NL8302790A - Basisch protease en werkwijze ter verkrijging daarvan. - Google Patents

Description

*· 'ï

Basisch protease en werkwijze ter verkrijging daarvan.

Basisch protease wordt veel gebruikt in bijvoorbeeld de leer-industrie, voedingsindustrie, textielindustrie en farmaceutische industrie omdat het meer warmtebestendig zou zijn dan neutraal protease. Ook in wasmiddelen wordt het de .. *1 5 laatste tijd veel toegepast.

De in wasmiddelen toegepaste basische proteasen zijn verkregen uit bacteriën behorende tot het genus Bacillus en hebben een maximum aktiviteit bij een pH van ongeveer 9“10.

De meeste van deze enzymen vertonen een maximum aktiviteit bij 10 een betrekkelijk hoge temperatuur van in het bijzonder ongeveer 60°C, maar zijn minder of in het geheel niet aktief bij betrekkelijk lage temperatuur, in het bijzonder ongeveer kamertemperatuur. Daardoor kunnen hun eigenschappen niet volledig worden benut in een land zoals Japan waar lijfgoed 15 gewoonlijk bij kamertemperatuur wordt gewassen. En omdat de laatste tijd steeds meer lijfgoed uit synthetische vezels met een betrekkelijk lage warmtebestendigheid wordt gedragen, bestaat er behoefte aan enzymen voor wasmiddelen die zelfs bij betrekkelijk lage temperatuur aktief zijn.

20 Volgens de uitvinding eordt hieraan tegemoet gekomen met een nieuw basisch protease aangeduid met API-21 dat de volgende eigenschappen heeft: 1) aktiviteit: hydrolyseert caseïne onder basische omstandigheden, optimaal bij een pH 10-11 en een temperatuur 25 van lt5“50°C; 2) Stabiliteit: geen vermindering in aktiviteit bij 10 min. verwarmen tot Uo°C bij een pH 10 in afwezigheid van substraat, maar een aktiviteitsvermindering van 90 % of meer bij 10 min. verwarmen bij 50°C en een pH 10.

30 Desaktivering treedt op bij 10 min. verwarmen bij 50°C en een pH 8 en is praktisch volkomen na 10 min. verwarmen bij 60°C en een pH 8. Het protease is stabiel onder basische --* 8302790 - 2 - » ΐ omstandigheden, in het "bijzonder "bij een pH en bestendig tegen bevriezen en' vriesdrogen; 3) Molekuulgewicht van het proteïne: ongeveer 22 000 zoals geschat door gelfiltratie over Sephadex G-75 5 bij een pH 10; isoelekbrisch punt: 7,U zoals geschat door elektrofocussering; UV absorptiepiek: bij 275-282 nm; IR absorptie-eigenschappen: zoals weergegeven in fig. 5ï en het enzym bezit op de aktieve plaats een serinerest.

De uitvinding heeft verder betrek-king op een 10 werkwijze ter verkrijging van het basisch protease API-21 door kweken van het species NKS-21 behorende tot het genus Bacillus dat in staat is om het basisch protease API-21 in een basisch cultuurmedium te vormen, en winnen van het basisch protease API-21 uit de cultuurvloeistof.

15 Ter toelichting op de eigenschappen van het enzym volgens de uitvinding wordt verwezen naar de figuren. In fig. 1 is de relatieve aktiviteit uitgezet tegen de pH.

Uit de grafiek blijkt dat de optimale aktiviteit bij een pH ΙΟΙ 1 ligt. Fig. 2 heeft betrekking op de bestendigheid van het 20 enzym bij afwezigheid van substraat tegen verschillende pH's.

In fig. 3 is de relatieve aktiviteit uitgezet tegen de temperatuur. Uit de grafiek blijkt dat de optimale aktiviteit bij een temperatuur van ongeveer 50°C ligt. De figuren en l*B hebben betrekking op de bestendigheid van het enzym bij 25 afwezigheid van substraat tegen verschillende temperaturen bij een pH van resp. 10 en 8. In fig. 5 is het Fourier Transform Infrarood Spectrum van het enzym weergegeven.

Het nieuwe microorganisme waaruit het basisch protease API-21 wordt gewonnen, te weten Bacillus sp. nov. NKS-21, in 30 het vervolg als NKS-21 aangeduid, werd geïsoleerd uit bodem- materiaal bij Fuchu-shi, Tokio, Japan. Het is gebleken,dat NKS-21 een nieuwe, aerobe sporangium bacterie is die behoort tot het genus Bacillus. Het species NKS-21 is op 3 februari 1982 bij het Fermentation Research Institute (FRI) in Japan 35 gedeponeerd als Bacillus sp. FERM BP-93· Deze verzameling is 8302790 • * - 3 - bij het verdrag van Boedapest erkend. Het microorganisme wordt op verzoek ter beschikking gesteld aan derden om de onderhavige uitvinding te testen.

De microbiologische eigenschappen van NKS-21 zijn 5 in het onderstaande vermeld. De toegepaste reagentia en iso- leringsmethoden zijn volgens Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8e druk, 197^· De bacterie werd uit bodemmateriaal geïsoleerd door een kleine hoeveelheid daarvan toe te voegen aan een peptonmedium en het kweken uit te voeren op een schudtafel 10 bij een temperatuur van 10-U0°C en een pH 7“10 gedurende Uo-150 uren. Een gedeelte van het kweekprodukt werd uitgespreid op agarplaten waarna de stam op gebruikelijke wijze werd geïsoleerd. Microbiologische eigenschappen van NKS-21 a) Morfologische karakteristieken 15 1) grootte van vegitatieve cellen: 0,6-0,8 jxbl x 2,5-3,5 jm 2) cel pleomorfisme: cellen zetten soms uit tot een grootte van 0,6-1,0 ^im x U,5 jm.

20 3) Gram-kleuring: positief maar snel ontkleurd.

k) motiliteit: motile met peritriche flagellae.

5) sporen: 25 ovaal tot elliptisch, subterminaal, 0,8 x 1,2 yum.

6} sprangia: licht gezwollen.

