CN113876611A - 唾液酸在制备促进胶原蛋白生成的制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种唾液酸在制备促进胶原蛋白生成的制剂中的应用，通过利用唾液酸促进成纤维细胞刺激胶原蛋白的产生，从而延缓皮肤老化、保持或提高皮肤弹性以及促进皮肤再生及伤口愈合，从而保持皮肤结构正常化。
Description
技术领域
本申请涉及制剂技术领域，具体涉及一种唾液酸在制备促进胶原蛋白生成的制剂中的应用。
背景技术
胶原蛋白是一种由真皮产生和分泌的不溶性蛋白，皮肤真皮含有大约90％的胶原蛋白，其中Ⅰ型胶原蛋白占皮肤总胶原蛋白的70％至90％，其余大约10％至30％的皮肤总胶原蛋白主要是Ⅲ型胶原蛋白。胶原蛋白具有支撑皮肤结构、提供细胞生存环境以及保湿的功能，在维持皮肤弹性方面起重要作用。为了维持皮肤弹性，胶原的产生和降解需要以正常的方式进行，当皮肤受到某些特定外界影响，如紫外线照射、干燥时，胶原蛋白会丢失，当衰老和处于压力状态下时，皮肤中的胶原蛋白也会丢失，同时这些外界影响和/或衰老能引起皮肤细胞(主要是成纤维细胞)中胶原蛋白的合成减少，这些都与皮肤老化及皮肤皱纹的形成紧密相关。保持一定数量的胶原蛋白以及表现良好的胶原蛋白合成能力对保持健康皮肤是很重要的。另外胶原还在创伤愈合中起重要作用，通过促进受伤表皮内的胶原合成可以迅速地无疤痕地愈合创伤。
目前，含有胶原蛋白的外用制剂已经应用于市场中，例如化妆品和软膏，然而，由于这些产品中的胶原蛋白是大分子，不能仅通过涂在皮肤上被皮肤吸收，因此，不能期望它们体现有效的润湿和愈合创伤作用。为了解决该问题，可促进胶原蛋白合成的物质的研发越来越受到关注。对于胶原的生物合成，已有维生素C、视黄酸、转化生长因子或某些植物提取物被用作促进胶原蛋白生成的活性物质。
然而，当将这些物质施用到皮肤上时，由于诸如刺激性和发红之类的安全性问题，这些物质的使用量受到限制或效果不明显，不能期望具有良好的效果。因此，迫切需要发现一种安全、有效的促进胶原蛋白生成的材料。
发明内容
鉴于此，本申请提供一种唾液酸在制备促进胶原蛋白生成的制剂中的应用。
一方面，本申请提供唾液酸在制备促进胶原蛋白生成的制剂中的应用。
可选的，所述制剂包括皮肤外用制剂，所述皮肤外用制剂为护肤品、化妆品或药品。
可选的，所述唾液酸选自：唾液酸单体、聚唾液酸、唾液酸金属盐及唾液酸衍生物中的至少一种。
可选的，所述制剂用于：
(a)：延缓皮肤老化；
(b)：促进皮肤生长及伤口愈合；和/或
(c)：制备组织工程皮肤。
可选的，所述制剂用于：防止皱纹出现、降低皱纹深度；改善皮肤的轮廓和外观；改善皮肤厚度、紧致度及丰满度；皮肤下垂的治疗；皮肤弹力的增加；修复或改善皮肤屏障；改善皮肤的柔度；减轻皮肤脆弱性；祛疤；植皮；烧伤创面，因创伤或手术引起的皮肤缺损创面的愈合；或人工皮肤培养。
可选的，所述促进胶原蛋白生成是通过促进成纤维细胞产生胶原蛋白。
可选的，所述胶原蛋白为Ⅰ型胶原蛋白。
第二方面，本申请还提供一种体外促进胶原蛋白生成的方法，所述方法包括：在皮肤和/或粘膜上施用美容有效剂量的唾液酸，以促进胶原蛋白生成。
可选的，所述皮肤和/或粘膜选自下列至少一种区域：颈部，胸肩部，腹部，臂，大腿，胯部，臀部，腰部和/或面部。
第三方面，本申请还提供一种组织工程皮肤的制备方法，所述方法包括：培养成纤维细胞，其中，在成纤维细胞的培养基中引入唾液酸。
有益效果：
本申请中通过利用唾液酸促进成纤维细胞刺激胶原蛋白的产生，延缓皮肤老化、保持或提高皮肤弹性以及促进皮肤再生及伤口愈合，从而促进皮肤结构正常化；另一方面，唾液酸的刺激性小，可改善诸如刺激性和发红之类的安全性问题，具有良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是本申请实施例提供的Collagen I检测结果示意图。
图2是本申请实施例提供的MTT实验的细胞活力曲线图。
图3是本申请实施例提供的MTT实验的形态学结果。
具体实施方式
