JPH0631414B2 - 酵素洗剤添加物 - Google Patents

酵素洗剤添加物

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JPH0631414B2
JPH0631414B2 JP59127716A JP12771684A JPH0631414B2 JP H0631414 B2 JPH0631414 B2 JP H0631414B2 JP 59127716 A JP59127716 A JP 59127716A JP 12771684 A JP12771684 A JP 12771684A JP H0631414 B2 JPH0631414 B2 JP H0631414B2
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detergent additive
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D7/00—Compositions of detergents based essentially on non-surface-active compounds
    • C11D7/22—Organic compounds
    • C11D7/40—Products in which the composition is not well defined
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38627—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing lipase

Description

【発明の詳細な説明】 (1)従来技術及び発明が解決しようとする問題点 酵素添加物の分野は、過去数十年間において急速に進歩
して来ている。例えば文献「How Enzymes Got into Det
ergents」、１２巻、Developments in Industrial Micr
obiology（工業微生物協会出版、アメリカンインスティ
テュートオブバイオロジカルサイエンス、ワシントン、
Ｄ．Ｃ．１９７１年、Claus Dambmann，Poul Holm，Vil
ly Jensen及びMogens Hilmer Nielsenによる）を参照さ
れ度い。
最も普通の酵素洗浄剤添加物はタンパク分解添加物であ
るが、又脂肪分解洗浄添加物が、例えば米国特許４，０
１１，１１６、第４カラム、６５行ないし第５欄、６８
行に並びに英国特許１，２９３，６１３、２頁、６行な
いし２９行に記載されている。
又、洗浄剤添加物としてハンスアンドレー（Hans Andre
e）等により記載された広範囲に吟味した文献が、ジャ
ーナルオブアプライドバイオケミストリイ、２，２１８
〜２２９（１９８０）、標題「Lipases as Detergent C
omponents」において見い出される。
もしも洗浄方法が高温度で且つ高アルカリ性で行われる
場合、汚物を含有する脂肪はけん化により溶解するであ
ろう。しかし、エネルギー危機の為、低温洗浄方法（60
℃付近及び以下）が一般に好まれ、更にこれら等の低い
温度では公知のリパーゼは、汚物を含有する脂肪の一部
のみしか溶解し得ない。
脂肪分解酵素洗浄剤添加物の有効性は、英国特許１，３
６１，３８６（特に４頁及び７頁）並びに米国特許３，
７２３，２５０（特に１５〜１９欄）に記載された手順
を採用し、EMPAスイス連邦原料試験及び試験及び実験所
（Ｅｉｄｇｅｎｓｓｉｓｃｈｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｐ
ｒｆｕｎｇｓ ｕｎｄ Ｖｅｒｓｕｃｈｓａｎｓｔａ
ｌｔ）、セントガレン、スイス国見本番号１０１（オリ
ーブ油／綿）及び１０２（オリーブ油／羊毛）を用いる
ことにより好都合に測定出来る。この方法においては脂
肪分解洗浄剤添加物として公知の酵素は、それ等が不満
足な低脂肪分解洗浄効率を示すという点においてむしろ
不満足であるように思われる。というのはそれ等は洗浄
液中経済的に合理的なリパーゼ活性においてディファレ
ンシャルレミッタンスヴァリュー（differential remit
tance value）ΔＲが低い値を反映しているからであ
る。
かくして、洗浄液中経済的に合理的なリパーゼ活性にお
いて相当に高いディファレンシャルレミッタンスヴァリ
ューΔＲに対応する、相当に良好な脂肪分解洗浄効率を
示す脂肪分解洗浄添加剤の必要性が存在する。
(2)問題点を解決する為の手段及び作用 今や、本発明の第一の面によれば、脂肪分解洗浄剤添加
物が見い出されこれは洗浄液中経済的に合理的なリパー
ゼ活性において相当に高いディファレンシャルレタッタ
ンスヴァリューΔＲに対応する、相当に良好な脂肪分解
洗浄効率を示し、この脂肪分解洗浄剤添加物はリパーゼ
がフサリアムオキシスポラム（Fusarium oxysporum）の
リパーゼ生産菌株により生産できるという事実に特徴づ
けられている。
種フサリアムオキシスポラム（Fusarium oxysporum）の
定義は過去数十年において幾分変化している。例えば本
発明の目的に対し、種フサリアムオキシスポラム（Fusa
rium oxysporum）の定義は「The Genus Fusarium」、