7) zuurvastheid: 30 negatief b) Kweekkarakteristieken in verschillende media l) peptonbouillon:

a) pH 9,5· goede groei 1¾ 20°C en 30°C

pH 7,2: schrale groei bij 20°C en goede groei

35 bij 30°C

8302790 - 1» -

i V

b) groeitemperatuur bij pH 9»5: groei tussen 1U en kl°C geen groei boven b3°C of onder 12°C 2) andere media: 5 schuine vleesextract-peptonagar: goede groei; vleesextract-peptonbouillon met 7 % NaCl: goede groei vleesextract-peptonbouillon: 10 goede groei schuine caseine-vleesextract-pepton agar goede groei caseine-vleesextract- peptonbouillon: goede groei 15 zetmeel-peptonbouillcn: goede groei glucose-peptonbouillon: goede groei tripton-gistextractagarplaat: 20 goede groei zetmeel-gistextractbouillon: groei vleesextract-gelatineplaat: a) pH 10,0, 30°C: 25 groei en vervloeiing b) pH 10,0, 20°C: zwakke oppervlaktegroei en zwakke vervloeiing c) pH 7,2, 30°C: groei en vervloeiing 30 d) pH 7,2, 20°C: zwakke oppervlaktegroei en vervloeiing 3) Groei onder anaerobe omstandigheden: geen groei onder anaerobe maar wel groei onder aerobe omstandigheden.

35 c) Fysiologische karakteristieken 8302790 * % - 5 - 1} reductie van nitraat tot nitriet: geen reductie 2} anaerobe gasvorming uit nitraat: negatief 5 3) methyl rood (MR) test: negatief k) Voges-Proskauer (VP) test: negatief 5) indoolvorming: 10 geen 6) vorming van H^S: geen T) zetmeelhydrolyse: positief 15 8) benutting van citraat: positief 9) benutting van anorganische stikstofbron: benut nitraten en ammoniumzouten 10) pigmentvorming: 20 geen 11) urease test: negatief 12) cytochroomoxydasetest: positief 25 13) kat alaset est: positief 14) 0-F test (Hugh, en Leifson’s medium): zwakke fermentatie 15) zuurvorming en gasontwikkeling uit koolwaterstoffen: 30 3302790 i i - 6 - zuurvorming gas-ontwikkeling L-arabinose - - D-xylose D-glucose + - 5 D-mannose + D-fructose - D-galactose + maltose + sucrose + - 10 lactose trehalose + - D-sorbitol + D-mannitol + inositol + 15 glycerol + zetmeel + - ribose - - raffinose + cellobiose + - on . .

+: positief, negatief 16) Andere karakteristieken: a) deaminering van fenylalanine: positief b) caseinehydrolyse: 2*5 . .

J positief c) tyrosineontleding positief

Uit het bovenstaande blijkt dat de stam NKS-21 een aerobe sporangium bacterie is waarvan wordt aangenomen dat 90 . .

J hij behoort tot het genus Bacillus. De karakteristieken van deze stam zijn dat hij in neutraal tot basisch medium groeit en dat de pH voor de optimale groei 8-10 bedraagt. Deze microbiologische eigenschappen zijn soortgelijk aan die voor de bekende stammen Bacillus pasteurii en Bacillus alcalouhilus.

Naast overeenkomsten zijn er echter ook verschillen in micro- _________ _Λ 8302790 * * - 7 - biologische eigenschappen. Zo groeien bijvoorbeeld de stammen Bacillus pasteurii en Bacillus alcalophilus beide in basisch milieu maar de laatste groeit niet bij een pH 7» Daarentegen groeit NKS-21 niet alleen goed in basisch milieu maar ook in 5 neutraal milieu. In dit opzicht verschilt KKB—21 dus van

Ban-inns alcalophilus. Verder hydrolyseert Bacillus pasteurii geen zetmeel maar NKS-21 vel. Daarnaast zijn er nog de volgende verschillen tussen NKS-21 en Bacillus pasteurii: 1} Bacillus pasteurii reduceert nitraten en NKS-21 10 niet; 2) Bacillus pasteurii heeft bolvormige tot bijna ovale endosporen en NKS-21 ovale tot elliptische endosporen; en 3) Bacillus pasteurii ontleedt ureum en NKS-21 niet.

Hieruit blijkt dus dat de microbiologische eigen- 15 schappen van NKS-21 sterk verschillen van die van 3acillus pasteurii

De klassificatiekarakteristieken van Bacillus alcalophilus zijn niet in detail beschreven in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8 druk 197**·. Omdat de standaard 20 stam Bacillus alcalophilus niet beschikbaar was, zijn de microbiologische eigenschappen van NKS-21 experimenteel vergeleken met die van de oorspronkelijke stammen Bacillus alcalophilus NCIB 10^36 en NCIB IOU38 aaagehaald in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8e druk 1971*·· NCIB 10¾36 25 en NCIB 10**38 zijn beide enigszins positief bij Gramkleuring en vorden snel ontkleurd, dus net zoals NKS-21.

Voor wat de morfologische karakteristieken van de vegetatieve cellen betreft, elektronenmicroscopisch onderzoek van NCIB IOU36 geeft korte staafjes te zien met een grootte 30 van 0,7 x 2,0 γα. en lange staafjes met een grootte van 0,8 x U,6 pm.· NCIB 101*38 heeft vegetatieve cellen met een grootte van 0,7 x 1,5yum onder de elektronenmicroscoop. Daarentegen heeft NKS-21 onder de elektronenmicroscoop vegetatieve cellen met een grootte van 0,6-0,8 x 2,5-3,5 ^im en hebben de endosporen 35 een ovale tot elliptische vorm met een grootte vah 0,8 x 1,2 ^im. Mötiliteit voor NCIB 1Q**36 en NCIB 101*38 werd niet vaar- 8302790 I » - 8 - genomen maar vel voor NKS-21. Verder zijn er nog de volgende verschillen in fysiologische eigenschappen tussen NCIB 10^36 en NCIB 10^38 enerzijds en NKS-21 anderzijds: 1) Bacillus alcalophilus NCIB 10^36 en NCIB 10^38 5 groeien niet in een mannitol medium en NKS-21 wel; en 2) NCIB IOU36 groeit niet in een vleesextract-pepton bouillon met J % NaCl en NCIB 10^8 en NKS-21 vel.

