KR920000589B1 - 효소 세정첨가제 및 그의 제조방법 - Google Patents

효소 세정첨가제 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

효소 세정첨가제 및 그의 제조방법
본 발명은 효소 세정첨가제(酵素 洗淨添加制)에 관한 것이다.
근래 십년간 효소 세정첨가제가 급속히 발전하고 있다. “효소가 세정제로 이용되는 방법”(How Enzymes Got into Detergents”, Vol. 12, Developments in Industrial Microbiology, a publication of the Society for Industrial Microbiology, American Institute of Biological Sciences, Washington, D.C.1971, 저자:Claus Dambmann, Poul Holm, Villy Jensen, 및 Mogens Hilmer Nielsen)의 계재물을 참조한다.
가장 일반적인 효소 세정첨가제는 단백질분해 첨가제이나, 지방분해 세정첨가제도 역시 미국특허 제4,001,116호 제4난 65열-제5난 68열과, 영국특허 제1,293,613호 제2면 6-29열에 기술되어 있다.
세정첨가제로서의 지방분해효소(Lipase)에 대한 포괄적인 연구물은 한스 안드레(Hans Andree)씨등이 저술한 것으로 “응용 생화학지”(Journal of Applied Biochemistry, 2, 218-229, 1980)에서 “세정제 성분으로서의 지방분해효소”(Lipases as Detergent Components)라는 제목으로 발표된 바 있다.
세척공정이 높은 온도와 높은 알칼리도에서 수행되면 지방분을 함유하는 때는 검화작용에 의하여 용해된다. 그러나 에너지 위치에 따라 저온 세척공정(약 60℃ 이하)이 일반적으로 바람직하며, 이와 같은 저온에서 공지된 지방분해효소는 지방함유때의 일부만을 용해시킬 수 있다.
지방분해효소 세정첨가제의 효율은 EMPA(Eidgen
Figure kpo00001
sische Materialpruf
Figure kpo00002
gsund Versuchsanstalt, St. Gallen, Switzerland)방법, 표본번호 101(올리브유/면)과 102(올리브유/모)에 의하여, 영국특허 제1,361,386호(특히 4면과 7면)과 미국특허 제3,723,250호(특히 col. 15-19)를 적용함으로써 측정할 수 있다. 이러한 방법으로 측정한 결과, 지방분해 세정첨가제로서 알려진 효소는, 세척용액내에서의 경제적으로 합리적인 지방분해효소 활성에서 미분송환치(differential remittance value) △R의 값이 낮다는 것으로부터 반영되는 바와 같이, 이들은 만족스럽지 못한 지방분해 정화효율을 나타낸다는 의미에서 대단히 불만스러운 것이라고 생각된다.
따라서 세척용액내에서 경제적으로 합리적인 지방분해효소 활성에서의 상당히 높은 미분송환치에 상응하는 상당히 양호한 지방분해 정화효율을 나타내는 지방분해 세정첨가제의 수요가 있어 왔다.
본 발명의 제1특징에 따르면, 지방분해 세정첨가제가 발견되었으며, 이것은 세척용액내의 경제적으로 합리적인 지방분해효소 활성에서 상당히 높은 미분송환치, △R에 상응하는, 상당히 양호한 지방분해 정화효율을 나타내고, 이 지방분해 세정첨가제는 지방분해효소가 푸자리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum)의 지방분해효소 생성균주에 의하여 생성된다는 특징을 갖는다.
푸자리움 옥시스포럼 종의 정의는 지난 10년간 어느 정도 변하였다. 그러나 본 발명의 목적을 위하여는 푸자리움 옥시스포럼 종의 정의는 “푸자리움 속” “The Genus Fusarium”, C. Booth, CMT, 1971)에 기술된 정의이다.
푸자리움 옥시스포럼의 특정균주에 관련하여 지방분해효소의 형성이 기술된 문헌이 있다[Agric. Biol. chem. 43(10)(1979), 2126, 표 1을 참조 여기에는 푸자리움 리니 지방분해효소 지적되어 있다(상기한 푸자리움 옥시스포럼의 정의에 따라 푸자리움 리니는 푸자리움 옥시스포럼에 속한다), Indian Journal of Experimental Biology, Vol. 11(1973), p37-39의 논제 “Fusarium vasinfectum” 균주에 있어서의 지질과 지방분해효소 활성”을 참조(상기한 푸자리움 옥시스포럼의 정의에 따라 Fusarium vasinfectum은 푸자리움 옥시스포럼에 속한다).]
푸자리움 옥시스포럼에 속하는 몇몇의 균주는 지방분해효소 생성체로서는 빈약하다. 본 발명의 목적을 위하여는 푸자리움 옥시스포럼 지방분해효소 생성균주를, 다음과 같은 조건하에서 10LU/ml(LU는 다음의 본 명세서에서 정의하는 지방분해효소 단위이다) 이상을 생성하는 균주로서 정의된다.
플래스크를 진동할 수매질(受昧質)은 g/ℓ로 나타낸 다음 성분으로 제조된다.
Figure kpo00003
살균은 121℃에서 40분간 수행된다. 100ml의 수매제를 넣은 500ml 엘렌마이어 플래스크를, 지방분해효소 생성을 시험하기 위하여 푸자리움 옥시스포럼 균주로 미리 접종해 놓은 한천 상징액(上澄液)으로부터 나온 포자로 접종시켰다. 이 플래스크를 230rpm으로 30℃에서 5일간 진동시킨 다음 지방분해효소 수율을 측정하였다. 실시예 29를 참조한다.