（C.Both，CMI，１９７１年）に記載されている定義で
ある。
フサリアムオキシスポラム（Fusarium oxysporum）のあ
る種の菌株に関し、リパーゼ形成が記載されている。例
えばAgric.Biol.Chem.４３（１０）（１９７９），２１
２６，第Ｉ表を参照され度い。ここにおいてフサリアム
リニィ（Fusarium lini）リパーゼが示されている（フ
サリアムオキシスポラム（Fusarium oxysporum）の上記
定義によれば、フサリアムリニィ（Fusarium lini）は
フサリアムオキシスポラム（Fusarium oxysporum）に今
や帰属している）、更にIndian Journal of Experiment
al Biology，11巻（1973年），37〜39頁、標題「Lipids
and Lipase Activity in Strains of Fusarium vasinf
ectum」（フサリアムオキシスポラム（Fusarium oxyspo
rum）の上記定義によれば、フサリアムヴァシンヘクタ
ム（Fusarium vasinfectum）は今やフサリアムオキシス
ポラム（Fusarium oxysporum）に帰属する）を参照され
度い。
フサリアムオキシスポラム（Fusarium oxysporum）に帰
属する菌株の中には、リパーゼ生産能が低いものがあ
る。本発明の目的に対し、フサリアムオキシスポラム
（Fusarium oxysporum）のリパーゼ生産菌株は、次の条
件のもとで１０LU／ml（LUは本明細書中後に定義される
リパーゼ単位（Lipase Units）である）以上を生産する
菌株として定義される： 振とうフラスコ用に意図された基質は次の生成（１リッ
トル当りのグラム量）で調製される： 大豆ミル…………45 グルコース…………70 KH2PO4…………２ Na2HPO4…………３ 大豆油…………５。
滅菌を１２１℃で４０分間行った。リパーゼ生産に対し
試験されるべきフサリアムオキシスポラム（Fusarium o
xysporum）の菌株で予め接種した寒天斜面からの胞子を
用いて、基質１００mlを有する５００mlのエーレンマイ
ヤーフラスコに接種した。フラスコを２３０rpmで且つ
３０℃で５日間振とうし、しかる後リパーゼ収率を測定
した。例２９を参照され度い。
今や以下の驚くべき事実が見い出された。即ち本発明に
係る洗浄剤添加物は本明細書中後に説明する記載から明
らかなように劇的に改良された脂肪分解洗浄効果を示
す。
フサリアムオキシスポラム（Fusarium oxysporum）菌株
DSM２６７２，ATCC７８０８，CBS２０．７２，CBS６４
５．７８，CBSCBS７９４．７０に関し、以下の事実が見
い出された。即ち、これらの菌により生産されるリパー
ゼの最適活性のためのpHの菌株間の平均値は９〜１１付
近であり、更に最適活性の菌株間の平均温度は３５〜５
０℃付近である（分析時間：２０分）。DSM２６７２由
来のリパーゼから生産される抗体を用いた交差免疫電気
泳動法から以下の内容から明らかにされる。即ち上述の
五種の菌株から得られるリパーゼは同一であるか又は部
分的に同一である。上述の知見から以下の内容が結論づ
けられる。即ち本発明に係る酵素洗浄剤添加物の活性成
分は一群の緊密に関連したリパーゼである。
リパーゼ活性は、リパーゼ活性を測定する為のノボ（NO
VO）法に従って測定される。この方法は、酵素によりト
リブチリンの加水分解を基礎においている。遊離した酪
酸を水酸化ナトリウムを用いた滴定法により滴定する。
１ノボリパーゼ単位（LU）は、一定pHのもと且つ以下の
標準条件のもとで、一分当り水酸化ナトリウム１μmol
に相当する適定可能な酪酸を遊離する酵素の量である。
標準条件 温度………３０．０℃ pH………７．０ 反応時間………２０分 基質………トリブチリン。
この方法の詳細は、パンフレットAF95/4（日付１９８２
−０８−１８）に記載されており、これは請求によりノ
ボインダストリィ社、（バグスヴァヤルド、デンマーク
国）から入手可能である。
本発明に係る酵素洗浄剤添加物の特に好ましい態様にお
いて、フサリアムオキシスポラム（Fusarium oxysporu
m）のリパーゼ生産菌株はDSM２６７２である。菌株フサ
リアム種（Fusarium sp.）DSM２６７２は、Fusarium ox
ysporum Schlecht.ex Fries,emond.Snyder＆Hansenとし
て分類されて来ている。菌株DSM２６７２フサリアムオ
キシスポラム（Fusarium oxysporum）の形態学上の性質
は、フサリアム（Fusarium）属、C.Booth，CMI，１９７
１中フサリアムオキシスポラム（Fusarium oxysporum）
の種の説明の開示に正しく相当する。リパーゼのpH活性
曲線は作成されており、このリパーゼ活性はAF95/4-GB
に従って測定され、基質の正常なpH値７以外に基質のpH
値を４、５、及び６、並びに８，９、及び１０に調節す
ることにより修正される。トリブチリンはリパーゼなし
で高いpH値において分解されるので、pH曲線はその様な
自動分解に対し修正される。この方法によりpH１０付近
のpH最適活性が見い出された。酵素の安定性は、１８時
間後８０％の残留活性が５℃で４．５〜１１のpH間隔に
おいて更に２５℃で５〜１０のpH間隔において見い出す