Uit de boven genoemde verschillen blijkt dat er tussen NKS-21 enerzijds en Bacillus alcalophilus NCIB 10^36 en NCIB 10 10U38 anderzijds een duidelijk onderscheid bestaat hoewel NKS-21 in sommige microbiologische eigenschappen overeenkomt met Bacillus alcalophilus.

Verder komt NKS-21 overeen met Bacillus subtilis in de grootte van de vegetatieve cellen die voor Bacillus 15 subtilis 0,7-0,8 x 2-3 ^un. bedraagt en in de zetmeelhydrolyse.

Maar van Bacillus subtilis onderscheid NKS-21 zich op de volgende punten: 1) Bacillus subtilis groeit goed bij een pH 595~ 8,5 maar groeit niet bij een pH 9“ 10 zoals NKS-21; en 20 2) De temperatuur voor de optimale groei van

Bacillus subtilis bedraagt ^5-55°0 terwijl NKS-21 niet groeit boven h-3°C.

NKS-21 is dus duidelijk verschillend van Bacillus pasteurii. Bacillus alcalophilus en Bacillus subtilis. en 25 enige stam met dezelfde microbiologische eigenschappen als NKS-21 is niet beschreven in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8 druk 197^« Hieruit kan worden besloten, dat NKS-21 een nieuwe stam is die behoort tot het genus Bacillus.

Het nieuwe basische protease API-21 met een hoge 30 aktiviteit bij betrekkelijk lage temperatuur wordt verkregen door het nieuwe species NKS-21 te kweken in een basisch cultuurmedium en uit de cultuurvloeistof het gevormde protease te winnen. Behalve NKS-21 zelf kunnen ook natuurlijke en kunstmatige mutanten daarvan worden gebruikt voor het vormen 35 van protease API-21. Deze mutanten vallen binnen het kader 8302790 9 « - 9 - van de uitvinding.

Het kweken van NKS-21 kan aëroob worden uitgevoerd in bijvoorbeeld een peptonkweekmedium met een pH 8-10 op een schudtafel of aëroob onder roeren van de cultuur na enten met 5 NKS-21, bij een temperatuur van 10-U0°C gedurende UO-150 uren.

De gevormde cellen worden gemakkelijk afgescheiden en het protease API-21 kan gemakkelijk uit de opgehelderde bovenstaande vloeistof worden geprecipiteerd met een organische vloeistof zoals ethanol. Het neerslag wordt das afgescheiden door 10/ centrifugeren en gevriesdroogd in vacuo.

De aktiviteit van het aldus gewonnen basische protease API-21 kan als volgt worden bepaald:

De heldere cultuurvloeistof of de enzymoplossing wordt passend verdund met 0,1 M natriumcarbonaat- 0,1 M 15 boorzuur ~ kaliumchloridebufferoplossing (pH10,0). Aan 0,5 ml van de verkregen oplossing wordt 0,5 ml 2 5-ige melkcaseïne-oplossing met een pH 10,0 toegevoegd waarna een enzymatische reaktie wordt uitgevoerd bij 30°C gedurende 10 min. De reaktie wordt gestopt door toevoegen van 2 ml 0,1 M trichloorazijnzuur 20 dat 0,2 M azijnzuur en 0,2 M natriumacetaat bevat. Na 10 min. of langer staan bij 30°C wordt het mengsel over filtreerpapier gefiltreerd. Aan 1 al van het filtraat worden 5 ml 0,U M natriumcarbonaat en 1 ml 5x verdund "fenolreagens" toegevoegd waarna het mengsel 20 min. wordt weggezet bij 30°C onder 25 kleurontwikkeling. Aan het gekleurde mengsel wordt de absorptie gemeten bij 660 nm. De enzymeenheid wordt bepaald volgens de richtlijnen van de Commission on Biochemical Nomenclature (Comprehensive Biochemistry vol. 13, 1973, biz. 26-27). Volgens deze richtlijnen wordt de hoeveelheid basisch protease die in 30 trichloorazijnzuur oplosbare stoffen vrijmaakt, welke stoffen de kleur bij 660 nm ontwikkelen overeenkomend met 1 mol tyrosine uit 1 % caseïnesubstraat met een pH 10,Q bij 30°C gedurende 1 sec., gedefinieerd ds 1 katal.

In het hierna volgende zijn de fysicochemische eigen-35 schappen van het basisch protease API-21 volgens de uitvinding 8302790 - 10 - nader beschreven.

1) Aktiviteit API-21 hydrolyseert proteïnen zoals caseïne, hemoglobine, albumine, globuline, vleesproteïne, visproteïne en 5 soj aboonproteïne.

2) Invloed van de pH op de enzymatische aktiviteit. Zoals uit fig. 1 blijkt, ligt de optimale relatieve aktiviteit bij een pH van ongeveer 10-11. De relatieve aktiviteit vordt als volgt bepaald: 10 Elk van de hieronder aangegeven bufferoplossingen (0,5 ml) die 2 % melkcaseïne bevatten, wordt toegevoegd aan 50 jü. van de enzymoplossing.

pH bufferoplos sing

6-9 0,1 M kaliumfosfaat - 0,05 M

15 natriumboraat 9-11 0,1 M natriumcarbonaat - 0,1 M boor- zuur kaliumchloride 11-12 0,1 M dinatriumwaterstoffosfaat- natriumhydroxyde 20 Aan de testoplossing wordt de enzymatische aktivi teit bepaald zoals boven beschreven. De relatieve aktiviteit {%) wordt berekend, waarbij de enzymatische aktiviteit bijeen pH 10,0 op 100 % wordt gesteld.

3) Invloed van de pH op de stabiliteit bij afwezig- 25 heid van substraat.

Zoals uit fig. 2 blijkt, is het enzym stabiel bij een pH van ongeveer 7“11,5· De stabiliteit van het enzym wordt als volgt bepaald:

Elk van de hieronder aangegeven bufferoplossingen 30 0,5 ml) wordt toegevoegd aan 50 jil van de gedialyseerde en passend verdunde enzymoplossing waarna het mengsel 10 min. bij 30°C wordt geincubeerd.