이와 같이하여 이외에도 본 발명의 세정첨가제는 대단히 증진된 지방분해 정화효율을 나타내었고, 이것은 다음에 본 명세서에서 나타낸 문헌으로부터 명확하게 될 것이다.
푸자리움 옥시스포럼 균주 DSM 2672, ATCC 7808, CBS 620.72, CBS 645.78 및 CBS 794.70에 관하여는, pH 활성 최적치의 평균값이 약 9-11이고, 활성 최적치의 평균온도는 약 35-50℃(분석시간 20분)라는 것이 발견되었다. DSM 2672로부터 나온 지방분해효소로부터 생성된 항체와 더불어 교차면역전기영동법(crossed immunoelectrophoresis)을 근거로 하건데, 상기 5종의 균주로부터 생성되는 지방분해효소는 동일하거나 부분적으로 동일하다는 것이 나타났다. 상기한 발견을 근거로 하면, 본 발명에 따르는 효소 세정첨가제는 긴밀히 연관된 지방분해효소의 일군이라는 결론을 얻을 수 있다.
지방분해효소 활성은 지방분해효소 활성 측정에 대한 노보법(NOVO method)에 따라 측정한다. 이 방법은 효소에 의한 트리부티린의 가수분해를 근거로 한 것이다. 유리된 부티르산을 NaOH로 적정하여 측정한다. 1노보 지방분해효소 단위(LU)는 pH가 일정한 다음과 같은 표준조건하에서 매분 1μmol의 NaOH에 상당하는 적정가능한 부티르산을 유리시키는 효소의 양이다.
Figure kpo00004
이 방법의 더욱 상세한 점은 1982. 8. 18일자 AF 95.4 인쇄물에 기술되어 있고, 이 인쇄물은 노보(NOVO Industri A/S, Bagsvaerd, Denmark)에 청하면 구입할 수 있다.
본 발명에 따르는 효소 세정첨가제의 특히 바람직한 구체예에서는 푸자리움 옥시스포럼의 지방분해효소 생성균주가 DSM 2672이다. 균주 푸자리움 종 DSM 2672는 푸자리움 옥시스포럼 슐레크트(Schlecht. ex Fries, emend. Snyder ＆amp; Hansen)로서 분류되었다. 균주 DSM 2672 푸자리움 옥시스포럼의 형태학적 성질을 푸자리움 속(C.Booth, CMI, 1971)에 있는 푸자리움 옥시스포럼의 종에 대한 상세점에 정확히 상응한다. 지방분해효소의 pH 활성곡선을 그렸으며, 지방분해효소 활성은 AF 95/4-GB에 따라 측정하였고, 수매제의 pH값을 정규 pH값인 7이외에 4, 5 및 6과 8, 9 및 10까지 조정함으로써 변조시켰다. 고온에서는 지방분해효소가 없어도 트리부티린이 분해한다는 사실에 따라, pH 곡선을 이와같은 자체분해에 대하여 보정하였다. 이에 의하여 활성 최적치의 pH가 약 10이라는 것이 발견되었다. 효소의 안정성은 광범위한 pH간격에 걸쳐서 우수하여서, 18시간후에 80% 이상의 잔유활성을 5℃에서 4.5-11의 pH 간격과, 25℃에서 5-10의 pH 간격에서도 관찰할 수 있을 정도이다. 또한 지방분해효소 활성의 최적온도는 약 40℃이다. 효소는 40℃까지에서는 30분간 안정하며, 이점은 약 60℃ 이하에서의 전술한 저온세척에 관련하여 보면 대단히 유리한 점이다.
본 발명에 따르는 효소 세정첨가제의 특히 바람직한 구체예에서, 본 첨가제는 비-분진(非지-粉唇) 과립으로서 제공된다. 이들 과립은 여러가지 다른 방법으로 제조될 수 있다. 영국특허 제1,362,365호를 참조할 수 있으며, 이 특허는 압출기와 스페로나이저(spheronizer, MARUMERIZER
Figure kpo00005
로서 판매된다)로 구성되는 장치에 의하여 세정첨가제로서 사용되는 효소-함유 입자의 제조를 기재하고 있고, 드럼 조립기(granulator)에 의하여 세정첨가제로 사용되는 효소함유과립의 제조를 기술하고 있는 미국특허 제4,106,991호를 참조할 수도 있다.
본 발명에 따르는 효소 세정첨가제의 특히 바람직한 구체예에 있어서, 본 첨가제는 효소안정제를 포함하는 액체로서 공급된다. 안정제는 푸로필렌 글리콜이나 기타 효소용액에 대한 안정제로서 공지된 기타 제제일 수 있다. 액상의 세정제는 사용 용이성 때문에 점증하는 인기를 누리고 있다.
본 발명 효소 세정첨가제의 특히 바람직한 구체예에서 지방분해효소 활성은 20,000 내지 100,000LU/첨가제 1g이다. 이와 같은 방법으로, 통상의 지방분해효소 활성은 세정첨가제가 0.2-2g/세정제 100g의 양으로 세정제에 가해지는 경우와, 세정제가 1-5g의 세정제/세척용액 1ℓ의 양으로 세척용액에 가해지는 경우에 세척용액에서 발생된다.
