NL194443C - Bacillus stam, basisch protease geproduceerd door deze Bacillus stam en wasmiddel dat dit protease bevat. - Google Patents

Description

1 194443

Bacillus tam, basisch protease geproduceerd door deze Bacillus stam en wasmiddel dat dit protease bevat

De uitvinding heeft betrekking op een Bacillus stam, een basisch protease geproduceerd door deze Bacillus 5 stam en een wasmiddel dat dit protease bevat.

Basisch protease wordt veel gebruikt in bijvoorbeeld de leerindustrie, voedingsindustrie, textielindustrie en farmaceutische industrie omdat het meer warmtebestendig zou zijn dan neutraal protease. Ook in wasmiddelen wordt het de laatste tijd veel toegepast.

De in wasmiddelen toegepaste basische proteasen zijn verkregen uit bacteriën behorende tot het genus 10 Bacillus.

In het algemeen bestaat er een behoefte aan enzymen voor wasmiddelen die bij betrekkelijk lage temperatuur actief zijn.

Zo worden in het Amerikaanse octrooischrift 3.723.250 basische proteasen uit diverse Bacillus stammen beschreven waarvan sommige een pH optimum van 7,5 en 10 en een temperatuur optimum van 40, 45, 50 15 en 55°C hebben (zie Tabel IX).

De uitvinding voorziet in een nieuwe Bacillus stam, gedeponeerd en verkrijgbaar bij het Fermentation Research Institute (FRI) in Japan als Bacillus sp. FERM BP-93, dat in staat is om onder basische omstandigheden een protease te produceren.

Verder heeft de uitvinding betrekking op een basisch protease aangeduid met API-21, geproduceerd door 20 voornoemde nieuwe Bacillus stam, welk protease de volgende eigenschappen bezit: 1. activiteit: hydrolyseert caseïne onder basische omstandigheden, optimale activiteit bij een pH 10-11 en een temperatuur van 45-50°C, 2. stabiliteit: geen vermindering in enzymatische activiteit bij 10 min. verwarmen tot 40°C bij een pH 10 in afwezigheid van substraat, vermindering in enzymatische activiteit van 90% of meer bij 10 min. verwarmen 25 bij 50°C en een pH 10, beginnende desactivering bij 10 min. verwarmen bij 50°C en een pH 8 en volledige of nagenoeg volledige desactivering bij 10 min. verwarmen bij 60°C en een pH 8, stabiel onder basische omstandigheden, in het bijzonder bij een pH 7-11,5, en bestand tegen bevriezen en vriesdrogen, en 3. enzymmolecuul: het protease is een proteïne met een moleculair gewicht van ongeveer 22 000 zoals geschat met een gelfiltratiemethode, een isoelektrisch punt van 7,4 zoals geschat met een elektrofocusse- 30 ringsmethode, een absorptiepiek in het UV spectrum bij 275-282 nm, een IR absorptiespectrum zoals weergegeven in figuur 5, en een serinerest op de actieve plaats.

Verder heeft de uitvinding betrekking op een enzym bevattend wasmiddel, welk wasmiddel het basische protease API-21 bevat.

35 Ter toelichting op de eigenschappen van het enzym volgens de uitvinding wordt verwezen naar de figuren.

In figuur 1 is de relatieve activiteit uitgezet tegen de pH. Uit de grafiek blijkt dat de optimale activiteit bij een pH 1011 ligt.

Figuur 2 heeft betrekking óp de bestendigheid van het enzym bij afwezigheid van substraat tegen verschillende pH's.

40 In figuur 3 is de relatieve activiteit uitgezet tegen de temperatuur. Uit de grafiek blijkt dat de optimale activiteit bij een temperatuur van ongeveer 50°C ligt.

De figuren 4A en 4B hebben betrekking op de bestendigheid van het enzym bij afwezigheid van substraat tegen verschillende temperaturen bij een pH van resp. 10 en 8.

In figuur 5 is het Fourier Transform Infrarood Spectrum van het enzym weergegeven.

45

Het nieuwe micro-organisme waaruit het basisch protease API-21 wordt gewonnen, te weten Bacillus sp. nov, NKS-21, in het vervolg als NKS-21 aangeduid, werd geïsoleerd uit bodemmateriaal bij Fuchu-shi,

Tokio, Japan. Het is gebleken.dat NKS-21 een nieuwe, aerobe sporangium bacterie is die behoort tot het genus Bacillus. Het species NKS-21 is op 3 februari 1982 bij het Fermentation Research Institute (FRI) in 50 Japan gedeponeerd als Bacillus sp. FERM BP-93. Deze verzameling is bij het verdrag van Boedapest erkend. Het micro-organisme wordt op verzoek ter beschikking gesteld aan derden om de onderhavige uitvinding te testen.

De microbiologische eigenschappen van NKS-21 zijn in het onderstaande vermeld. De toegepaste reagentia en isoleringsmethoden zijn volgens Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8e druk, 1974. 55 De bacterie werd uit bodemmateriaal geïsoleerd door een kleine hoeveelheid daarvan toe te voegen aan een peptonmedium en het kweken uit te voeren op een schudtafel bij een temperatuur van 1O-40°C en een pH 7-10 gedurende 40-150 uren. Een gedeelte van het kweekproduct werd uitgespreid op agarplaten 194443 2 waarna de stam op gebruikelijke wijze werd geïsoleerd.

Microbiologische eigenschappen van NKS-21 a. Morfologische karakteristieken 5 1. grootte van vegitatieve cellen: 0. 6-0,8 pm x 2,5-3,5 pm 2. cel pleomorfisme: cellen zetten soms uit tot een grootte van 0,6-1,0 pm x 4,5 pm.

