FI116144B

FI116144B - Uudet proteaasit

Info

Publication number: FI116144B
Application number: FI934484A
Authority: FI
Inventors: Poul Lindegaard; Margrethe Christiansen; Kim Brint Pedersen
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 1991-04-12
Filing date: 1993-10-11
Publication date: 2005-09-30
Also published as: US5472865A; JPH06506592A; DK65891D0; DE69223777D1; ES2111636T3; EP0579710B1; DK0579710T3; KR100245619B1; WO1992018622A1; EP0579710A1; FI934484A; DE69223777T2; JP3399941B2; FI934484A0; GR3026158T3; ATE161576T1

Description

116144

Uudet proteaasit - Nya proteaser

Esillä oleva keksintö koskee pesuaineproteaaseja. Tarkemmin määriteltynä esillä oleva keksintö kohdistuu uusiin alkali-5 siin proteaaseihin, jotka ovat peräisin Dendryphiella- ja (tai) Scolecobasidium-sukujen (suvun) imperfect fungi -kannoilta. Ennen kaikkea esillä oleva keksintö kohdistuu prote-aasien valmistusmenetelmään, proteaasien käyttöön pesuaine-entsyyminä sekä esillä olevan keksinnön mukaisia proteaaseja 10 sisältäviin pesuainekoostumuksiin.

Pesuaine-entsyymejä on myyty pitempään kuin 20 vuoden ajan, ja niille on nyt luotu varma asema sekä jauhemaisten että nestemäisten pesuaineiden normaaleina ainesosina kaikkialla maailmassa. Sen suuntauksen myötä, että peseminen suoritetaan 15 alemmassa lämpötilassa, detergenttientsyymin kulutus on noussut viimeisten vuosien aikana. Pesuaineformulaatioissa käytetyt entsyymit sisältävät proteaaseja, lipaaseja, amylaaseja, sellulaaseja sekä muita entsyymejä tai niiden seoksia. Kaupallisesti tärkeimpiä ovat proteaasit.

i f * * “!'! 20 Pesuaineproteaaseja on kehitetty eristämällä luonnosta löy- * ; dettyjä proteaaseja, minkä jälkeen niitä on testattu pesuai- nef ormulaatioissa . Useimmat pesuaineproteaasit saadaan Bacil-lus-suvun jäseniltä. Uusia proteaasityyppejä tulee jatkuvasti I \* markkinoille tarjoten mahdollisuuden antaa parempi hinnan ja V ! 25 tehon suhde erilaisissa tarkoin määrätyissä olosuhteissa.

. . Kaupallisten proteaasituotteiden esimerkkejä ovat Alcalase™,

Esperase™ sekä Savinase™, joita kaikkia Novo Nordisk A/S, Tanska, toimittaa. Nämä ja samankaltaiset entsyymi tuotteet, U’ jotka ovat peräisin muista kaupallisista läheistä, ovat ak- 30 tiivisia pesuaineliuoksissa, se on pH-arvoissa, jotka ovat ‘ . alueella 8-11, sekä sekvestraus-, pinta-aktiivisuus- ja vai- t * · > » kaisuaineiden, kuten esimerkiksi natriumberporaatin läsnä ollessa. Alcalase™-proteaasia tuotetaan Bacillus licheniformis- 2 116144 lajin kannoilla. AlkalofUlisten bakteereiden kantoja viljelemällä saadaan Esperase™- ja Savinase™-proteaaseja.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti annetaan käyttöön uusia pesuaineproteaaseja. Ensimmäisessä näkökohdassaan esillä 5 oleva keksintö antaa käyttöön proteaasin, joka on saatavissa Dendryphiella- tai Scolecobasidium-suvun kannalta.

Tarkemmin määrätyssä näkökohdassa esillä oleva keksintö antaa käyttöön proteaasin, jonka pl on noin 9,1, molekyylipaino on noin 18 - 20 kD, ja joka on aktiivinen hemoglobiinia, kaseii-10 nia, kuorittua maitoa ja Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA:ta kohtaan, tai jonka pl > 9,5 ja molekyylipaino noin 28 kD.

Seuraavassa näkökohdassa esillä oleva keksintö antaa käyttöön proteaasien valmistusmenetelmän, joka käsittää Dendryphiella tai Scolecobasidium-suvun proteaasia tuottavan kannan vilje-15 lemisen sopivassa kasvatusalustassa, joka sisältää hiilen ja typen lähteet sekä epäorgaanisia suoloja, minkä jälkeen haluttu entsyymi otetaan talteen.

