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TECHNISCHES
GEBIET
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine neue Keratan-Sulfat-Hydrolase,
ein Verfahren zu deren Herstellung und einen neuen Mikroorganismus,
der diese herstellt.
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STAND DER
TECHNIK
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Als
von Mikroorganismen stammende Enzyme, welche Keratan-Sulfat hydrolysieren
(im Weiteren als eine Keratan-Sulfat-Hydrolase bezeichnet), sind
ein endo-β-galactosidase-Typ-Enzym,
welches galactosidische Bindungen in der Zuckerkette des Keratan-Sulfats
hydrolysiert, und ein endo-β-N-acetylglucosaminidase-Typ-Enzym
bekannt, welches N-acetylglucosaminidische Bindungen von dieser
hydrolysiert.
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Als
Mikroorganismen, die das endo-β-N-acetylglucosaminidase-Typ-Enzym
herstellen, ist nur der Ks 36-Stamm bekannt, der zu der Gattung
Bacillus gehört,
der aus Bodenproben durch die vorliegenden Erfinder isoliert wurde
und dessen mikrobiologischen Merkmale und enyzmologischen Eigenschaften
wurden geklärt (japanische
Patentanmeldung-Offenlegung Nr. 2-57182).
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Das
Keratan-Sulfat wird in Keratan-Sulfat I, das in der Cornea von Tieren
vorkommt, und Keratan-Sulfat II und Keratan-Polysulfat gruppiert,
welche in den Geweben, wie z. B. Knorpel, enthalten sind, und jedes von
ihnen ist ein Copolymer, das das Disaccharid der Galactose und das
N-Acetylglucosamin als eine konstitutionelle Einheit umfasst. In
der Gestalt weisen die meisten der 6-Positionen des N-Acetylglucosamins eine Hydroxylgruppe
auf, während
ein großer
Prozentsatz der Konstituenten das Disaccharid-Disulfat sind, von dem
beide Hydroxylgruppen der 6-Positionen des N-Acetylglucosamins und
der Galactose letztendlich sulfatiert sind.
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Eine
Keratan-Sulfat-Hydrolase des endo-β-N-acetylglucosaminidase-Typs
wirkt auf die obigen Keratan-Sulfate und stellt als die Hydrolysate
hauptsächlich
sulfatiertes Keratan-Sulfat-Disaccharid und sulfatiertes Keratan-Sulfat- Tetrasaccharid her.
Das Disaccharid enthält
monosulfatiertes Keratan-Sulfat-Disaccharid
und disulfatiertes Keratan-Sulfat-Disaccharid, dessen reduzierte
Zuckerenden N-Acetylglucosamin sind.
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Dementsprechend
sind die hauptsächlich
durch die Keratan-Sulfat-Hydrolase des endo-β-N-acetylglucosaminidase-Typs
sulfatierten Hydrolysate des Keratan-Sulfats sulfatiertes Keratan-Sulfat-Disaccharid
und sulfatiertes Keratan-Sulfat-Tetrasaccharid,
welche die N-Acetyllactosamin-Struktur aufweisen.
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Das
N-Acetyllactosamin ist in der Zuckerkette des Oligosaccharids in
der menschlichen Milch, den Lipopolysacchariden und einer Vielfalt
von als Wachstumsfaktor des Lactobacillus bifidus (Bifidusfaktor),
welches ein Enterobakterium von gestillten Babys ist, bekannten
Glycoproteinen und Glycolipiden enthalten, und es wird Erfolg versprechend
davon ausgegangen, dass es für
Lebensmittel mit hohem Nährwert,
wie z. B. für Babys
hergestellte Trockenmilch, verwendet wird. Und letztendlich weist
das durch die sogenannte Sialyl-Lex-Zuckerkette
dargestellte Oligosaccharid, welche durch Binden der Fucose durch
die α-1,3-Bindung
an den N-Acetylglucosamin-Rest des N-Acetyllactosamins und der Sialinsäure durch
die α-2,3-Bindung
an den Galactoserest hergestellt wird, eine inhibitorische Aktivität zur Zelladhäsion auf,
und es wird erwartet, dass es ein Bestandteil von antiinflammatorischen
Agenzien sein wird, und es wird daher auch Erfolg versprechend davon
ausgegangen, dass das N-Acetyllactosamin ein Startmaterial für die Sialyl-Lex-Zuckerketten-Synthese ist.
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Es
ist bekannt, dass N-Acetyllactosamin durch ein Syntheseverfahren
mit einem Enzym, einem Desulfatierungsverfahren von sulfatiertem
Keratan-Disaccharid, welches ein Hydrolysat mit einer Keratan-Sulfat-Hydrolase
ist, usw., hergestellt wird. Und es ist bekannt, dass sulfatiertes
N-Acetyllactosamin-tetrasaccharid durch die Hydrolysierung von Keratan-Sulfat
mit einer wie oben beschriebenen Keratan-Sulfat-Hydrolase hergestellt
wird. Als die in der obigen Präparation
verwendete Keratan-Sulfat-Hydrolase des endo-β-N-acetylglucosaminidase-Typs
ist jedoch nur die wie oben beschriebene von dem Ks 36-Stamm stammende
Keratan-Sulfat-Hydrolase (Keratan-Sulfat-Hydrolase II) bekannt.
Dieses Enzym hat keine ausreichende Hitzestabilität, so dass
es bei ungefähr
30°C oder
darüber nicht
stabil ist. Daher wird es nicht als ein geeignetes Enzym betrachtet,
um sulfatiertes Keratan-Sulfat-Disaccharid oder -Tetrasaccharid
in einem großen
industriellen Maßstab herzustellen.
Speziell bei der Herstellung von sulfatiertem Keratan-Sulfat-Disaccharid
oder -Tetrasaccharid durch ein Batch-Abbauverfahren oder einem immobilisierten
Enzym-Abbauverfahren, benötigt
die Keratan-Sulfat-Hydrolase
eine hohe Hitzestabilität
und die Entwicklung der Keratan-Sulfat-Hydrolase des endo-β-N-acetylglucosaminidase-Typs,
die eine hohe Hitzestabilität
aufweist, wird erwünscht.
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BESCHREIEBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung wurde in Betracht des oben beschriebenen Gesichtspunktes
gemacht, dessen Ziel es ist, eine neue Keratan-Sulfat-Hydrolase
des endo-β-N-acetylglucosaminidase-Typs,
die eine hohe Hitzestabilität
aufweist, einen diese produzierenden neuen Mikroorganismus und ein
Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen.
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Die
vorliegenden Erfinder untersuchten weitgehend Bodenmikroorganismen,
um einen Mikroorganismus zu erhalten, der eine Keratan-Sulfat-Hydrolase
des endo-β-N-acetylglucosaminidase-Typs
herstellt, welche eine hohe Hitzestabilität aufweist, und waren erfolgreich
in der Isolierung eines Bacillus circulans-Stammes aus dem Boden
der Saitama Präfektur
in Japan, welcher die erwünschte
Zielsetzung erfüllt.