ことが出来る限りにおいて、広範囲のpH間隔に亘って優
れている。又、リパーゼ活性の最適温度は４０℃付近で
ある。酵素は４０℃までは３０分間安定であり、これは
６０℃付近あるいはそれ以下において先に述べた低温度
洗浄方法に関し特に優れている。
本発明に係る酵素洗浄剤添加物の特に好ましい態様にお
いて、ノンダスチング粒質物として得られる。これ等の
粒質物は幾つかの異なった方法で得ることが出来る。英
国特許１，３６２，３６５を参照することが出来、これ
には押出機及びスフェロナイザー（spheronizer）（Ｍ
ＡＲＵＭＥＲＩＺＥＲ として市販）から成る装置を用
いることにより洗浄剤添加物として使用される酵素含有
粒質物の製造を開示しており更に米国特許４，１０６，
９９１を参照することが出来これは回転造粒機を用いて
洗浄剤添加剤として使用される粒質物を含有する酵素の
製造を開示している。
本発明に係る酵素洗浄剤添加物の特に好ましい態様にお
いて、添加物は酵素安定剤を有する液体として提供され
る。安定剤はプロピレングリコール又は酵素溶液に対し
安定剤として公知の他の試剤であって良い。液状洗剤は
適用の容易さの故に一般的になって来ている。
本発明に係る酵素洗浄剤添加物の特に好ましい態様にお
いて、リパーゼ活性は添加物１ｇ当り約２０００〜約１
０００００LUである。この方法において、洗浄剤添加物
を洗浄剤１００ｇ当り０．２〜２ｇ量で洗浄剤に添加し
た場合並びに洗浄剤を洗浄溶液１当り１〜５ｇの洗浄
剤の量で該洗浄溶液に添加した場合通常のリパーゼ活性
が洗浄溶液において得られる。
本発明に係る酵素洗浄剤添加物の特に好ましい態様にお
いて、該添加物はリパーゼの外にタンパク分解酵素を含
有する。驚くべきことに以下の事実が見い出された。即
ちタンパク分解洗浄剤添加物は、添加物中、洗浄剤中又
は洗浄溶液中の何れの（タンパク）リパーゼをも分解し
ない。従って、タンパク分解及び脂肪分解洗浄剤添加物
は共存することが出来、更に以下の事実が見い出され
た。即ちこの洗浄剤添加物は非常に高いΔＲ値をもたら
し、非常に高い洗浄効率を有する。バシラスリケニフォ
ルミス（Bacillus licheniformis）により微生物学的に
生産される、ノボインダストリィ社から市販されている
タンパク分解酵素ALCALASE は、優れた結果を伴って使
用することが出来る。混合酵素添加物は、予め製造した
リパーゼ粒質物と予め製造したプロティナーゼと混合す
るか、又はプロティナーゼコンセントレートを、リパー
ゼコンセントレートと混合し次いでこの混合物を通常の
造粒助剤と共に造粒装置に導くことにより製造すること
が出来る。
本発明に係る酵素洗浄剤添加物の特に好ましい態様にお
いて、タンパク分解活性は添加物１ｇ当り約０．５〜約
３．０アンソン単位である。洗浄剤添加物を洗浄剤１０
０ｇ当り０．２〜２ｇの量で該洗浄剤に添加した場合更
に洗浄剤を洗浄溶液１当り洗浄剤１〜５ｇの量で洗浄
液に添加した場合、好都合なタンパク分解活性が洗浄溶
液中で生じる。
本発明の第二の面は、酵素洗浄剤添加物を有する洗浄剤
を含んで成り、その活性成分は微生物により生産された
リパーゼであり、ここにおいて酵素洗浄剤添加物は本発
明に係る酵素洗浄剤添加物である。
本発明に係る酵素洗浄剤添加物の特に好ましい態様にお
いて、洗浄剤は本発明に係る酵素洗浄剤添加物を０．２
〜２．０％ｗ／ｗの量で含有する。この様にして、酵素
作用と他の洗浄剤成分の活性との間の妥当なバランスが
得られる。
本発明の第三の面は、使用する洗浄剤が本発明に係る洗
浄剤であり且つpHが７〜１１であり且つ温度が６０℃以
下である様な洗浄方法を含んで成る。
本発明に係る酵素洗浄剤添加物の特に好ましい態様にお
いて、洗浄溶液は本発明に係る洗浄剤を、洗浄溶液１
当り１〜５ｇの量で含有する。この様にして、好都合な
酵素活性が、例えば洗浄溶液１当り典型的には１００
０〜５０００LUで、洗浄溶液中に発生する。これ等の状
況のもとで、非常に高いΔＲ値が通常の洗浄時間、例え
ば２０分付近に対し得られる。
(3)実施例 本発明を以下の例により非制限的に説明する。
例１ この例は振とうフラスコ中で本発明に係る酵素洗浄剤添
加物中の活性成分の製造について説明する。
基質は次の成分を１リットル当りのグラム量から成る。
大豆ミル ５０ グルコース ５０ KH2PO4 ２ Na2HPO4 ３ 大豆油 １ 滅菌を１２１℃で４０分間行う。１００mlの基質を有す
る５００mlのエルレンマイヤーフラスコに、フサリアム
オキシスポラムDSM２６７２で予め接種した寒天斜面か
らの胞子１０7個で接種した。フラスコを２３０rpmで且
つ２５°〜３０°で２〜５日間振とうした。収率は３０
〜８０LU/mlであった。
例２ この例及び例３〜１５は、２リットルの実験室用発酵器
において、本発明に係る酵素洗浄剤添加物中の活性成分
の製造を示す。
次の培地２６０mlを有する５００mlのエルレンマイヤー
フラスコを調製した。
グルコース ２４ｇ／ コーンスティープリカー ２４ｇ／ 大豆油 ３．８ｇ／ 炭酸カルシウム ３．８ｇ／ 炭酸カルシウム添加前のpH＝５．５ 滅菌を１２１℃で４０分間行った。
例１で示したと同様の方法で寒天斜面からの胞子で接種
した跡、フラスコを２３０rpmで且つ３０℃で２日間攪
拌した。この種培養物１２０mlを以下の組成を有し且つ
１２１℃で１時間滅菌した培地１．３リットルを有する
２リットルの発酵器に移した。