8302790 * · - 11 - pH _bufferoplossing_ 3-8 0,1 M citroenzuur - 0,2 M dinatriumwaterstof- fosfaat 8-11 0,1 M natriumcarbonaat - 0,1 M boorzuur - kalium- 5 chloride 11-12 0,15 M dinatriumwaterstoffosfaat - natriumhydro- xyde

Na afloop van het incuberen wordt 9,5 ml 0,1 M carbonaatbufferoplossing die 2 % caseïne bevat en een pH 10 10,0 heeft, toegevoegd. De enzymatische aktiviteit van het mengsel vordt bepaald zoals boven beschreven. De relatieve aktiviteit {%) wordt berekend, waarbij de enzymatische aktiviteit bij een pH 10,0 op 100 % wordt gesteld.

Blijkens fig. 2 is het enzym het meest stabiel bij een 15 pH van ongeveer 10-11. Bij deze pH blijft de oorspronkelijke aktiviteit van het enzym volledig behouden. Tussen een pH 7 en 11,5 blijft 80 % of meer van de oorspronkelijke aktiviteit behouden.

4) Invloed van de temperatuur op de enzymatische 20 aktiviteit.

Zoals uit fig. 3 blijkt, hydrolyseert het enzym caseïne bij een temperatuur van 5-65°C en een pH 10,0. De optimale aktiviteit ligt bij een temperatuur van ^5-50°C.

5) Invloed van de temperatuur op de stabiliteit bij 25 afwezigheid van substraat.

Blijkens de fig. en blijft de aktiviteit van het enzym volledig behouden bij 10 min. verwarmen tot ^0°C bij een pH 10,0, maar gaat de meeste aktiviteit verloren bij 50°C.

Verder blijft de aktiviteit behouden bij 10 min. verwarmen tot 30 ^5°C bij een pH 8, maar treedt desaktivering op bij 50°C en wordt het enzym geheel of nagenoeg geheel gedesaktiveerd bij 6o°c.

6} Opslagstabiliteit

Het enzym is bestand tegen bevriezen en vriesdrogen.

35 Na 2 weken bewaren van een gevriesdroogd monster bij kamer- ----- 8302 790 ί * i - 12 - * temperatuur werd geen aanmerkelijke achteruitgang in de aktivi-teit waargenomen. Bij bewaren van een gevriesdroogd monster in een exsicator bij kamertemperatuur bleef de aktiviteit geheel behouden.

5 7) Inhibitie

Het enzym wordt sterk geinhibiteerd door een aktieve serinerestinhibitor zoals diisopropylfluorfosforzuur en fenylmethaansulfonylfluoride. Ook door benzyloxycarbonyl-fenylalanine-chloormethylketon wordt het geinhibiteerd. Het 10 enzym wordt daarentegen niet geinhibiteerd door tosyl-fenyl- alanine-chloormethylketon dat een inhibitor is van een dierlijk serineprotease, chymotrypsine en tosyl-lysine-chloor-methylketon dat een trypsineinhibitor is.

Verder wordt de aktiviteit van het enzym niet 15 ongunstig beïnvloed door p-chloor-kwik(II)benzoaat en ethyleen- diaminetetraacetaat. Pepstatine heeft ook geen ongunstige invloed op de aktiviteit. Uit deze inhibitiegegevens volgt dat het enzym een protease met een serinerest op de aktieve plaats is.

20 8) Enzymatische aktiviteit

Voor de bepalingsmethode: zie boven 9) Molekuulgewicht

Het molekuulgewicht van het enzym is ongeveer 22 000 zoals geschat door gelfiltratie over Sephadex G-75 25 bij een pH 10.

10) Isoelektrisch punt

Het isoelektrische punt van het enzym bedraagt 7»^ zoals geschat door elektrofocussering.

11) UV absorptie 30 Absorptiepiek Üj 275-282 ^im in het ansorptiespectrum.

12) IR absorptiespectrum

Zoals weergegeven in fig. 5· 13) Elementair analyse

Niet bepaald omdat dit niet goed mogelijk is voor 35 stoffen met een dergelijk hoog molekulair gewicht.

8302790 κ i · - 13 - 1k} Aminozuursamenstelling

Voorlopige "berekening op basis van de resultaten van zure hydrolyse van het enzym behalve voor cysteine/cystine en tryptofaan, van ontleding met permierezuur voor cysteine/ 5 cystine, en van basische ontleding voor tryptofaan, volgens de methode beschreven in Methods in Enzymology vol. XI, 19^7, Academie Press, New York. De samenstelling is vermeld in onderstaande tabel A samen met die voor andere basische proteasen waarvoor de gegevens zijn ontleend aande literatuur. Blijkens 10 tabel A bestaan er grote verschillen tussen API-21 en de andere enzymen in aminozuursamenstelling ten aanzien van onder meer serine, arginine, lysine, vlaine, alanine, tryptofaan en praline.

15 8302790

- 1¾. -Tabel A

Aminozuursamenstelling van API-21 en andere basische proteasen

Aminozuur API-21 subtilisine subtilisine

Novo Carlsberg lysine U 11 9 histidine 86 5 arginine 82 b tryptofaan 0 3 1 asparaginezuur 11 9 /asparagine 27 17 19 threonine 10 13 19 serine 17 37 32 glutaminezuur ^ 5 /glutamine ^ n 7 proline 7 1^ 9 glycine 30 33 35 alanine 26 37 ^1 valine 20 30 21 methionine b 5 5 isoleucine 10 13 10 leucine 1¾ 15 16 tyrosine 12 10 13 fenylalanine 3 b cysteine 0 0 0 /cystine 1) J. Biol. Chem., 2^3.5296 (1968) 2) J. Biol. Chem., 2^3.213^ (1968)

Subtilisine Novo in bovenstaande tabel A is afkomstig uit Bacillus subtilis, en subtilisine Carlsberg uit Bacillus licheniformis. Beide bekende basische proteasen bevatten op de aktieve plaats een serinerest en bezitten een molekulair gewicht van ongeveer 27 000 - 30 000 en een isoelektrisch punt van 9~11 - Ook de meeste andere bekende extra cellulaire basische proteasen afkomstig uit bacteriën van het genus Bacillus bezitten _ 8302790 ~ 15 - f » een molekulair gewicht van 25 000 - 30 000 en een isoelektrisch punt van 9 - 11« De meeste daarvan worden niet gedesaktiveerd bij 10 min. verwannen bij 50°C en een pH 10 zoals het enzym volgens de uitvinding. Bekende basische proteasen met een 5 lager molekulair gewicht die afkomstig zijn uit bacteriën van het genus Bacillus zijn E-1 en E-2 afkomstig uit Bacillus D-6.

