall wurde durch Zentrifugieren entfernt und die Neuraminidaseaktivität in der überstehenden Flüssigkeit festgestellt. Auf diese Weise konnten nur 0,051 Gesamteinheiten an Enzymaktivität innerhalb der Zellen festgestellt werden, während insgesamt 11,5

Einheiten sich im Induktionsfiltrat fanden. Diese geringe Menge an intrazellularem Enzym ist im Vergleich zur extrazellular gefundenen Menge vernachlässigbar

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und kann eher absorbiertes Enzym als ein wirklich intrazellulares Material darstellen. Vergleichsversuche zeigten, daß N-Acetylneuraminatpyr_uvatlyase zwar in geringer Aktivität innerhalb zellfreier Extrakte anwesend war, jedoch nicht im extrazellularen Induktionsmedium gefunden wurde.

Tabelle 3

Induktion der Neuraminidaseaktivität in Anwesenheit von Antibiotika

zugefügte Verbindung Aktivität spezif. Aktivität

Einh./ccm Einh./mg Protein

keine	0,0	0,0
säurebehand.Vogelnest (ATBM)	0,265	0,848
ATBN + Chloramphenicol	0,0	0,0
ATBN + Chlortetracyclin	0,0	0,0
ATBN + Neomycin	0,292	0,925
ATBN + Penicillin G	0,300	0,755

= " acid-treated bird¹ s nest

Die Zellen wurden gemäß b) von Tabelle 2 mit säurebehandeltem Vogelnest als Anreger gezüchtet. In allen Fällen wurden die Antibiotika dem Induktionsmedium in einer Endkonzentration von 50 /Ug/ccm zugefügt«

Die Säurebehandlung des Vogelnestextraktes stimuliert dessen Wirkung für die gesamte und spezifische Enzymaktivität« Die größte Erhöhung der Neuraminidaseaktivität erfolgte innerhalb der ersten 30 Minuten der Säurebehandlung mit einer geringen linearen Erhöhung im Anschluß daran. Die Dünnschichtchromatographie des 0,05N säurebehandelten Extraktes zeigte einen neuen Ehrlich positiv Flecken, der im ursprünglichen Extrakt nicht festgestellt worden war. Die Fraktionierung des säurebehandelten Vorgelnestextraktes in Komponenten von unterschiedlichem Molekulargewicht zeigte, daß dieses Präparat mehrere unterschiedliche Anregermaterialien enthielt, von denen das aktivste ein Molekulargewicht zwischen 1000-10 000 Dalton hatte. Aus diesen Versuchen wurde eine Standardzeit der

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Säurebehandlung von 1,5 Stunden für ein anschließendes Arbeiten mit diesem Anregermaterial gewählt. Selbstverständlich sind der oder die Anreger höchst

ihrer Natur nach
wahrscheinlich/Glycopeptide oder proteanassoziierte Saccharide. Die Aktivität pro ecm Neuraminidase ist zweiphasig mit. einer schnellen linearen Anfangsphase, die bei etwa 0,25 mg/ccm säurebehandeltem Vogelnestextrakt merklich langsamer wird. Im Gegensatz dazu erhöhte sich die spezifische Aktivität des Enzyms

sehr schnell über eine lineare Anfangsphase und erreichte ein Maximum von 1,36 Einheiten/mg Protein, worauf sie mit erhöhter Akkumulierung der Aktivität abnahm» .Als Kompromiss zwischen Veränderungen in der spezifischen und Gesamtaktivität wurde-eine Endkonzentration von 0,40 mg/ccm als Standard gewählt. Es wurde die Aktivität dieser Anregerkonzentration gegen die Anzahl der A, sialophilum Zellen untersucht. Die Neuraminidaseaktivität wurde bei exponentieller Geschwindigkeit manifest und erreichte ein Maximum von 3 ^x 10 Zellen/ecm vor dem Absinken. Daher verwendeten Enzymherstellungen in großem Umfang diese Zelldichte.

Parameter der Enzyminduktioi

Die Induktion der Neurarainidase durch A. sialophilum wurde durch Vorbehandlung mit einem hohen M-9 Salzmedium verstärkt. Zur genauen Feststellung dieser Wirkung wurde eine Reihe von Versuchen durchgeführt. Wenn die Zellen einem 8 χ M-9 Medium ausgesetzt wurden, zeigte sich eine maximale Enzymbildung. Die aus diesen Versuchen entfernten Aliquote ergaben innerhalb der Versuchsfehlergrenzen

"Aufbringen'¹;
beim Züchten (/"plating") auf TYE identische Zellzählungen. Die bei jeder dieser Salzkonzentrationen untersuchten nassen Zellhäufchen waren von völlig coccoider Form. Diese Salzschockwirkung beruht vermutlich auf einer nicht bestimmten Folge der Permeabilität.