グルコース ５０ｇ／ 大豆ミル ５０ｇ／ KH2PO4 ２．０ｇ／ Na2HPO4・2H2O ３．０ｇ／ 大豆油 １０ｇ／ プルロニック ０．３ｍ 接種後引き続き、通気（７００ml／分）を開始した。又
攪拌を開始し次いでその速度は最初の２４時間中は６０
０rpmであり、しかる後８００rpmにその速度を増加せし
めた。温度を３０℃に保持した。１００時間発酵を維持
し、この間pH値は６．３から８．５に上昇した。上澄み
液を分析し、次いでリパーゼ活性を９０LU/mlとして得
た。
一連の実験を温度の点を除いては例２に示したと同様に
行った。次の表を参照され度い。
上記の表から、最適温度は３４℃付近であることが理解
される。
pHの影響を調べる為、二種の新しい実験を、３４℃で且
つpHの点を除いて例６と同様に行った：二種の実験の何
れにおいても、発酵器内での最初の２４時間の発酵中pH
は調節しなかった；第一の実験（例８）において、発酵
器内での最初の２４時間の発酵後H3PO4によりpHを６．
５に保持し、更に第二の実験（例９）において、全発酵
期間中pHは監視しなかった。結果を以下の表に示す。
上記の表から明らかな様にもしもpH値を説明した方法で
監視する場合リパーゼ収率は改善される。
攪拌の程度の影響を調べる為、攪拌の程度を除いては例
８に説明したと同様に三種の実験を行った：攪拌器の速
度は、最初の２４時間発酵後の全発酵期間中６００rpm
から種々のレベルに上昇した。次の表を参照され度い。
結果は次の表から明らかである。
上記の表から最適な攪拌速度は約８００rpmであること
が分かる。
発酵培地中の大豆油の濃度の影響を調べる為、大豆油の
濃度を除いては例１１に示したと同様で（例えば温度、
pH及び攪拌の程度に対し最適な値で）行った。次の表を
参照され度い。
例１６ この例はパイロットプラント発酵器において、本発明に
係る酵素洗浄剤添加物における活性成分の製造を示す。
３００の容積を有する接種タンク中で、次の培地を調
節した。
コーンスティープリカー ７．２kg 大豆油 １．５kg 炭酸カルシウム １．５kg プルロニック ２５ml 水を加え２９０までとする。
培地を１２０℃で１時間滅菌した。グルコース７．２kg
及びクエン酸７．２ｇを含有する２０リットル溶液を、
１２１℃で０．５時間滅菌し次いでコーンスティープリ
カー混合物に添加した。３０℃で冷却後、酵母エキス、
燐酸塩、マグネシウム、グルコース及び寒天を含有し且
つ既に３０℃で７日間インキュベートしたフェルンバッ
ハフラスコからのDSM２６７２の胞子を、培地に接種し
た。通気（３００／分）を直ちに開始し、次いで２０
時間後攪拌（２５０rpm）を開始した。温度を３０℃で
保持し次いで２９時間増殖を行った。この種培養物３０
を、以下の成分を含有する主発酵器に移した： 大豆ミル １５kg KH2PO4 ０．６kg Na2HPO412H2O １．２kg 大豆油 ３kg プルロニック ２５ml 水を加えて２７５リットル容量とする。
培地を１２１℃で１時間殺菌した。２５の水中グルコ
ース１５kg及びクエン酸１５ｇを１２１℃で３０分間別
に滅菌し次いで大豆ミル混合物に添加した。
接種に引き続き、通気（３００／分）を開始した。攪
拌も開始し、更にその速度を発酵の最初の１０時間に亘
って４００rpmに増加した。温度を３４℃に保持した。
発酵を６０時間継続させ、この間pH値は６．６４から８
に増加し更にしかる後タンクを冷却し次いで菌糸を遠心
分離で分離した。上澄み液を分析し、次いでリパーゼ活
性を測定し９０LU/mlを得た。
例１７ この例はパイロットプラント発酵器内での本発明に係る
酵素洗浄剤添加物中の活性成分の製造を説明する。
フサリアムオキシスポラムDSM２６７２の液内好気性発
酵によりリパーゼを製造した。
次の組成を有する寒天基質を、フェルンバッハフラスコ
内で調製した： 酵母エキスデイフコ ４ｇ K2HPO4 １ｇ MgSO4・7H2O ０．５ｇ グルコース １５ｇ 蒸留水ad １０００ml 寒天Merck １５ｇ 混合物を４０分間１２０℃でオートクレイブ処理した。
（基質はYPG-寒天と命名される） 菌株DSM２６７２を、YPG-寒天斜面上で一週間３０℃で
培養した。該斜面からの胞子の殺菌した脱脂乳中に懸濁
させ、次いで懸濁液をバイアル中で凍結乾燥した。凍結
乾燥した一個のバイアルの内容物を、フェルンバッハフ
ラスコに移した。次いでフラスコを一週間３０℃でイン
キュベートした。
次の組成を有する基質を、５００の種発酵器内で調製
した： CaCO3 １．５kg グルコース ７．２kg コーンスティープリカー ７．２kg 消泡剤プルロニック ３０ml 水道水を添加し全量を約２４０リットル程度にした。pH
を、CaCO3の添加前に５．５付近に調節した。基質を、
種発酵器内で１時間１２１℃で蒸気滅菌した。接種前の
最終容器は、３００リットル程度であった。
フェルンバッハフラスコの胞子懸濁液を、種発酵器に移
した。
種発酵条件は次の通りであった： 発酵器のタイプ：高さ／直径比が２程度である通常の通
気及び攪拌発酵器 攪拌：３００rpm（２個のタービン型インペラー） 通気：毎分300の空気（室温および常圧のもと） 温度：３０℃ 圧力：０．５気圧 時間：約１７時間 過剰の発泡を防止する為、攪拌及び通気速度を減少する
ことが可能である。しかしここで説明する種発酵器にお
いてはその様な操作は行われなかった。０．５〜１日後
良好な増殖が得られた場合、ここにおいては接種後約１