Beide enzymen hebben een molekulair gewicht van 20 000 en bij verwarmen bij 50°C en een pH 9,0 neemt hun aktiviteit niet af (zie de Japanse octrooipublicatie 56-b23ë). De reeds eerder 10 genoemde basische protease afkomstig uit Bacillus alcolophilus NCIB 10k36 en NCIB IOU38 daarentegen behouden ongeveer 90 % van hun aktiviteit bij 10 min. verwarmen bij 50°C en een pH 10.

En de reeds eerder genoemde basische proteasen subtilisine Carlsberg en subtilisine Novo behouden 70-80 % van hun 15 aktiviteit bij 10 min. verwarmen bij 50°C en een pH 10. De bekende basische proteasen afkomstig uit bacteriën behoudende tot het genus Bacillus zoals Bacillus subtilis zijn dus bij hoge temperatuur betrekkelijk stabiel in tegenstelling tot het enzym volgens de uitvinding dat bij 10 min. verwarmen bij 20 50°C en een pH 10 het grootste gedeelte van zijn aktiviteit verliest. API-21 is stabiel bij 10 min. verwarmen tot ^0°C en een pH 10. Bij 10 min. verwarmen bij 50°C en een pH 8 treedt desaktivering op en na 10 min. verwarmen bij 60°C en een pH 8 is de aktiviteit voor het grootste gedeelte verdwenen. De 25 boven veimelde verschillen tussen de bekende basische proteasen en API-21 zijn nog eens samengevat in onderstaande tabel B.

8302 79 0 - 16 - ö •η

S

Ο •ο •Η ° Ο ο ο cm or on «- w ο νο t- \ο •Η — m *rI η ί ρ. p- -p σι

•HG rH

>· <u ^ •H tt) +» σι -¾ "t ^

Qj «Η

Sc o h' -- S°O00O -cf LA VO ^f' Ό k la cK co

C c in -I

OS r~ w rö ^ <u qj . »a*

A > iH S

a) in +i J-l

Η N

I 3 Λ ·Η Η « V-J Η m 4J Η p to fn c Η

43 -4- rtO

PQ +3 on > οι g λ ^ . , -=r g Η H 3 * · « » * (1)01

¢) Ο) ft On ON t— 4J<U

jj -8 <3 1

ε-1 ·Η CO N

c

Ο) M

+J

+) ω

, (U A

* fe £π Ή gj ^ ^ +3 m -=r on .λα} o c— t— ο σ

<1J ·Η OO CO Ο O

H S CM tA Ο O

o <U ♦ · I * »

§60 t— t— LA CO

CM CM CM CM

<0 CM

•H tfl Μ i

0) 6 3 Si H

W Η H ft

CÖ O Ή ·Η <C

<U +» V« ω ,0 A w +3 ·Η ·Η ·Η P4 ft ® ί G Η Ο O *“

h <0 ·Η Η H CM

ft 60 X! -P ί a I

•η ο Λ ο o CO

Λ +> ·η ί H H hi o to h to aj vo · π co a; οι ε m co •ho to to toj- to «3- to toii O 3 ίο ίο ί ί Vi Η Η γΗ γΗ ·“ r-f O d Η Η Η γΗ Η •Η Ή ·Η Μ ·Η W ·Η ο υ υ μ ο μ ο ί ί ίο ίο ί pq ρα pq S « ö « 8 3 0 2 7 9 0“ - 17 - API-21 kan in wasmiddelen worden gebruikt als builder omdat bet stabiel is bij een pH 7“11,5 en de hoogste enzymatische aktiviteit wordt bereikt bij een pH 10-11. Zelfs bij betrekkelijk lage temperatuur van bijvoorbeeld 20-30°C 5 blijft de hoge aktiviteit behouden in tegenstelling tot de bekende enzymen in wasmiddelen. Derhalve is API-21 zeer geschikt in wasmiddelen voor wassen bij kamertemperatuur in landen zoals Japan. Verder kan het enzym worden gebruikt om afval (huishoudelijk afval) en afvalwater te behandelen om 10 het daarin aanwezige proteinemateriaal snel te ontleden. Een andere toepassing is in de voedingsindustrie omdat het enzym na gebruik snel kan worden gedesaktiveerd door verwarmen bij betrekkelijk lage temperatuur van 50-6o°C. Dit maakt het enzym geschikt voor kwaliteitscontrole van het verwerkte voedsel. 15 Wanneer API-21 in wasmiddelen wordt opgenomen is dit gewoonlijk in een hoeveelheid van 5“500 nKatal (of 10 ^ Katal), bij voorkeur 10-100 nKatal per gram wasmiddel maar deze grenzen zijn niet dwingend.

Behalve API-21 in de boven aangegeven hoeveelheid 20 bevatten de wasmiddelen waarin het wordt gebruikt verder gebruikelijke bestanddelen. Voorbeelden daarvan zijn 10-50 gev.% oppervlakte aktieve stof, tot 50 gev.% builder, 1-50 gew.5? van een basisch middel of anorganische elektroliet, 0,1-5 gev.% van een anti-redepositiemiddel, een enzym, een bleekmiddel, 25 een optische of fluorescerende kleurstof, een middel om aan koeken te voorkomen, en een antioxydant. Om verstuiven te voorkomen verdient het aanbeveling om API-21 als een oplossing in het wasmiddel op te nemen.

Voorbeeld I

30 De nieuwe stam HKS-21 werd gekweekt op een schuin cultuurmedium. Het kweekprodukt werd gesuspendeerd in gestereli-seerd water en van de suspensie werd 0,5 ml gebruikt om te enten.

Een enzymvormend cultuurmedium dat 1 gev.% caseïne, 35 1 gev.% vleesextract, 1 gev.% polypepton en 1 gev.% natrium- 8302790 - 18 - waterstofcarbonaat bevatte, werd ingesteld op een pH 9,5 of 7,2 door toevoegen van waterig natriumhydroxyde of zoutzuur.

A) Van het bereide mediu- met een pH 9,5 werd 100 ml, 200 ml of 300 ml in 1 1 Erlenmeyerkolven gebracht.