Zur Untersuchung der Beziehung A +.,sialophilum Vermehrung zur Enyzminduktion erfolgte die Neuraminidasesynthese gegen die Zellzählung. Die aufgetragenen Ergebnisse zeigten eine Kurve mit einer deutlichen Verzögerung ("lag") von

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Stunden und einem anschließenden exponentiellen Wachstum, was eine Generationszeit von 3,25 Stunden ergab. Während der Verzögerungsphase war die Enzymsynthese linear und flachte dann ab, als der Mikroorganismus die exponentiell Phase betrat. Auch die spezifische Aktivität der extrazellularen Neurain in idase ähnelte stark einer Enzymaktivität und erreichte ein Maximum ναι 1,10 Einheiten pro mg Protein.

Reinigung der A. sialophilum Neuraminidase

Die zur Reinigung der Neuraminidase verwendeten Verfahren sind in Tabelle 4

zusammengefaßt.

Tabelle 4
Reinigung der Neuraminidase aus A. sialophilum

Material Vol. Protein Protein spezif.

ecm mg Einheiten Aktivität Ausbeute

Einheiten $ .„

	4040	1959	824	mg Protein	100
Induktionfiltrat (I)	243	534	786	0,421	95
Ammoniumsulfat ausfällung (II)	202	162	4o4	1Λ7	49
DEAE-Celluloseaus- fluß (III)	3,5	25,6	320	2,49	39
Konzentrat aus XM-50 Ultrafiltration (IV)	39	10,9	319	12,5	39
Sephadex G-I50 (V)			29,3

Die Reinigungsstufen (II) bis (V) erfolgten bei 4°C.

Zur großtechnischen Snzymherstellung wurde A, sialophilum 24 Stunden bei 30⁰C. in 20-1-Behälter gezüchtet, die 10 1 TYE enthielten. Nach dem Zentrifugieren wurden die Zellen mit 0,90 # sterilem NaCl gewaschen, über Nacht in 10 χ M-9 vorbehandelt und 6 Stunden erneut in 5 1 Induktionsmedium, das säurebehandiltea Vogelnestextrakt enthielt, suspendiert. Die Bakterien wurden durch Zentrifugieren entfernt (Stufe I). Festes Ammoniumsulfat wurde innerhalb von 6 Stunden unter mechanichem Rühren auf eine Sättigung von 0,80 zugefügt, und der Niederschlag wurde in einem Minlestvolumen an 0,01M Citrat-Phosphat-Puffer (pH 6,0) gelöst

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(Stufe (II). Dann wurde die Lösnng einer Ionenaustauschchromatographie auf einer 2 χ 80 cm Kolonne aus DEAE Cellulose unterworfen, die mit dem Citrat-Phosphat-Puffer äquilibriert worden war. Unter diesen Bedingungen wurde die Neuraminidase nicht absorbiert, sondern erschien im Ausfluß (Stufe III). Die weitere Entfernung von niedrig molekularem Material erfolgte durch Druckfiltiation (Stickstoff) durch ein Diaflow XM-50 Filter (Amicon Apparatus Co.) (Stufe JJ). Die weitere Reinigung erfolgte durch Gelausschlußchromatographie auf einer Kolonne aus Sephadex G-150 (1,5 χ 100 cm), die mit Citrat-Phosphat-Puffer äquilibriert worden war (Stufe V). Nach der Salzentfernung durch Dialyse wurden die Neuraminidaseaktivität enthaltenden Fraktionen kombiniert, lyophilisiert und erneut in einem Mindestvolumen an 0,01OM Citrat-Phosphat-Puffer suspendiert. Die spezifische Aktivität des Endpräparates erhöhte sich um das 71-fache auf 29 Einheiten/mg Protein mit einer Gesamtausbeute von 29 $. Die Untersuchung dieses Präparates durch analytische Scheibengelelektrophorese bei sauren oder basischem pH-Wert zeigte ein vorherrschendes Band (um 80 %) mit drei geringeren Proteinverunreinigungen (um 20 $). Die gesamte Neuraminidaseaktivität der aufgeschnittenen Gelabschnitte war mit dem Hauptband verbunden. In einer getrennten Analyse unter Verwendung einer spezifischen Färbung mit MPN wurde das Enzym·.'· auch koinzident mit dem Hauptprotein lokalisiert. Die im Induktionsfiltrat anwesende Neuraminidasemenge (Stufe I) kann aus diesen Daten berechnet werden. Bezogen auf eine geschätzte endgültige spezifische Aktivität um 40 Einheiten/mg Protein für das homogene Enzym und weil das anfängliche Induktionsfiltrat 2o6 Einheiten/1 enthielt, kann dieses Isolat mindestens 5 mg Neuraminidase/l produzieren.