Obwohl die von dem Stamm hergestellte Keratan-Sulfat-Hydrolase ähnliche
Funktionen zu der konventionellen Keratan-Sulfat-Hydrolase II aufweist,
gibt es Unterschiede in der Hitzestabilität (sie ist bis zu 45°C stabil)
und anderer enzymologischer Eigenschaften. Es wurde daher bestätigt, dass
sie ein äußerst charakteristisches
Enzym ist. Dadurch wurde die vorliegende Erfindung vollendet.
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Und
zwar ist eine Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung
(des Weiteren manchmal als „das
vorliegende Enyzm" oder „das Enzym
der vorliegenden Erfindung" bezeichnet)
ein neues von dem Bacillus circulans erhältliches Enzym, dass die folgenden
physikalischen und chemischen Eigenschaften aufweist:
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(1) Wirkung
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Das
vorliegende Enzym wirkt auf Keratan-Sulfat und hydrolysiert dessen
N-Acetylglucosaminidische Bindung,
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(2) Substratspezifität
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Das
vorliegende Enzym wirkt auf Keratan-Sulfat I, Keratan-Sulfat II
und Keratan-Polysulfat,
und erzeugt sulfatiertes Keratan-Sulfat-Disaccharid und sulfatiertes
Keratan-Sulfat-Tetrasaccharid als die Haupthydrolysate,
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(3) pH-Reaktionsoptimum
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Das
vorliegende Enzym weist ein pH-Reaktionsoptimum von 4,5–6 in dem
0,1 M-Acetat-Puffer
oder dem 10 mM-Tris-Acetatpuffer bei 37°C auf,
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(4) pH-Stabilität
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Das
vorliegende Enzym weist eine pH-Stabilität von 6 bis 7 auf, wenn das
vorliegende Enzym im 0,1 M-Acetatpuffer oder dem 10 mM-Tris-Acetatpuffer
bei 37°C
für eine
Stunde stehen gelassen wird,
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(5) Reaktionstemperatur-Optimum
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Das
vorliegende Enzym weist ein Reaktionstemperatur-Optimum von 50 bis
60°C auf,
wenn das vorliegende Enzym im 0,1 M-Acetatpuffer, pH 6,0, für 10 Minuten
reagiert,
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(6) Hitzestabilität
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Das
vorliegende Enzym ist mindestens bei 45°C stabil, wenn das vorliegende
Enzym im 0,1 M-Acetatpufter, pH 6,0, für eine Stunde stehengelassen
wird, und
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(7) Molekulargewicht
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Die
Hydrolase weist ein Molekulargewicht von etwa 200.000 Dalton auf,
wenn das Molekulargewicht durch die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
in einer Gelkonzentration von 7% bestimmt wird.
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Des
Weiteren ist ein Verfahren zur Herstellung der Keratan-Sulfat-Hydrolase
der vorliegenden Erfindung durch das Kultivieren des Bacillus circulans
gekennzeichnet, der die Fähigkeit
aufweist, die Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung
in einem Medium herzustellen, und Gewinnen der Keratan-Sulfat-Hydrolase
aus dem Medium und/oder den mikrobiellen Zellen. Des Weiteren wird
die Keratan-Sulfat-Hydrolase von den mikrobiellen Zellen bevorzugt
aus dem Extrakt der mikrobiellen Zellen gewonnen, welches durch
Lysieren oder Aufschließen
der mikrobiellen Zellen hergestellt wird, um einen Extrakt der mikrobiellen Zellen
zu erhalten, und Behandlung des Extrakts mit Deoxyribonuclease.
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Ein
Bacillus circulans-Stamm der vorliegenden Erfindung gehört zu der
Gattung Bacillus und weist die Fähigkeit
auf, die die oben beschriebenen Eigenschaften aufweisende Keratan-Sulfat-Hydrolase
herzustellen,. Ein Beispiel für
den Stamm von Bacillus circulans enthält Bacillus circulans KsT202.
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Die
vorliegende Erfindung wird unten im Detail beschrieben werden.
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(1) Der neue Stamm, der
die Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung herstellt
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Das
Enzym der vorliegenden Erfindung kann von Bacillus circulans erhalten
werden, speziell wird Bacillus circulans KsT202 bevorzugt verwendet.
Dieser Stamm ist ein neuer Stamm, der von den vorliegenden Erfindern
aus dem in der Präfektur
Saitama erhaltenen Boden isoliert und aufgrund seiner in den unten
genannten Beispielen beschriebenen mikrobiologischen Eigenschaften
als Bacillus circulans identifiziert wurde. Der vorliegende Stamm
assimiliert Keratan-Sulfat, während
von keinem der bekannten Bacillus circulans bis jetzt berichtet
wurde, Keratan-Sulfat zu assimilieren, und daher ist der vorliegende
Stamm ein neuer Stamm, der in dieser Hinsicht von den bekannten
Stämmen
unterscheidbar ist und mit KsT202 benannt ist.
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Dementsprechend
ist der die Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung
herstellende Bacillus circulans-Stamm selbst neu und die vorliegende
Erfindung schließt
einen Stamm von Bacillus circulans ein, der die Keratan-Sulfat-Hydrolase
der vorliegenden Erfindung herstellt, welche die oben genannten
Eigenschaften aufweist, ohne auf den vorliegenden Stamm begrenzt
zu sein.
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Der
die Keratan-Sulfat-Hydrolase herstellende Mikroorganismus kann wie
folgt erhalten werden. Eine kleine Menge eines Materials zur Isolierung,
wie z. B. Boden, wird in ein flüssiges
Medium gegeben, welches Stickstoffquellen, anorganische Salze und
Keratan-Sulfat enthält,
und für
einige Tage kultiviert. Dann wird der Überstand des kultivierten Mediums
auf ein Filterpapier gespottet und das flüssige Medium (Kontrolle) wird
dort ebenfalls auf die gleiche Weise gespottet. Nach der Lufttrocknung
wird das Filterpapier in einer Toluidin-Blau-Lösung eingeweicht und ausreichend
mit einer verdünnten
Essigsäurelösung gewaschen
und die Farbe auf der gespotteten Stelle des Überstandes des Kulturmediums
wird mit der der Kontrolle verglichen. Da sich Toluidin-Blau mit
Keratan-Sulfat verbindet, um eine blaue Farbe zu entwickeln, kann
es bestätigt
werden, dass ein Keratan-Sulfat assimilierender Mikroorganismus
in der Probe existiert, die eine geringere Farbe als die Kontrolle
entwickelt. Der Keratan-Sulfat assimilierende Mikroorganismus wird
unter Verwendung eines Platten-Mediums (z. B. Herz-Infusions-Agar) durch
ein konventionelles Verfahren von dem wässrigen Medium rein-isoliert,
das den Keratan-Sulfat assimilierenden Mikroorganismus enthält. Indem
eine Vielzahl von den rein-isolierten Mikroorganismen für die Assimilation
von Keratan-Sulfat unter Verwendung eines wässrigen Mediums in der gleichen
Weise wie oben untersucht werden, kann der gewünschte Keratan-Sulfat assimilierende
Mikroorganismus erhalten werden.