3. Gram-kleuring: 10 positief maar snel ontkleurd.

4. motiliteit: motile met peritriche flagellae.

5. sporen: ovaal tot elliptisch, subterminaal, 0,8 μ x 1,2 p.

15 6. sporangia: licht gezwollen.

7. zuurvastheid: negatief b. Kweekkarakteristieken in verschillende media 20 1. peptonbouillon:

a) pH 9,5: goede groei bij 20°C en 30°C

pH 7,2: schrale groei bij 20°C en goede groei bij 30°C

b) groeitemperatuur bij pH 9,5: groei tussen 14 en 41 °C

25 geen groei boven 43°C of onder 12°C

2. andere media: schuine vleesextract-peptonagar: goede groei; vleesextract-peptonbouillon met 7 % NaCI: 30 goede groei vleesextract-peptonbouillon: goede groei schuine caseïne-vleesextract-pepton agar goede groei 35 caseïne-vleesextract- peptonbouillon: goede groei zetmeel-peptonbouiilon: goede groei glucose-peptonbouillon: 40 goede groei tri pton-gistextractagarplaat: goede groei zetmeel-gistextractbouillon: groei 45 vleesextract-gelatineplaat: a) pH 10,0, 30°C: groei en vervloeiing b) pH 10,0, 20°C: zwakke oppervlaktegroei en zwakke vervloeiing 50 c) pH 7,2, 30°C: groei en vervloeiing d) pH 7,2, 20°C: zwakke oppervlaktegroei en vervloeiing 3. Groei onder anaërobe omstandigheden: 55 geen groei onder anaërobe maar wel groei onder aerobe omstandigheden.

c. Fysiologische karakteristieken 1. reductie van nitraat tot nitriet: 3 194443 geen reductie 2. anaërobe gasvorming uit nitraat: negatief 3. methyl rood (MR) test: 5 negatief 4. Voges-Proskauer (VP) test: negatief 5. indoolvorming: geen 10 6. vorming van H2S: geen 7. zetmeelhydrolyse: positief 8. benutting van citraat: 15 positief 9. benutting van anorganische stikstofbron: benut nitraten en ammoniumzouten 10. pigmentvorming: geen 20 11. urease test: negatief 12. cytochroomoxidasetest: positief 13. katalasetest: 25 positief 14. O-F test (Hugh en Leifson’s medium): zwakke fermentatie 15. zuurvorming en gasontwikkeling uit koolwaterstoffen: 30 zuurvorming gas-ontwikkeling L-arabinose - - D-xylose - - D-giueose + D-mannose + - 35 D-fructose - - D-galactose + - maltose + - sucrose + - lactose - - 40 trehalose + - D-sorbitol + - D-mannitol + - inositol + glycerol + - 45 zetmeel + ribose - - raffinose + - cellobiose + - 50 +·. positief, -: negatief 16. Andere karakteristieken: a) deaminering van fenylalanine: positief 55 b) caseïnehydrolyse: positief c) tyrosineontleding 194443 4 positief

Uit het bovenstaande blijkt dat de stam NKS-21 een aerobe sporangium bacterie is waarvan wordt aangenomen dat hij behoort tot het genus Bacillus. De karakteristieken van deze stam zijn dat hij in neutraal tot basisch medium groeit en dat de pH voor de optimale groei 8-10 bedraagt. Deze microbiologische 5 eigenschappen zijn soortgelijk aan die voor de bekende stammen Bacillus pasteurii en Bacillus alcaiophiius. Naast overeenkomsten zijn er echter ook verschillen in microbiologische eigenschappen. Zo groeien bijvoorbeeld de stammen Bacillus pasteurii en Bacillus alcaiophiius beide in basisch milieu maar de laatste groeit niet bij een pH 7. Daarentegen groeit NKS-21 niet alleen goed in basisch milieu maar ook in neutraal milieu. In dit opzicht verschilt NKS-21 dus van Bacillus alcaiophiius. Verder hydrolyseert Bacillus pasteurii 10 geen zetmeel maar NKS-21 wel. Daarnaast zijn er nog de volgende verschillen tussen NKS-21 en Bacillus pasteurii: 1. Bacillus pasteurii reduceert nitraten en NKS-21 niet; 2. Bacillus pasteurii heeft bolvormige tot bijna ovale endosporen en NKS-21 ovale tot elliptische endospo-ren; en 15 3. Bacillus pasteurii ontleedt ureum en NKS-21 niet.

Hieruit blijkt dus dat de microbiologische eigenschappen van NKS-21 sterk verschillen van die van Bacillus pasteurii.

De classificatiekarakteristieken van Bacillus alcaiophiius zijn niet in detail beschreven in Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8e druk 1974. Omdat de standaard stam Bacillus alcaiophiius niet beschik-20 baar was, zijn de microbiologische eigenschappen van NKS-21 experimenteel vergeleken met die van de oorspronkelijke stammen Bacillus alcaiophiius NCIB 10436 en NCIB 10438 aangehaald in Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8e druk 1974. NCIB 10436 en NCIB 10438 zijn beide enigszins positief bij Gramkleuring en worden snel ontkleurd, dus net zoals NKS-21.