본 발명 효소 세정첨가제의 특히 바람직한 구체예에서 본 첨가제는 지방분해효소 이외에 단백질 분해효소를 함유한다. 이외에도, 단백질분해 세정첨가제는 첨가제나 세정제나 또는 세척액내에서나(단백질) 지방분해효소를 파괴시키지 않는다는 것을 발견되었다. 따라서 단백질분해 및 지방분해 세정첨가제는 혼화성이며, 이 세정첨가제는 대단히 높은 세정효율을 갖고 있어서 높은 △R 값을 얻을 수 있게 된다. 바실루스 리케니포르미스에 의하여 미생물학적으로 제조된 노보(NOVO INDUSTRI A/S)로부터 얻게 되는 단백질분해효소 알칼라제(ALCALASE
Figure kpo00006
)을 사용하면 우수한 결과를 얻을 수 있다. 혼합요소 첨가제는 미리 제조된 단백질분해효소 과립을 미리 제조된 지방분해효소 과립과 혼합시키거나, 또는 단백질분해효소 농축물을 지방분해효소의 농축물과 혼합한 다음 이 혼합물을 조립장치에 일반적인 조립보조제와 함께 도입시킴으로써 제조할 수 있다.
본 발명 효소 세정첨가제의 특히 바람직한 구체예에서 단백질분해 활성은 약 0.5 내지 3.0앤슨(Anson) 단위/첨가제 1g이다. 이와 같은 방법으로, 통상의 단백질분해 활성은, 세정첨가제가 0.2-2g/100g의 세정제의 양으로 세정제에 가해지는 경우와, 세정제가 1-5g의 세정제/세척용액 1ℓ의 양으로 세척용액에 가해지는 경우에, 세척용액내에서 발생된다.
본 발명의 제2특징은 효소 세정첨가제를 포함한 세정제를 제공하는 것이며, 상기 첨가제의 활성성분은 미생물학적으로 생성된 지방분해효소로서, 이때 효소 세정첨가제는 본 발명에 따르는 효소 세정첨가제이다.
본 발명의 효소 세정첨가제의 특히 바람직한 구체예에서, 본 세정제는 본 발명의 효소 세정첨가제를 0.2 내지 2.0%w/w의 양으로 포함한다. 이와 같은 방법으로 효소작용과 기타 세정제 성분의 작용사이에 합리적인 평형이 이루어진다.
본 발명의 제3의 특징은 세척방법이 제공된다는 것이며, 이때 사용되는 세정제는 본 발명에 따르는 세정제이고, 여기에서 pH는 7 내지 11이고, 온도는 60℃ 이하이다.
본 발명 효소 세정첨가제의 특히 바람직한 구체예에 있어서, 세척용액은 본 발명의 세정제를 1 내지 5g/세척용액 1ℓ의 양으로 함유한다. 이와 같은 방법으로, 통상의 효소활성이 세척용액내에서, 즉 대체로 1,000 내지 5,000LU/세척용액 1ℓ로 세척용액내에 이루어진다. 이와 같은 조건하에 대단히 높은 △R 값이 통상적인 세척시간, 즉 약 20분 동안에 얻어진다.
본 발명을 다음 실시예에 의하여 설명하고져 한다.
[실시예 1]
이 실시예는 본 발명에 따르는 효소 세정첨가제의 활성성분을 진동 플래스크내에서 제조하는 것을 설명하는 것이다. 수매제는 g/ℓ로 표시된 다음의 성분으로 구성된다.
Figure kpo00007
살균은 40분간 121℃에서 수행하였다.
100ml의 수매제를 함유한 500ml 엘렌마이어 플래스크를 푸자리움 옥시스포럼으로 미리 접종시킨 한천 상징액으로부터 얻은 107개의 포자로 접종시켰다. 이 플래스크를 230rpm으로 25 내지 30℃에서 2-5일간 진동시켰다. 수율은 30-80LU/ml었다.
[실시예 2]
이 실시예와 실시예 3-15는 2ℓ의 실험실 발효기내에서 본 발명 효소 세정첨가제의 활성성분을 제조하는 것을 설명하는 것이다.
다음 성분 260ml를 함유하는 500ml 엘렌마이어 플래스크를 준비하였다.
Figure kpo00008
Figure kpo00009
살균은 121℃에서 40분동안 수행되었다.
실시예 1에서 지시한 바와 동일한 방법으로 한천 상징액으로부터 나온 포자로 접종시킨 후 플래스크를 230rpm으로 30℃에서 2일간 교반하였다. 이 종자배양액 120ml를 121℃에서 1시간동안 살균한 1.3ℓ의 매제와 다음 성분을 함유하는 2ℓ 발효기에 옮겼다.
Figure kpo00010
접종후에 공기통과(700ml/분)를 시작하였다. 교반도 역시 개시하고, 그의 속도는 처음 24시간동안은 600rpm으로 하고, 그후는 800rpm으로 증가시켰다. 온도를 30℃에 유지시키고, 발효는 100시간동안 계속하였으며, 이 동안 pH값은 6.3에서 8.5로 상승하였다. 상징액을 분석하였으며, 지방분해효소 활성은 90LU/ml로 판명되었다.
다음 표에 나타낸 온도를 제외하고는 실시예 2에서 지시한 방법으로 일련의 실험을 수행하였다.