Na steriliseren werd geënt met 0,5 ml van de boven bereide NKS-21 suspensie. Het kweken werd uitgevoerd op een schudtafel bij 20°C en 200 omw./min. gedurende 1*1,65 of 89 uren.

B) Van het bereide medium met een pH 9,5 of 7,2 werd 100 ml in een 500 ml Sakaguchi-kolf gebracht. Na steriliseren werd geënt met 0,5 ml van de boven bereide NKS-21 suspensie. Het kweken werd uitgevoerd op een schudtafel bij 30°C en 110 omw./min. gedurende 66 of 90 uren.

Na afloop van het kweken werd de cultuurvloeistof 15 min. gecentrifugeerd bij 28 000 x g. De bovenstaande vloeistof werd afgescheiden en de enzymatische aktiviteit van de oplossing werd bepaald zoals boven beschreven. De resultaten zijn in onderstaande tabellen C en D vermeld.

Tabel C

Resultaten van A) (20°C, begin pH van het medium 9.5) enzymatische aktiviteit hoeveelheid -(mierpkataL/liter)- medium (ml) 1*1 uren 65 uren 89 uren 100 1,3 2,6 2,7 200 2,0 1*,3 1,0 300_2^5_5^6_5 Λ 8302790 - 19 -

Tabel D

resultaten, van B) (30°C) enzymatische aktiviteit begin pH ren [m&m&ilit'il- 5 het medium 66 uren 90 uren 9,6 U,5 3,0 7,2 k,9 3Λ

Bij kweken van NKS-21 op een schudtafel bij 30°C was de groei niet alleen bij een beginpH van het medium van 10 9,5 goed maar ook bij een beginpH van 7,2 terwijl de snelheid waarmee AFI-21 werd gevormd in beide gevallen hoog was. En soortgelijke resultaten als bij kweken bij 20°C en een beginpH van 9,5 werden verkregen bij kweken bij 20°C en een beginpH van 7,2.

15 Van de na centrifugeren van de cultuurvloeistof en afscheiden verkregen oplossing werd 7 1 afgekoeld tot 3°C.

Te voren tot 3°C afgekoelde ethanol werd in 2 x de volume-hoeveelheid toegevoegd onder vorming van een neerslag. Het neerslag werd afgecentrifugeerd in een gekoelde centrifuge 20 bij 11 000 x g en meteen gevriesdroogd in vacuo. Aldus werd 15,7 g (33 % opbrengst) van het enzym als een poeder verkregen. De specifieke aktiviteit bedroeg 0,71 ^ïKatal/kg proteïne (bepaling volgens Lowry).

Het gevriesdroogde enzym werd opgelost in 0,01 25 M natriumcarbonaat-boorzuur-kaliumchloridebuffer (pH 10,0) die 0,2 M natriumchloride bevatte. De enzymoplossing werd onderworpen aan gelfiltratie over een kolom (diameter 2 cm, lengte 7^ cm) gepakt net te voren met voornoemde buffer geequilibreerd Sephadex G-75 (afkomstig van Pharmacia Fine 30 Chemicals AB, Zweden). Het eluaat werd in frakties van 3 ml opgevangen en uit de hoofdfrakties met de hoogste enzymatische aktiviteit werd het gezuiverde enzym verkregen. Molekulair-gewicht: ongeveer 22 000 zoals geschat door gelfiltratie over Sephadex G-75 bij een pH 10. Isoelekfcrisch punt: 7,^ zoals 35 geschat door bepaling volgens een elektrofocusseringsmethode.

8302790 - 20 - ! De specifieke aktiviteit van het enzym was door de gelfiltratie met ongeveer 10 x toegenomen en bedroeg 7,0 yuKatal/ kg proteïne. De opbrengst bedroeg 70 %.

Voorbeeld II

5 Een cultuurmedium dat 1 gew./ί caseïne, 1 gew.% vleesextract, 1 gew.% polypepton en 1 gew.# natriumwaterstof-carbonaat bevatte, werd op een pïï 9,5 ingesteld door toevoegen van waterig natriumhydroxyde. Van het medium werd 300 ml in een 1 1 Erlenmeyerkolf gebracht. Na steriliseren werd geënt met 10 0,5 ml van een NKS-21 suspensie zoals bereid in voorbeeld I.

Het kweken werd 3 dagen bij 20°C uitgevoerd. Na afloop werd 300 ml van het kweekprodukt in een gesteriliseerde 30 1 fermen-tator die 10 1 van het boven bereide cultuurmedium met een pH 9,5 bevatte, gebracht. De fermentatie werd aëroob onder 15 roeren üitgevoerd bij 20°C gedurende 3 dagen bij een roer- snelheid van 100 omw./min. en een beluchtingssnelheid van 12 l/min.

Van het kweekprodukt werd 10 1 in een gesteriliseerde 500 1 fermentator die 220 1 van het boven bereide cultuurmedium 20 met een pH 9,5 bevatte, gebracht. De fermentatie werd weer aëroob en onder roeren uitgevoerd bij 20°C maar gedurende U dagen bij een roersnelheid van UOO omw./min. en een beluchtingssnelheid van 200 l/min.

Na afloop werd de cultuurvloeistof gecentrifugeerd 25 bij 11 000 x g in een gekoelde, continue centrifuge. De bovenstaande vloeistof werd in een hoeveelheid van 200 1 afgescheiden en af gekoeld tot 3°C. Te voren tot 3°C af gekoelde ethanol werd in 2 x de volumehoeveelheid toegevoegd onder precipitatie-van API-21. Het enzym werd afgecentrifugeerd bij 30 ongeveer 11 000 x g in een gekoelde, continue centrifuge en meteen gevriesdroogd in vacuo. Aldus werd 1230 g (70 % opbrengst) API-21 verkregen met een specifieke aktiviteit van 0,52 yuKatal/kg proteïne.

Het enzym werd op dezelfde wijze als in voorbeeld I 35 gezuiverd. Molekulairgewicht: ongeveer 22 000. Isoelektrisch 8302790 - 21 - punt: bij een pH 7»^·

Voorbeeld III

API-21 en een in de handel verkrijgbaar basisch protease werden opgenomen in een wasmiddel waarmee weefsels 5 met bloedvlekken werden gewassen.

