JPH0416186A - 新規アルカリプロテアーゼｍ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、バチルス属の１新菌株を培養することにより
得られる新規アルカリプロテアーゼ及びその製造法に関
する。更に詳細には、衣料用洗浄剤全般に配合して洗浄
力改善に大きく寄与する新規アルカリプロテアーゼＭ及
びその製造法に関する。

〔従来の技術〕

近年、洗浄剤の洗浄力向上のために、洗浄剤へのアルカ
リプロテアーゼの配合が行われている。アルカリプロテ
アーゼは洗浄剤のみでは落ちにくい蛋白質汚垢を分解し
、洗浄力の向上に寄与する。アルカリプロテアーゼとし
ては一般にバチルス　ズブチリヌ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ａｕｂｔｉｌｌ）、バチルス　リケニフオルミヌ（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓｌｌｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉａ　）　、バチ
ルス　アルカミフィルス（Ｂａｏｉｌｌｕａ　ａｌｋａ
ｌｏｐｈｉｌｌｕｓ）　、その他ストレプトマイセスＪ
ｉｇ　（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）　、アスペルギル
ヌ９４　（Ａｓ＋ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　）　　　フザリ
ウム属（ＩＦｕｓａｒｉｕｍ）　、アースロバフタ−属
（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）等の微生物により生産さ
れるものが知られており洗浄剤への配合酵素として用い
られている代表的なアルカリプロテアーゼの商品として
は、下記商品名のオブチクリーン（マイルズカリケミ製
）、アルカラーゼ、サビナーゼ、エスペラーゼ（ノボ　
インダストリー製）、マキサターゼ（ギヌト　プロカー
デス製）４４がある。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、衣類に付着している蛋白質汚垢には水不
溶性のものもあり、従来のアルカリプロテアーゼではこ
れらの分解が十分とはいえず、洗浄力の向上は必ずしも
満足できるものではない。

従って本発明は衣類に付着している水不溶性の蛋白質汚
垢をも分解し、衣料用洗浄側の洗浄力の向上に大きく寄
与するアルカリプロテアーゼ及びその製造法を提供する
ことを目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上記の目的を達成するために広く自然界
よりアルカリプロテアーゼ産生菌株を検索した結果、京
都府福知山市の土壌中から得られたバチルス属に属する
１菌種が産生する新規なアルカリプロテアーゼ（アルカ
リプロテアーゼＭと称する）が、前記の目的を達成する
ものであると認め、本発明を完成するに至った。

本発明のアルカリプロテアーゼＭを産生ずる微生物はバ
チルス属に属する微生物、バチルスエスピー（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｓｐ、）　ＯＮＵ　−１４と名付けられたも
のであり、以下に示すような菌学的性質を有する。

菌学的性質の試験及び分類法は「バージニーズ　マニュ
アル　オグ　グイターミネイティブバクテリオロジー第
８版（１９７４）Ｊ及び「パージニーズ　マニュアル　
オブ　シヌテマテイック　パクテリオロジー（１９８６
）Ｊに基づいて行った。本菌株はアルカリ条件の方が良
好な生育を示すため、以下に述べる試験には炭酸ナトリ
ウム１％を加えｐＨを１０．５に調整した培地を用いた
。

（Ａ）形態的性質 １）細胞の形、大きさ 桿菌０６〜１．０μｍ×２５〜５０μｍつ多　形　性 な　　し ３）運　動　性 周継手を有し運動性有り ４）胞子（大きさ、形、位置） ０．５〜１．０μｍＸ１．ｏ〜２．０μｍ１円形〜楕円
形、中央準端 ωグラム染色性 陽性 ６）抗酸性 陰　　性 （Ｂ）培地的性質 ｌ）肉汁寒天平板培養 円形、扁平、金縁のコロニーを形成する。

該コロニーの表面は粗面でにぷい光沢があり、黄土色を
呈する。

２）肉汁寒天斜面培養 波帯状に生育し、にぶい光沢のある黄土色ノコロニーを
形成する。

３）肉汁液体培養 生育良好で菌膜は形成しない。

→肉汁ゼラチン穿刺培養 生育良好で液化する。

５）リドマスミルク 生育するが凝固は認められない。培地がアルカリ性のた
めリドマスの変色は不明。

（０）生理的性質 １）硝酸塩の還元：陽性 ２）脱窒反応　　：陰性 ３）ＭＲテスト　　：陽性 滲ＶＰテスト　　：陽性 ５）インドールの生成：陰性 ６）硫化水素の生成：陰性 り澱粉加水分解：陽性 ８）クエン酸の利用：陽性 ９）無機窒素源の利用：硝酸塩、アンモニウム塩を資化
する。