Figure kpo00011
위이 표로부터 최적온도는 약 34℃인 것으로 나타났다.
pH의 영향을 조사하기 위하여 pH를 제외한 실시예 6에서 지적한 대로 34℃에서 새로운 두 실험을 수행하였고; 발효기내에서 발효시키는 처음 24시간동안은 두 실험중 아무 실험에서도 pH를 조절하지 않았으며; 제1실험(실시예 8)에서 pH는 발효기내에서 처음 25시간 발효후 H3PO4에 의하여 6.5로 유지하였으며, 제2실험(실시예 9)에서 pH는 전체 발효기간동안 감시하지 않았다. 그 결과는 다음 표로부터 알 수 있다.
Figure kpo00012
위의 표로부터 알 수 있는 바와 같이 지방분해효소 수율은 pH값을 지시된 방법으로 감시함으로써 증진된다.
교반정도의 영향을 조사하기 위하여 교반정도를 제외하고 실시예 8에서와 동일한 방법으로 3종의 실험을 수행하였으며; 교반기의 속도를 다음 표와 같이 처음의 발효 24시간후 전체 발효기간중 600rpm으로부터 상이한 수준으로 상승시켰다. 그 결과는 다음 표와 같다.
Figure kpo00013
위의 표로부터 알 수 있는 바와 같이, 최적 교반정도는 약 800rpm이다.
발효매제내의 대두유의 농도영향을 조사하기 위하여 실시예 11(즉 온도, pH 및 교반정도)에 지시한 방법으로 3종의 실험을 다음 표의 대두유 농도를 제외하고 수행하였다.
Figure kpo00014
[실시예 16]
이 실시예는 시험공장 발효기내에서 본 발명의 효소 세정첨가제를 활성성분을 제조하는 것을 설명하는 것이다.
300ℓ의 용적을 갖는 접종탱크내에서 다음의 매제를 제조하였다.
Figure kpo00015
매제는 121℃에서 1시간동안 살균하였다. 7.2kg의 글루코오즈와 7.2g의 구연산을 함유하는 12ℓ 용액을 121℃에서 1/2시간 살균하여 옥수수 침지액 혼합물을 가한다. 30℃까지 냉각후 효모 추출물, 인산염, 막네슘, 글루코오즈 및 한천을 함유하는 페른바크 플래스크로부터 나온 DSM 2672포자로 접종시키고, 이것을 30℃에서 7일간 배양하였다. 공기통과(300ℓ/분)를 즉시 시작하고 20시간후에 교반(250rpm)을 개시하였다. 온도를 30℃에 유지시키고, 29시간동안 생장을 계속시켰다. 이 종자 배양액 30ℓ를 다음을 함유하는 주배양기에 옮겼다.
Figure kpo00016
이 매제를 1시간동안 121℃에서 살균하였다. 25ℓ의 물에 녹인 15kg의 글루코오즈와 15g의 구연산을 별도로 121℃에서 30분간 살균하여 대두분 혼합물에 가하였다.
접종후 공기통과(300ℓ/분)를 시작하였다. 교반도 역시 시작하고, 그의 속력은 발효의 처음 10시간동안 400rpm으로 증가시켰다. 온도는 34℃로 유지하였다. 발효를 60시간동안 계속하고, 이 동안 pH값은 6.68에서 8까지 상승하였으며, 그후 탱크를 냉각시키고, 균사체는 원심분리로 분리시켰다. 상징액을 분석한 결과 지방분해효소 활성은 90LU/ml로 판명되었다.
[실시예 17]
이 실시예는 시험공장 발효기내에서 본 발명 효소 세정첨가제의 활성성분을 제조하는 것을 설명하는 것이다.
이 지방분해효소는 푸자리움 옥시스포럼 DSM 2672의 침지 통기발효에 의하여 제조하였다.
페른바크 플래스크내에서 다음 조성을 갖는 한천 수매제를 제조하였다.
Figure kpo00017
이 혼합물을 40분간 120℃에서 오오토클레이빙하였다.(수매제의 명칭은 YPG-한천이다)
균주 DSM 2672는 30℃에서 일주일간 YPG-한천 상징액상에서 배양하였다. 상징액으로부터 나온 포자를 살균한 탈지우유에 현탁시키고, 현탁액은 작은 유리병에 넣어 동결 건조시켰다. 동결 건조된 유리병 하나의 내용물을 페른바크 플래스크에 옮겼다. 다음에 이 플래스크를 30℃에서 일주일간 배양하였다. 500ℓ의 종자 발효기내에서 다음 조성을 갖는 수매제를 제조하였다.
Figure kpo00018
수돗물을 전체용적이 약 240ℓ될 때까지 가하였다. CaCO3를 가하기전 pH를 5.5로 조정하였다. 수매제는 종자 발효기내에서 1시간동안 121℃에서 살균하였다. 접종전 최종용적은 약 300ℓ이었다.
페른바크 플래스크 포자 현탁액은 종자 발효기에 옮겼다. 종자 발효조건은 다음과 같았다.
발효기 형태:높이/직경 비율이 약 2인 통상의 통기, 교반 발효기.
교반:300rpm(2터어빈 추진기)
공기통과:300표준상태의 공기 ℓ/분
온도:30℃
압력:0.5ato
시간:약 17시간
과량의 포말을 방지하기 위하여 교반과 공기통과속도의 감소가 가능하였다. 그러나 여기에서 기술한 종자발효에서는 이와 같은 가능성을 이용하지 않았다. 1/2-일후 생장이 잘 되었을 때 즉 접종후 약 17시간 될 때 25ℓ를 종자 발효기로부터 주 발효기로 옮겼다.