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案以及技术效果更加清楚明白，以下将结合具体实施例对本申请进行进一步的详细描述，显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
为了促进对本申请的理解，纳入本申请上下文中使用的一些术语和表述的含义。
术语“唾液酸”学名叫作“N-乙酰基神经氨酸(N-Acetylneuraminic acid)”，是一种天然存在的碳水化合物，CAS号为131-48-6。化学式为C11H19NO9。它最初由颌下腺粘蛋白中分离而出，也因此而得名。唾液酸的生产方法包括有合成法(例如化学合成、酶合成)、天然提取法(例如从蛋清、颌下腺粘蛋白或胎盘中提取)及发酵法，其中发酵法能够产生唾液酸单体或者聚唾液酸，需要说明的是，唾液酸的来源并不影响本申请实施例的实施。
术语“胶原蛋白”是指在动物中，特别是在脊椎动物的皮肤和结缔组织中发现的一组天然蛋白质。它是结缔组织的主要组成部分，是哺乳动物中含量最高的蛋白质，占生物蛋白质总量的25％至35％。细长纤维形式的胶原蛋白主要存在于肌腱、韧带和皮肤等纤维组织中，并且在角膜、软骨、骨骼、血管、肠道和椎间盘中也丰富。
术语“皮肤”应当理解为从最上层或角质层到最下层或真皮(二者包括在内)，包含它的层。这些层包含不同类型的细胞，例如尤其是角化细胞、纤维原细胞、黑素细胞和脂肪细胞。在本申请实施例中，术语“皮肤”主要指哺乳动物的皮肤，尤其是指人的皮肤，包括头皮。
术语“老化”是指由紫外光、自发(按年月顺序)或外部环境造成皮肤真皮中胶原蛋白的减少，从而引起的皮肤退化，具体表现为皮肤弹性的下降，甚至细纹或皱纹的产生。
术语“延缓”表示通过向个体施用本申请的含有唾液酸的制剂来抑制或延迟皮肤老化的发生的任何作用。
术语"改善"是指至少降低与所治疗的病症有关的参数的严重性的任何动作，例如症状。
本发明中使用的术语"个体"是指包括哺乳动物，尤其指人类。
本申请的发明人意外地发现，唾液酸可以促进胶原蛋白生成，因此，本申请提供一种唾液酸在制备促进胶原蛋白生成的制剂中的应用。
本申请的发明人发现，唾液酸可以促进成纤维细胞生成胶原蛋白，因而可以促进皮肤结构正常化，本申请中“使皮肤结构正常化”至少包括降低构成皮肤的表皮、真皮和皮下组织结构的破坏程度或修复皮肤表皮、真皮和皮下组织的损伤。具体而言，唾液酸促进成纤维细胞生成胶原蛋白，进而可以修复皮肤缺损区域。其中，“皮肤缺损”包括皮肤结构的破坏状态，其中例如形成皮肤粗糙、皱纹和开放性伤口。在一些具体实施例中，唾液酸至少可以应用于皮肤，以实现如下功效：
(a)延缓皮肤老化：例如将唾液酸应用于皮肤，以减少胶原蛋白流失，并促进成纤维细胞生成胶原蛋白，从而对皮肤皱纹、细纹或皮肤弹性丧失进行预防或修复。具体来说，延缓皮肤老化包括防止或减缓皱纹、细纹出现；降低或减轻已有皱纹、细纹的程度，起到紧致、抚平的效果；改善皮肤的轮廓和外观；改善皮肤厚度、紧致度及丰满度；皮肤下垂的治疗；皮肤弹力的增加；修复或改善皮肤屏障；改善皮肤的柔度；减轻皮肤脆弱性等。
本领域技术人员可以理解，这种皮肤老化可以是本领域已知的任何引起皮肤老化的因素所导致，包括但不限于皮肤自然衰老、光照(紫外线)、生活习惯(例如吸烟、熬夜、饮酒等)、其他外界环境(例如电磁辐射、风沙、干燥等)。由于唾液酸延缓皮肤老化是基于其促进胶原蛋白的生成，因而其可以对于各种因素所导致的皮肤老化均是有效的。
作为延缓皮肤老化的用途，唾液酸可用于制备皮肤外用制剂，包括但不限于作为有效成分被制备成护肤品例如爽肤水、乳液、精华、面霜、眼霜、身体乳、防晒剂、护手霜、护唇膏，还可以用于制备化妆用品例如粉底、隔离霜、口红等。在这些护肤品或化妆用品中，唾液酸可以与其他护肤活性成分共同存在，必要时可加入适量的辅料以制备成这些外用制剂。
(b)促进皮肤生长及伤口愈合：由于唾液酸可以促进成纤维细胞生成胶原蛋白，因而唾液酸可用于促进皮肤生长及伤口愈合。在一些实施例中，唾液酸可适用于皮肤表面的开放性伤口，促进皮肤胶原蛋白、弹性蛋白的生成，帮助新皮肤组织的生成，修复皮肤缺损。这些开放性伤口可以是因任何因素导致的皮肤表面受损，包括但不限于割伤、划伤、烧伤、烫伤、擦伤等。值得说明的是，唾液酸具有优异的皮肤修复、保湿功效，因而其在促进皮肤生长的过程中，可有效减轻皮肤愈合过程中可能存在的增生，进而可有效减少疤痕的产生，改善伤口外观。