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Enzymeigenschaf-ten

Die Enzymaktivität erhöhte sich linear mit der Konzentration bis zu 0,28 mg/ccm Protein. Die Wikrung des pH-Wertes auf die Aktivität wurde in Citrat-Phosphat-Puffer untersucht. Sin pH Aktivitätsprofil mit Collocalia-mucoid ergab ein breites Optimum um 5-6. Die K Werte für Collocalia-mucoid und M-Acetylr-auramin-

^m ("inverse plots")

lactose wurde aus den als umgekehrte Eintragungen/gegebenen kinetischen Daten bestimmt. Diese Konstanten betrugen 2,08 mg/ccm für Collocalia mucoid und 3>3

-3

χ 10 M für N-Acetylneuraminlactose. Die folgenden Kationen, ob nun in der Bestimmungsmischung enthalten oder mit dem Enzym 30 Minuten bei 37 C. vorbebriitet

und in Konzentrationen zwischen 10 M und 10 'M, hatten keine Wirkung auf die

ι τ, ι ι. J L A J,

HeuKtmnidaseaktivität: Ca , Mg , Mn und Co . Auch das unter denselben Bedingungen getestete SDTA hatte keine Wirkung auf die Neuraminidaseaktivität. Die Wärmestabilität der A. sialophilum Neuraminidase erwies sich bei 3?°C als maximal mit einem scharfen Verlust der Aktivität nach 50 G.

Vorversuche erfolgten zur Bestimmung der Bindungspezifizität der A. sialophilum Neuraminidase.Colominsäure ist ein über eine c<-2,8-Bindung gebundenes Homopolymeres der N-Acetylneuraminsäure, während N-Acetylneuraminlactose eine Mischung der tf-2,3- und o(-2,β-Isomeren ist. Eine längere Bebrütung dieser Substrate mit Neuraminidase bewirkte eine Freisetzung von etwa 100 % der gebundenen N-Acetylneuraminsäure. Aus diesen Versuchen kann geschlossen werden, daß" A« sialophilum Enzym jede der obigen Bindungen hydrolysiert. Weitere Versuche mit getrennten,

für sein,

homogenen Isomeren würden/die Feststellung notwendig/ _ob kinetische Unterschiede

in der Hydrolyse dieser glycosidischen Bindungen bestehen.

Das Molekulargewicht der A. sialophilum Neuraminidase wurde durch Gelfiltration auf Sephadex G-I50 bestimmt. Man erhielt eine einzige symmetrische Spitze, und durch Extrapolieren wurde ein Molekulargewicht von 87 000 Dalton berechnet.

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Somit unterscheidet sie sich in dieser Eigenschaften nicht merklich von einer Ansammlung ("cluster") ähnlicher funktioneller, aus pathogenen Mikroorganismen erhaltenen Enzyme. Dieser Mikroorganismus A. sialophilum zeigt ein anspruchsloses aerobes Wachstum, die Induzierbarkeit unter definierten Bedingungen, die Bildung einer extrazellularen Aktivität ohne feststellbare begleitende Glycohydrolasen oder N-Acetylneuraminatpyruvat-lyase und die Bildung relativ großer Mengen an Enzym unter standardisierten Bedingungen.

Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus wird aufgrund seiner morphologischen, physiologischen, biochemischen und Färbungseigenschaften sowie im Zusammenhang mit den zu seiner Isolierung und enyzmatischen Induktion verwendeten Substraten als Arthrobacter sialophilum identifiziert. Der enzymbildende Organismus in ungefärbten Präparaten ist ein kleiner, leicht gebogener, nicht-motiler Stab, der keine Verzweigung zeigt. Die stabförmige, anfänglich gram-variable Phase wurde gram-positiv und unterzog sich einer pleomorphen Veränderung auf die kugelförmige Form nach längerer Bebrütung in flüssigem Medium. Die anfänglich auf festen Medien farblosen Kolonien wurden mit der Zeit leuchten!gelb, es sei denn, man hielt sie fm der Dunkelheit; diese Reaktion ist charakteristisch

("halotolerant")

für Carotenoidpigmente. Der Mikroorganismus ist halogentolerant/ überlebt eine 18-stündige Behandlung mit lO-/6igen Salzkonzentrationen, kann wiederholt auf Glucoseminimalmedium übergeführt werden und wächst nach einer Auswahl bei 37°C bis zu 43 C. Seine DNA Grundzusammensetzung von 56,0 Mol-# GC verweist ihn an untere Ende der in der Literatur angegebenen Werte für Arthrobacter Isolate. Er zeigt weiterhin die im letzten Satz des obigen Absatzes angegebenen Eigenschaften .

Die Zusammensetzung des Austauschinduktionsmediums, das andere Kohlenstoffquellen als den komplexen Anreger eliminierte, verhinderte die Katabolitrepression der Enzyminduktion; dieses Phänomen ist bereits für verschiedene Enzyme in den verwandten A. Crystallopoietes untersucht worden. Unter Verwendung handelsüblicherp-NOg-Phenylglycoside und den Neuraminidase liefernden Induktions·»

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bedingungen konnten keine feststellbaren ß-Galactosidase-, ß-Glucosidase-, ß-Glucosaminidase-, ot- oder ß-Fucosidase- oder <*—Mannosidaseaktivitäten gefunden werden, obgleich ot-Glucosidase schwach anwesend war. Diese chromogenen Glycoside zeigen die Analyse der Kohlehydratzusammensetzung von Collocaliamucoid (Kathan und Weeks, 1°69 "Structure studies of Collocalia mucoid; I. Carbohydrate and amino acid composition"; Arch.Biochem.Biophys. 13^:572-576), die Befunde während des Induktionsverfahrens zeigen jedoch, das nur Reste rait endständigen Sialsäuregruppen zur de novo Snzymsynthese beitrugen« Diese Beobachtungen stehen im Gegensatz zu verschiedenen Glycohydrolasen, die beim Ansprechen von D. pneumoniae auf Rinderherzinfusionsbrühe gefunden wurden.

Interessant ist die Natur der potentesten Anregersubstanz(en) im "säurebehandelten" Vogelnestmaterial. Wie in Tabelle 2 gezeigt, erhielt man die maximale Induktion durch 1,5-stündige Behandlung von Vogelnestnsteäal. bei 80 C. mit 0,05N HgSO^. Die oben genannten Daten von Kathan und Weeks bezüglich der Säurebehandlung von Collocalia-mucoid mit O,1N HpSO^ für 50 Minuten im Gegensatz zu 60 Minuten bei dieser Temperatur zeigten, daß die erstgenannten Bedingungen 4-0-Acetyl-N-acetylneuraminsäure als wesentliches freigesetztes Sialsäurederivat lieferten.

Die allgemeinen Eigenschaften der in diesem Mikroorganismus furuiUizierten Neuraminidase, d.h. offensichtliches Molekulargewicht von 87 000, pH Optimum zwischen 5-6, offensichtlicher K^ Wert von 3 t 3 * 10 M für N-Acetylneuraminlactose, die Unempfindlichkeit gegen Ca Ionen und EDTA₁ ihre Bindungsspezifizität und Wärmebeständigkeit rücken sie in die Nähe vieler anderer pathogener bakterieller Neuraminidasen (Balke, Scharmann und Drzeniek, 1974- "Die. Bestimmung des Molekulargewichts bakterieller Neuraminidasen mit Hilfe der Gelfiltration", Zentralbl. Bakteriol.parasitenkd* Infektionskr. Hyg. Ab. 1 Orig. Reihe A 229r55-6?; Drzeniek, 1972 "Viral and bacterial neuraminidases", Seite 37-75| in Arber et al (ed.), Curr. Topics in Microbiol. and Immunol., Bd. 59, Springer Verlag,

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New iork.). Der erf indungsgemäß verwendete Mikroorganismus liefert wesentlich mehr Neuraminidase als andere pathogene oder sonstige Quellen. Weiterhin ist das Enzym unter dem hier angegebenen Induktionsverfahren relativ homogen. Die Verwendung von A. sialophilum zur Herstellung präparativer Mengen an Neuraminidase bei minimalen Materialkosten und Laboratoriumsschritten ist äußerst zweckmäßig.