Kolmannessa näkökohdassaan esillä oleva keksintö antaa käyt- töön proteaasin valmistusmenetelmän, joka käsittää proteaasia '!'! 20 koodittavan DNA-fragmentin eristämisen, DNA-fragmentin yhdis- • * · * ; tämisen sopivan ilmentymissignaalin kanssa sopivassa plasmi- ···’ divektorissa, plasmidivektorin viemisen sopivaan isäntään ·.*: joko autonomisesti replikoitavana plasmidina tai kromosomiin ; integroituna, isäntäorganismin viljelemisen olosuhteissa, V : 25 jotka johtavat proteaasin ilmentymiseen, sekä proteaasin tal teenoton kasvatusalustasta.

'!!/ Neljännessä näkökohdassaan esillä oleva keksintö esittää vaatimukset proteaasien käytölle pesuaineentsyymeinä. Tämän näkökohdan tarkemmin määritellyssä sovellutusmuodossa anne-30 taan käyttöön pesuainekoostumuksia, jotka sisältävät prote-aaseja. Tämän näkökohdan vielä eräässä spesifisessä sovellu-. tusmuodossa pesuainekoostumukset annetaan käyttöön pesuaineen lisäaineena, mieluummin pölyämättömänä granulaattina, stabiloituna nesteenä, lietteenä tai suojattuna entsyyminä.

3 116144

Organismi

Esillä olevan keksinnön mukaisia uusia pesuaineproteaaseja voidaan hankkia Dendryphiella- ja Scolecobasidium-sukujen jäseniltä. Dendryphiella ja Scolecobasidium kuuluvat Fungi 5 imperfectiin. D. salina (Sutherland) Pugh et Nicot (synonyymit: S. salinum (Sutherland) M.B. Ellis, Cercospora salina (Sutherland) ja D. arenaria Nicot (synonyymit: S. arenarium (Nicot) M.B. Ellis) ovat erittäin läheisiä lajeja, jotka tavallisesti eristetään merikasvupaikoilta, lähiranta-alueilta. 10 Esimerkkejä ovat kannat D.arenaria Nicot, DSM 6260, joka alunperin eristettiin hajoavasta Nereocystis-levästä, sekä D. salina (Sutherland) Pugh et Nicot, DSM 6331. Muita lajeja ovat esimerkiksi D. vinosa (Bert & Curt) Reisinger; D. infus-cans (Thumen) M.B. Ellis; S. cateniphorum Matsushima; S. 15 echinophilum (Massalongo) Sutton; S. fusiforme Matsushima; S. longiphorum Matsushima; S. salmonicolor Shearer; S. terreum Abbot; S. tshawytschae (Doty & Slater) McGinnis & Ajello; S. constrictum Abbot; S. humicola Barron & Bush; S. obovatum Matsushima; S. variabile Barron & Busch; S. anelli Graniti; 2 0 S. verruculosum Roy, Dwivedi & Mishra; S. gyrocarpi M.B.

,:. Ellis.

Eräs esimerkki on S. gyrocarpin kanta M.B. Ellis, DSM 6332.

.:. Mikro-organismien kasvattaminen : Mikro-organismeja voidaan kasvattaa aerobisissa olosuhteissa ,* * 25 kasvatusalustassa, joka sisältää assimiloituvia hiilen ja typen lähteitä yhdessä muiden välttämättömien ravintoaineiden : ; : kanssa, kun alustan koostuu tunnetun tekniikan periaatteiden mukaisesti. D. salinan ja D. arenarian kantoja voidaan vil-*, jellä alustassa, joka sisältää merivettä tai merisuoloja ;;; 30 mutta se ei ole välttämätöntä.

Organismit pystyvät kasvamaan huoneenlämpötilassa monilla • · yleisesti käytetyillä agar-alustoilla, kuten PDA:11a (Potato * ·

Dexstrose Agar), YPG:llä (4 g/1 hiivauutetta; 15 g/1 glukoosia; 1 g/1 K2HP04: ää; 0,5 g/1 MgS04,7H20 : ta; 2 0 g/1 agaria; pH

4 116144 7,3-7,5 ennen sterilointia) sekä Bacto Yeast Morphology Agarilla (Difco™). D.arenaria ja D. salina pystyvät kasvamaan myös KMV-agarilla (1 g/1 glukoosia; 0,1 g/1 hiivauutetta; 0,1 g/1 Bacto™-peptonia; 1 g/1 gelatiinihydrolysaattia, 5 12 g/1 agaria; 40 g/1 Sigma™:n merisuoloja (Sea Salts).