１０色素の生成　：陰性 １１）ウレアーゼ　：陰性 １２）オキシダーゼ：陽性 １３）カタラーゼ　：陽性 １滲生育の温度」囲：５０℃以下 １ω生育のｐＨ範囲＝７〜１１ １６）酸素に対する態度：好気性 １７）ＯＦテスト　　：弱いが発酵 １８）糖類からの酸及びガスの生成、及び糖類の資化性
ＣＤ）その他の性質 １）塩化ナトリウム耐性ニア％ＨａＯ／以下で生育する
。

２）洗浄剤溶液中で安定であり、かつ日本工業規格（：
ｒ工ｓ　）衣料用合成洗剤の洗浄力評価（えりあか布洗
浄試験）において洗浄力改善に寄与しうるアルカリプロ
テアーゼＭを産生ずる。

本発明のＯＮＵ　−１４株は上述の如く好気性有胞子細
菌であり、バチルス属に属することは明らかであるが、
更に若干の相違点はあるものの、嫌気条件下では生育不
可能であること、カゼイン及び澱粉の加水分解能のある
こと、クエン酸を利用すること、インドールを生成しな
いこと並びに脱窒反応のないことよりバチルス　ズブチ
リス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）及びバ
チルスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｓ
ｒｉｕｍ　）に近縁であると考えられる。しかし、バチ
ルス　ズブチリスはｐＨ５，５においても生育する点に
おいて本発明の菌と異なっており、またバチルス　メガ
テリウムはｖｐテストが陰性である点において本発明の
菌と興なっている。更に本発明の菌はｐＨ７〜１１、特
に７〜１０．５で生育が良好であり、好アルカリ性バチ
ルス細菌であるバチルスアルカロフイ〃ス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ａｌａａｌｏｐｈｉｌｕ＠）と近縁と考えられ
るが、バチルス　アルカロフイルスはＶＰテストが陰性
である点及びクエン酸を利用しない点において本発明の
菌とは異なっている。

以上の点から、本発明者らは本発明のアルカリプロテア
ーゼ生産菌、即ち、バチルス　エスピー０ＮＵ−１４は
従来知られているバチルス属の菌種とは異なるバチルス
属の新菌種と判断した。本菌株を以下のように工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託した。

バチルス　エスピーｏａｎ−１４（微工研菌寄第１１４
２５号） 本発明に用いる微生物は、前記バチルス属ＯＮＵ　−１
４株の他、バチルス属に属する微生物で本発明のアルカ
リプロテアーゼＭを生産する菌株であれば差し支えない
。また、それらの菌株の天然又は人為的変異株や該アル
カリプロテアーゼＭ活性の発現に必要な遺伝子断片を人
為的に取り出し、それを組み入れた他の微生物菌体であ
っても本発明に用いることができる。

これらの微生物菌体を培養してアルカリプロテアーゼＭ
を生産させるには、通常の静置培養、振盪培養、通気攪
拌培養成いは固体培養等により、連続的或いは間歇的に
行うことができる。

用いる培地は、使用される微生物の生育するものであれ
ば特に制限はなく、窒素源としては、例えば、ポリペプ
トン、酵母エキス、肉エキス、大豆粉、コーンスチーブ
リカー、コーンミール等の有機窒素源の他、硫安、塩安
、硝安、リン安等の無機窒素源を必要に応じて、適宜混
合して、又は単独で用いることができる。また、炭素源
としては、例えば、澱粉、デキストリン、廃糖蜜、転化
糖等の他、資化し得る炭水化物、油脂、脂肪酸等を必要
に応じて、適宜混合して、又は単独で用いることができ
る。培地には炭素源、窒素源の他、無機塩例えば、リン
酸　ｙｇ　ｌ＋０８１＋、Ｍｎ　”、ＩＰｅ”、７　ｅ
　３＋、Ｚｎ”、Ｃｏ”、Ｎａ”に十等の壇を必要に応
じて、適宜混合して、又は単独で用いることができる。

更に上記培地に炭酸塩を加えてアルカリ性にした培地を
使用することもでき、その他必要に応じて菌の生育、酵
素の生産に必要な各種無機物、有機物を添加することも
できる。