７時間後、２５リットルを種発酵器から主発酵器へ移し
た。
次の組成を有する基質を、５００の主発酵器内で調製
した： 焼して殻をとった大豆ミル ３９kg グルコース １５kg 大豆油 ３kg KH2PO4 ０．６kg Na2HPO4 12H2O １．２kg 消泡剤プルロニック ３０ml 蒸留水を添加し全量を約２５０リットルとした。大豆ミ
ルを水に懸濁させた。pHをNa2CO3で８に調節し、次いで
温度を５０℃に上昇させた。しかる後約４８０アンソン
単位のアルコラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ Ｌ）（4AU/m
l）を懸濁液に添加した。混合物を、４時間５０℃で且
つpH＝８．０（Na2CO3の添加）で且つ通気は行わず、０
気圧で１５０〜２００rpmの攪拌下に保った。しかる後
残りの基質成分を添加し次いでpHを燐酸で約６．５に調
節した。基質を主発酵器内で１時間１２１℃で蒸気滅菌
した。３４℃に冷却後、pHを殺菌した炭酸ナトリウム溶
液（全量２０リットル中３kgの炭酸ナトリウム）を用い
て約６．０に調節した。接種前の最終容量は約２８０リ
ットルであった。次いで種培養物２５リットルを添加し
た。
発酵条件は次の通りであった： 発酵器のタイプ：高さ／直径の比が約２である通常の通
気及び攪拌発酵器 攪拌：１５０rpm（０〜６時間）及び４００rpm（６時間
ないし終了時）（２個のタービン型インペラー） 通気：毎分２００〜２５０ノーマルリットルの空気（０
〜２２時間）並びに毎分３００ノーマルリットルの空気
（２２時間から終了時まで） 温度：３４℃ 圧力：１．０気圧（０〜３４時間）及び０．５気圧（３
４時間から終了時まで） 時間：約１１２時間。
過剰の発泡を防止する為、攪拌、通気及び圧力を変化さ
せることは可能であった。ここで説明する発酵におい
て、先に示したデータから明らかな様にそれは行われ
た。
燐酸溶液を添加して発酵pHを約６．５に保持した。ここ
で説明する発酵において、発酵約３０時間から終了時ま
で投入が行われた。燐酸溶液は以下の如くして５００リ
ットルの調合タンク内で製造された：２０kgの濃燐酸
（８０％）に、水道水を全体の量が約１６０リットルに
なるまで添加した。溶液を調合タンク内で１２１℃で１
時間蒸気滅菌した。投入開始前の最終容量は約２００リ
ットルであった。発酵pHを約６．５に保つ為に必要な燐
酸溶液の量だけを主発酵器に添加した。
滅菌した消泡剤Ｐ２０００（ポリプロピレングリコー
ル）を、発酵中泡形成を防止する為主発酵器に添加し
た。ここで説明する発酵において３．５リットルのＰ２
０００を用いた。
約１１２時間の発酵後、発酵工程を停止した。主発酵器
は培養ブロス約３１５リットルを含有しており更に得ら
れたリパーゼの収率は、ブロス１グラム当り約２００Ｌ
Ｕであった（基質としてトリブチリンを用いるノボＬＵ
−アッセイＮ０９５／５−ＧＢに従って測定した）。
例１８ リパーゼを例１７において記載した如く製造したが、発
酵は相当により高い基質量及び容積を有する２５００リ
ットルの主発酵器内で行った。
攪拌：２５０rpm（二個のタービン型インペラー） 過剰の発泡を防ぐ為、通気及び圧力を次の如く変化させ
た： 通気：空気を毎分７５０Ｎ（０〜１３時間） 空気を毎分１２００Ｎ（１３〜３７時間） 空気を毎分１５００Ｎ（３７時間から終了時まで） 圧力：０．７気圧（０〜２５時間） ０．５気圧（２５時間から終了時まで） この発酵においては消泡剤Ｐ２０００は添加しなかっ
た。
発酵の終了時には、発酵器は約１８００リットルの培養
ブロスを含有し更に得られたリパーゼ収率はブロス１グ
ラム当り約１２５ＬＵであった。
例１９ リパーゼを例１７で記載した如く製造したが、発酵は、
相当に高量及び容積の基質を含有する２５００リットル
の主発酵器内で行い更に大豆ミルのアルカラーゼ処理は
省略した。２００kgの大豆ミルを用い更に接種前の容量
は１４００リットルであった。基質を、１２３℃で１．
５時間主発酵器内で蒸気滅菌した。
攪拌：２５０rpm（二個のタービン型インペラー） 過剰の発泡を防止する為、通気及び圧力を次の様に変化
させた： 通気：空気を毎分７５０Ｎ（０〜３時間） 空気を毎分９００Ｎ（３〜１１時間） 空気を毎分１１００Ｎ（１１〜２４時間） 空気を毎分１３００Ｎ（２４〜２７時間） 空気を毎分１５００Ｎ（２７時間から終了時まで） 圧力：１．０気圧（０〜２７時間） ０．７５気圧（２７〜４０時間） ０．５気圧（４０時間から終了時まで） この発酵において消泡剤Ｐ２０００は添加しなかった。
発酵の終了時において、発酵器は培養ブロス約１４００
リットルを含有し更に得られたリパーゼ収率はブロス１
グラム当り約１９８ＬＵであった。発酵時間は約１４０
時間であった。
例２０ リパーゼを例１７で記載した如く製造したが、発酵は相
当により高い基質量及び容積を有する２５００リットル
の主発酵器内で行い、更に大豆ミルのアルカラーゼ処理
は省略した。１７０kgの大豆ミルを用い更に接種前の容
量は１４００リットルであった。基質を、１２３℃で
１．５時間主発酵器内で蒸気滅菌した。
攪拌：２５０rpm（二個のタービン型インペラー） 過剰の発泡を防止する為、通気及び圧力を次の如く変化
させた： 通気：空気を毎分７５０Ｎ（０〜１１時間） 空気を毎分１１５０Ｎ（１１〜１９時間） 空気を毎分１３００Ｎ（１９〜２７時間） 空気を毎分１５００Ｎ（２７時間から終了時まで） 圧力：１．０気圧（０〜２７時間） ０．５気圧（２７時間から終了時まで） この発酵において消泡剤Ｐ２０００を０．５リットルを