在一些实施例中，唾液酸可作用于皮肤真皮层缺损导致的凹陷性缺损，例如痤疮、水痘等留下的伤口；还可用于皮肤表皮缺损导致的伤口例如擦伤、浅表性划伤、浅表性烫伤的伤口；或者可用于真皮层破坏所导致的深层伤口，例如烧伤、割伤、其他机械性外伤、手术伤口等。
本领域技术人员可以理解，由于唾液酸是对人类安全的化学品，并且具有良好的生物相容性，因而可以将含有唾液酸的制剂施用于皮肤缺损的患处。
作为促进皮肤生长及伤口愈合的用途，唾液酸可用于制备皮肤外用制剂，包括但不限于祛疤产品、伤口敷料、促进伤口愈合产品等。
(c)制备组织工程皮肤：唾液酸可用于成纤维细胞培养液中，促进成纤维细胞生长并生成胶原蛋白。本领域技术人员可以理解，成纤维细胞在支架材料上增殖生长可以制备得到组织工程皮肤(人工皮肤)，胶原蛋白可为组织工程皮肤提供骨架支撑，为组织工程皮肤的重要部分。唾液酸具有良好的生物相容性，加入到成纤维细胞培养液中，可使得成纤维细胞更快地生成胶原蛋白，形成良好的人工皮肤骨架结构，进而，唾液酸可作为成纤维细胞培养液的成分。
在本申请实施例中，唾液酸可以来源于合成的游离唾液酸或天然材料提取物。天然材料提取物可以是燕窝提取物。在本申请中，可选用本领域已知的通过生物合成或化学合成方法制备并分离纯化的游离唾液酸。在一些实施方式中，出于唾液酸纯度以及唾液酸成分安全性、稳定性考虑，合成的唾液酸是本申请所期望的。
在一些实施例中，所述唾液酸选自：唾液酸单体、聚唾液酸、唾液酸金属盐及唾液酸衍生物中的至少一种。例如，在一些具体实施例中，所述唾液酸金属盐可以为唾液酸钠盐或锌盐；在另一些具体实施例中，所述唾液酸还可以以α-糖苷键的形式连接于糖蛋白、糖脂与寡糖的末端。
在一些实施例中，所述促进胶原蛋白生成是通过促进成纤维细胞产生胶原蛋白的作用机理来实现。成纤维细胞是产生胶原蛋白的细胞，当皮肤老化或暴露于紫外线或热中时，合成胶原蛋白的能力降低并且胶原蛋白的量迅速降低，当胶原蛋白的量减少时，肌肉的形状将无法维持，并且皮肤老化，皮肤弹性减弱和出现皱纹。因此，本申请通过促进成纤维细胞的胶原蛋白，可延缓皮肤老化、保持或提高皮肤弹性，并且可以获得诸如促进皮肤再生及伤口愈合的效果。
在一些实施例中，所述胶原蛋白为I型胶原蛋白，成纤维细胞与I型胶原蛋白的生成有密切关系，皮肤中的I型胶原蛋白比例降低会使皮肤老化，本申请利用唾液酸来刺激成纤维细胞的胶原蛋白，从而产生延缓皮肤老化的效果。
本申请还提供一种体外促进胶原蛋白生成的方法，该方法主要通过在皮肤和/或粘膜上施用有效剂量的唾液酸，以促进胶原蛋白生成来实现，从而起到延缓衰老，保持或增加皮肤光泽、紧致度或弹性的作用。
本申请的对含有唾液酸的制剂的施用方法没有特别限制，可以使用任何施用途径和方法，例如可以皮肤外用给药，只要该唾液酸可以到达期望的部位即可。因此在一些实施例中，所述制剂可以为外用制剂，所述外用制剂为护肤品、化妆品或药品，所述护肤品为：精华液、乳液、面霜、眼霜、面膜、防晒霜、沐浴露及洗面奶中的任一种，所述化妆品为：化妆水、粉底及BB霜中的任一种，所述药品为皮肤外用药，包括：膏剂、洗剂、敷料、霜剂及乳剂中的任一种。
具体的，唾液酸还可以与护肤品、化妆品或药品上可接受的，特别是皮肤科可接受的赋形剂和/或载体掺入到以上所述外用制剂中。例如：脂肪成分、含水成分、湿润剂、防腐剂、调质剂、香料、芳香剂、抗氧化剂及着色剂等，这样的赋形剂和/或载体是本领域技术人员已知的，此处不作具体限定。
在一些实施例中，所述制剂个体施用的次数可以为每天一次、两次或三次，施用时间可以继续一周、两周、四周、八周、六个月或更久。需要说明的是，以上仅为举例，本申请的针对唾液酸的有效剂量和次数可以根据剂型和/或途径而变化。或者可以根据其他医学领域众所周知的各种因素和类似因素而变化，例如年龄、体重、性别、饮食及总体健康状况等，此处不作具体限定。
在一些实施例中，所述皮肤和/或粘膜选自下列至少一种区域：颈部，胸肩部，腹部，臂，大腿，胯部，臀部，腰部和/或面部。