Sopivia hiilenlähteitä ovat hiilihydraatit, kuten esimerkiksi sakkaroosi, glukoosi ja tärkkelys, tai hiilihydraattia sisältävät materiaalit, kuten esimerkiksi soijapapuryynit, pellavan siemen jauhot, viljanjyvät, maltaat, riisi ja durra. Alus-10 taan sisällytetty hiilihydraattikonsentraatio voi vaihdella laajalti, esim. 25-0,1 prosentin välillä, mutta tavallisesti 1-10 prosenttia on sopiva alue.

Typen lähde kasvatusalustassa voi olla luonteeltaan epäorgaaninen ja (tai) orgaaninen. Sopivia epäorgaanisen typen 15 lähteitä ovat nitraatit ja ammoniumsuolat. Fermentaatioissa käytetään säännöllisesti jokseenkin suurta joukkoa yhdisteitä, jotka valitaan orgaanisten typpiyhdisteiden piiristä. Valaisevia esimerkkejä ovat soijapapujauho, pellavansiemenjauho, kaseiini, maissi, maissinliuotusneste, hiivauute, urea ja 20 albumiini. Kasvatusalustan tulisi lisäksi sisältää tavallisia ·...’ hivenaineita.

• · · • >

Proteaasien talteenotto ja puhdistaminen ti·» t < · Käymisen jälkeen voidaan sienien tuottamat ekstrasellulaari- • · * • · t : set proteaasit ottaa talteen ja puhdistaa tunnetun tekniikan V * 25 periaatteiden mukaisesti, esim. käyttämällä sellaisia vaihei ta kuten esimerkiksi karkeiden ainesten poistamista sentrifu-; goimalla tai rumpusuodatuksella, kasva tus liemen konsentroin- tia haihduttamalla tai ultrasuodatuksen avulla sekä puhdista-

• · I

·, mistä anioninvaihtokromatografiän avulla. Puhdistettuihin ··*· 30 proteaaseihin voidaan lopuksi lisätä säilöntäaineita.

• » » ·

Yhdistelmä-DNA-tekniikalla tuotetut proteaasit

Esillä olevan keksinnön mukaiset proteaasit voidaan saada myös yhdistelmä-DNA-tekniikalla.

5 116144

Proteaasien valmistusmenetelmä voi käsittää proteaasia koo-dittavan DNA-fragmentin eristämisen, DNA-fragmentin yhdistämisen sopivan ekspressiosignaalin kanssa sopivassa plasmidi-vektorissa, plasmidivektorin viemisen sopivaan isäntään joko 5 autonomisesti replikoituvana plasmidina tai kromosomiin integroituna, isäntäorganismin viljelemisen olosuhteissa, jotka johtavat proteaasin ilmentymiseen, ja proteaasin talteenotta-misen kasvatusalustasta. Erilaiset vaiheet, jotka muodostavat tämän yhdistelmämenetelmän, ovat tutkimustyön piirissä sinän-10 sä tunnettuja menetelmiä.

E. coli tai Bacillus-, Aspergillus- tai Streptomyces-suvun jäsenet ovat edullisia organismeja.

Proteolyyttisen aktiivisuuden määrittäminen

Proteolyyttinen aktiivisuus määritetään käyttäen kaseiinia 15 substraattina. Yksi kaseiiniproteaasiyksikkö (CPU) määritetään entsyymin määränä, joka vapauttaa 1 millimoolin primaarisia aminoryhmiä (määritetty vertailemalla seriinistandardin kanssa) minuutissa standardiolosuhteissa, se on inkuboimalla 30 minuutin ajan 25°C:ssa, pH 9,5:ssä. Mainoslehtinen AF 228, ·;· 20 joka kuvaa analyysimenetelmää ja joka sisällytetään esillä olevaan hakemukseen viitteenä, on pyynnöstä saatavissa Novo Nordisk A/S:ltä, Tanskasta.

• · I t

Entsyymi i · * • ·

• I

Esillä olevan keksinnön mukaiset entsyymit ovat uusia pesu-2 5 aineproteaaseja. Entsyymit ovat saatavissa Dendryphiella- ja . . Scolecobasidium-sukujen kannoilta, esimerkiksi D. salinan, D.