培養の温度は用いる微生物の生育に適した温度を選択す
ればよく、通常１５〜６０′″Ｃ１好ましくは２５〜４
０℃で培養するのが適当である。

また、培養の時間は該菌の生育及びアルカリプロテアー
ゼＭの生産に十分な時間続行されるが、通常２４〜１２
０時間を要する。

このようにして培養した後、培養物を遠心分離又は濾過
することによって菌体を分離して上澄を得、この上澄か
ら通常の手段、例えば、塩析法、溶媒沈殿法（例えばエ
タノール、アセトン等）によって蛋白質を沈殿させたり
、また、限外濾過（例えばダイヤフローメンブレンＹＯ
。

アミコン社製）により濃縮させて本発明のアルカリプロ
テアーゼＭを得る。塩析法、溶媒沈殿法ではアルカリプ
ロテアーゼＭを沈殿させ、濾過或いは遠心分離、脱塩処
理した後、これを凍結乾燥粉末とすることもできる。更
に上記で得られたアルカリグロチアーゼＭを塩析、溶媒
沈殿、等電点沈殿、電気泳動、イオン交換クロマトグツ
フィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー
、晶出等の通常の酵素の精製手段を適宜組み合わせるこ
とによって、比活性の向上した粗酵素乃至精製酵素とす
ることもできる。

次に本発明のアルカリプロテアーゼＭの分離、精製法の
一例について詳細に説明する。

〈分離・精製法〉 微生物培養液を１０００　’Ｏｒｐｍで１０分間達遠心
離し菌体を除去した上澄を得る。次にこの上澄に最終４
３ｗ／ｖ％となるようにエタノールを加え、夾雑物を析
出させ、遠心分離又は濾過により除去した後、上澄液又
は濾液にエタノールを更に加え最終濃度８０　ｖ　／　
ｖ％としてアルカリプロテアーゼＭを析出させ、遠心分
離又はｆＲ過により沈殿物として回収する。得られた沈
殿物を５０ｍＭグリシン−ＩＪａＯＨ緩衝液（ｐＨ９，
０）に溶解し、ＤＫＡＩＣ−）ヨバール（商品名：東洋
曹達製）のアニオン交換カラムクロマトグラフィーにか
け、５ＱｍＭグリシンーＮａＯＨ（１）Ｈ９，０）で溶
出させ、非吸着画分を得る。続いてこの非吸着画分を１
０ｍＭ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に対して透析する
。透析後の酵素液を（ｊＭ−トヨパール（商品名：東洋
曹達製）のカチオン交換カラムクロマトグラフィーにか
け、Ｏ−０，１２５ＭＮａａｌのグラジェントにより溶
出を行う。該アルカリプロテアーゼＭは０．１　Ｍ　　
ＮａＣ／付近で溶出される。

以下、本発明のアルカリプロテアーゼＭの酵素学的性質
及び物理化学的性質について説明する。

〈作用及び基質特異性〉 アルカリ条件下で各種蛋白質例えばカゼイン、大豆蛋白
、牛血製ヘモグロビン、ケラチンを分解する。

各穐酵素の基質特異性を、各種蛋白質の中で異なるもの
について第１　表＆：示ｔ。

第　　　　１　　　　表 オプチクリーン二マイルズ　カリケミ社製アルカラーゼ
：ノボ　インダストリー祉製サビナーゼ：ノボ　インダ
ヌトリー社製Ｍ　　　二本発明のアルカリグロチアーゼ
（測定条件） １）Ｈ：　１０．５　（０，Ｉ　Ｍ＊つ酸−ＮａＯＨ＠
衝液）温　度：３０℃ 反応時間：大豆蛋白　１ｏ分間、ケラチン　１５時間反
応条件：大豆蛋白　静置反応、ケラチン　振盪反応基質
濃度二大豆蛋白　１％、ケラチン　１％酵素使用量：大
豆蛋白　１５ｐｖｑケラチン　５００　ＰＵ奔奔出白質
分解率測定はアンソン−基原の変法に従って行った。即
ち、各基質を含んだ液５ａｖ／に各酵素液１　ｙｘｌを
加え、上記の所宕の条件で反応後、トリクロロ酢酸混液
（組成：０．１１Ｍトリクロロ酢酸、０．２２ｍ酢酸ナ
トリウム、０４４Ｍ酢酸）５１を加えて反応を停止し、
３０℃１１０分間放置後、東洋濾紙腐１３１にて濾過し
、未反応蛋白質を除いた反応溶液的１１１１４ｔのうち
２＊ｊを０．５５　Ｍ炭酸ナトリウム５　ａｔと混合し
、更に３倍希釈フォリン・シオカルトｅフェノール試薬
１　ｍｌを加えて、３０’Ｃ，３０分間放置後６６０ｎ
ｍにて測定した。