Voor wat de morfologische karakteristieken van de vegetatieve cellen betreft, elektronenmicroscopisch 25 onderzoek van NCIB 10436 geeft korte staafjes te zien met een grootte van 0,7 x 2,0 pm en lange staafjes met een grootte van 0,8 x 4,6 pm. NCIB 10438 heeft vegetatieve cellen met een grootte van 0,7 x 1,5 pm onder de elektronenmicroscoop. Daarentegen heeft NKS-21 onder de elektronenmicroscoop vegetatieve cellen met een grootte van 0,6-0,8 x 2,5-3,5 pm en hebben de endosporen een ovale tot elliptische vorm met een grootte van 0,8 x 1,2 pm. Motiliteit voor NCIB 10436 en NCIB 10438 werd niet waargenomen maar 30 wel voor NKS-21. Verder zijn er nog de volgende verschillen in fysiologische eigenschappen tussen NCIB 10436 en NCIB 10438 enerzijds en NKS-21 anderzijds: 1. Bacillus alcaiophiius NCIB 10436 en NCIB 10438 groeien niet in een mannitol medium en NKS-21 wel; en 2. NCIB 10436 groeit niet in een vleesextract-pepton bouillon met 7 % NaCI en NCIB 10438 en NKS-21 35 wel.

Uit de boven genoemde verschillen blijkt dat er tussen NKS-21 enerzijds en Bacillus alcaiophiius NCIB 10436 en NCIB 10438 anderzijds een duidelijk onderscheid bestaat hoewel NKS-21 in sommige microbiologische eigenschappen overeenkomt met Bacillus alcaiophiius.

Verder komt NKS-21 overeen met Bacillus subtilis in de grootte van de vegetatieve cellen die voor 40 Bacillus subtilis 0,7-0,8 x 2-3 pm bedraagt en in de zetmeel hydrolyse. Maar van Bacillus subtilis onderscheid NKS-21 zich op de volgende punten: 1. Bacillus subtilis groeit goed bij een pH 5,58,5 maar groeit niet bij een pH 9-10 zoals NKS-21; en 2. De temperatuur voor de optimale groei van Bacillus subtilis bedraagt 45-55°C terwijl NKS-21 niet groeit boven 43°C.

45 NKS-21 is dus duidelijk verschillend van Bacillus pasteurii, Bacillus alcaiophiius en Bacillus subtilis, en enige stam met dezelfde microbiologische eigenschappen als NKS-21 is niet beschreven in Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8® druk 1974. Hieruit kan worden besloten, dat NKS-21 een nieuwe stam is die behoort tot het genus Bacillus.

Het nieuwe basische protease API-21 met een hoge activiteit bij betrekkelijk lage temperatuur wordt 50 verkregen door het nieuwe species NKS-21 te kweken in een basisch cultuurmedium en uit de cultuur-vloeistof het gevormde protease te winnen. Behalve NKS-21 zelf kunnen ook natuurlijke en kunstmatige mutanten daarvan worden gebruikt voor het vormen van protease API-21. Deze mutanten vallen binnen het kader van de uitvinding.

Het kweken van NKS-21 kan aëroob worden uitgevoerd in bijvoorbeeld een peptonkweekmedium met 55 een pH 8-10 op een schudtafel of aëroob onder roeren van de cultuur na enten met NKS-21, bij een temperatuur van 10-40°C gedurende 40-150 uren. De gevormde cellen worden gemakkelijk afgescheiden en het protease API-21 kan gemakkelijk uit de opgehelderde bovenstaande vloeistof worden geprecipiteerd 5 194443 met een organische vloeistof zoals ethanol. Het neerslag wordt dan afgescheiden door centrifugeren en gevriesdroogd in vacuo.

De activiteit van het aldus gewonnen basische protease API-21 kan als volgt worden bepaald:

De heldere cultuurvloeistof of de enzymoplossing wordt passend verdund met 0,1 M natriumcarbonaat-5 0,1 M boorzuur - kaliumchloridebufferoplossing (pH10,0). Aan 0,5 ml van de verkregen oplossing wordt 0,5 ml 2%-ige melkcaseïneoplossing met een pH 10,0 toegevoegd waarna een enzymatische reactie wordt uitgevoerd bij 30°C gedurende 10 min. De reactie wordt gestopt door toevoegen van 2 ml 0,1 M trichloor-azijnzuur dat 0,2 M azijnzuur en 0,2 M natriumacetaat bevat. Na 10 min. of langer staan bij 30°C wordt het mengsel over filtreerpapier gefiltreerd. Aan 1 ml van het filtraat worden 5 ml 0,4 M natriumcarbonaat en 1 ml 10 5x verdund ’’fenolreagens” toegevoegd waarna het mengsel 20 min. wordt weggezet bij 30°C onder kleurontwikkeling. Aan het gekleurde mengsel wordt de absorptie gemeten bij 660 nm. De enzymeenheid wordt bepaald volgens de richtlijnen van de Commission on Biochemical Nomenclature (Comprehensive Biochemistry vol. 13, 1973, biz. 26-27). Volgens deze richtlijnen wordt de hoeveelheid basisch protease die in trichloorazijnzuur oplosbare stoffen vrijmaakt, welke stoffen de kleur bij 660 nm ontwikkelen overeenko-15 mend met 1 mol tyrosine uit 1% caseïnesubstraat met een pH 10,0 bij 30°C gedurende 1 sec., gedefinieerd als 1 katal.

In het hierna volgende zijn de fysicochemische eigenschappen van het basisch protease API-21 volgens de uitvinding nader beschreven.

20 1. Activiteit API-21 hydrolyseert proteïnen zoals caseïne, hemoglobine, albumine, globuline, vleesproteïne, visproteïne en sojaboonproteine.

2. Invloed van de pH op de enzymatische activiteit 25 Zoals uit figuur 1 blijkt, ligt de optimale relatieve activiteit bij een pH van ongeveer 10-11. De relatieve activiteit wordt als volgt bepaald:

Elk van de hieronder aangegeven bufferoplossingen (0,5 ml) die 2 % melkcaseïne bevatten, wordt toegevoegd aan 50 μΙ van de enzymoplossing.