다음의 조성을 갖는 수매제를 500ℓ의 주 발효기내에서 제조하였다.
Figure kpo00019
수돗물을 약 205ℓ 총 용적이 될때까지 가하였다. 대두분을 물에 현탁시켰다. pH를 Na2CO3로 8.0까지 조정하고, 온도를 50℃까지 상승시켰다. 그후 약 480앤슨단위의 알칼라제
Figure kpo00020
L(4LU/ml)을 현탁액에 가하였다. 이 혼합물을 4시간동안 50℃에서 pH=8.0(Na2CO3첨가)으로 공기통과를 시키지 않고, 0의 ato와 150-200rpm 교반하에 유지시켰다. 다음 잔유 수매제 성분을 가하고, pH는 인산으로 약 6.5로 조정하였다. 수매제는 1시간동안 121℃에서 주 발효기내에서 증기살균하였다. 34℃까지 냉각후 살균된 Na2CO3용액(전체용액 20ℓ 내의 Na2CO33kg)으로 pH를 약 6.0으로 조정하였다.
접종전 최종용적은 약 280ℓ이었다.
다음에 종자배양액 25ℓ를 가하였다.
발효조건은 다음과 같다.
발효기 형태:높이/직경 비율이 약 2인 통상의 통기, 교반 발효기.
교반:150rpm(0-6시간) 및 400rpm(6시간-완료까지)(2터어빈 추진기)
공기통과:200-250표준상태의 공기 ℓ/분(0-22시간)과 300표준상태의 공기 ℓ/분(22시간-완료까지)
온도:34℃
압력:1.0ato(0-34시간) 및 0.5ato(34시간-완료까지)
시간:약 112시간
과량의 포말을 방지하기 위하여 교반과 공기통과와 압력을 변화시킬 수 있었다. 여기에서 기술된 발효에서는 위에 보인 실측치로부터 알 수 있는 바와 같이 이와 같은 가능성은 이용하지 않았다. 발효 pH는 인산용액을 가하여 약 6.5로 유지하였다. 본 실시예에서 기술한 발효에서는 혼합이 약 30시간의 발효부터 완료까지 수행되었다.
다음과 같은 500ℓ의 혼합탱크내에서 인산용액을 제조하였다:즉 20kg의 농인산(80%)에 수돗물을 가하여 전체용적이 약 160ℓ되게 하였다.
이 용액을 1시간동안 121℃로 혼합탱크내에서 증기-살균하였다. 혼합 시작전의 최종용적은 약 200ℓ이었다. 발효 pH를 약 6.5로 유지하는데 요구되는 양만의 인산 용액을 주 발효기에 가하였다. 발효중 살균된 포말방지제 P2000(폴리푸로필렌 글리콜)을 주 발효기에 가하여 포말형성을 감소시켰다. 이 발효에서는 3.5ℓ의 P2000이 사용되었다. 약 112의 발효시간 후 발효공정을 중단하였다. 주 발효기는 약 315ℓ의 배양액을 함유하였고, 얻어진 지방분해효소 수율은 트리부티린을 수매제로 사용하여 노보의 LU-분석 No 95/5-GB에 따라 측정했을 때 배양액 g당 약 200LU이었다.
[실시예 18]
지방분해효소는 실시예 17에 기술한 바와 같이 제조하였으나 발효는 상응하는 다량의 수매제를 사용하여 2500ℓ의 주 발효기내에서 수행하였다.
교반:250rpm(2터어빈 추진기)
과량의 포말을 방지하기 위하여 공기통과와 압력을 다음과 같이 변화시켰다.
공기통과:750Nl/분의 공기(0-13시간)
1200Nl/분의 공기(13-37시간)
1500Nl/분의 공기(37시간-완료까지)
압력:0.7ato(0-25시간)
0.5ato(25시간-완료까지)
포말방지제 P2000은 이 발효에서 가하지 않았다. 발효완료때에 발효기는 약 1800ℓ의 발효액을 함유하였고, 얻어진 지방분해효소 수율은 배양액 g당 약 125LU이었다.
[실시예 19]
지방분해효소는 실시예 17에 기술한 바와 같이 제조하였으나, 발효는 상응하는 다량의 수매제를 사용하여 2500ℓ의 주 발효기내에서 수행하였고, 대두분의 알칼라제 처리는 생략하였다. 200kg의 대두분을 사용하였고, 접종전의 용적은 1400ℓ이었다. 수매제의 증가-살균은 주 발효기내에서 1.5시간 동안 123℃로 수행하였다.
교반:250rpm(2터어빈 추진기)
과량의 포말을 방지하기 위하여 공기통과와 압력을 다음과 같이 변화시켰다.
공기통과:750Nl/분의 공기(0-3시간)
900Nl/분의 공기(3-11시간)
1100Nl/분의 공기(11-24시간)
1300Nl/분의 공기(24-27시간)
1500Nl/분의 공기(27시간-완료까지)
압력:1.0ato(0-27시간)
0.7ato(27-40시간)
0.5ato(40시간-완료까지)
본 발효에서는 포말방지제 P2000을 가하지 않았다. 발효완료때 발효기는 약 1400ℓ의 배양액을 함유하였고, 얻어진 지방분해효소 수율은 배양액 g당 198LU이었다. 발효시간은 약 140시간이었다.