'li,* arenarian tai S. gyrocarpin kannoilta, esim. D.arenarian ;· kannalta DSM 6260, D. salinan kannalta DSM 6331 tai S. gyro- carpin kannalta DSM 6332.

i i 30 Esillä olevan keksinnön mukaiset proteaasit ovat aikalisiä proteaaseja, joiden isoelektriset pisteet (pi) LKB: n PAG-levyillä (pH 3,5-9,5) määritettyinä ovat 8,0:n yläpuolella.

6 116144

Esillä olevan keksinnön mukaisella, erityisellä proteaasilla pl on noin 9,1, molekyylipaino noin 18-20 kD:tä, proteaasi on aktiivinen hemoglobiinia, kaseiinia, kuorittua maitoa ja Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA:ta kohtaan, sen immunokemialliset ominai-5 suudet ovat identtiset tai osittain identtiset proteaasien, jotka ovat peräisin kannasta D. arenaria, DSM nro 6260, tai kannasta D. salina, DSM nro 6331, ominaisuuksien kanssa.

Esillä olevan keksinnön mukainen toinen proteaasi on proteaasi, jonka pl > 9,5, molekyylipaino on noin 28 kD ja immunoke-10 mialliset ominaisuudet ovat identtiset tai osittain identtiset proteaasien, jotka ovat peräisin Dendryphiella arenarial-ta, DSM nro 6260, immunokemiallisten ominaisuuksien kanssa.

Immunokemialliset ominaisuudet

Immunokemialliset ominaisuudet voidaan määrittää immunologi-15 silla ristireaktioidenttisyyskokeilla. Identtisyyskokeet voidaan suorittaa hyvin tunnetulla Ouchterloney-kaksoisimmuno-diffuusiomenetelmällä tai peräkkäisellä, ristiinmenevällä immunoelektroforeesilla N. H. Axelsenin mukaan; Handbook of Immunoprecipitation-in-Gel Techniques; Blackwell Scientific ·;· 20 Publications (1983), kappaleissa 5 ja 14. Termejä "antigeeni- nen identtisyys" ja "osittainen antigeeninen identtisyys" kuvataan samassa kirjassa, kappaleissa 5, 19 ja 20.

·” Pesuainekoostumukset t · · • *

Esillä olevan keksinnön mukaiset pesuainekoostumukset voivat 25 sisältää yhden tai useampia pinta-aktiivisia aineita, jotka ; ·_ voivat olla anioniaktiivisia, ionittomia, kationiaktiivisia, t * » *!,V amfoteerisiä tai zwitterionityyppiä tai näiden seoksia. An- ” ioniaktiivisten pinta-aktiivisten aineiden tyypillisiä esi- merkkejä ovat lineaariset alkyylibentseenisulfonaatit (LAS) , 30 alkyylisulfaatit (AS), alfaolefiinisulfonaatit (AOS), alkoho- | . lietoksisulfaatit (AES) sekä luonnonmukaisten rasvahappojen , alkalimetallisuolat. Ionittomien pinta-aktiivisten aineiden esimerkkejä ovat alkyylipolyetyleeniglykolieetterit, nonyyli-fenolipolyetyleeniglykolieetterit, sakkaroosin ja glukoosin 7 116144 rasvahappoesterit sekä polyetoksiloidun alkyyliglukosidin esterit.

Esillä olevan keksinnön mukainen pesuainekoostumus voi sisältää myös muita pesuaineen ainesosia, jotka ovat tunnettuja 5 kyseessä olevan tekniikan piirissä, kuten esimerkiksi muita aineita kuin pesuaineen pesuaktiivisia aineita, valkaisuaineita, valkaisun aktivaattoreita, korroosionestoaineita, sek-vestrausaineita, harmaantumisen estoaineita, hajusteita, vakautteita entsyymejä ja valkaisuaineita varten, formuloin-10 nin apuaineita, optisia kirkasteita, vaahdotusaineita, kela-toivia aineita, täyteaineita, kankaan pehmentäjiä, jne. Esillä olevan keksinnön mukainen pesuainekoostumus voidaan formuloida suurin piirtein, kuten J. Falben julkaisussa kuvataan [Falbe, J.; Surfactants in Consumer Products. Theory, Techno-15 logy and Application; Springer Verlag 1987, katso erityisesti kappaletta, jonka otsikko on "Frame formulations for liquid/-powder heavy-duty detergents"].