本申请还提供一种组织工程皮肤(人工皮肤)的制备方法，所述方法包括：培养成纤维细胞，其中，在成纤维细胞的培养基中引入唾液酸。
本申请的培养方法是在含有唾液酸的培养基存在下培养动物的正常成纤维细胞，该唾液酸可用于任何类型的成纤维细胞培养基中，可用于促进成纤维细胞生成胶原蛋白，尤其是I型胶原蛋白。
需要说明的是：用于本申请培养方法中的正常动物成纤维细胞没有特别的限制。正常的成纤维细胞为具有形成有组织的胶原蛋白凝胶能力的非肿瘤细胞。这种正常的成纤维细胞可由口腔粘膜、皮肤等获得，或可制备和使用其原始培养物。本领域技术人员可以理解，成纤维细胞的获得为已知技术，本领域技术人员可以根据本领域已知的手段。
以下为利用各实施例对本申请的技术方案进行的详细说明。
本申请实施例中所用的唾液酸为N-乙酰神经氨酸，白色粉末，由武汉中科光谷绿色生物技术有限公司提供，生产批号：2103131。
试验例1：唾液酸在促进胶原蛋白生成方面的性能测试
一、试验目的
以成纤维细胞为测试工具，通过检测样品作用成纤维细胞后Collagen I(I型胶原蛋白)含量的变化情况，来评价待测样品的紧致抗皱功效。
二、试验试剂及设备
测试系统：本测试所用细胞为成纤维细胞(批号：Fb20081901)，由广东博溪生物科技有限公司提供。人成纤维细胞(fibroblasts)是疏松结缔组织、真皮层的主要组成细胞，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。成纤维细胞呈梭形，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构。
主要试剂：DMEM培养液(GIBCO)、胎牛血清(四季青)、PBS(索莱宝)、DMSO(Sigma)、Collagen I ELISA试剂盒(Abcam)。
主要设备：CO2培养箱(Thermo，150i)、超净工作台(苏州安泰，SW-CJ-1F)、酶标仪(BioTek，Epoch)、倒置显微镜(Olympus，CKX41)。
三、试验方法
(1)细胞接种：按1.0×104个/孔的接种密度接种成纤维细胞至96孔板，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育过夜。
(2)配液：按照实验设计配置受试物工作液。
(3)给药：根据表1实验具体设计，待96孔板中细胞铺板率达到40％～50％时，进行分组给药，每孔给药量为200μL，每组设3个复孔，培养箱(37℃、5％CO2)继续培养24h。
(4)收集细胞上清液：培养24h后，收集细胞培养上清液于EP管中，收集完后将用于Collagen I含量检测的样品置于-80℃冰箱冷冻保存。
(5)Collagen I含量的检测：根据Collagen I含量检测试剂盒的操作说明书进行检测。
(6)结果分析：应用GraphPad Prism Program软件作图，各组间采用t-test统计分析，*P＜0.05表示差异显著，**P＜0.01表示差异极显著。
表1.实验设计
注：PC(TGFβ)为转化生长因子-β，BC为胎牛血清。
四、试验结果
根据以上试验方法进行Collagen I检测，具体结果见表2和图1。
表2.检测结果
| 样品名称 | 平均浓度 | SD | P-value |
| BC | 17.63 | 0.80 | / |
| PC(TGFβ) | 31.75 | 0.21 | 0.000** |
| 燕窝酸(0.05％) | 17.95 | 0.18 | 0.536 |
| 燕窝酸(0.1％) | 27.29 | 1.46 | 0.001** |
| 燕窝酸(0.2％) | 44.51 | 3.90 | 0.000** |
备注：用t-test方法进行统计分析时，与BC组相比，显著性以*表示，P-value<0.05表示为*，P-value<001表示为**。
由图1和表2可知，与BC组相比，PC(TGFβ)组的Collagen I含量显著上升，说明本次阳性对照检测有效。