[실시예 20]
지방분해효소는 실시예 17에 기술한 바와 같이 제조하였으나, 발효는 상응하는 다량의 수매제를 사용하여 2500ℓ의 주 발효기내에서 수행하였고, 대두분의 알칼라제 처리는 생략하였다. 170kg의 대두분을 사용하였고, 접종전의 용적은 400ℓ이었다. 수매제는 주 발효기내에서 1.5시간 동안 123℃로 증기-살균하였다.
교반:250rpm(2개의 터어빈 추진기)
과량의 포말을 방지하기 위하여 공기통과와 압력을 다음과 같이 변화시켰다.
공기통과:750Nl/분의 공기(0-11시간)
1150Nl/분의 공기(11-19시간)
1300Nl/분의 공기(19-27시간)
1500Nl/분의 공기(27시간-완료까지)
압력:1.0ato(0-27시간)
0.5ato(27시간-완료까지)
본 발효에서는 0.5ℓ의 포말방지제 P2000을 사용하였다. 발효완료때 발효기는 약 1400ℓ의 발효액을 함유하였고, 얻어진 지방분해효소 수율은 배양액 g당 약 221LU이었다. 발효시간은 약 144시간이었다.
[실시예 21]
지방분해효소는 실시예 17에 기술한 바와 같이 제조하였으나, 주 발효기 수매제내의 대부분 농도는 5%까지 강하시켰고, 대부분의 알칼라제 처리는 생략하였다. 과량의 포말을 방지하기 위하여 교반은 다음과 같이 변화시켰다.
교반:0rpm(0-22시간)
100-150rpm(22-33시간)
300rpm(33시간-완료까지)
이 발효에서는 포말방지제 P2000을 가하지 않았다. 발효완료시 발효기는 약 310ℓ의 배양액을 함유하였고, 얻어진 지방분해효소 수율은 배양액 g당 약 146LU이었다.
[실시예 22]
지방분해효소는 실시예 17에 기술한 바와 같이 제조하였으나, 주 발효기 수매제내의 대두분 농도는 5%까지 감소시켰고, 알칼라제 처리는 생략하였고, 대두유는 최초 발효매제로부터 제거시켰고, 대신에 살균된 대두유를 발효 48,60,72 및 84시간때 주 발효기에 1ℓ씩 가하여 총 4ℓ의 대두유를 가하였다.
과량의 포말을 방지하기 위하여, 교반, 공기통과 및 압력을 다음과 같이 변화시켰다.
교반:200-300rpm(0-24시간)
400rpm(24시간-완료까지)
공기통과:150Nl/분의 공기(0-17시간)
275Nl/분의 공기(17-25시간)
300Nl/분의 공기(25-완료까지)
압력:0.9-1.0ato(0-33시간)
0.5ato(33-완료까지)
이 발효에서는 2ℓ의 포말방지제 P2000을 사용하였다. 발효완료때에 발효기는 약 285ℓ의 배양액을 함유하였고, 얻어진 지방분해효소 수율은 배양액 g당 약 113LU이었다.
[실시예 23]
실시예 19로부터 얻은 배양액을 수산화나트륨으로 8.0까지 조정하고, 1% 염화칼슘, 1% 세르바민(Servamine) KZA 346(Servo), 0.03% 슈퍼플록(Superfloc) A-130(American Cyanamid) 및 0.5% 트리톤(Triton) X-100(Rohm and Haas)에 의하여 응결시켰다.
응결된 배양액은 원판 원심분리기(Westfalia SAMS)상에서 원심분리하였다.
원심분리액은 아세트산으로 pH 4.5로 조정하였다. 이와 같은 pH에서 침전이 형성되었다. 침전물은 원심분리(Westfalia SAMS)에 의하여 상등액으로부터 분리시킨 다음 트리톤 X-100으로 처리하였다. 다음에 처리된 침전을 물로 희석하고 또다시 원심분리하였다.
2회 원심분리한 것으로부터 나온 원심분리액을 혼합하고, 2회째의 원심분리단계로부터 나온 침전은 폐기하였다.
원심분리액을 다이어여과(diafilter)(DDS-module GR60P membranes)하고, 다음에 초여과, 농축시켰다.
UF-농축물을 여과보조제인 하이-플로-슈퍼셀(Hy-flo-supercell)(Johns Manville)을 사용하여 폴리루로필렌상에서 여과하였다. 다음에 여액은 수산화나트륨으로 pH 8.0으로 조정하고, 슈프라(Supra) 100여과지(Seitz)상에서 여과하고, 맨 마지막으로 슈프라 EKS(Seitz)상에서 세균-여과하였다.
세균여과액을 동일한 양의 아세톤으로 침전시키고, 순수한 아세톤으로 세척하였다. 침전을 진공실에서 건조시켰다. 얻어진 건조 농축물은 약 90,000LU/g의 활성을 갖고 있었다.