30 pH bufferoplossing

6-9 0,1 M kaliumfosfaat - 0,05 M

natriumboraat

9-11 0,1 M natriumcarbonaat - 0,1 M

boorzuur kaliumchloride 35 11-12 0,1 M dinatriumwaterstoffosfaat- natriumhydroxide

Aan de testoplossing wordt de enzymatische activiteit bepaald zoals boven beschreven. De relatieve 40 activiteit (%) wordt berekend, waarbij de enzymatische activiteit bij een pH 10,0 op 100 % wordt gesteld.

3. Invloed van de pH op de stabiliteit bij afwezigheid van substraat

Zoals uit figuur 2 blijkt, is het enzym stabiel bij een pH van ongeveer 7-11,5. De stabiliteit van het enzym wordt als volgt bepaald: 45 Elk van de hieronder aangegeven bufferoplossingen (0,5 ml) wordt toegevoegd aan 50 μΙ van de gedialyseerde en passend verdunde enzymoplossing waarna het mengsel 10 min. bij 30°C wordt geïncubeerd.

pH bufferoplossing

50 3-8 0,1 M citroenzuur - 0,2 M

dinatriumwaterstoffosfaat

8-11 0,1 M natriumcarbonaat - 0,1 M

boorzuur - kaliumchloride 11-12 0,15 M dinatriumwaterstoffosfaat 55 - natriumhydroxide 194443 6

Na afloop van het incuberen wordt 9,5 ml 0,1 M carbonaatbufferoplossing die 2% caseïne bevat en een pH 10,0 heeft, toegevoegd. De enzymatische activiteit van het mengsel wordt bepaald zoals boven beschreven. De relatieve activiteit (%) wordt berekend, waarbij de enzymatische activiteit bij een pH 10,0 op 100% wordt gesteld.

5 Blijkens figuur 2 is het enzym het meest stabiel bij een pH van ongeveer 10-11. Bij deze pH blijft de oorspronkelijke activiteit van het enzym volledig behouden. Tussen een pH 7 en 11,5 blijft 80% of meer van de oorspronkelijke activiteit behouden.

4. Invloed van de temperatuur op de enzymatische activiteit 10 Zoals uit figuur 3 blijkt, hydrolyseert het enzym caseïne bij een temperatuur van 5-65°C en een pH 10,0. De optimale activiteit ligt bij een temperatuur van 45-50°C.

5. Invloed van de temperatuur op de stabiliteit bij afwezigheid van substraat

Blijkens de figuren 4A en 4B blijft de activiteit van het enzym volledig behouden bij 10 min. verwarmen tot 15 40°C bij een pH 10,0, maar gaat de meeste activiteit verloren bij 50°C. Verder blijft de activiteit behouden bij 10 min. verwarmen tot 45°C bij een pH 8, maar treedt desactivering op bij 50°C en wordt het enzym geheel of nagenoeg geheel gedesactiveerd bij 60°C.

6. Opslagstabiliteit 20 Het enzym is bestand tegen bevriezen en vriesdrogen. Na 2 weken bewaren van een gevriesdroogd monster bij kamertemperatuur word geen aanmerkelijke achteruitgang in de activiteit waargenomen. Bij bewaren van een gevriesdroogd monster in een exsicator bij kamertemperatuur bleef de activiteit geheel behouden.

25 7. Inhibitie

Het enzym wordt sterk geïnhibiteerd door een actieve serinerestinhibitor zoals diisopropylfluorfosforzuur en fenylmethaansulfonylfluoride. Ook door benzyloxyearbonylfenylalanine-chloormethylketon wordt het geïnhibiteerd. Het enzym wordt daarentegen niet geïnhibiteerd door tosyl-fenylalanine-chloormethylketon dat een inhibitor is van een dierlijk serineprotease, chymotrypsine en tosyl-lysine-chloormethylketon dat een 30 trypsineinhibitor is.

Verder wordt de activiteit van het enzym niet ongunstig beïnvloed door p-chloor-kwik(tl)benzoaat en ethyleendiaminetetraacetaat. Pepstatine heeft ook geen ongunstige invloed op de activiteit. Uit deze inhibitiegegevens volgt dat het enzym een protease met een serinerest op de actieve plaats is.

35 8. Enzymatische activiteit

Voor de bepalingsmethode: zie boven.

9. Molecuulgewicht

Het molecuulgewicht van het enzym is ongeveer 22 000 zoals geschat door gelfiltratie over Sephadex G-75 40 bij een pH 10.

10. Iso-elektrisch punt

Het iso-elektrische punt van het enzym bedraagt 7,4 zoals geschat door elektrofocussering.

45 11. UV absorptie

Absorptiepiek bij 275-282 pm in het ansorptiespectrum.

12. IR absorptiespectrum Zoals weergegeven in figuur 5.

50 13. Elementair analyse

Niet bepaald omdat dit niet goed mogelijk is voor stoffen met een dergelijk hoog moleculair gewicht.

14. Aminozuursamenstelling 55 Voorlopige berekening op basis van de resultaten van zure hydrolyse van het enzym behalve voor cyste!ne/cystine en tryptofaan, van ontleding met permierezuur voor cysteine/ cystine, en van basische ontleding voor tryptofaan, volgens de methode beschreven in Methods in Enzymology vol. XI, 1967, 7 194443

Academic Press, New York. De samenstelling is vermeld in onderstaande tabel A samen met die voor andere basische proteasen waarvoor de gegevens zijn ontleend aan de literatuur. Blijkens tabel A bestaan er grote verschillen tussen API-21 en de andere enzymen in aminozuursamenstelling ten aanzien van onder meer serine, arginine, lysine, vlaine, alanine, tryptofaan en praline.