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Der
wie oben beschrieben isolierte Bacillus circulans KsT202 wurde im
National Institute of Bioscience and Human-Technology of Agency
of Industrial Science and Technology of Ministry of International
Trade and Industry (1–3,
Higashi 1-chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan) am 5. September 1994 unter
der Zugangsnummer FERM P-14516 hinterlegt und er wurde dann für die auf
dem Budapester Abkommen vom 6. November 1995 basierende internationale
Hinterlegung unter der Zugangsnummer FERM BP-5285 hinterlegt.
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(2) Keratan-Sulfat-Hydrolase
der vorliegenden Erfindung
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Die
Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung wird hergestellt
und akkumuliert in dem Medium oder den mikrobiellen Zellen durch
Kultivierung eines Mikroorganismus, der zu der Gattung Bacillus
gehört,
der die Fähigkeit
aufweist, eine Keratan-Sulfat-Hydrolase herzustellen, z. B. der
Bacillus circulans KsT202, in einem Nährstoffmedium, welches gewöhnlich für Kulturen
von Mikroorganismen verwendet wird, vorzugsweise in einem Medium,
welches Keratan-Sulfat oder eine dieses enthaltene Substanz enthält, um die Fähigkeit
zu steigern, das Enzym herzustellen, und das Enzym kann durch eine
konventionelle Methode gewonnen werden.
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Das
Verfahren zur Herstellung des vorliegenden Enzyms ist weiterhin
als ein Beispiel unter Verwendung des Bacillus circulans KsT202
beschrieben. Der Bacillus circulans KsT202 wird in einem speziellen
Nährstoffmedium
kultiviert, beispielsweise in einem Medium, spezielle Kohlenstoffquellen,
Stickstoffquellen, anorganische Salze und Keratan-Sulfat oder Substanzen,
die diese enthalten, und dergleichen enthält, um so das vorliegende Enzym
herzustellen und in dem Medium oder den mikrobiellen Zellen zu akkumulieren.
Als die Kohlenstoffquelle kann jede Substanz verwendet werden, solange
sie metabolisiert werden kann, z. B. D-Glucose, L-Arabinose, D-Xylose,
D-Mannose, Stärke
und eine Vielfalt von Peptonen. Die verwendbare Stickstoffquelle
enthält
organische oder anorganische Stickstoff-Zusammensetzungen oder Substanzen,
die diese enthalten, z. B. Hefeextrakt, Malzextrakt, eine Vielfalt
von Peptonen, eine Auswahl von Brühe-Extrakt, in Flüssigkeit eingeweichtes Getreide,
Aminosäurelösungen,
Amoniumsalze und dergleichen. Die dem Medium zugegebenen anorganischen
Salze enthalten eine Vielfalt von Phosphaten, Magnesiumsalzen, Kalium,
Natrium, Kalzium, etc.. Eine Vielfalt von anorganischen oder organischen
Substanzen, die für
das Wachstum der Mikroorganismen oder zur Herstellung des Enzyms
benötigt
werden, z. B. bildungshemmende Agenzien, wie z. B. Silikonöl, Sesamöl und eine
Auswahl von Tensiden, und Vitamine können, wenn notwendig, dem Medium
zugegeben werden.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung kann durch Zugabe von Keratan-Sulfat oder einer Substanz,
die dieses enthält,
als ein Induzierer („Inducer") des vorliegenden
Enzyms, das vorliegende Enzym in einer größeren Menge hergestellt werden.
Der Induzierer kann beim Ansatz oder im Verlauf der Kultur zugegeben
werden. Gewöhnlich
wird Keratan-Sulfat zugegeben, um dessen Konzentration in dem Bereich
von 0,2 bis 2% einzustellen, um erstrebenswerte Ergebnisse zu erzielen.
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Die
Kultur kann in der Form einer Flüssigkultur
oder einer Festkultur ausgeführt
werden, und gewöhnlich
ist die Flüssigkultur
bevorzugt. Eine Unterwasser-Belüftungs-Kultur
mit Agitation ist industriell von Vorteil. Die Kulturbedingungen
der vorliegenden Erfindung können
geeignet ausgesucht und eingestellt werden, um so das vorliegende
Enzym am vorteilhaftesten herzustellen. Die Kulturtemperatur kann
von 30 bis 45°C
variieren, vorzugsweise von 35 bis 45°C. Die Kulturdauer ist gewöhnlich in
Abhängigkeit
von den anderen Kulturbedingungen etwa 8 bis 24 Stunden, und die
Kultur kann gestoppt werden, wenn die maximale Akkumulation des
vorliegenden Enzyms erreicht ist. Der pH des Mediums ist beim Herstellen
des Mediums in etwa neutral und es werden gewöhnlich keine speziellen Zusätze benötigt.
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Das
Enzym der vorliegenden Erfindung kann zum einen aus dem Überstand
des Kulturmediums und zum anderen aus den mikrobiellen Zellen, die
dieses enthalten, erhalten werden. Das Enzym in den mikrobiellen
Zellen kann als ein Extrakt der mikrobiellen Zellen durch Aufschluss
oder Lysierung der mikrobiellen Zellen durch ein Ultraschall-Aufschluss-Verfahren,
einen osmotischen Schock, ein Lysierungsverfahren unter Verwendung
eines nichtionischen oberflächenaktiven
Stoffs, wie z. B. Polyoxyethylen(23)-lauryl-alkohol-ether(Brij-35)
und dergleichen, durch Einfrieren und Auftauen der mikrobiellen
Zellen, ein Lysierungsverfahren unter Verwendung eines lytischen
Enzyms, wie z. B. Lysozym, oder der Kombination davon erhalten werden.
Des Weiteren wird der Extrakt der mikrobiellen Zellen mit Deoxyribonuclease
und dergleichen behandelt, um die Ausbeute aus dem Extrakt der mikrobiellen
Zellen zu erhöhen
und die Menge des extrahierten Enzyms anzuheben. Dieser Effekt ist
besonders in der Bakteriolyse unter Verwendung eines bakteriolytischen Enzyms
signifikant. Und wenn das Tensid verwendet wird, steigt die Extraktionseffizienz
an, aber das nachfolgende Aussalzen wird manchmal schwierig werden.
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Die
Keratan-Sulfat-Hydrolase in dem Überstand
des Kulturmediums oder das Extrakt der mikrobiellen Zellen kann
durch Zugabe von Amoniumsulfat zu diesem bis zu einer Sättigung
von 70%, dem folgenden Dialysieren des erhaltenen Niederschlages
und Unterziehen des Dialysats der Chromatographie unter Verwendung
eines Ionenaustauschers, eines Gelfiltrationsträgers, einer hydrophobischen
Trägers
oder dergleichen gereinigt werden.