Der oben beschriebene Mirkoorganismus Arbhrobacter sialophilum ist bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA unter der Bezeichnung ATCC No. 31253 deponiert worden.

Es folgen .die Zusammensetzungen erfindungsgemäß geeigneter Lösungen. Tabelle 5 gibt die Zusammensetzung einsr Trypton-Hefeextrakt (TYE) Lösung, die zum Züchten des Mikroorganismus A. sialophilum geeignet ist.

Tabelle 5

10 g Bactotrypton
5 g Hefeextrakt
1 1 dest. Wasser

Tabelle 6 gibt die Zusammensetzung verschiedener Salzlösungen, nämlich des modifizierten M-9 Medium, die zur Induktion von Neuraminidase aus dem Mikroorganismus A. sialophilum geeignet sind.

Tabelle 6

	modifiziertes M-9	Medium
Komponente	2 χ	10 χ
Na₂HPO^	11,6 g	58 /g
KH₂PO^	6,0 g	30 g
NaCl	1,0 g	5,0 g
NH₂₁₁Cl	2,0 g	10,0 g
MgSOj₊	0,12 g	0,60 g
H₀O	1 1	1 1

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Tabelle ? zeigt die Herstellungsstufen von Vogelnextextrakt als Anregermedium für den Mikroorganismus A. sialophilum zur Neuraminidaseproduktion.

Tabelle 7

1) 300 g Vogelnest + 61 dest. V/asser

2) 6-stündiger Rückfluß bei 100°C.

3) Abkühlen auf Zimmertemperatur h) Filtrieren

5) Zugabe von 1,39 ecm konz. H₂SO^ (3όΝ) pro 1 Filtrat

6) 1,5-stündiges Erhitzen auf 80°C.

7) Abkühlen auf Zimmertemperatur

8) Zugabe von etwa 300 ecm gesättigbem Ba(OH)₂/! Filtrat; gegebenenfalls Einstellung des pH-Wertes auf 7,0

9) Zentrifugieren in einem Lourdes No 1350 Kopf bei 5000 χ g für 15 Minuten

10) auf die Hälfte mit dest. V/asser verdünnen

11) Sterialisation durch Autoklavenbehandlung bei 121 C. für 30 Minuten.

Tabelle 8 zeigt die verschiedenen Stufen zur Züchtung des Mikroorganismus A. sialophilum und der Induktion der Neuraminidase einschließlich der zur relativ großtechnischen Herstellung des Mikroorganismus und des Enzyms anwendbaren

Stufen.

Tabelle 8 Zellzüchtung in kleinem Maßstab (50 ecm)

1) Zugabe von 5,0 ecm steriler 0,9-$igsr NaCl zu geneigten Agarplatten

2) Entnahme von 2 ecm von (1) und Animpfen von 50 ecm ΤΪΕ in einem 500-ccm-Erlenmeyer-KoIben

3) l6-stündiges Züchten bei 30°C. und 150 rpm

k) Entnahme von 2 ecm der Übemachtkultur (aus 3) und Animpfen von 50 ecm ΤΥΈ

5) 10-stündiges Züchten bei 30°C. und 150 rpm

6) Zentrifugieren in 50 ecm Flaschen bei 12 000 g im SS y± Sorvall Rotor für 15 Minuten

7) Waschen mit 10 ecm steriler 0,9-$iger HaCl und zentrifugieren wie oben

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, 20 -

8) erneutes Suspendieren der Zellen in 5 ecm M-9 (B) Enzyminduktion in kleinem Maßstab

1) ¹J- ecm Anreger

2) 0,5 ecm M-9 (3)

3) - 0,5 ecm Zellen

¹O werden 6 Stunden bei 30°C. und 150 rpm gezüchtet; 5)- Zentrifugieren wie oben

6) Untersuchung des Induktionsfiltreates auf Neuraminidase

ZeHzüchtung in großem Umfang (25 1)

1) Zugabe von 5,0 ecm steriler 0,9-$iger NaCl zu geneigten Agarplatten

2) Entnahme von 2 ecm von (1) und Animpfen von 50 ecm TYE in 500 ecm Erlenmeyer Kolben