5

TABEL A

Aminozuursamenstelling van API-21 en andere basische proteasen 10 Aminozuur API-21 subtilisine subtilisine Νονοί) Carlsberg2) lysine 4 11 9 15 histidine 8 6 5 arginine 8 2 4 tryptofaan 0 3 1 asparaginezuur 11 9 /asparagine 27 17 19 20 threonine 10 13 19 serine 17 37 32 glutaminezuur 4 5 /glutamine 14 11 praline 7 14 9 25 glycine 30 33 35 alanine 26 37 41 valine 20 30 21 methionine 4 5 5 isoleucine 10 13 10 30 leucine 14 15 16 tyrosine 12 10 13 fenylalanine 4 3 4 cysteine 0 0 /cystine 0 0 0 35 1) J. Biol. Chem., 243.5296 (1968) 2) J. Biol. Chem., 243.2134 (1968) 40 Subtilisine Novo in bovenstaande tabel A is afkomstig uit Bacillus subtilis, en subtilisine Carlsberg uit Bacillus licheniformis. Beide bekende basische proteasen bevatten op de actieve plaats een serinerest en bezitten een moleculair gewicht van ongeveer 27 000 - 30 000 en een isoelektrisch punt van 9-11. Ook de meeste andere bekende extra cellulaire basische proteasen afkomstig uit bacteriën van het genus Bacillus bezitten een moleculair gewicht van 25 000 - 30 000 en een isoelektrisch punt van 9-11. De meeste 45 daarvan worden niet gedesactiveerd bij 10 min. verwannen bij 50°C en een pH 10 zoals het enzym volgens de uitvinding. Bekende basische proteasen met een lager moleculair gewicht die afkomstig zijn uit bacteriën van het genus Bacillus zijn E-1 en E-2 afkomstig uit Bacillus D-6. Beide enzymen hebben een moleculair gewicht van 20 000 en bij verwarmen bij 50°C en een pH 9,0 neemt hun activiteit niet af (zie de Japanse octrooipublicatie 56-4236). De reeds eerder genoemde basische protease afkomstig uit Bacillus alcolophilus 50 NCIB 10436 en NCIB 10438 daarentegen behouden ongeveer 90% van hun activiteit bij 10 min. verwarmen bij 50°C en een pH 10. En de reeds eerder genoemde basische proteasen subtilisine Carlsberg en subtilisine Novo behouden 70-80% van hun activiteit bij 10 min. verwarmen bij 50°C en een pH 10. De bekende basische proteasen afkomstig uit bacteriën behoudende tot het genus Bacillus zoals Bacillus subtilis zijn dus bij hoge temperatuur betrekkelijk stabiel in tegenstelling tot het enzym volgens de uitvinding 55 dat bij 10 min. verwarmen bij 50°C en een pH 10 het grootste gedeelte van zijn activiteit verliest. API-21 is stabiel bij 10 min. verwarmen tot 40°C en een pH 10. Bij 10 min. verwarmen bij 50°C en een pH 8 treedt desactivering op en na 10 min. verwarmen bij 60°C en een pH 8 is de activiteit voor het grootste gedeelte 194443 8 verdwenen. De boven vermelde verschillen tussen de bekende basische proteasen en API-21 zijn nog eens samengevat in onderstaande tabel B.

TABEL B

5 - basisch protease afkomstig uit moleculair isoelektrisch behoud van gewicht punt activiteit (%) bij 10 min. verwarmen 10 bij een pH 10

. 50°C 60°C

Bacillus licheniformis 27.2873) 9,43> 78 2

Bacillus subtilis 27.5374) 9,14) 70 1 15 Bacillus alcalophilus NCIB 10436 - 94 73

Bacillus alcalophilus NCIB 10438 25.000 - 85 63

Bacillus NKS-21 (API-21) 22.000 7,4 6 1 20 3) Fette Seiten Anstrichmittel. 75, blz. 49 (1973) 4) The Enzymes vol III blz. 564 (1971) API-21 kan in wasmiddelen worden gebruikt als builder omdat het stabiel is bij een pH 7-11,5 en de hoogste enzymatische activiteit wordt bereikt bij een pH 10-11. Zelfs bij betrekkelijk lage temperatuur van 25 bijvoorbeeld 20-30°C blijft de hoge activiteit behouden in tegenstelling tot de bekende enzymen in wasmiddelen. Derhalve is API-21 zeer geschikt in wasmiddelen voor wassen bij kamertemperatuur in landen zoals Japan. Verder kan het enzym worden gebruikt om afval (huishoudelijk afval) en afvalwater te behandelen om het daarin aanwezige proteïnemateriaal snel te ontleden. Een andere toepassing is in de voedingsindustrie omdat het enzym na gebruik snel kan worden gedesactiveerd door verwarmen bij 30 betrekkelijk lage temperatuur van 50-60°C. Dit maakt het enzym geschikt voor kwaliteitscontrole van het verwerkte voedsel.

Wanneer API-21 in wasmiddelen wordt opgenomen is dit gewoonlijk in een hoeveelheid van 5-500 nKatal (of 10'9 Katal), bij voorkeur 10-100 nKatal per gram wasmiddel maar deze grenzen zijn niet dwingend.