酵素使用量を決定するための酵素活性は、同じくアンソ
ン−蔽原の変法に従い、カゼインを基質として、ｐＨ１
０，５，３０′Ｃにて１０分間静置反応する他は、上記
と同じ操作を行い、１分間に千ロジン１μｉ相当量を遊
離させる酵素量をＩＰＵとした。

この結果、本発明のアルカリプロテアーゼＭは、オプチ
クリーン、アルカラーゼ、サビナーゼとは異なる基質特
異性をもち、かつケラチンの分解性が特に優れているこ
とがわかる。

〈至ＩＭｐＨ＞ カゼイン０．６　ｗ　／　ｖ％を含む０．１Ｍの各ｐＨ
の緩衝液にＩＱＰＵのアルカリプロテアーゼＭを加え、
３０℃、１０分間反応を行った。至適ｐＨでの活性を１
００％としたときの各ｐＨでの相対活性を第１図に示し
た。なお、使用した緩衝液及びそのｐＨ範囲は以下の通
りである。

ｐＨ６，５〜　８．０ニリン酸緩衝液 ｐＨ７，５〜　９．０：）リス−塩酸緩衝液ｐＨ８，５
〜１１．０ニホウ駿−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ１０，５〜１
２０ニリン酸ナトリウム緩衝液ＰＨ１１，５〜１２．５
　：　ＫＯＩ　−ＮａＯＨ１１ｇ液この図から明らかな
如く、本発明のアルカリプロテアーゼＭの至適ｐＨは１
１，５〜１２０である。

く安定ｐＨ範囲〉 Ｂｒ１ｔｔｏｎ　−ＲｏｂＬｎａｏｎ広域緩衝液（ｐＨ
３，０〜１２０）にアルカリプロテアーゼＭを４００Ｐ
Ｕ／ｗＬｔになるように加え、３０℃で１５時間インキ
ュベートした。この処理液を０．１Ｍホウ酸−ＮａＯＨ
＠衝液（１）Ｈｌｏ、５）で１０倍に希釈後、カゼイン
を基質として、ｐＨ１０，５で反応を行い残存活性を測
定した。処理前の酵素活性を１００％とし、各ｐＨ領域
にて処理したサンプルの残存活性を相対的に表した。こ
の結果を第２図に示す。

この図より明らかな如く、本発明のアルカリプロテアー
ゼＭはｐ）！　６．　Ｏ〜１００の範囲で安定である。

〈至適温度〉 カゼインを基質としてＴＩＨ１０，５にて１０分間各温
度でアルカリプロテアーゼＭを反応させ、至適温度での
活性を１００％として各温度での相対活性を求めること
により測定した。この結果を第３図に示す。

この図より明らかな如く、本発明のアルカリプロテアー
ゼＭの至適温度は６０℃である。

〈温度安定性〉 １００ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０，５）に
４０ＰＵ／ｍｔとなるようにアルカリプロテアーゼＭを
加えて各温度で１０分間熱処理し氷冷した後、カゼイン
を基質としてｐＨ１０，５で反応を行い残存活性を測定
した。また、Ｃａイオンの添加効果の検討には上記酵素
液にＣａイオンの最終濃度が５ｍＭになるように添加し
た。処理前の酵素活性を１００％とし、各温度にて処理
したサンプルの残存活性を相対的に表した。この結果を
第４図に示す。

この図より明らかな如く、本発明のアルカリプロテアー
ゼＭは４５℃の温度まで活性が維持される。そして更に
５ｍＭのＣ＆イオンの存在によりｍ炭安定性は約２０″
Ｃ向上する。

く金属イオンの影響〉 金属イオンの酵素活性におよぼす影響について調べた結
果を第２表に示す。各金属塩を反応時の最終濃度が５ｍ
Ｍとなるように添加し、カゼインを基質としてｐＨ７，
５にてアルカリプロテアーゼＭの活性を測定した。金属
塩無添加の系を対照として用い、その活性を１００％と
したときの相対値で各金属イオンの影響を表した。