与BC组相比，浓度为0.05％、0.1％和0.2％的燕窝酸，Collagen I含量均上升，尤其是浓度为0.1％和0.2％的燕窝酸，CollagenⅠ含量显著上升，效果更加明显，说明燕窝酸具有促进成纤维细胞生产CollagenⅠ的功能。
试验例2：MTT实验
将不同浓度的唾液酸进行关于成纤维细胞的MTT实验，实验结果如下表3和图2所示，关于成纤维细胞的形态学结果，如图3所示。
表3
根据表3、图2和图3结果，可以得出燕窝酸基于成纤维细胞，在一定的浓度范围内无细胞毒性。
试验例3：金属蛋白酶的实验
本试验例基于UVA辐照HFF-1细胞MMP-1(金属蛋白酶)表达检测，具体步骤如下：
(1)接种：将细胞接种至6孔板中，37℃，5％CO2培养箱孵育18h至24h。
(2)配液：根据表4配制受试物和阳性对照。
(3)给样：根据表4试验分组和浓度设置，待6孔板中细胞铺板生长18h至24h后，进行分组给样，每组设3个复孔。组1中，空白对照与阴性对照组均加入含0.1％DMSO的细胞培养基，阳性对照加入含有10μg/mLVe(维生素E)的细胞培养基；组2中，空白对照与阴性对照组均加入细胞培养基，样品组加入含有相应浓度样品的细胞培养基，于37℃，5％CO2培养箱继续培养24h。
表4.试验分组和浓度设置
结果如表5所示：
表5
备注：▲▲表示与SC(UVA-，0.1％DMSO)组相比，差异极显著，P<0.01；△△表示与BC(UVA-)组相比，差异极显著，P<0.01；##表示与SC(UVA+，0.1％DMSO)组相比，差异极显著，P<0.01。
试验结果表明，与SC(UVA-，0.1％DMSO)组相比，唾液酸各给药浓度下，未显著下调MMP-1的表达。
以上对本申请所提供的一种唾液酸在制备促进胶原蛋白生成的制剂中的应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的技术方案及其核心思想；本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请实施例的技术方案的范围。
Claims (10)
1.唾液酸在制备促进胶原蛋白生成的制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制剂包括皮肤外用制剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述唾液酸选自：唾液酸单体、聚唾液酸、唾液酸金属盐及唾液酸衍生物中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制剂用于：
(a)：延缓皮肤老化；
(b)：促进皮肤生长及伤口愈合；和/或
(c)：制备组织工程皮肤。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制剂用于：防止皱纹出现、降低皱纹深度；改善皮肤的轮廓和外观；改善皮肤厚度、紧致度及丰满度；皮肤下垂的治疗；皮肤弹力的增加；修复或改善皮肤屏障；改善皮肤的柔度；减轻皮肤脆弱性；祛疤；植皮；烧伤创面，因创伤或手术引起的皮肤缺损创面的愈合；或人工皮肤培养。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述促进胶原蛋白生成是通过促进成纤维细胞产生胶原蛋白。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述胶原蛋白为Ⅰ型胶原蛋白。
8.一种体外促进胶原蛋白生成的方法，其特征在于，所述方法包括：在皮肤和/或粘膜上施用有效剂量的唾液酸，以促进胶原蛋白生成。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述皮肤和/或粘膜选自下列至少一种区域：颈部，胸肩部，腹部，臂，大腿，胯部，臀部，腰部和/或面部。
10.一种组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，所述方法包括：培养成纤维细胞，其中，在成纤维细胞的培养基中引入唾液酸。
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