35 Behalve API-21 in de boven aangegeven hoeveelheid bevatten de wasmiddelen waarin het wordt gebruikt verder gebruikelijke bestanddelen. Voorbeelden daarvan zijn 10-50 gew.% oppervlakte actieve stof, tot 50 gew.% builder, 1-50 gew.% van een basisch middel of anorganische elektroliet, 0,1-5 gew.% van een anti-redepositiemiddel, een enzym, een bleekmiddel, een optische of fluorescerende kleurstof, een middel om aankoeken te voorkomen, en een antioxydant. Om verstuiven te voorkomen verdient het 40 aanbeveling om API-21 als een oplossing in het wasmiddel op te nemen.

Voorbeeld I

De nieuwe stam NKS-21 werd gekweekt op een schuin cultuurmedium. Het kweekproduct werd gesuspendeerd in gesteriliseerd water en van de suspensie werd 0,5 ml gebruikt om te enten.

45 Een enzymvormend cultuurmedium dat 1 gew.% caseïne, 1 gew.% vleesextract, 1 gew.% polypepton en 1 gew.% natriumwaterstofcarbonaat bevatte, werd ingesteld op een pH 9,5 of 7,2 door toevoegen van waterig natriumhydroxide of zoutzuur.

A. Van het bereide mediu- met een pH 9,5 werd 100 ml, 200 ml of 300 ml in 1 I Erlenmeyerkolven gebracht. Na steriliseren werd geënt met 0,5 ml van de boven bereide NKS-21 suspensie. Het kweken werd 50 uitgevoerd op een schudtafel bij 20°C en 200 omw./min. gedurende 41,65 of 89 uren.

B. Van het bereide medium met een pH 9,5 of 7,2 werd 100 ml in een 500 ml Sakaguchi-kolf gebracht. Na steriliseren werd geënt met 0,5 ml van de boven bereide NKS-21 suspensie. Het kweken werd uitgevoerd op een schudtafel bij 30°C en 110 omw./min. gedurende 66 of 90 uren.

Na afloop van het kweken werd de cultuurvloeistof 15 min. gecentrifugeerd bij 28 000 x g. De boven-55 staande vloeistof werd afgescheiden en de enzymatische activiteit van de oplossing werd bepaald zoals boven beschreven. De resultaten zijn in onderstaande tabellen C en D vermeld.

9 194443

TABEL C

Resultaten van A) 5 (20°C, begin pH van het medium 9,5) enzymatische activiteit (microkatal/liter) hoeveelheid medium (ml) 41 uren 65 uren 89 uren 100 1,3 2,6 2,7 10 200 2,0 4,3 4,0 300 2,5 5,6 5,4

TABEL D

^ resultaten van B) (30°C) enzymatische activiteit (microkatal/liter) begin pH van het medium 66 uren 90 uren 20 9,6 4,5 3,0 7,2 4,9 3,4

Bij kweken van NKS-21 op een schudtafel bij 30°C was de groei niet alleen bij een beginpH van het 25 medium van 9,5 goed maar ook bij een beginpH van 7,2 terwijl de snelheid waarmee API-21 werd gevormd in beide gevallen hoog was. En soortgelijke resultaten als bij kweken bij 20°C en een beginpH van 9,5 werden verkregen bij kweken bij 20°C en een beginpH van 7,2.

Van de na centrifugeren van de cultuurvloeistof en afscheiden verkregen oplossing werd 7 I afgekoeld tot 3°C. Te voren tot 3°C afgekoelde ethanol werd in 2 x de volumehoeveelheid toegevoegd onder vorming van 30 een neerslag. Het neerslag werd afgecentrifugeerd in een gekoelde centrifuge bij 11 000 x g en meteen gevriesdroogd in vacuo. Aldus werd 15,7 g (33% opbrengst) van het enzym als een poeder verkregen. De specifieke activiteit bedroeg 0,71 pKatal/kg proteïne (bepaling volgens Lowry).

Het gevriesdroogde enzym werd opgelost in 0,01 M natriumcarbonaat-boorzuur-kaliumchloridebuffer (pH 10,0) die 0,2 M natriumchloride bevatte. De enzymoplossing werd onderworpen aan gelfiltratie over een 35 kolom (diameter 2 cm, lengte 74 cm) gepakt met te voren met voornoemde buffer geëquilibreerd Sephadex G-75 (afkomstig van Pharmacia Fine Chemicals AB, Zweden). Het eluaat werd in fracties van 3 ml opgevangen en uit de hoofdfracties met de hoogste enzymatische activiteit werd het gezuiverde enzym verkregen. Moleculairgewicht: ongeveer 22 000 zoals geschat door gelfiltratie over Sephadex G-75 bij een pH 1). Isoelektrisch punt: 7,4 zoals geschat door bepaling volgens een elektrofocusseringsmethode.

40 De specifieke activiteit van het enzym was door de gelfiltratie met ongeveer 10 x toegenomen en bedroeg 7,0 pKatal/ kg proteïne. De opbrengst bedroeg 70%.

Voorbeeld II

Een cultuurmedium dat 1 gew.% caseïne, 1 gew.% vleesextract, 1 gew.% polypepton en 1 gew.% 45 natriumwaterstofcarbonaat bevatte, werd op een pH 9,5 ingesteld door toevoegen van waterig natriumhydroxide. Van het medium werd 300 ml in een 1 I Erlenmeyerkolf gebracht. Na steriliseren werd geënt met 0,5 ml van een NKS-21 suspensie zoals bereid in voorbeeld I. Het kweken werd 3 dagen bij 20°C uitgevoerd.

Na afloop werd 300 ml van het kweekproduct in een gesteriliseerde 30 I fermentator die 10 I van het boven bereide cultuurmedium met een pH 9,5 bevatte, gebracht. De fermentatie werd aëroob onder roeren 50 uitgevoerd bij 20°C gedurende 3 dagen bij een roersnelheid van 100 omw./min. en een beluchtingssnelheid van 12 l/min.