第　　　２　　　表 この結果、本発明のアルカリプロテアーゼＭはＨｇイオ
ンによって強く阻害されたが他の金属イオンに対しては
安定であり、阻害を受けなかった。

〈阻害剤の影響〉 ０、１　Ｍ　）リスーＨ０Ｉ緩衝液（ｐＨ７，５）にア
ルカリプロテアーゼＭを４００ＰＵ／Ｉｌｔとなるよう
に加え、各阻害剤を所定濃度添加して３０℃１１時間イ
ンキュベート後上記緩衝液で１０倍希釈し、カゼインを
基質としてアルカリプロテアーゼＭの残存活性を測定し
た。阻害剤無添加の系を対照として用いその活性を１０
０％としたときの残存率で各阻害剤の影響を第３表に示
す。

第　　３　　表 １処理時濃度 襲 阻害剤 残存率 無添加 ＣＭＢ １ｍＭ ＦＦ １ｍＭ ＭＳＦ １ｍＭ ＤＴＡ １ｍＭ 【八〇つＴ官７−ｊ ＰＯＭＢ・・・ｐ−クロロ安息香酸水銀Ｄ７Ｆ　　・・
・ジイソプロピルフルオロリン酸ＰＭＳＩＦ・・・フェ
ニルメチルスルホニルフルオフイドＥＩ）ＴＡ・・・エ
チレンジアミン四節酸Ｐ工　　・・・ポテト　インヒビ
ター なお、Ｐ工についてはビオプヲーゼ（商品名：ナガセ生
化学製アルカリプロテアーゼ）ＩＰＵを阻害する量をＩ
Ｐ工Ｕと定義した。

この結果、本発明のアルカリプロテアーゼＭはＤＦＦお
よびＰＭＳＦにより阻害されることから、活性中心にセ
リンを有するプロテアーゼであることがわかる。また、
馬鈴薯中に存在するプロテアーセ阻ＩＦ剤であるポテト
インヒビターニヨっても阻害された。

〈界面活性剤およびビルダーの影響〉 各種界面活性剤およびビルダーの酵素活性に及ぼす影響
について調べた結果を第４表に示す。

各種界面活性剤またはビルダーを反応時所定の濃度とな
るように添加し、カゼインを基質としてｐＨ７，５にて
アルカリプロテアーゼＭの活性を測定した。界面活性剤
、ビルダー無添加の系を対照として用い、その活性を１
００％とした時の相対値で各種界面活性剤およびビルダ
ーの影響を表した。

第　　　　４　　　　表 この結果より明らかな如く、本発明のアルカリプロテア
ーゼＭは各種界面活性剤およびビルダーに対して安定で
あるといえる。

〈分子量〉 ＴＳＫ　−ＧｚＬａ　３０００　ｓｗ　（商品名：東洋
曹達製）を用いるゲル濾過クロマトグツフィーにより、
アルカリプロテアーゼＭの分子量を測定した。このゲル
濾過において溶出液としては１０ｍＭリン酸緩衝！（Ｐ
Ｈ７，０）を用い、また欅準蛋白としてカタラーゼ（Ｍ
Ｙ：２４０（１００）、牛血清アルブミン（ＭＹ：１５
８０００）、卵白アルブミン（ＭＹ：４５０００）　　
　キモトリデシノーゲ：／　（ＭＹ：２５０００）　、
＋ｔクロムＯ（Ｍ’ｗ：１２５００）を用いた。

この結果、本発明のアルカリプロテアーゼＭの分子量は
、２２−０００であると決定した。

以上、アルカリプロテアーゼＭの性質を明らかにしたが
、本発明のアルカリプロテアーゼＭはアルカリ側におい
て高い活性を示し、更にこのアルカリプロテアーゼはケ
ラチン等の不溶性蛋白質の分解力も優れており、かつ洗
剤組成中に配合されたり、洗濯中に混入する各種成分、
例えば界面活性剤、ビルダー成分、金属イオン等の存在
下においてもほとんどその作用の低下は認められない。

従って、本発明のアルカリプロテアーゼＭは、各種の洗
剤に配合するプロテアーゼとして優れたものである。

〔実施例〕

以下に実施例をもって、本発明の内容をより具体的に示
す。これらはいずれも本発明の内容を例示するものにす
ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。％は他に
特記せぬ限りｗ／ｖ％である。