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Die
Aktivität
des Enzyms der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel durch Messen
eines Anstiegs des Reduktionsendes, welches durch die Hydrolysierung
des Keratan-Sulfats hergestellt wird, durch das Park-Johnson-Verfahren
(J. Biol. Chem., 181, 149, (1949)) bestimmt werden. Und zwar werden
10 μl der
Enzymlösung
und 180 μl
des 0,1 M-Acetat-Puffers (pH 6,0) zu 10 μl einer Lösung zugegeben, die Keratan-Polysulfat
(10 mg/ml) enthält,
welches aus dem Knorpel von Haien stammt, und der Mischung wird
erlaubt, bei 37°C
für 10
Minuten zu reagieren. Die Reaktion wird durch Zugabe von 200 μl der Karbonat-Zyanid-Lösung des Park-Johnson-Verfahrens
gestoppt. Dann werden 200 μl
der Eisen-Zyanid-Lösung zugegeben
und die Reaktionslösung
wird in einem kochenden Wasserbad für 15 Minuten erhitzt und in
einem Wasserbad gekühlt. Und
dann wird 1 ml der Eisen(III)-Lösung
dazu zugegeben und gemischt. Nach 15 Minuten wird die Extinktion bei
690 nm bestimmt. Die dekadische Extinktion zu diesem Zeitpunkt wird
als A definiert, die dekadische Ausgangsextinktion der gleichen
Reaktionslösung
(0 Minuten der Reaktionsdauer) wird als A0 definiert,
und die dekadische Extinktion wird als ASt definiert,
wenn 200 μl
einer Galactoselösung
(10 μg/ml)
als der Standard anstelle der Reaktionslösung verwendet und in der gleichen
Weise behandelt wird.
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Eine
Einheit der Enzym-Quantität
(nachstehend manchmal als Einheiten (Units) oder U bezeichnet), welche
das einem μmol
Galactose in einer Minute unter den obigen Bedingungen entsprechende
Reduktionsende herstellt, wird durch die folgende Gleichung berechnet.
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Als
nächstes
werden nachfolgend die physikalischen und chemischen Eigenschaften
der neuen Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung beschrieben
werden.
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(1) Wirkung
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Das
vorliegende Enzym wirkt auf Keratan-Sulfat und hydrolysiert dessen
N-Acetylglucosaminidische Bindung.
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(2) Substratspezifität
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Das
vorliegende Enzym wirkt auf Keratan-Sulfat I, Keratan-Sulfat II
und Keratan-Polysulfat,
und erzeugt sulfatiertes Keratan-Sulfat-Disaccharid und sulfatiertes
Keratan-Sulfat-Tetrasaccharid als die Haupthydrolysate (siehe 1).
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Des
Weiteren ist es bestätigt,
dass das vorliegende Enzym ebenfalls sulfatiertes Keratan-Sulfat-Pentasaccharid
als ein Hydrolysat herstellt.
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Das
vorliegende Enzym wirkt nicht auf desulfatiertes Keratan und benötigt eine
Sulfatgruppe in der Zuckerkette an dem Wirkungsort. Das vorliegende
Enzym wirkt mit Ausnahme von Keratan-Sulfat nicht auf Glycosaminogylcan.
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Das
vorliegende Enzym wirkt selbst in einer hochkonzentrierten Lösung (10%)
auf Keratan-Polysulfat (siehe 12).
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(3) pH-Reaktionsoptimum
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Das
vorliegende Enzym weist ein pH-Reaktionsoptimum von 4,5 bis 6 auf,
welches in dem 0,1 M-Acetat-Puffer oder in dem 10 mM-Tris-Acetat-Puffer
bei 37°C
bestimmt wird (siehe 3).
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(4) pH-Stabilität
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Das
vorliegende Enzym weist eine pH-Stabilität bei etwa 6 bis 7 auf, welche
während
des Stehenlassens in dem 0,1 M-Acetat-Puffer oder dem 10 mM-Tris-Acetat-Puffer bei
37°C für eine Stunde
bestimmt wird (siehe 4).
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(5) Reaktionstemperatur-Optimum
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Das
vorliegende Enzym weist ein Reaktionstemperatur-Optimum von 50 bis
60°C auf,
welches durch die Reaktion in dem 0,1 M-Acetat-Puffer (pH 6,0) bei
von 37 bis 65°C
für 10
Minuten bestimmt wird (siehe 5).
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(6) Hitzestabilität
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Das
vorliegende Enzym wird nicht bei 45°C deaktiviert und weist 65%
der Restaktivität
bei 50°C
auf, wenn dessen Restaktivität
nach Erhitzen von 30 bis 45°C
in dem 0,1 M-Acetat-Puffer (pH 6,0) für eine Stunde bestimmt wird
(siehe 6).
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(7) Molekulargewicht
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Wenn
das vorliegende Enzym durch die SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
(in der Gel-Konzentration von 7%) unter den reduzierenden und nichtreduzierenden
Bedingungen elektrophoriert wird, wird eine Einfachbande, die die
gleiche Mobilität
unter den beiden Bedingungen aufweist, beobachtet, und das Molekulargewicht
des vorliegenden Enzyms wird mit ungefähr 200.000 Dalton von der Kalibrierungskurve
des Standardproteins berechnet (siehe 7).
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(8) Inhibition
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Es
ist keine Inhibition vorhanden, wenn die Aktivität des vorliegenden Enzyms in
der Gegenwart von einer Vielfalt der unten beschriebenen Agenzien
in einer Endkonzentration von 1 mM bestimmt wird.
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Na+, K+, Mn2+, Mg2+, Co2+, Ba2+, Ca2+, Zn2+, SO4 2–, PO4 3–,
EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)
und PCMB (p-(Chlormercuri)-benzoesäure).
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Durch
den Vergleich der oben beschriebenen Ergebnisse mit der Keratan-Sulfat-Hydrolase II (japanische
Patentanmeldung-Offenlegung Nr. 2-57182), welche als Keratan-Sulfat-Hydrolase
des endo-β-N-acetylglucosaminidase-Typs
bekannt ist, ist es bestätigt,
dass das Enzym der vorliegenden Erfindung ein neues Enzym ist, welches
abweichende Eigenschaften von den bekannten Enzymen aufweist, da
dort Unterschiede in der Reaktivität auf das Keratan-Polysulfat
bei hohen Konzentrationen, dem pH-Optimum, der pH-Stabilität, dem Temperatur-Optimum,
der Hitzestabilität,
dem Einfluss der Hemmung von Agenzien und dergleichen sind.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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1 ist ein Diagramm, welches
die Substratspezifität
des Enzyms der vorliegenden Erfindung zeigt.
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2 ist ein Diagramm, welches
die Substratspezifität
(Reaktivität)
des Enzyms der vorliegenden Erfindung und der Keratanase II auf
das Keratan-Polysulfat (10%) zeigt.
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3 ist ein Diagramm, welches
ein pH-Reaktionsoptimum des Enzyms der vorliegenden Erfindung zeigt.
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4 ist ein Diagramm, welches
eine pH-Stabilität
des Enzyms der vorliegenden Erfindung zeigt.