[실시예 24]
다른 지방분해효소와 비교된 푸자리움 옥시스포럼 지방분해효소의 세척효율
시험물질:EMPA 101(올리브유/면)
세정용액:세정제*), 5g/ℓ, 10°dH물
세척기:TERG-O-TOMETER
세척계획:40℃에서 20분간
견본직물의 수:9/900ml 세척용액
지방분해효소:푸자리움 옥시스포럼 지방분해효소
Asp.niger, AMANO AP6; Candida
cylindracea, Sigma; Mucor miehei, SP225
지방분해효소 농도:0, 750, 1500, 2250, 3000LU/ℓ
푸자리움 옥시스포럼 지방분해효소 활성단위는, 실시예 1에 그의 제법을 기술한 배양액을 원심분리하여 얻은 적당량의 상징액으로써 도입시킨 것이다.
세척효율은 엘레포(Elrepho)광도계, 여과 R46으로, 9개 견본직물에 대하여 평균 2회 측정하여 R=경감치(Remission value)로서 표시하였다.
*)세정제 A는 다음의 조성을 갖는다.
Figure kpo00021
표에서 그 결과는 R과 △R=R-R0로서 나타나 있으며, 이때 R0는 지방분해효소가 없는 견본의 경감치이고, R은 지방분해효소로 세척한 견본의 경감치이다.
Figure kpo00022
[실시예 25]
면 이외의 다른 직물에 대한 지방분해 효과를 나타내기 위하여, 폴리에스테르/면과 아크릴에 대하여서도 시험물질을 만들었다.
시험오염:10% 올리브유
1.5% 유화제
0.4% 토양색
0.3% 인디안 잉크
87.8% 물
이 용액을 래니(Rannie) 균질화기에서 유화시켰다. 면, 폴리에스테르/면 및 아크릴 조각을 균질화된 용액에 담갔다. 과량의 얼룩은 짜내어 버리고, 천조각을 30분간 회전건조기상에서 건조시켰다.
세척조건
시험물질: 올리브유:Ⅰ 면에 대하여
Ⅱ 폴리에스케르/면에 대하여
Ⅲ 아크릴에 대하여
세정액:세정제 B**), 3.25g/ℓ, 10℃dH물
세정제 C***), 1g/ℓ, 10℃dH물
세척기:Launder-O-Meter
세척계획:15℃로부터 40℃까지 가열, 가열시간 37분, 40℃에서 12분간 세척
직물견본의 수:3/300ml 세척용액
지방분해효소:푸자리움 옥시스포럼 지방분해효소
Mucor miehei, SP 225
C. cylindracea, Sigma
Pancreatic 지방분해효소, Sigma
지방분해효소:다양함
푸자리움 옥시스포럼 지방분해효소 단위는 다음과 같은 방법으로 제조된, 동결건조 분말의 적당량으로써 도입시켰다. 1ℓ의 실험실 플래스크에서의 발효는 실시예 1에서 지적한 것과 유사한 방법으로 수행하였다. 배양액은 원심분리하고, 초여과로 농축시켜서 냉동건조시켰다.
*)세정제 B는 다음의 조성을 갖는다.
Figure kpo00023
***) 세정제 C는 100% 노닐 페놀 에톡실레이트, EO=12(비이온성 계면활성제)이다.
세척효율은 엘레포 광도계, 여과기 R 46으로, 3개 견본에 대하여 평균 2회 측정한 R=경감치로서 나타내었다. 표에서 R0와 △R은 실시예 24에서 지적한 것과 동일한 의미를 갖는다.
Figure kpo00024
Mucor miehei 지방분해효소
Figure kpo00025
C. cylindracea, pancreatic 지방분해효소 시험물질:면
Figure kpo00026
[실시예 26]
이 실시예는 본 발명에 따르는 효소 세정첨가제내에서의 단백질분해효소와 지방분해효소의 혼화성을 나타내는 것이다. 시험물질은 실시예 25에서 나타낸 것과 같이 오염시킨 면이었다.
세척조건
시험물질:위에서와 같이 오염된 면
세정용액:세정제 B 3.25g/ℓ, 10℃dH 물
세정제 C 1.0g/ℓ, 10℃dH 물
세척기:Launder-O-미터
세척계획:15℃부터 45℃까지 가열, 가열시간 37분, 40℃에서 12분간 세척
견본 직물의 수:3/300ml 세척용액
효소:푸자리움 옥시스포럼 지방분해효소
알칼라제 2.0T
지방분해효소 농도:0; 250; 500; 750; 3000LU/ℓ
단백질분해효소농도:0; 0.06 또는 0.01; 0.02; 0.04; 0.08AU/ℓ
푸자리움 옥시스포럼 지방분해효소 단위는 실시예 1에서 그의 제조를 기술한 배양액을 원심분리하여 얻는 상징액의 적당한 용량으로서 도입시켰다.
단백질분해 활성은 앤슨단위/ℓ(AU/ℓ)로 측정하였고, 노보(NOVO ENZYME INFORMATION 1B No. 058 e-GB)에 기술된 변조된 앤슨방법에 따라 측정하였다(원래의 앤슨방법은 J.Gen.Physiol., 22, 79-89, 1939에 기술되어 있다). 세척효율은 실시예 25에 지시된대로 나타내었다. 표에 나타난 기호의 의미는 실시예 24에 지시된 것과 동일하다.
그 결과는 다음 표에 나타낸 것과 같다.
Figure kpo00027
[실시예 27]
이 실시예는 공지된 지방분해 세정첨가제의 우수한 세척 특성을 나타내는 것이다. 2종류의 세척조건을 이용하였다.
