JP5815203B2 - コラーゲン産生低下抑制剤、それを含む皮膚外用組成物および化粧料 - Google Patents
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Description
なお本発明者等は、同時に、燕窩の酵素分解物が、皮膚真皮繊維芽細胞におけるI型コラーゲンの優れた産生促進効果を有することも見出している。
本発明によるコラーゲン産生低下抑制剤は、前記したように、燕窩の酵素分解物を有効成分とする。
より具体的な例を挙げれば、燕窩の酵素分解物は、以下のようにして調製することができる。
なお、燕窩酵素分解物については必要に応じて、ここでの操作条件を適宜変更したり、慣用の精製もしくは分画方法を適用したりすることによって、さらに前記平均分子量の下限値を、好ましくは5,000以上、より好ましくは10,000以上、さらに好ましくは15,000以上、さらにより好ましくは20,000以上とすることができる。
本発明によるコラーゲン産生低下抑制剤は、単独でそのままでも使用することができるが、化粧料、医薬品、医薬部外品などの種々の皮膚外用組成物に添加剤として含有させることができ、真皮線維芽細胞のコラーゲン産生低下を抑制する効果を有する組成物を得ることができる。得られた組成物は、スキンケア、好ましくは、紫外線照射を受ける前または後におけるスキンケア、よち好ましくは、紫外線照射を受けた皮膚において生ずる、肌の張りおよびツヤの低下の改善、およびシワの予防もしくは改善に有効に使用することができる。
(1-1) 燕窩酵素分解物1
市販の無漂白の燕窩を粉砕機で粉砕して、100メッシュパス(粒径150μm以下)の燕窩粉末を得、この燕窩粉末に、約50倍量(質量)の水を加えて5℃で20時間膨潤させた後、121℃、15分間加熱殺菌処理した。
酵素反応の時間を24時間とした以外は、前記(1-1)項の酵素分解物1と同様に行い、「燕窩酵素分解物2」を得た。
市販の無漂白の燕窩(乾燥物)40gを粉砕機で粉砕し、この粉砕物を、1000mlの蒸留水に加えて、加熱還流下にて2時間抽出処理を行った。加熱還流後、静置した後、上清を分取して濾過し、濾液を回収した。残渣についてはさらに、上記と同様に1000mlの蒸留水に加えて、加熱還流下にて再抽出処理を行った後、固形物残渣を濾過により除去し、濾液を回収した。得られている濾液(抽出液)を併せ、減圧下にて濃縮し、得られた濃縮物を凍結乾燥して、黄白色の「燕窩熱水抽出物」(比較例)を得た。
得られた各燕窩サンプル(燕窩酵素分解物1、燕窩酵素分解物2および燕窩熱水抽出物)中のシアル酸量とタンパク質量とを下記のようにして測定した。
シアル酸の量は、各試料を酸加水分解後に高速液体クロマトグラフィーにて遊離N−アセチルノイラミン酸として測定した。
タンパク質の量は、Brad ford法に基づくBio Rad社のプロテインアッセイキットを使用して測定した。
・カラム: Shodex Asahipak GS320HQ (φ7.6×300mm)
・カラム温度: 35℃
・移動相: 50mM CH3COONH3 pH6.7
・流速: 0.4ml/min
・試料注入量: 10μl
・検出器: 紫外分光検出器(UV220nmにて測定)
[使用した分子量マーカー]
・BSA MW 66,000
・Gly-gly MW 132.1
・Gly-gly-gGly MW 189.17
・L-Asparaginic acid MW133.1
・DL-Asparaginic acid MW 150.1
・N-Acetylneuraminic acid MW 309.3
なお、タンパク質の分子量の評価にあたっては、公知文献(Guo, C. T., Suzuki Y., et al., Antiviral Res. 70, pp.140-146 (2006) に示されているデータも参考にした。
正常ヒト皮膚真皮線維芽細胞(KF−4109、クラボウ社より入手)を、0.5%仔牛血清(FBS)含有DMEM培地(SIGMAより入手)を用いて、96穴プレートに2×104cellsの細胞密度にて播種した。播種24時間後、下記所定の濃度の各燕窩サンプルを含有した0.5%FBS含有DMEM培地と交換し、さらに24時間培養した。
またサンプル濃度については下記のとおりであった:
(i) 酵素分解物の濃度(0、78.1、312.5、1250、5000μg/ml)、
(ii) 熱水抽出物の濃度(0、1.56、6.25、25、100μg/ml)。
培養後、培地上清を回収し、上清中のI型コラーゲン量をELISA法により測定した。
細胞は0.1%Triton X-100溶液にて溶解後、タンパク質量を定量した。
タンパク質量の定量は、BCA法(ビシンコニン法)(ペプチド結合に反応させた銅イオンをBCA(ビシンコニン酸)と反応させ、波長562nmでの吸収を測定する方法)によって行った。
培地中のI型コラーゲン量は、全細胞のタンパク質量で培地中のI型コラーゲン量を除することによって単位タンパク質量当たりのI型コラーゲン産生量として算出した。
結果から、燕窩の酵素分解物が、UVB照射による真皮線維芽細胞におけるI型コラーゲン産生低下を、有意に抑制することが確認された。また熱水抽出物(比較例)の場合には、このような抑制効果は見られなかった。
Claims (5)
- 燕窩のパンクレアチンによる酵素分解物を有効成分とする、真皮線維芽細胞における紫外線照射によるコラーゲン産生低下の抑制外用剤。
- 酵素分解物の分子量が、70〜200,000である、請求項1に記載のコラーゲン産生低下抑制外用剤。
- 酵素分解物の平均分子量が、1,000〜50,000である、請求項1または2に記載のコラーゲン産生低下抑制外用剤。
- 紫外線照射により皮膚真皮繊維芽細胞において生ずるI型コラーゲン産生低下を抑制するための、請求項1〜3のいずれか一項に記載のコラーゲン産生低下抑制外用剤。
- 化粧料である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のコラーゲン産生低下抑制外用剤。
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