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5 ist ein Diagramm, welches
ein Reaktionstemperatur-Optimum des Enzyms der vorliegenden Erfindung
zeigt.
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6 ist ein Diagramm, welches
eine Hitzestabilität
des Enzyms der vorliegenden Erfindung zeigt.
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7 ist ein Diagramm, welches
ein Molekulargewicht des Enzyms der vorliegenden Erfindung zeigt.
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BEFVORZUGTE BEISPIELE
ZUM AUSFÜHREN
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung wird im Weiteren mit Bezug auf die folgenden
Beispiele erklärt
werden. Die Enzymaktivität
wurde durch das Park-Johnson-Verfahren bestimmt.
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Beispiel 1: Isolierung
des Bacillus circulans KsT202
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Eine
kleine Menge des Bodens wurde zu 5 ml eines wässrigen Mediums zugegeben,
das eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und Keratan-Sulfat
enthält,
und unter Schütteln
bei 45°C
für drei
Tage kultiviert. Nach der Kultivierung wurden jeweils 10 μl des Überstands
des kultivierten Mediums und des wässrigen Mediums (Kontrolle)
auf ein Filterpapier gespottet. Nach dem Lufttrocknen wurde das
Filterpapier in einer Toluidin-Blau-Lösung getränkt und ausreichend mit einer
verdünnten
Essigsäurelösung gewaschen
und die Farbe auf der gespotteten Stelle des Überstands des kultivierten
Mediums wurde mit der der Kontrolle verglichen. Da sich Toluidin-Blau
mit Keratan-Sulfat verbindet, um eine blaue Farbe zu entwickeln,
wurde es bestätigt,
dass ein Keratan-Sulfat assimilierender Mikroorganismus in der Probe
existiert, die eine geringere Farbe als die Kontrolle entwickelt.
Der Keratan-Sulfat assimilierende Mikroorganismus wurde durch ein
konventionelles Verfahren aus der Kulturlösung unter Verwendung eines
Platten-Mediums
(z. B. Herz-Infusions-Agar) rein-isoliert.
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Indem
eine Vielfalt von rein-isolierten Mikroorganismen für die Keratan-Sulfat-Assimilation unter
Verwendung eines wässrigen
Mediums in der gleichen Weise wie oben untersucht wurden, wurde
der gewünschte Keratan-Sulfat
assimilierende Mikroorganismus erhalten. Das Folgende sind die morphologischen
Eigenschaften, die Wachstumseigenschaften und die physiologischen
Eigenschaften dieses Stammes.
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Mikrobiologische
Eigenschaften
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Die
taxonomische Untersuchung des die obigen mikrobiologischen Eigenschaften
aufweisenden KsT202-Stammes wurde gemäß der Bergey's Anleitung der Systematischen
Bakteriologie, 1. Auflage, Vol. 2 (1986) gemacht. Der vorliegende
Mikroorganismus wurde als ein Stamm erkannt, der zur Gattung Bacillus
gehört,
basierend auf der Tatsache, dass der Mikroorganismus ein aerobischer
Gram-negativer stäbchenförmiger Mikroorganismus
mit Beweglichkeit und Bildung von Sporen war, dessen Hauptisoprenoid-Chinon
Menachinon-7 war und er Meso-Diaminopimelinsäure in dem
Peptidoglycan der Zellwand enthielt. Des Weiteren wurde als das
Ergebnis der Untersuchung von dessen anderen Eigenschaften der Mikroorganismus
als Bacillus circulans identifiziert. Bis heute wurde von keinem
bekannten Bacillus circulans berichtet, Keratan-Sulfat zu assimilieren,
und daher ist der vorliegende Stamm ein neuer Stamm und kann von
den bekannten Stämmen
in dieser Hinsicht unterschieden werden.
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Der
Bacillus circulans KsT202 wurde für die internationale Hinterlegung
im National Institute of Bioscience and Human-Technology of Agency
of Industrial Science and Technology unter der Hinterlegungsnummer
FERM BP-5285 hinterlegt.
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Beispiel 2 Extraktion
der Keratan-Sulfat-Hydrolase aus dem Bacillus circulans KsT202
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(1) Aufschließen oder
Lysieren der mikrobiellen Zellen
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Der
Zellextrakt von Bacillus circulans KsT202 wurde durch eine Vielfalt
der unten beschriebenen Aufschluss-Verfahren oder Lysierungsverfahren
für mikrobielle
Zellen unter Verwendung einer mikrobiellen Zell-Suspension präpariert,
die durch Suspendieren jeweils eines Gramms der gefrorenen mikrobiellen
Zellen in 3 ml der Phosphat gepufferten Salzlösung (PBS: 100 mM KH2PO4, 0,155 M NaCl,
pH 7,2) erhalten wurde, und die Extraktionseffizienz des Enzyms
der vorliegenden Erfindung wurde bestimmt.
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Extraktionsbedingungen
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- (1) Ultraschall-Auffschluss-Verfahren: Die
Behandlung unter Verwendung eines Ultraschall-Generators (Insonator
201 M, Kubota Corporation.) bei einer Frequenz von 20 kHz mit 40
W Leistung für
30 Sekunden wurde in einem Eiswasserbad sechsmal in Ein-Minuten-Intervallen
gemacht.
- (2) Einfrier- und Auftauverfahren: Die gefrorenen mikrobiellen
Zellen wurden durch Haltung bei 37°C für 30 Minuten aufgetaut.
- (3) Lysierungsverfahren mit einem Tensid: Brij-35 (Nacalai Tesque)
wurde zu der mikrobiellen Zellensuspension bis zu einer Endkonzentration
von 5% zugegeben und sie wurde bei 37°C für 30 Minuten gehalten.
- (4) Lysierungsverfahren mit dem Enzym: Das Lysozym (Seikagaku
Corporation) wurde zu der mikrobiellen Zellsuspension bis zu einer
Endkonzentration von 100 μg/ml
zugegeben und sie wurde bei 37°C
für 30
Minuten gehalten.
-
Die
Proteinmenge und die Aktivität
der Keratan-Sulfat-Hydrolase wurden in den wie oben erhaltenen aufgeschlossenen
mikrobiellen Zellen oder den lysierten mikrobiellen Zellen bestimmt.
Tabelle 1 zeigt die Gesamtaktivität, die Aktivität pro Proteineinheit
und die Enzymausbeute. Die Proteinmenge ist als durch das Lowry-Verfahren unter Verwendung
eines Serum-Albumins als den Standard erhaltene Werte gezeigt. Die
Ausbeute ist als relative Werte, bei Festlegung der Gesamtaktivität in den
durch das Ultraschall-Aufschlussverfahren erhaltenen aufgeschlossenen
mikrobiellen Zellen als 100, dargestellt. Das vorliegende Enzym
wurde von den mikrobiellen Zellen durch jedes der Verfahren effizient
extrahiert.