実施例　１ アルカリプロテアーゼ産生菌株の採取、分離（１）京都
府福知山市で採取した土壌サンプルの約１１を滅菌した
０、８５％Ｎａ０１を含む５０　ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，４）　１０　＊ｉミニ散Ｌ、上Ｐｉｌ液の０．１
１をスキムミルク寒天培地へ塗布し、３７℃にて２４〜
４８時間静置培養した◇用いたスキムミルク寒天培地の
組成を以下に示す。

ポリペプトン　　　　　　　０５％ 酵母エキス　　　　　　　　　０５％ 可溶性澱粉　　　　　　　　　２０％ リン酸第２カリウム　　　　　０．１％硫酸マグネシウ
ム・７水’４　　０．０２％炭酸ナトリウムＣ別滅菌）
　　　１０％スキムミルク（別滅菌）６，０％ 寒　　　天　　　　　　　　　　１．５％培養後、生育
したコロニーの周囲にハローの生じたものを選抜し、同
培地で２〜３回純化し、均一のア、ルカリプロテアーゼ
産生菌株を得た。土壌サンプル２００点より上記の条件
で得られた菌株は３９株であった。

（２上記（１）で得られた菌株３９株を夫々以下に示す
液体培地へ接種し、３７℃で好気的に７２時間振盪培養
を行った。

ポリペプトン　　　　　　　０７５％ 酵母エキス　　　　　　　　　０．５％可溶性澱粉　　
　　　　　　　６．０％リン酸第２カリウム　　　　　
０１％ 硫酸マグネシウム・７水塩　　０．０２％炭酸ナトリウ
ム（別滅菌）１．０％ 培養終了後、得られた培養物を遠心分離（１００００ｒ
ｐｍ１１０分間）して菌体を除失し、得られた上澄液に
８０％飽和となるように硫安を添加した。生じた沈殿を
遠心分離（１００００ｒｐｍ　％　２０分間）し、水道
水に対し透析後、透析内液をアルカリプロテアーゼ酵素
剤として、：ｒｘｓ　ｘ　３３７１に準じ、洗浄試験を
行った。洗浄系は市販の無リン重質洗剤（酵素未添加の
もの）を０１３３％になるように、Ｊ工！１１　Ｋ　３
３７１の５．８．４（３）に記載の使用水にて調製後、
上記アルカリプロテアーゼ酵素液を１０　ＰＵ／＊／と
なるように添加した。

試験布はＪ工５Ｋ３３７１の５．８．４（１３に記載の
えりあか布（ヒト皮膚上の汚れが付着したもの）とじ１
酵素添加或いは酵素無添加の洗浄系にて３０℃，１時間
浸漬を行った。浸漬終了後、ターゴツトメーター（Ｔｓ
ｒｇ　−０−Ｔｏｍｅｔｓｒ　　（上皇製作所製）〕を
使用し、３０℃、１２０　ｒｐｍで１０分間洗浄を行っ
た。濯ぎ、乾燥後、３名の判定者により一対のえりあか
布（１５組）を見比べ汚れ落ちの程度を失々肉眼で観察
し、判定を行った。

この判定結果を基にして３９株のうち最も洗浄力を発揮
したアルカリプロテアーゼを産生ずる菌株を１株選択し
、菌株の同定実験を行った。

その結果、前述の如くこの菌株をバチルス　エスピー〇
ＮＵ　−１４と命名した。

実施例　２ 実施例１より得られたバチルス　エスピー〇ＮＵ　−１
４を以下の培地に接種し、３７℃で好気的に７２時間振
盪培養を行い、アルカリプロテアーゼを産生させた。

大豆粉　　　　２．０％ カゼイン　　　　　　　０．５％ 可溶性澱粉　　　　　　　　　６．０％リン酸第２カリ
ウム　　　　　０．１％硫酸マグネシウム・７水塩　　
００２％炭酸ナトリウム（別滅菌）　　　１０　％培養
終了後、得られた培養物を遠心分離（１００００ｒｐｍ
、１０分間）して、菌体及び不溶物を除去し、得られた
培養上澄を酵素液としてそのアルカリプロテアーゼ活性
す測定した。

アルカリプロテアーゼの活性測定は、実施例１の（２）
と同様にして測定した。

この結果、本実施例で得られた酵素液のアルカリプロテ
アーゼ活性は４０００　ＰＵ／ｖｔｌであった０ 実施例　３ 実施例２において得られた酵素液から前記〔分離・精製
法〕で述べた方法によって本発明のアルカリプロテアー
ゼＭを分離、精製し、その酵素学的性質及び物理化学的
性質を調べたところ、前記の通りであった。