A) Prepareren van katoenweefsels bevlekt met totaal bloed

Weefsels werden onder de hieronder aangegeven omstandigheden in vers totaal runderbloed waaraan onmiddellijk 10 na het verzamelen 1 vol.deel natriumcitraatoplossing per 9 vol.

delen bloed was toegevoegd om coaguleren te voorkomen, gedompeld waarna zij met een mangel voor 70 % werden uitgewrongen om é£Üjkmatig bevlekte weefsels te verkrijgen. De weefsels werden aan de lucht gedroogd onder afschermen tegen direkt zonlicht 15 en daarna in het donker bewaard bij 0~5°C. Hierna werden de weefsels in stukken van 10 x 5 cm gesneden.

Weefsels: 10 cm x 15 cm runderbloed: 100 ml per 10 weefsels

bevlekkingstemperatuur: 10 + 2°C

20 bevlekkingstijd: 5 min. (om de 30 sec.

werd de roerrichting veranderd) B) Wasnrocedure

De weefsels werden onder de hieronder aangegeven omstandigheden gewassen en gespoeld ( 3x) in een Terg-0-Tometer. 25

Wasomst andigheden bevlekte weefsels: 5 cm x 10 cm wasmiddel: 0,133 % (0,7 nKat/ml enzym badverhouding: 1:85 30 roeren: 105 omw./min.

wastijd: 10 min.

Snoelomstandigheden bevlekte weefsels: 5 cm x 10 cm badverhouding: 1:85 35 roeren: 105 omw./min.

spoeltijd: 3 min.

8302790 - 22 - f . .

'

Na het spoelen werden de weefsels aan de lucht gedroogd onder afschermen tegen direkt zonlicht.

C) Gebruikt wasmiddel en enzym

De volgende zes fosfaat en niet-fosfaatwasmiddelen 5 werden gpbruikt

Samenstelling met fosfaat zonder fosfaat oppervlakte aktieve stof 15 % 15 % natriumtripolyfosfaat 17 zeoliet - 17 10 natriumsilicaat 5 5 natriumcarbonaat 3 3 c arboxymet hylc ellulo s e 1 1 water 8 8 natriumsulfaat rest rest 15 De pH van elk wasmiddel bij een concentratie van • * 0,133 gew.$ en een temperatuur van 25°C had de volgende waarde: Oppervlakte aktieve stof met fosfaat zonder fosfaat NAS type 10,18 10,18 o) NDS type 9,76 9,86 3) 20 AAS type 9,95 10,17 1) NAS: natrium lineair alkylbenzeensulfonaat 2) NDS: natriumdodecylsulfaat 3) AAS: alfa-alkeensulfonaat

Als enzymen werden^bruikt API-21 en een in de handel 2$ verkrijgbaar basisch protease.

De reinigende werking werd als volgt bepaald:

De bevlekte weefsels werden voor en na het wassen 2 uren geextraheerd met 100 ml van een 0,1 N waterige natrium-hydroxydeoplossing met een temperatuur van 90 + 2°C. Het 30 extract werd gekleurd met een koper-Folinreagens en de absorptie werd gemeten bij een golflengte van 750 nm. De reinigende werking (D) werd berekend uit de betrekking: 8302790 _ ————^^ - 23 -

Db - Do D (%) = - X °°

Db - Da

Da = absorptie van extract van bevlekt weefsel (1 g) 5 gewassen zonder enzym

Db = absorptie van extract van bevlekt weefsel (1 g) voor wassen met enzym Dc - absorptie van extract van bevlekt weefsel (1 g) na wassen met enzym 8302790 ί . .

- 2U - ο m £Ö α> _

^ Cl t-C\ J· O \Q IA i- t— XO XO Ot- O t— LTX O

2 co t— t—o oo COCO Ox t— *- v- o cm oox θ'- ft t-c— t— CO coco COCO COCO Οχ σ\ OX OX Ox CO ox ox ca H o Ό VX Ü ω * ,3

bO

0 •r+ 4 r- t- o xo co oox coo ο η xo o t- n 1- vo cvj rtj ΛΙ fi Λ Λ Μ Λ Λ (V ft A Λ Λ Λ #*Λ A Λ Aft s ι ιτχ cm ία ιτχ t-xo οχο τ-χ- τ-ο 3Γ-5 Si *r S! Π! Μ COCO COCO COCO CO Ox OxOx Ox Ox Ox Ox Ox OX Ox ox rS $

Cl 0 60 •rl a 0 >> •rf ¢3 2 S xo co o oj j· o oxo 0-4· oxux cooo cmcj no

A |V A n A A A A A A A #V A A A Λ A A

μ CO CO 00 O ÖNCO CO OJ -=r ON ΙΛ-Sf 00-5f CO-d- O ON

pq ¢) VO l· VD\0 t-t- t“t*“ t-l· Cot

'S

H C

o o

p N

E+

14 O Ox OX

¢) » « " +3 trx o ccx n jj· -3- Ϊ* 0 01

g ij O

0 2 O „ JJ 0 O O LTX o 01 +30 *” CM -ci

<tf OJ

> u

+35+5+5+5+5+¾¾¾¾ 0 000)0 00000 aJrdrtf'Ö'tiO'ÖO'Ü'O

+3Ö +) ΰ +3Ö +3Ö +3 Ö +3 Ö +3Ö +3C +3C

tnoooo oo oo oo oo oo oo oo

0 S tJ S n ë m S n S n β n S M

o o p ^

® ·Η OOOOOOOOO

¢3 SR&ftfcSeS6 U a +3+3+3+3+3+3+3+3+3 ftOCQracqmram^cQm o)+3<P+E<Q<isQ*3 8302790 - 25 -

Voorbeeld IV

De waspro ef in voorbeeld III werd herhaald met het API-21 bevattende wasmiddel zonder fosfaat en op basis van de oppervlakte aktieve stof van het NAS type, en met ver-5 schillende protease-aktiviteiten. De resultaten zijn in onder staande tabel F vermeld.

Tabel F

Reinigende werking- % protease aktiviteit _wastemperatuur_ ,0 _io°c ^

0 68,8 T2,0 7M

0,7 78,2 87,8 89 Λ 2,1 80,5 88,6 92,8 15 3,5 80,8 89 Λ 92,8 7 . 82,0 89,8 9^,3

Voorbeeld V

Vuile halsboorden werden gewassen met verschillende wasmiddelen die API-21 of een in de handel verkrijgbaar basisch 20 protease bevatten.