-
-
(2) Effekt der Deoxyribonuclease
auf die Extraktion der Keratan-Sulfat-Hydrolase von der mit dem
Enzym lysierten Lösung
-
Bei
der Herstellung des mikrobiellen Zellextrakts durch das Lysierungsverfahren
mit dem Enzym unter Verwendung von Lysozym wurde Deoxyribonuclease
I (DNase I, Funakoshi) zugegeben, um die Extraktionseffizienz des
vorliegenden Enzyms zu bestimmen. Zu der mikrobiellen Zellsuspension
(0,2 g/ml-PBS),
die durch Suspendieren der gefrorenen mikrobiellen Zellen in der
Phosphat gepufferten Salzlösung
(PBS: 100 mM KH2PO4,
0,155 M NaCl, pH 7,2) erhalten wurde, wurde Lysozym mit einer Konzentration
von 50 μg/ml
zugegeben und die Suspension wurde bei 37°C für 30 Minuten gehalten. Zu dem
Lysat wurde DNase I bis zu Konzentrationen von 0,2 bis 26 μg/ml zugegeben
und wurde bei 37°C
für 30
Minuten reagiert. Nach der Reaktion wurde jede der Reaktionsflüssigkeiten
zentrifugiert, um den Rest der mikrobiellen Zellen zu entfernen,
und die Mengen der Überstände und
der Enzymaktivitäten
wurden bestimmt. Die Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse. Die Extraktionseffizienz
ist als relative Werte, bei Festlegung der Gesamtaktivität ohne Zugabe
von DNase I als 100, dargestellt. Diese Ergebnisse haben die Anhebung
der Extraktionseffizienz durch die Zugabe von DNase zu dem Lysat
bewiesen.
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(3) Re-Extraktion der
Keratan-Sulfat-Hydrolase aus dem Rest der mikrobiellen Zellen
-
Um
die Extraktionseffizienz zu untersuchen, wurde das vorliegende Enzym
aus dem Rest der mikrobiellen Zellen re-extrahiert. Der Extrakt
der mikrobiellen Zellen wurde unter Verwendung der Suspension von 8
g der gefrorenen mikrobiellen Zellen in 32 ml des PBS durch das
Frieren- und Auftauverfahren (siehe Beispiel (1)) oder dem Lysierungsverfahren
mit dem Enzym (kombinierte Verwendung von DNase, siehe (2)) hergestellt.
Der Extrakt der mikrobiellen Zellen wurde in den Überstand
und den Rest der mikrobiellen Zellen durch die Zentrifugation (10.000
rpm, 40 Minuten) getrennt.
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Der
Rest der mikrobiellen Zellen, die durch das Frieren- und Auftauverfahren
er halten wurden, wurde bei –20°C für 16 Stunden
(nochmaliges Einfrieren) gehalten, und er wurde unter den gleichen
Bedingungen wie oben zur Re-Extraktion aufgetaut. Während der
Rest der durch das Lysierungsverfahren mit dem Enzym erhaltenen
mikrobiellen Zellen in der gleichen Menge PBS wie in dem obigen
zur Re-Extraktion suspendiert wurde. In jedem dieser Fälle wurde
die Re-Extraktion dreimal wiederholt und die Enzymaktivität der Keratan-Sulfat-Hydrolase
in dem Überstand
von jedem der Extrakte (von der ersten Extraktion und den drei Re-Extraktionen) wurde
bestimmt. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse.
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Die
Ausbeute erfolgte in 97% oder mehr durch dreimaliges Extrahieren
mit dem Frieren- und Auftauverfahren oder mit der zweimaligen Extraktion
in dem Lysierungsverfahren mit dem Enzym. Und die durch das Lysierungsverfahren
mit dem Enzym erhaltene Menge des Enzyms war 27% größer als
die durch das Frieren- und
Auftauverfahren erhaltene Menge.
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Beispiel 3
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50
ml eines Mediums (pH 7,5), das 1,0% Pepton (Kyokuto Seiyaku Kogyo),
0,75% Bierhefeextrakt (Nippon Seiyaku), 0,25% Fischfleischextrakt
(Kyokuto Seiyaku Kogyo), 0,5% des vom Knorpel der Haie hergestellten
Keratan-Polysulfats (Seikagaku Corporation), 0,5% K2HPO4, 0,02% MgSO4·7H2O und 0,1% NaCl enthält, wurde in eine Schulterflasche
mit einer Kapazität
von 0,5-L gegeben, bei 121°C
für 20
Minuten autoklaviert, mit einer Platin-Öse von Bacillus circulans KsT202
aseptisch inokuliert und bei 37°C
für 16
Stunden unter Schütteln
(120 Takt/Minute, 7 cm Amplitude) kultiviert.
-
Nach
der Kultivierung wurden die mikrobiellen Zellen mittels einer Zentrifuge
geerntet und mit einem Ultraschall-Aufschließer (-Disrupter) aufgeschlossen.
Die Wirksamkeit der Keratan-Sulfat-Hydrolase in der aufgeschlossenen
Flüssigkeit
wurde durch das oben genannte Verfahren bestimmt, um 45 Milliunits
(Millieinheiten) pro Liter des Kulturmediums zu ergeben.
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Beispiel 4
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20
l eines Mediums (pH 7,5), das 1,0% Pepton (Kyokuto Seiyaku Kogyo),
0,75% Bierhefeextrakt (Nippon Seiyaku), 0,25% Fischfleischextrakt
(Kyokuto Seiyaku Kogyo), 0,5% des vom Knorpel der Haie hergestellten
Keratan-Polysulfats (Seikagaku Corporation), 0,5% K2HPO4, 0,02% MgSO4·7H2O, 0,1% NaCl und 0,0015% eines anti-bildenden
Agens, Adekanol LG109 (Asahi Denka Kogyo) enthält, wurde in einen Stand-Fermenter
mit einer Kapazität
von 30-L gegeben, bei 121°C
für 25
Minuten autoklaviert, aseptisch mit 0,6 l (3%) der Kulturlösung von
dem KsT202-Stamm inokuliert, welcher zuvor unter Schütteln in
dem in Beispiel 3 beschriebenen Medium bei 37°C für 16 Stunden kultiviert wurde,
und bei 37°C
für 8 Stunden
unter Belüftung (1
vvm) und Rühren
(300 rpm) kultiviert. 20 l der Kulturlösung wurden mittels einer kontinuierlichen
Zentrifugation behandelt, um 170 g der mikrobiellen Zellen auf Nassbasis
zu erhalten.
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Die
Wirksamkeit der in den mikrobiellen Zellen enthaltenen Keratan-Sulfat-Hydrolase wurde durch
Ultraschall-Aufschluss eines Teils der mikrobiellen Zellen bestimmt,
um 5,1 Einheiten (Units) pro Gramm auf Nassbasis zu ergeben. Der
Rest der mikrobiellen Zellen wurde zur Konservierung gefroren.