実施例　４ ｘ工ｓ　Ｋ　３３７１に準じ、洗浄試験を行った。

洗浄系は市販の無リン重質洗剤４（３）に記載の使用水
にて調製後、各種アルカリプロテアーゼをｌ　Ｑ　ＰＨ
／ｍｌとなるように添加した。

試験布はＪ工５Ｋ３３７１の５．８．４　（１）に記載
のえりあか布（ヒト皮膚上の汚れが付着したもの）とし
、酵素添加或いは酵素無添加の洗浄系にて３０℃，１時
間浸漬を行った。浸漬終了後、ターゴツトメーターを使
用し、３０℃，１２Ｏｒｐｍで１０分間洗浄を行った。

濯ぎ、乾燥後、３名の判定者により一対のえりあか布（
１５組）を見比べ汚れ落ちの程度を夫々肉眼で観察し、
判定を行った。判定基準は、酵素無添加の洗浄系で洗浄
したえりあか布の汚れ落ちの程度に対して酵素添加の洗
浄系で洗浄したえりあか布の汚れ落ちの程度が、 明らかに劣る場合・・・・・・−２ やや劣る場合　　・・・・・・−１ はとんど差がない場合・・・０ ややまさる場合　・・・・・・＋１ 明らかにまさる場合・・・＋２ として評価し、Ｊ工５Ｋ３３７１の評価法に従い、３名
の評価点の合計点数の多数によって比較判定した。

この結果を第５表に示す。

第　　５　　表 実施例　５ 実施例４の洗浄試験において、洗浄系として：ｒｘｓ　
Ｋ３３７１　（Ｆ）　５．８．４（２）に記載の洗浄力
判定用指標洗剤（組成：直鎖アルキルベンゼンスルホン
酸ナトリウム３０部、トリポリリン酸ナトリウム１７部
、けい酸ナトリウム１０＠、炭酸ナトリウム３部、カル
ボキシメチルセルローフ１部、硫酸ナトリウム５８部）
を用いること及び添加する各種アルカリプロテアーゼを
Ｉ　ＰＵ／ｒａｔとなるように添加すること以外は実施
例４と同様にして洗浄試験を行い、判定した。

この結果を第６表に示す。

第　　６　　表 後の活性を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の理化学的性質を有するアルカリプロテアーゼＭ
   、 （１）作用 アルカリ条件下で各種蛋白質を分解する。 （２）基質特異性 カゼイン、大豆蛋白、牛血製ヘモグロビン、ケラチンに
   対する高い活性を有する。特にケラチンに対して高い活
   性を有する。 （３）至適ｐＨ カゼインを基質として３０℃で反応させた 場合至適ｐＨは１１．５〜１２．０である。 （４）安定ｐＨ範囲 カゼインを基質として種々のｐＨで３０℃、１５時間処
   理後の残存活性を測定した場合、ｐＨ６．０〜１０．０
   の範囲において安定であり、ｐＨ４以下において殆ど失
   活する。 （５）至適温度 カゼインを基質としてｐＨ１０．５で反応させた場合至
   適温度は６０℃である。 （６）温度安定性 カゼインを基質としてｐＨ１０．０、５０℃にて１０分
   間熱処理後の残存活性を測定した場合、９０％以上、活
   性が残存する。また、同条件で熱処理時にＣａイオンを
   ５ｍＭの濃度で添加すると、６０℃の熱処理後において
   もほぼ１００％、活性が残存する。 （７）金属イオンの影響 Ｈｇイオンにより活性が強く阻害される。 （８）安定化剤の影響 Ｃａイオンの存在下で温度安定性が向上する。 （９）阻害剤の影響 ＤＦＰ、ＰＭＳＦ、ポテトインヒビターにより特異的に
   活性が阻害される。 （１０）分子量 約２２０００（ゲル濾過法による）。 ２、バチルス属に属するアルカリプロテアーゼＭ生産菌
   を培養し、培養物からアルカリプロテアーゼＭを採取す
   ることを特徴とするアルカリプロテアーゼＭの製造法。 ３、アルカリプロテアーゼＭ生産菌がバチルスエスピー
   （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＯＮＵ−１４（微工研菌
   寄第１１４２５号）である請求項２記載の製造法。