1: 0:3000LU/ℓ, EMPA 101
Terg-O-tometer:40℃에서 20분간
세정제 ALL+Na2SO4:3.75±1.25g/ℓ, 10°dH, pH=9.5
2: 0:3000LU/ℓ, 10% 올리브유/면
Launder-O-미이터:유우식 세척 40℃
Berol wasc(비이온성 tenside) 1.0g/ℓ; 노보 세정제 3.25g/ℓ, 10°dH, pH 8.5/9.5
3.25g의 노보 세정제는 1g의 LAS와 2g의 STPP와 0.05g의 CMC와 0.1g Berol wasc로 구성된다. 다음 표는 본 발명의 지방분해 세정첨가제에 비교하여, 여러가지 종래 지방분해 세정첨가제에 대한 △R값으로서의 세척효과를 나타내는 것이다. 슬랫쉬를 동반한 두값으로 나타낸 것은 2회의 측정이 이루어진 것을 나타낸다.
Figure kpo00028
표로부터 알수 있는 바와 같이, 푸자리움 옥시스포럼을 기본으로 하는 지방분해 세정첨가제는 종래의 지방분해 세정첨가제에 비하여 우수하였다.
[실시예 28]
본 실시예는 여러가지 지방분해효소 생성 푸자리움 옥시스포럼 균주로부터 나온 지방분해효소의 세척특성을 나타내는 것이다. 시험물질은 다음과 같은 방법으로 오염시킨 아크릴섬유 이었다.
시험오염:3% 올리브유
1.5% 유탁제
0.4% 토양색
0.3% 인디안 잉크
87.8% 물
이 용액을 래니 균질화기에서 유화시켰다.
아크릴 섬유를 상기 균질용액에 담갔다. 과량의 얼룩은 짜내어 버리고, 천조각을 회전건조기에서 30분간 건조시켰다.
[실험 Ⅰ]
예비침적:5개의 견본직물(5×10cm)을 50ml의 희석 발효액과 5ml의 용액 A를 함유하는 용액에 실온에서 2시간 동안 담가 놓았다.
용액 A:Berol wasc(노닐 페놀 에톡실레이트)를 10°dH 물에 녹인 것(0.00603% MgCl2·6H2O 0.0165% CaCl2및 0.035% NaHCO3을 탈이온수에 녹인 것)
세척:견본직물은 적신 후에 10분간 헤우고, 1.33g TOP.10°dH의 물 1ℓ를 함유하는 세정용액에 10분간 30℃에서 Terg-O-trmeter내에서 세척하였다.
세척이 끝난 다음 견본직물을 수돗물에서 10분간 헤우고 건조시켰다.
세정성은 △R로서 표시한다.
Figure kpo00029
[실험 Ⅱ]
상기한 것과 유사한 과정(실험 Ⅰ)을 이용하여 몇종의 지방분해효소 생성 푸자리움 옥시스포럼 균주로부터 나온 배양액을 시험하였다.
Figure kpo00030
[실시예 29]
이 실시예는 몇종의 푸자리움 옥시스포럼 균주가 본 명세서 앞부분에서 정의한 바에 따르는 지방분해효소 생성체이며, 한편 다른 푸자리움 옥시스포럼 균주는 본 명세서 앞에서 정의한 것에 따르는 지방분해효소 생성체가 아니라는 사실을 나타내는 것이다.
지방분해효소 생성을 위한 수매제는 다음의 성분(g/ℓ)으로 구성된다.
Figure kpo00031
살균은 121℃에서 40분간 행하였다.
각각 100ml의 수매제를 넣은 11개의 500ml 엘렌마이어 플래스크를 11개의 푸자리움 종으로 미리 접종시킨 한천 상징액으로부터 나온 107개의 포자로 접종시켰다. 이 플래스크를 230rpm으로 30℃에서 5일간 진동시켰다. 그 수율은 다음에 나타낸 것과 같다.
Figure kpo00032
본 명세서에 나타낸 모든 균주는 모든 사람이 구입할 수 있는 것이다.

Claims (5)

  1. 푸자리움 옥시스포럼의 지방분해 효소 생성 균주에 의해 생성되고 그 활성이 첨가제 g당 20,000 내지 100,000LU인 지방분해효소 및 바실루스 리케니포르미스에 의해 미생물학적으로 제조되고 그 활성이 첨가제 g당 0.5 내지 3.0앤슨인 단백질 분해 효소를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 효소 세정첨가제.
  2. 상기 청구범위 제1항에 의한 효소 세정첨가제를 0.2 내지 2.0%w/w의 양으로 함유하는 것을 특징으로 하는 세정제.
  3. 세척용액이 상기 청구범위 제2항에 의한 세정제를 세척용액 1ℓ당 1 내지 5g의 양으로 함유하고, pH는 7 내지 11이며, 온도는 5 내지 60℃인 것을 특징으로 하는 세척방법.
  4. 푸자리움 옥시스포럼의 배양액에서 지방분해효소를 분리, 수득하는 단계, 바실루스 리케니포르미스의 배양액에서 단백질 분해 효소를 분리, 수득하는 단계, 및 첨가제 g당 지방분해효소는 활성이 20,000 내지 100,000LU가 되고 단백질분해효소는 활성이 0.5 내지 3.0앤슨이 되도록 혼합하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 효소세정첨가제가 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 과립화하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 효소 세정첨가제의 제조방법.
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