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Beispiel 5
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20
l des Mediums (pH 8,0), das 1,5% Pepton (Kyokuto Seiyaku Kogyo),
0,75% Bierhefeextrakt (Nippon Seiyaku), 0,75% des vom Knorpel der
Haie hergestellten Keratan-Polysulfats (Seigakaku Corporation),
0,5% K2HPO4, 0,02%
MgSO4·7H2O, 0,5% NaCl und 0,0015% eines anti-bildenden
Agens, Adekanol LG109 (Asahi Denka Kogyo) enthält, wurde in einen Stand-Fermenter
mit einer Kapazität
von 30-L gegeben, bei 121°C
für 20
Minuten autoklaviert, aseptisch mit 1 l (5%) der Kulturlösung des
KsT202-Stammes inokuliert, welcher zuvor unter Schütteln in
dem gleichen Medium bei 37°C
für 16
Stunden kultiviert wurde, und bei 45°C für 45 Stunden unter Belüftung (1
vvm) und Rühren
(300 rpm) kultiviert. 20 l der Kulturlösung wurden mit einer kontinuierlichen Zentrifugation
behandelt, um die mikrobiellen Zellen zu entfernen und annähernd 20
l der extrazellulären
Flüssigkeit
zu ergeben.
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Die
Wirksamkeit der in der extrazellulären Lösung enthaltenen Keratan-Sulfat-Hydrolase war 11,6
Milliunits pro Milliliter.
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Beispiel 6
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Zu
5 g der gefrorenen und konservierten in Beispiel 4 erhaltenen mikrobiellen
Zellen wurden 25 ml der 10 mM Phosphat gepufferten Salzlösung (pH
7,2) zugegeben, um eine mikrobielle Zellsuspension zu ergeben, und
sie wurde langsam bei 37°C
für 60
Minuten gerührt,
um das Enzym zu extrahieren. Nachdem der Extrakt zentrifugiert wurde,
wurde Amoniumsulfat zu dem Überstand
bis zu einer 30%igen Sättigung
zugegeben und das erhaltene Präzipitat
wurde durch die Zentrifugation entfernt. Dann wurde weiteres Amoniumsulfat
bis zu einer 60%igen Sättigung
zugegeben und das erhaltene Präzipitat
wurde durch die Zentrifugation gesammelt.
-
Nachdem
dieses Präzipitat
in annäherend
20 ml eines 10-mM-Tris-Hydrochlorid-Puffers (pH 7,2) gelöst wurde, wurde es gegen 5
l desselben Puffers bei 4°C über Nacht
dialysiert. Nach Bestätigung,
dass die Konduktivität
der Lösung
nicht mehr als 1 mS/cm beträgt,
wurde die Lösung
durch eine DEAE-Zellulose·DE-52-(Whatman)-Säule (2,4 × 14 cm)
gegeben, welche zuvor mit dem 10 mM-Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,2) equilibriert
wurde, um dem Enzym zu gestatten, zu adsorbieren. Nachdem die Säule mit
100 ml desselben Puffers gewaschen wurde, wurde das Enzym mit einer
linear ansteigenden Natriumchlorid-Konzentration von 0 bis 1 M in
dem gleichen Puffer eluiert.
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Zu
der eluierten aktiven Fraktion wurde Natriumchlorid zugegeben, um
die Konzentration auf 4 M zu bringen, und die Fraktion wurde durch
eine Phenyl-Sepharose-(Pharmacia)-Säule (1,5 × 14 cm)
gegeben, die mit dem 4 M-Natriumchlorid
enthaltenen Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,2) equilibriert wurde,
um dem Enzym zu gestatten, zu adsorbieren, und das Enzym wurde mit
einer linear absteigenden Natriumchlorid-Konzentration von 4 M bis
0 in dem gleichen Puffer eluiert, und 74 ml des gereinigten Enzyms
wurden erhalten. Das erhaltene Enzym war 14 Units, dessen spezifische
Aktivität
war 1,22 Unit/mg (berechnet in Bezug auf das Gewicht des Rinder-Serum-Albumins),
dessen Re-Extraktion aus dem Extrakt der mikrobiellen Zellen war
55% und die spezifische Aktivität
stieg annähernd
60-fach an. Das gereinigte Enzym enthielt keine kontaminierten Enzyme,
wie z. B. Glycosidasen.
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Beispiel 7
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Zu
der in Beispiel 5 erhaltenen extrazellulären Flüssigkeit wurde Amoniumsulfat
bis zu einer Sättigung von
70% zugegeben, und das erhaltene Präzipitat wurde durch die Zentrifugation
gesammelt und in 2,5 l des 10 mM-Tris-Acetat-Puffers (pH 7,5) gelöst. Zu dieser
Lösung
wurde Amoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 35% zugegeben,
das erhaltene Präzipitat
wurde durch die Zentrifugation entfernt, weiteres Amoniumsulfat wurde
bis zu einer Sättigung
von 55% zugegeben und das erhaltene Präzipitat wurde durch die Zentrifugation gesammelt.
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Das
Präzipitat
wurde in 2,5 l des 10 mM-Tris-Acetat-Puffers (pH 7,5) aufgelöst und durch
eine DEAE-Zellulose·DE52-(Whatman)-Säule (5,2 × 24 cm)
gegeben, die zuvor mit dem gleichen Puffer equilibriert wurde, um
dem Enzym zu gestatten, zu adsorbieren. Nachdem die Säule mit
1,5 l des gleichen Puffers gewaschen wurde, wurde das Enzym mit
einer linear ansteigenden Natriumchlorid-Konzentration von 0 bis
0,3 M in dem gleichen Puffer eluiert.
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Die
aktive Fraktion wurde gesammelt und Amoniumsulfat wurde dazu bis
zu einer Sättigung
von 55% zugegeben und dann das Präzipitat durch die Zentrifugation
gesammelt und in einer kleinen Menge eines 10 mM-Tris-Acetat-Puffers
(pH 7,5) gelöst.
Dann wurde die Lösung
auf eine Sephacryl-S-300-(Pharmacia)-Säule (3,4 × 110 cm) geladen und einer
Gelfiltration mit dem 50 mM Tris-Acetat-Puffer (pH 7,5), der 0,5
M Natrium enthält,
unterzogen.
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Die
aktive Fraktion wurde durch Ultrafiltration unter Verwendung einer
UK-10-Membran (Advantec
Toyo) konzentriert und gegen annähernd
der 100-fachen Menge des 10 mM-Tris-Acetat-Puffers (pH 7,5) dialysiert.
Die Innenlösung
wurde durch eine DEAE-Toyopearl (Tosoh Corporation)-Säule (2,2 × 15 cm)
gegeben, die zuvor mit dem gleichen Puffer equilibriert wurde, um
dem Enzym zu gestatten, adsorbiert zu werden. Dann wurde die Säule mit
150 ml desselben 0,1 M-Natriumchlorid
enthaltenen Puffers gewaschen, und das Enzym wurde mit einer linear
ansteigenden Natriumchlorid-Konzentration von 0,1 bis 0,2 M in dem
gleichen Puffer eluiert.
-
Die
aktive Fraktion wurde durch Ultrafiltration konzentriert, auf eine
Sephacryl-S-300-Säule (2,2 × 101 cm)
geladen und einer Gelfiltration unterzogen.