用いた。発酵の終了時において発酵器は培養ブロス約１
４００リットルを含有しており更に得られたリパーゼ収
率はブロス１グラム当り約２２１ＬＵであった。発酵時
間は約１４４時間であった。
例２１ リパーゼを例１７で記載した如く製造したが主発酵器内
の基質の大豆ミル濃度は５％に減少させ更に大豆ミルア
ルカラーゼ処理は省略した。
過剰の発泡を防止する為、攪拌を次の如く変化させた： 攪拌：０rpm（０〜２２時間） １００〜１５０rpm（２２〜３３時間） ３００rpm（３３時間から終了時まで） この発酵において消泡剤Ｐ２０００は添加しなかった。
発酵の終了時において発酵器は培養ブロス約３１０リッ
トルを含有し更に得られたリパーゼ収率はブロス１グラ
ム当り約１４６ＬＵであった。
例２２ リパーゼを例１７で記載した如く製造したが、主発酵器
の基質の大豆ミル濃度は５％に減少させ、アルカラーゼ
処理は省略し、大豆油は最初の発酵培地から除去し更に
その代り滅菌した大豆油を発酵４８，６０，７２及び８
４時間目に主発酵器に１リットルずつ合計４リットルを
添加した。
過剰の発泡を防止する為、攪拌、通気及び圧力を次の如
く変化させた： 攪拌：２００〜３００rpm（０〜２４時間） ４００rpm（２４時間から終了時まで） 通気：空気を毎分１５０Ｎ（０〜１７時間） 空気を毎分２７５Ｎ（１７〜２５時間） 空気を毎分３００Ｎ（２５時間から終了時まで） 圧力：０．９〜１．０気圧（０〜３３時間） ０．５気圧（３３時間から終了時まで） この発酵において２リットルの消泡剤Ｐ２０００を用い
た。
発酵の終了時には、発酵器は約２８５リットルの培養ブ
ロスを含有し更に得られたリパーゼ収率はブロス１グラ
ム当り約１１３ＬＵであった。
例２３ 例１９で得られる培養ブロスを、水酸化ナトリウムを用
いてpH８．０に調節し更に１％の塩化カルシウム、１％
のServamine KZA３４６（Servo）、０．０３％のSuperf
loc Ａ−１３０（アメリカンシアナミド）及び０．５
％のTrioton Ｘ−１００（ロームアンドハース）を用
いてフロキュレートした。
フロキュレートした培養ブロスを、円板遠心機（Westfa
lia SAMS）を、用いて遠心分離した。
遠心分離物を酢酸でpH４．５に調節した。このpHで沈殿
が生じた。沈殿物を遠心分離（ウエストファリアSAMS）
により上澄み液から分離し次いでトリトンＸ−１００で
処理した。処理された沈殿物を水で希釈し再び遠心分離
した。
二回の遠心分離により得られる遠心分離物を混合物次い
で二回目の遠心分離工程から得られるスラッジを廃棄し
た。
遠心分離物を、膜ろ過し（DDS−モジュールGR60P膜）、
次いでしかる後限外ろ過し更に濃縮した。
限外ろ過した濃厚物をろ過助剤としてハイフロ−スーパ
ーセル（John Manville）を有するポリプロピレンクロ
スでろ過した。次いでろ液を水酸化ナトリウムを用いて
pH８．０に調節し更にサプラ（Supra）１００ろ紙（Sei
tz）でろ過し最後にサプラ(Supra)EKS(Seitz)で細菌ろ
過した。
細菌ろ液を同量のアセトンで沈殿させ次いで純粋アセト
ンで洗浄した。
沈殿物を真空室で乾燥させた。得られた乾燥濃縮物は活
性度約９００００ＬＵ／ｇを有していた。
例２４ 他のリパーゼと比較したフサリアムオキシスポラムリパ
ーゼの洗浄効果 試験材料：EMPA１０１（オリーブ油／綿布） 洗浄液：洗剤Ａ＊），５ｇ／１０°dH水 洗浄機械：TERG-O-TOMETER 洗浄プログラム：４０℃で２０分間 材料見本番号：９／９００mlの洗浄液 リパーゼ：フサリアムオキシスポラムリパーゼAsP.ナイ
ガー，AMANO AP6カンジダ シリンドラシア（Candidacy
lindracea），Sigmaムコアマイヘイ（Mucor miehei）Ｓ
Ｐ ２２５ リパーゼ濃度：０，７５０，１５００，２２５０，３０
００ＬＵ／ フサリアムオキシスポラムリパーゼ活性分に関し、培養
ブロスの遠心分離から得られる適当量の上澄み液として
導入し、その製法は例１で説明している。
洗浄効果はエルレホ（Elrepho）ホトメータ，フィルタ
ーＲ４６を用い、９個の材料見本に関し測定した二回の
読み取りの平均値によりＲ＝レミッション（Remissio
n）値として表される。＊）洗剤Ａは次の組成を有す
る： 綿状アルキルベンゼンスルホネート（LAS，アニオン界
面活性剤 １７％ ノニルフェノールエトキシレート，ＥＯ＝１２ （非イオン界面活性剤） ３％ トリポリ燐酸ナトリウム（ＳＴＰＰ） ３０％ ケイ酸ナトリウム ４％ 炭酸ナトリウム ３％ 硫酸ナトリウム ３７％ 水 ６％ 表中結果はＲ及びΔＲ＝Ｒ−Ｒ０として表され、ここに
おいてＲ０はリパーゼなしで洗浄した材料見本のレミッ
ション値であり更にＲはリパーゼを用いて洗浄した材料
見本のレミッション値である。
例２５ 綿布以外の他の織物についてタンパク分解作用を実証す
る為、同様にポリエステル／綿布及びアクリルから試験
材料を調製した。
試験汚染：オリーブ油 １０％ 乳化剤 １．５％ アーセン（earthen）カラー ０．４％ インディアンインク ０．３％ 水 ８７．８％ 溶液をラニイ（Rannie）ホモゲナイザー中で乳化した。
綿布、ホリエステル／綿布及びアクリルの試験片で均質
化した溶液中で浸漬した。過剰の汚染を絞り取り更に布