3) 16-stündige Züchtung bei 30°C. und 150 rpnw

4·) Zugabe von 20 ecm der 16-stündigen Kultur zu 2 1 Erlenmeyer-kolben, die jeweils 500 ecm TYE enthalten

5) 2*£-stündiger Züchtung bei 30°C. und 150 rpm

6) Animpfen von 12,5 1 TYE in 20-1-Behälters mit 500 ecm dec Übernachtkultur von (5)

7) 2^-stündige Züchtung bei 30°C. unter Belüftung

8) kontinuierliches Ernten der Zellen mit einer Sorvall Zentrifuge bei 19 000 χ g und einer Fließgeschwindigkeit von etwa 125 ccm/min

9) erneutes Suspendieren der Zellen in 500 ecm steriler 0,9-$iger NaCl

10) Zentrifugieren mit einem Sorvall· GSA Rotor bei 8000 χ g für 30 Minuten

11) erneutes Suspendieren in 2,5 1 M-9 (B)

12) Lagern über Nacht bei ^⁰C. Enzyminduktion in großem Maßstab

1) 10 1 Anreger werden mit

2) 2,5 1 Zellen (aus 11 B) geimpft

3) 6-stühdige Züchtung bei 30 C. in einem New Brunswick Fermentor bei einer Belüftungs geschwindigkeit von 2000 ccm/min bei 200 rpm

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4) Ernten durch Zentrifugieren mit einem Sorvall GSA Rotor bei 8000 χ g für 15 Minuten

Die folgende Tabelle 9 zeigt ein Bestimmungsverfahren für Neuraminidaae.

Tabelle 9 Bestimmungsbedingiingen

1) Zu 0,80 ecm Collocalia-mucoid in 0,l0M Citrat-Phosphat-Puffer (pH 6,0) wurden

2) 0,20 ecm Enyzm zugefügt;

3) -En-tnahJie von 0,20 ecm Aliquoten bei 5 und · 10 Minuten und Bestimmung auf NANA gemäß dem Warr,en-Verfahren in J.Biol.Chem. 234 I97I-1975 "The Thiobarbituric Assay of Sialic Acids".

Die folgende Tabelle 10 gibt eine bevorzugte Stufenfolge zur Reinigung der vom Mikroorganismus A. sialophilum hergeleiteten Neuraminidase bis zur Homogenität. Alle Stufen (II) bis (VII) erfolgten in Anwesenheit von 10 M Phenyl-

mereurylsulfonylfluorid.	Material	Tabelle 10	Aktivität Einheiten	spezif.Aktiv, Einheiten	Ausbeute t
Reinigung der	Induktionsfiltrat ₁₂ hnn			mg Protein
Vol. .. ecm	Ammoniumsulfataua- fällung (II) 430		3348	0,746	100
DEAE-Celluloseaus- fluß (III) 540		3010	6,22	90
Konzentrat aus XM-50 Ultrafiltration (IV) 3,3	Neuraminidase aus Arthrobacter sialophilum	2610	11,7	78
Sephadex G-I50 Eluat (V) 73	Protein mg	2060	26,1	62
Konzentrat aus PM-IO Ultrafiltration (VI) 17		2497	54,3	75
4489	1384	30,0	41
484
224
79
46 ·
45.6

Ammoniumsulfatkristallisation (VII)
erste Kristalle 5,0 8,2 490- 59,8 I5

Wie oben erwähnt, wird die Neuraminidase erfindungsgemäß vom Mikroorganismus A. sialophilum, einer Variante oder Mutante oder einem Derivat desselben her-

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geleitet. Eine rauhe Mutante desselben wurde erfindungsgemäß zur Herstellung von Neuraminidase verwendet; diese rauhe Mutante von A. sialophilum ist zur großtechnischen Herstellung von Neuraminidase besonders geeignet, da deren physikalische Eigenschaften rauh und nicht schleimig sind und sie somit zweckmäßiger und leichter gehandhabt und vom Kulturmedium abgetrennt werden kann.

Der hier verwendete Begriff "Vogelnest"' bezieht sich auf die z.B. aus der chinesischen Küche bekannten Vogelnester. Sie bestehen aus Glycoproteinen (vgl. auch Arch.Biochem.Biophys. 95:512-520, sowie Websters Dictionaries 1959), Sie werden von verschiedenen Arten Schwalben des genus collocalia in Südostasien hergestellt.