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Nachdem
das Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 4 M zu der aktiven
Fraktion zugegeben war, wurde die Lösung durch eine Phenyl-Sepharose-(Pharmacia)-Säule (1,6 × 15 cm)
gegeben, die mit dem 4 M-Natriumchlorid enthaltenen Tris-Acetat-Puffer
(pH 7,5) equilibriert wurde, der, um dem Enzym zu gestatten, adsorbiert
zu werden, und dann wurde das Enzym mit einer linear absteigenden
Natriumchlorid-Konzentration von 4 M bis 0 in demselben Puffer eluiert.
Das erhaltene Enzym war 29 Units, dessen spezifische Aktivität war 2,09
Unit/mg (berechnet in Bezug auf das Gewicht des Rinder-Serum-Albumins),
dessen Rückgewinnung
von der extrazellulären
Flüssigkeit
war 12,5% und die spezifische Aktivität stieg annähernd auf 180-fach an. Das
gereinigte Enzym enthielt keine kontaminierten Enzyme, wie z. B.
Glycosidasen.
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Beispiel 8
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Unter
Verwendung der im obigen Beispiel 7 erhaltenen Keratan-Sulfat-Hydrolase
wurden die Substratspezifität,
das pH-Reaktionsoptimum, die pH-Stabilität, das Reaktionstemperatur-Optimum,
die Hitzestabilität
und das Molekulargewicht der Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden
Erfindung durch die folgenden Verfahren ausgewertet.
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(1) Substratspezifität
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Es
wurde untersucht, dass die im obigen Beispiel 7 erhaltene Keratan-Sulfat-Hydrolase entsprechend auf
Keratan-Sulfat I, Keratan-Sulfat II und Keratan-Polysulfat wirken
durfte. 1 zeigt ein
Gelfiltrations-Chromatogramm der dabei erhaltenen Hydrolysate. Das
Ergebnis zeigt an, dass das erhaltene Haupthydrolysat durch Gestatten
der Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung auf Keratan-Sulfat
I, Keratan-Sulfat II und Keratan-Polysulfat zu wirken, sulfatiertes
Keratan-Sulfat-Disaccharid und sulfatiertes Keratan-Sulfat-Tetrasaccharid
enthält.
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Ferner
wurde es untersucht, dass der in Beispiel 7 erhaltenen Keratan-Sulfat-Hydrolase erlaubt
wurde, auf desulfatiertes Keratan-Sulfat unter den gleichen Bedingungen
zu wirken. Es wurde bestätigt,
dass die in Beispiel 7 erhaltene Keratan-Sulfat-Hydrolase nicht
auf das desulfatierte Keratan-Sulfat wirkt und eine Sulfat-Gruppe
in der Zuckerkette an dem Wirkungsort benötigt. Darüber hinaus wurde das gleiche
Experiment abweichend vom Keratan-Sulfat auf Glycosaminoglycan durchgeführt, und
die Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung wirkte nicht
auf dieses.
-
Zusätzlich wurde
es untersucht, dass eine Vielfalt von den in 2 gezeigten Mengen der in Beispiel 7
erhaltenen Keratan-Sulfat-Hydrolase und der bekannten Keratan-Sulfat-Hydrolase
II gestattet wurden, auf eine hochkonzentrierte Keratan-Polysulfat-Lösung (10%)
bei 37°C
für 24
Stunden zu wirken. 2 zeigt
ein Gelfiltrations-Chromatogramm der dabei erhaltenen Lysate. Das
Ergebnis macht deutlich, dass selbst eine extrem kleine Menge der
Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung ausreichend
auf Keratan-Polysulfat in einer hochkonzentrierten Lösung (10%)
wirkt.
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(2) pH-Reaktionsoptimum
-
Die
Aktivität
der in Beispiel 7 erhaltenen Keratan-Sulfat-Hydrolase wurde in dem
0,1 M-Acetat-Puffer und in dem 10 mM-Tris-Acetat-Puffer bei variierendem
pH bei 37°C
ermittelt. 3 zeigt die
Ergebnisse. Die Ergebnisse zeigen an, dass das pH-Optimum der Keratan-Sulfat-Hydrolase
von 4,5 bis 6 ist.
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(3) pH-Stabilität
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Die
Restaktivität
der in Beispiel 7 erhaltenen Keratan-Sulfat-Hydrolase wurde nach
dem Stehenlassen in dem 0,1 M-Acetat-Puffer und dem 10 mM-Tris-Acetat-Puffer
bei verschiendenen pH's
bei 37°C
für eine
Stunde bestimmt. 4 zeigt
die Ergebnisse. Die Ergebnisse zeigen an, dass die Keratan-Sulfat-Hydrolase
der vorliegenden Erfindung bei etwa 6 bis 7 stabil ist.
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(4) Reaktionstemperatur-Optimum
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Die
Aktivität
der in Beispiel 7 erhaltenen Keratan-Sulfat-Hydrolase wurde bestimmt,
wenn sie in dem 0,1 M-Acetat-Puffer (pH 6,0) unter verschiedenen
Temperaturbedingungen von 37 bis 65°C für 10 Minuten reagiert wurde. 5 zeigt die Ergebnisse.
Die Ergebnisse zeigen an, dass das Reaktionstemperatur-Optimum der
Keratan-Sulfat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung von 50 bis 60°C ist.
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(5) Hitzestabilität
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Die
Restaktivität
der in Beispiel 7 erhaltenen Keratan-Sulfat-Hydrolase wurde nach
dem Stehenlassen in dem 0,1 M-Acetat-Puffer (pH 6,0) unter verschiedenen
Temperaturbedingungen von 30 bis 50°C für eine Stunde bestimmt. 6 zeigt die Ergebnisse.
Die Ergebnisse zeigen an, dass die Keratan-Sulfat-Hydrolase der
vorliegenden Erfindung bei 45°C
nicht deaktiviert wird und 65% der Restaktivität bei 50°C aufweist.
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(6) Molekulargewicht
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Die
in Beispiel 7 erhaltene Keratan-Sulfat-Hydrolase wurde durch eine
SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (mit der 7%igen Gelkonzentration)
unter den reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen elektrophoriert.
Als das Ergebnis wurde eine Einfachbande gezeigt, die die gleiche
Mobilität
unter den beiden Bedingungen aufweist. 7 zeigt die mit der Eichkurve eines Standard-Proteins
erhaltene Mobilität.
In 7 zeigt „o" das grafische Ergebnis
des bestimmten Ergebnisses der in Beispiel 7 erhaltenen Keratan-Sulfat-Hydrolase.
Von diesem Ergebnis wurde das Molekulargewicht der Keratan-Sulfat-Hydrolase
der vorliegenden Erfindung auf annähernd 200.000 Dalton berechnet.
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Industrielle
Anwendbarkeit
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Die
vorliegende Erfindung hat eine eine hohe Hitzestabilität aufweisende
neue Keratan-Sulfat-Hydrolase des endo-β-N-acetylglucosaminidase-Typs
und einen diese herstellenden neuen Bacillus circulans-Stamm bereitgestellt.