の試験片をスピンドライヤー中で３０分間乾燥した。
洗浄条件 試験物質：オリーブ：Ｉ綿布上 IIホリエステル／綿布上 IIIアクリル上 洗浄溶液：洗剤Ｂ＊＊），３．２５ｇ／，１０℃dH水 洗剤Ｃ＊＊＊），１ｇ／，１０°dH水 洗浄機械：ラウンダー-O-メーター（Launder-O-Meter） 洗浄プログラム：１５℃から４０℃に加温、加温時間３
７分、４０℃で１２分間洗浄 材料見本番号：３／３００mlの洗浄液 リパーゼ：フサリアムオキシスポラムリパーゼ ムコアマイヘイ，ＳＰ２２５ Ｃ．シリンドラシア，Sigma パンクレアチンリパーゼ，Sigma リパーゼ濃度：多様 フサリアムオキシスポラムリパーゼが、次の方法におい
て得られた凍結乾燥粉末の適当量としてもたらされた。
１リットルの実験室用フラスコ内での発酵を、例１で説
明したと殆んど同様にして行った。発酵ブロスを遠心分
離し、限外ろ過により濃縮し次いで凍結乾燥した。
＊＊）洗剤Ｂは次の組成を有する： 綿状アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ，アニオン
界面活性剤） ３４％ ノニルフェノールエトキシレート，Ｅ０＝１２（非界面
活性剤） ３％ トリポリ燐酸ナトリウム（ＳＴＰＰ） ６２％ カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ） １％ ＊＊＊）洗剤Ｃは１００％のノニルフェノールエトキシ
レート，Ｅ０＝１２である（非イオン界面活性剤）。
洗浄効果は、エルレホホトメーター、フィルターＲ４６
を用いて測定されたＲ＝レミッション値として表され、
３個の材料見本につき２回の読み取りの平均で表す。
表中、Ｒ０及びΔＲは例２４で示されると同じ意味を有
する。
本発明に係る酵素洗浄剤添加物の活性成分 例２６ この例は、本発明に係る酵素洗剤添加物中のリパーゼ及
びタンパク分解酵素の適合性を実証する。試験材料は例
２５で説明した如く汚染した綿布であった。
洗浄条件 試験材料：先に説明した如く汚染した綿布 洗浄溶液：洗剤Ｂ３．２５ｇ／，１０°dH水 洗剤Ｃ１．０ｇ／，１０°dH水 洗浄機械：ラウンダー-O-メーター 洗浄プログラム：１５℃から４０℃に加温、加温時間３
７分、４０℃で１２分間洗浄 材料見本番号：３／３００mlの洗浄溶液 酵素：フサリアムオキシスポラムリパーゼアルカラーゼ
２．０Ｔ リパーゼ濃度：０；２５０；５００；７５０；３０００
ＬＵ／ タンパク分解濃度：０；０．０６又は０．０１；０．０
２：０．０４；０．０８ＡＵ／ フリリアムオキシスポラムリパーゼを、培養ブロスを遠
心分離した上澄み液の適当量として導入したが、この製
法は例１で説明している。
タンパク分解活性を、アンソン単位／（ＡＵ／）で
測定し次いでノボエンザイムインフォメイションＩＢN
o.０５８ｅ−ＧＢで記載される変性アンソン方法に従っ
て決定する（もとのアンソン方法はJ.Gen.Physiol.,２
２，７９〜８９（１９３９）に記載される）。
洗浄効果は例２５で示したと同様に表される。
表中の記号の意味は例２４で説明したと同じものであ
る。
結果は次の表に示される。
例２７ この例は、公知の脂肪分解洗浄剤添加物に比較し本発明
に係る脂肪分解洗浄剤添加物の優れた洗浄作用を実証す
る。
二セットの洗浄条件を用いた： １：０〜３０００ＬＵ／，EMPA１０１トルグ-O-トメ
ーター：４０℃で２０分間洗剤ALL＋Na2SO4：３．７５
＋１．２５ｇ／，１０°dH，pH＝９．５ ２：０〜３０００ＬＵ／，１０％オリーブ油／綿布ラ
ウンダー-O-メーター：ヨーロッパ式洗浄４０℃ベロー
ルヴアスク（Berol wasc）（非イオン界面活性剤）１．
０ｇ／；ノボ洗剤３．２５ｇ／，１０°dH，pH８．
５／９．５ ３．２５ｇのノボ洗剤はLAS１ｇ，STPP２ｇ，CMC０．０
５ｇ，及びベロールヴアスク０．１ｇから成る。
次の表は、本発明に係る脂肪分解洗剤添加物に比較し別
の従来技術の脂肪分解洗浄添加物に対するΔＲ値として
の洗浄作用を示す。斜線を有する１以上の値は２回の測
定が行われたことを示す。
従来技術の脂肪分解洗浄剤添加物に比較し、フサリアム
オキシスポラムに基づく脂肪分解洗剤添加物の優秀性
は、上記表から明らかである。
例２８ この例は異なったリパーゼ生産フサリアムオキシスポラ
ム菌株由来のリパーゼに関する洗浄特性を説明する。
試験材料は次の方法で汚染されたアクリル系布帛であ
る。
試験溶液：オリーブ油 ３％ 乳化剤 １．５％ アーセンカラー ０．４％ インディアンインク ０．３％ 水 ８７．８％ 溶液をラニイ（Rannie）ホモゲナイザー中で乳化した。
アクリル布帛の小片を、均質化した溶液中に浸漬した。
過剰の汚染物を絞り出し次いで布帛の小片をスピンドラ
イヤー中で３０分間乾燥した。
実験Ｉ プレソーキング：５０mlの希釈発酵ブロス及び５mlの溶
液Ａを含有する溶液中で、５個の見本材料（５×１０c
m）を室温で２時間浸軟させた。溶液Ａ：１０°dH水
（脱イオン水に溶解した0.00603％のMgCl2・6H2O，０．
０１６５％のCaCl2及び０．００３５％のNaHCO3）に溶
解したベロールヴアスク（ノニルフェノールエトキシレ
ート）。
洗浄：見本材料をソーキングした後１０分間濯ぎ次いで
１０°dHの水１．３３ｇTOP／リットルを含有する洗剤
溶液中１０分間３０°でトルグ−Ｏ−トメーター中で洗
浄した。