A) Prepareren van vuile halsboorden.

200 vuile halsboorden van 7 x 37 cm vervaardigd uit standaard katoenweefsel werden in stukjes van 1 x 5 cm gesneden. De halsboorden waren bevuild door 1 week dragen 25 volgens de methode beschreven in Seni Seihin Shohi Kagaku _1£ (1978), blz. 106-115· Van de stukjes halsboord werden er steeds 10 aan elkaar genaaid om een proefweefsel van 5 x 10 cm te verkrijgen. De proefweefsels werden in het donker bewaard bij een temperatuur van 0-5°C.

30 B) Wasprocedure

De weefsels werden onder de hierna aangegeven omstandigheden gewassen en gespoeld (3x) in een Terg-0-Tometer.

8302790 - 26 -

Wasomst andigheden vuile weefsels: 5 cm x 10 cm wasmiddel: 0,133 % (0,7 nKat/ml enzym 5 badverhouding: 1:85 roeren: 105 omw./min.

wastijd: 10 min.

Snoelomstandigheden vuile weefsels: 5 cm x 10 cm 10 b adverhouding: 1:85 roeren: 105 omw./min.

spoeltijd: 3 min.

Na het spoelen werden de weefsels aan de lucht gedroogd onder afschermen tegen direkt zonlicht.

15 C) Gebruikt wasmiddel en enzym.

De volgende vier fosfaat en niet-fosfaatwasmiddelen werden gebruikt:

Samenstelling met fosfaat zonder fosfaat oppervlakte aktieve stof 15 % 15 % 20 natnumtripolyfosfaat 17 - zeoliet (Ua) - 17 natriumsilicaat 5 5 natriumcarbonaat 3 3 carboxymethylcellulose 1 1 ^ water 8 8 natriumsulfaat rest rest

De pH van elk wasmiddel bij een concentratie van 0,133 gew.$ en een temperatuur van 25°C had de volgende waarde: 8302790 - 27 - oppervlakte aktieve stof met fosfaat zonder fosfaat MS type1 ^ 10,18 10,18 AAS type 2) 9,95 10,17 1) MS: natrium lineair alkylbenzeensulfonaat 5 2) AAS: alpha-alkeensulfonaat

Als enzymen werden gebruikt API-21 en een in de handel verkrijgbaar basisch protease. De resultaten zijn in onderstaande tabel G vermeld.

8302790 - 28 - o η ϋ ο +3 ° σ\Ό co ο cm on *- ch t— o^s-

p. A A A A AA AA AA AA

ία t— m vo on o\^t t—co mj on c\ o H t— b- co CO C— t— co co «D CO cO 0\

O

Ό Λ

A

bO

Λί Ki O--J-C0 t--- VO CM COCM h 1 » * » « " "· «* » « * · (U W CM CM t—VO IAO 0\ -r- VC r- O C\

5 ^ COCO COCO COCO CO OV CO ON OVCO

0 Ό 0 a B, °.S § r-t-J-o t~o J-CM mo vo <-

,_J0 AA AA A A AA AA AA

<u SL, U O VO O 1A 00 CO OO Ο CM VO

n (D t-VO COt— t-t— COCO COCO COCO

¢5 Ό * § w o m -- m

"S σ\ CM CO

gf ΙΛ ΙΛ L ° cd o (U Λ

1 p, u ο ΙΑ O

OJ & 3 *- CM ^r a} (U 3

>' -P -P

"«3 k V( f-i f·» f-J

aj <u <u o Ο o o rö Ό Ό Ό Ό BI 4JC +»C -PCS -Pö -PCS -PC* o 000)0 00 00 00 0)0

Oh g N g N g N geo g N geo I o ^ O 4J <U O O O 4) us assess .g +3 +3 +3 +3 +> +3 03 03 03 03 03 03 tslssssss 8302790

Claims (6)

1. Basisch protease, met het kenmerk dat, het "basisch protease, aangeduid met API-21, de volgende eigenschappen hezit: 5 1) Aktiviteit: hydrolyseert caseïne onder "basische omstandigheden, optimale aktiviteit "bij een pH 10-11 en een temperatuur van ^5“50°C,

2. Stabiliteit: geen vermindering in enzymatische aktiviteit bij 10 min. verwarmen tot ^0°C bij een pH 10 in 10 afwezigheid van substraat, vermindering in enzymatische aktivi teit van 90 % of meer bij 10 min. verwarmen bij 50°C en een pH 10, beginnende desaktivering bij 10 min. verwarmen bij 50°C en een pE 8 en volledige of nagenoeg volledige desaktivering bij 10 min. verwarmen bij 60°C en een pH 8, stabiel onder 15 basische omstandigheden, in het bijzonder bij een pH 7“11»5» en bestand tegen bevriezen en vriesdrogen, en

3. Enzymmolekuul : het protease is een proteïne met een molekulair gewicht van ongeveer 22 000 zoals geschat met een gelfiltratiemethode, een isoelektrisch punt van 7Λ 20 zoals geschat met een elektrofocusseringsmethode, een absorptie- piek in het UV spectrum bij 275“2δ2 nm, een IR absorptiespectrum zoals weergegeven in fig. 5, en een serinerest op de aktieve plaats.

2. Werkwijze ter verkrijging van een basisch protease, 25 met het kenmerk dat, een basisch protease aangeduid met API-21 wordt verkregen door kweken van het species NKS-21 behorende tot het genus Bacillus dat in staat is om het basisch protease API-21 in een basisch cultuurmedium te vormen, en winnen van het basisch protease API-21 uit de cultuurvloeistof.

3. Species NKS-21 behorende tot het genus Bacillus dat in staat is om onder basische omstandigheden het basische protease API-21 te produceren. H. Enzym bevattend wasmiddel, met het kenmerk dat, het wasmiddel API-21 zoals omschreven in conclusie 1 of ver- 8302790 - 30 - kregen met de werkwijze volgens conclusie 2 bevat.

5. Enzym, werkwijze ter verkrijging daarvan en het enzym bevattende produkten zoals beschreven in de beschrijving en voorbeelden. 8302790