Van het kweekproduct werd 101 in een gesteriliseerde 500 I fermentator die 220 I van het boven bereide cultuurmedium met een pH 9,5 bevatte, gebracht. De fermentatie werd weer aëroob en onder roeren uitgevoerd bij 20°C maar gedurende 4 dage bij een roersnelheid van 400 omwjmin. en een beluchtingssnel· 55 heid van 200 l/min.

Na afloop werd de eultuurvloeistof gecentrifugeerd bij 11 000 x g in een gekoelde, continue centrifuge.

De bovenstaande vloeistof werd in een hoeveelheid van 200 I afgescheiden en afgekoeld tot 3°C. Te voren 194443 10 tot 3°C afgekoelde ethanol werd in 2 x de volumehoeveelheid toegevoegd onder precipitatie van API-21.

Het enzym werd afgecentrifugeerd bij ongeveer 11 000 x g in een gekoelde, continue centrifuge en meteen gevriesdroogd in vacuo. Aldus werd 1230 g (70% opbrengst) API-21 verkregen met een specifieke activiteit van 0,52 pKatal/kg proteïne.

5 Het enzym werd op dezelfde wijze als in voorbeeld I gezuiverd. Moleculairgewicht: ongeveer 22 000. isoelektrisch punt: bij een pH 7,4.

Voorbeeld III

10 API-21 en een in de handel verkrijgbaar basisch protease werden opgenomen in een wasmiddel waarmee weefsels met bloedvlekken werden gewassen.

A. Prepareren van katoenweefsels bevlekt met totaal bloed

Weefsels werden onder de hieronder aangegeven omstandigheden in vers totaal runderbloed waaraan onmiddellijk na het verzamelen 1 vol.deel natriumcitraatoplossing per 9 vol. delen bloed was toegevoegd om 15 ecaguleren te voorkomen, gedompeld waarna zij met een mangel voor 70% werden uitgewrongen ongelijkmatig bevlekte weefsels te verkrijgen. De weefsels werden aan de lucht gedroogd onder afschermen tegen direct zonlicht en daarna in het donker bewaard bij 0-5°C. Hierna werden de weefsels in stukken van 10 x 5 omgesneden.

20 Weefsels: 10 cm x 15 cm runderbloed: 100 ml per 10 weefsels

bevlekkingstemperatuur: 10 ± 2°C

bevlekkingstijd: 5 min. (om de 30 sec. werd de roerrichting veranderd) 25 B. Wasprocedure

De weefsels werden onder de hieronder aangegeven omstandigheden gewassen en gespoeld (3x) in een Terg-O-Tometer.

30

Wasomstandigheden bevlekte weefsels: 5 cm x 10 cm wasmiddel: 0,133% (0,7 nKat/ml enzym badverhouding: 1:85 35 roeren: 105 omw./min.

wastijd: 10 min.

Spoelomstandigheden bevlekte weefsels: 5 cm x 10 cm badverhouding: 1:85 40 roeren: 105omw./min.

spoeltijd: 3 min.

Na het spoelen werden de weefsels aan de lucht gedroogd onder afschermen tegen direct zonlicht.

45 C. Gebruikt wasmiddel en enzym

De volgende zes fosfaat en niet-fosfaatwasmiddelen werden gebruikt

Samenstelling met fosfaat zonder fosfaat oppervlakte actieve stof 15% 15% 50 natriumtripolyfosfaat 17 zeoliet - 17 natriumsilicaat 5 5 natriumcarbonaat 3 3 carboxymethylcellulose 1 1 55 water 8 8 natriumsulfaat rest rest 11 194443

De pH van elk wasmiddel bij een concentratie van 0,133 gew.% en een temperatuur van 25°C had de volgende waarde:

Oppervlakte actieve stof met fosfaat zonder fosfaat 5 NAS type1) 10,18 10,18 NDS type2) 9,76 9,86 AAS type3) 9,95 10,17 1) NAS: natrium lineair alkylbenzeensulfonaat 10 2) NDS: natriumdodecylsulfaat 3) AAS: alfa-alkeensulfonaat

Als enzymen werden gebruikt API-21 en een in de handel verkrijgbaar basisch protease.

De reinigende werking werd als volgt bepaald:

^ De bevlekte weefsels werden vóór en na het wassen 2 uren geëxtraheerd met 100 ml van een 0,1 N

waterige natriumhydroxideoplossing met een temperatuur van 90 ± 2°C. Het extract werd gekleurd met een koper-Folinreagens en de absorptie werd gemeten bij een golflengte van 750 nm. De reinigende werking (D) werd berekend uit de betrekking: 20 OW-SE^1'100

Da = absorptie van extract van bevlekt weefsel (1 g) gewassen zonder enzym Db = absorptie van extract van bevlekt weefsel (1 g) vóór wassen met enzym Dc = absorptie van extract van bevlekt weefsel - (1 g) na wassen met enzym 25

TABEL E

oppervlakte actieve stof fosfaat was- reinigende werking, % tempera-

30 tuur °C

water zonder API-21 handelsenzym protease 35 NAS type met 68,6 85,7 78,6 zonder 68,8 82,0 77,3 NDS type met 10eC 35,0 68,0 85,6 77,7 zonder 70,2 85,8 80,9 AAS type met 69,4 87,0 80,4 40 zonder 68,0 86,9 80,0 NAS type met 73,9 89,8 88,6 zonder 72,0 90,0 88,5 AAS type met 75,9 91,6 91,6 zonder 74,5 90,0 91,6 45 NAS type met 73,8 91,7 90,0 zonder 74,8 94,3 92,1 AAS type met 80,3 92,6 90,5 zonder 79,0 91,2 91,0 50

Voorbeeld IV

De wasproef in voorbeeld III werd herhaald met het API-21 bevattende wasmiddel zonder fosfaat en op basis van de oppervlakte actieve stof van het NAS type, en met verschillende protease-activiteiten. De resultaten zijn in onderstaande tabel F vermeld.