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Claims

-Vi-

Patentansprüche

1,- Extrazellulare Enzymneuraminidase, hergestellt durch den Mikroorganismus Arthrobacter sialophilum (ATCC No. 31 253) oder eine Variante, Mutante oder ein Derivat desselben.

2,- Verfahren zur Herstellung einer Heuraminidase, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Arthrobacter sialophilum, eine Variante oder Mutante oder ein Derivat desselben in Anwesenheit einer Neuraminidase induzierenden Substanz züchtet.

3·- Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Neuraminidase induzierende Substanz ein G-lyeoprotein oder ein niedrig molekulares Glycopeptid· umfaßt.

k,- Verfahren nach Anspruch 2 und 3> dadurch gekennzeichnet, daß die Neuraminidase induzierende Substanz Vogelnestmaterial, ein eßbares, wieder ausge~ würgtes gelatinöses Material, produziert von Schwalben des genus Gollocälia umfaßt.

5o- Verfahren nach Anspruch 2 bis k, dadurch gekenn zeichnet, daß die Neuraminidase induzierende Substanz ein säurebehandeltes Vogelnestmaterial ist. ■

6.- Verfahren nach Anspruch 2 bis k, dadurch gekennzeichnet, daß die Neuramien
nidase induzierende Substanz ein/heißen Wasserextrakt von Vogelnestmaterial

umfaßt.

7,- Material, das als Anreger von Neuraminidase aus dem Mikroorganismus Arthrobacter sialophilum oder einer Variante, Mutan be oder eines Derivates desselben geeignet ist und einen säurebehandelten heißen Wasserextrakt von eßbarem Vogelnestmaterial umfaßt.

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8.- Medium zum Züchten des Mikroorganismus Arthrobacter .sialophilum oder einer Variante, Mutante oder eines Derivates desselben zwecks Bildung von extrazellularer Enzymneuraminidase, umfassend Trypton-Hefe-Extrakt und eßbares Vogelnestmaterial.

9.- Medium nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das eßbare Vogelnestmaterial· ein heißer Wasserextrakt desselben ist.

10.- Medium zum Züchten des Mikroorganismus Arthrobacter sialophilum oder einer Variante, Mutante oder eines Derivates desselben zur Bildung von extrazellularer Enzymneuraminidase, umfassen!Trypton-Hefe-Extrakt.

11,- Verfahren zur Herstellung einer Neuraminidase, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Arthrobacter sialophilum oder eine Variante, Mutante oder ein Derivat desselben züchtet, den gebildeten Mikroorganismus erntet und Neuraminidase aus diesem induziert, indem man den geernteten Mikroorganismus mit einer ifeuraminidase induzierenden Substanz in Berührung bringt.

12.- Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Neutraminidase induzierende Substanz ein Glycoprotein oder Glycopeptide umfaßt.

13·- Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Neuraminidase induzierende Substanz Vogelnestmaterial umfaßt.

14.- Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Neuraminidase induzierende Substanz ein säurebehandeltes Vogelnestmaterial umfaßt.

15.- Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Neuraminidase induzierende Substanz einen säurebehandelten heißen Wasserextrakt von Vogelnestmaterial umfaßt.

16.- Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der geerntete Mikroorganismus vor der Induzierung - der Neuraminidase durch Berührung mit einer Neuraminidase induzierenden Substanz mit einer wässrigen Salzlösung in Berührung gebracht wird.

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17.- Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die wässrige Salzlösung Natriumchlorid umfaßt.

18.-Neuraminidase, hergeleitet vom Mikroorganismus Arthrobacter ATCC 31253 oder einer Neuraminidase produzierenden Variante, Hutante oder eines Derivates desselben.

19·- Verfahren zum Züchten des Mikroorganismus A. sialophilum, dadurch gekennzeichnet, daß man gemäß den in Tabelle 8 aufgeführten Stufen verfährt.

20.- Verfahren zum Induzieren von Neuraminidase nach Züchtung und Ernten des Mikroorganismus A. sialophilum, dadurch gekennzeichnet, daß man gemäß den Stufen der Snzyminduktion entsprechend Tabelle 8 verfährt.

21,- Verfahren zum Reinigen von Neuraminidase, dadurch gekennzeichnet, daß man gemäß den Stufen entsprechend Tabelle 10 verfährt.

Der Patentanwalt:

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