洗浄終了後、見本材料を１０分間水道水で濯ぎ次いで乾
燥した。
洗浄力をΔＲとして表す。
実験II 上記実験Ｉに類似した手順を、よりリパーゼ生産能力が
あるフサリアムオキシスポラム菌株数種から得られた試
験培養ブロスに対し用いた。
例２９ この例は、ある種のフサリアムオキシスポラム菌株が本
明細書中先に説明された定義に従うリパーゼ生産物であ
るという事実を実証しており、一方他のフサリアムオキ
シスポラム菌株は本明細書中先に説明した定義によるリ
パーゼ生産物でないことを実証している。
リパーゼ生産に対する基質は次の成分（グラム／）か
ら成る： 大豆 ４５ Glucose ７０ KH2PO4 ２ Na2HPO4 ３ 大豆油 ５ 滅菌を１２１℃で４０分間行った。各々１００mlの基質
を有する１１個のエーレンマイヤーフラスコ５００ml
を、１１種のフサリアム種で予め接種した寒天斜面から
の１０７個の胞子を用いて接種した。フラスコを２３０
rpmで且つ３０℃で５日間振とうした。収率を以下に示
す：

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記標準的発酵条件： (1)大豆粉45ｇ／Ｌ、グルコース70ｇ／Ｌ、KH2PO4 ２
    ｇ／Ｌ、Na2HPO4 ３ｇ／Ｌ及び大豆油５ｇ／Ｌを含む
    培地を使用し、 (2)培地を121℃にて40分間殺菌し、 (3)500mlのエルレンマイヤーフラスコ中100mlの前記培
    地に、リパーゼ生産について試験すべき菌株の寒天斜面
    培養物からの胞子を接種し、そして (4)該フラスコを230rpm、30℃にて５日間振とうする； において10LU/mlを超えるリパーゼを生産するフサリア
    ム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)のリパーゼ生
    産菌株により生産されたリパーゼを活性成分とする酵素
    洗剤添加物。
  2. 【請求項２】前記フサリアム・オキシスポラム(Fusariu
    m oxysporum)のリパーゼ生産菌株がDSM2672である、特
    許請求の範囲第１項記載の酵素洗剤添加物。
  3. 【請求項３】前記添加物がノン−ダスティング(non-dus
    ting)粒質物として提供される、特許請求の範囲第１項
    又は第２項記載の酵素洗剤添加物。
  4. 【請求項４】前記添加剤が酵素安定剤を有する液体とし
    て提供される、特許請求の範囲第１項又は第２項記載の
    酵素洗剤添加物。
  5. 【請求項５】前記リパーゼの活性が添加物１ｇ当り約2
    0,000〜約100,000LUである、特許請求の範囲第３項又は
    第４項記載の酵素洗剤添加物。
  6. 【請求項６】前記添加物がリパーゼの外にタンパク分解
    酵素を含有する、特許請求の範囲第１項〜第５項の何れ
    かに記載の酵素洗剤添加物。
  7. 【請求項７】前記タンパク分解酵素活性が添加物１ｇ当
    り約0.5〜約3.0アンソン単位(Anson Units)である、特
    許請求の範囲第６項記載の酵素洗剤添加物。
  8. 【請求項８】下記標準的発酵条件： (1)大豆粉45ｇ／Ｌ、グルコース70ｇ／Ｌ、KH2PO4 ２
    ｇ／Ｌ、Na2HPO4 ３ｇ／Ｌ及び大豆油５ｇ／Ｌを含む
    培地を使用し、 (2)培地を121℃にて40分間殺菌し、 (3)500mlのエルレンマイヤーフラスコ中100mlの前記培
    地に、リパーゼ生産について試験すべき菌株の寒天斜面
    培養物からの胞子を接種し、そして (4)該フラスコを230rpm、30℃にて５日間振とうする； において10LU/mlを超えるリパーゼを生産するフサリア
    ム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)のリパーゼ生
    産株により生産されたリパーゼを活性成分とする酵素洗
    剤添加物を含んで成る洗剤。
  9. 【請求項９】前記洗剤が前記酵素洗剤添加物を0.2〜2.0
    ％ｗ／ｗの量を含有する、特許請求の範囲第８項記載の
    洗剤。
  10. 【請求項１０】下記標準的発酵条件： (1)大豆粉45ｇ／Ｌ、グルコース70ｇ／Ｌ、KH2PO4 ２
    ｇ／Ｌ、Na2HPO4 ３ｇ／Ｌ及び大豆油５ｇ／Ｌを含む
    培地を使用し、 (2)培地を121℃にて40分間殺菌し、 (3)500mlのエルレンマイヤーフラスコ中100mlの前記培
    地に、リパーゼ生産について試験すべき菌株の寒天斜面
    培養物からの胞子を接種し、そして (4)該フラスコを230rpm、30℃にて５日間振とうする； において10LU/mlを超えるリパーゼを生産するフサリア
    ム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)のリパーゼ生
    産株により生産されたリパーゼを活性成分とする酵素洗
    剤添加物を含んで成る洗剤を使用し、７〜11のpH、60℃
    以下の温度で行うことを特徴とする洗浄方法。
  11. 【請求項１１】洗浄溶液が前記洗剤を、洗浄液１リット
    ル当り１〜５ｇの量を含む、特許請求の範囲第10項記載
    の洗浄方法。
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