194443 12

TABEL F

Reinigende werking, % protease activiteit wastemperatuur 5 in wasmiddel -

(nKat/ml) 10°C 25°C 40°C

0 68,8 72,0 74,8 0,7 78,2 87,8 89,4 10 2,1 80,5 88,6 92,8 3,5 80,8 89,4 92,8 7 82,0 89,8 94,3

15 Voorbeeld V

Vuile halsboorden werden gewassen met verschillende wasmiddelen die API-21 of een in de handel verkrijgbaar basisch protease bevatten.

A. Prepareren van vuile halsboorden.

200 vuile halsboorden van 7 x 37 cm vervaardigd uit standaard katoenweefsel werden in stukjes van 1x5 20 cm gesneden. De halsboorden waren bevuild door 1 week dragen volgens de methode beschreven in Seni Seihin Shohi Kagaku 19 (1978), blz. 106-115. Van de stukjes halsboord werden er steeds 10 aan elkaar genaaid om een proefweefsel van 5 x 10 cm te verkrijgen. De proefweefsels werden in het donker bewaard bij een temperatuur van 0-5°C.

B. Wasprocedure 25 De weefsels werden onder de hierna aangegeven omstandigheden gewassen en gespoeld (3x) in een Terg-0-Tometer.

Wasomstandigheden vuile weefsels: 5 cm x 10 cm 30 wasmiddel: 0,133% (0,7 nKat/ml enzym badverhouding: 1:85 roeren: 105 omw./min.

wastijd: 10 min.

Spoelomstandigheden 35 vuile weefsels: 5 cm x 10 cm badverhouding: 1:85 roeren: 105 omw./min.

spoeltijd: 3 min.

40

Na het spoelen werden de weefsels aan de lucht gedroogd onder afschermen tegen direct zonlicht.

C. Gebruikt wasmiddel en enzym.

De volgende vier fosfaat en niet-fosfaatwasmiddelen werden gebruikt: 45 Samenstelling met fosfaat zonder fosfaat oppervlakte actieve stof 15% 15% natriumtripolyfosfaat 17 zeoliet (4A) - 17 natriumsilicaat 5 5 50 natriumcarbonaat 3 3 carboxymethylcellulose 1 1 water 8 8 natriumsulfaat rest rest

De pH van elk wasmiddel bij een concentratie van 0,133 gew.% en een temperatuur van 25°C had de volgende waarde: 55

Claims (3)

5 13 194443 oppervlakte actieve stof met fosfaat zonder fosfaat NAS type ’> 10,18 10,18 AAS type1 2 9,95 10,17

1. NAS: natrium lineair alkylbenzeensulfonaat

2. Basisch protease API-21, geproduceerd door de Bacillus stam van conclusie 1, welk protease de volgende eigenschappen bezit: 1. activiteit: hydrolyseert caseïne onder basische omstandigheden, optimale activiteit bij een pH 10-11 en een temperatuur van 45-50°C, 2. stabiliteit: geen vermindering in enzymatische activiteit bij 10 min. verwarmen tot 40°C bij een pH 10 45 in afwezigheid van substraat, vermindering in enzymatische activiteit van 90% of meer bij 10 min. 2 verwarmen bij 50°C en een pH 10, beginnende desactivering bij 10 min. verwarmen bij 50°C en een pH 8 en volledige of nagenoeg volledige desactivering bij 10 min. verwarmen bij 60°C en een pH 8, stabiel onder basische omstandigheden, in het bijzonder bij een pH 7-11,5, en bestand tegen bevriezen en vriesdrogen, en 194443 14 3. enzymmolecuul: het protease is een proteïne met een moleculair gewicht van ongeveer 22 000 zoals geschat met een gelfiltratiemethode, een isoelektrisch punt van 7,4 zoals geschat met een elektrofocus-seringsmethode, een absorptiepiek in het UV spectrum bij 275-282 nm, een IR absorptiespectrum zoals weergegeven in figuur 5, en een serinerest op de actieve plaats.

2. AAS: alpha-alkeensulfonaat

10 Als enzymen werden gebruikt API-21 en een in de handel verkrijgbaar basisch protease. De resultaten zijn in onderstaande tabel G vermeld. TABEL G 15 reinigende werking, % was- -- oppervlakte aktieve stof fosfaat tempera- water zonder API-21 handels- tuur, °C enzym protease 20 - NAS type met 70,1 82,0 77,9 zonder 66,7 82,1 73,6 AAS type met 10 49,3 80,4 87,4 86,4 zonder 75,0 86,8 83,3

25 NAS type met 78,7 85,7 79,0 zonder 78,0 80,1 74,2 AAS type met 25 52,1 80,4 89,6 87,3 zonder 80,2 91,2 88,1 NAS type met 80,3 86,8 86,9 30 zonder 81,0 91,2 89,7 NAS type met 40 58,3 82,6 90,1 89,0 zonder 86,1 89,1 90,4 35 Bacillus stam, gedeponeerd en verkrijgbaar bij het Fermentation Research Institute (FRI) in Japan als Bacillus sp. FERM BP-93, dat in staat is om onder basische omstandigheden een protease te produceren.

3. Enzym bevattend wasmiddel, welk wasmiddel het basische protease API-21 van conclusie 2 bevat. Hierbij 4 bladen tekening