Tällä hetkellä on suunniteltu, että esillä olevan keksinnön mukainen pesuainekoostumus voi sisältää entsyymivalmistetta 20 määrän, joka vastaa 0,0005-0,5 CPU:ta proteolyyttistä entsyy-miä litraa kohti pesuliuosta.

• j. Esillä olevan keksinnön mukaiset pesuainekoostumukset voidaan formuloida jollain sopivalla tavalla kuten esimerkiksi puute- I I t » ;·t·t reina, nesteinä jne.

• · V · 25 Esillä olevan keksinnön mukainen pesuainekoostumus voi sisäl tää edullisesti yhden tai useampia entsyymejä, esim. lipaase-: ; : ja, amylaaseja, sellulaaseja, oksidaaseja ja (tai) peroksi- daaseja, joita tavanomaisesti sisällytetään pesuainekoostu-‘, muksiin.

: 30 Esillä olevan keksinnön mukainen proteaasi voidaan sisällyt- ii>(; tää pesuainekoostumukseen lisäämällä erillisiä lisäaineita, jotka sisältävät pesuaineproteaasin, tai lisäämällä yhdistetyn lisäaineen, joka sisältää erilaisia pesuaine-entsyymejä.

8 116144

Esillä olevan keksinnön lisäaine voidaan formuloida esimerkiksi granulaatteina, nesteinä, lietteinä jne. Edullisia li-säaineformulaatioita ovat pölyämättömät granulaatit tai stabiloidut nesteet. Pölyämättömät granulaatit voidaan valmistaa 5 esimerkiksi GB-patenttijulkaisun 1 362 365 tai US-patentin 4 106 991 mukaisesti, tai ne voidaan päällystää tekniikan tason mukaisin menetelmin. Puhdistusaine-entsyymit voidaan sekoittaa ennen rakeistusta tai sen jälkeen. Nestemäiset entsyymivalmisteet voidaan stabiloida esimerkiksi lisäämällä 10 polyolia, kuten esimerkiksi propyleeniglykolia, sokeria tai sokerialkoholia, maitohappoa tai boorihappoa pystytettyjen menetelmien mukaisesti. Muut entsyymivakautteet ovat alalla hyvin tunnettuja. Suojattuja entsyymejä voidaan valmistaa EP-patenttijulkaisussa 238 216 julkaistulla tavalla.

15 Esillä olevaa keksintöä kuvataan edelleen seuraavissa esimerkeissä, joiden tarkoituksena ei ole millään tavalla rajoittaa esillä olevan keksinnön piiriä, joka esitetään patenttivaatimuksissa .

Esimerkki 1 20 Viljelyesimerkki

Kantaa D. arenaria, DSM nro 6260, viljeltiin 18 °C:ssa, 7 päivän ajan, pyörivällä ravistelupöydällä (250 kierrosta mi-nuutissa) , 100-500 ml:n vetoisissa, suuntauslevyllä varuste- * » » • ' tuissa Erlenmayer-pulloissa, jotka sisälsivät 100 ml alustaa, ’ 25 jolla oli seuraava koostumus (litraa kohti) :

Soijaryynejä 50 g

MgS04.7H20 0,2 g T Na2HP04.2H20 10 g K2HP04 2 g ^ 30 Glukoosia 10 g

PluronicR L-61 0,1 ml ‘ · pH säädetty 7,0:ksi ennen autoklaavikäsittelyä.

9 116144

Viljelyn jälkeen kasavatusliemen entsyymiaktiivisuus oli 3,7 CPU/1.

Kantaa D. salina, DSM nro 6331, kasvatettiin samalla tavalla, paitsi että kasvatusalusta sisälsi edelleen Sigman merisuolo-5 ja (Sea Salts, Sigma) 40 g/1.

Viljelyn jälkeen kasvatusliemen entsyymiaktiivisuus oli 5,2 CPU/1. Liemi sisälsi yhden pääproteaasikomponentin, jonka pl oli noin 9,1.

Esimerkki 2 10 Puhdistusesimerkki D. arenaria DSM 6260:n kasvatusliemi, joka saatiin esimerkin 1 mukaisesti, sentrifugoitiin Beckman J-6 -sentrifugissa nopeudella 4000 kierrosta minuutissa 30 minuutin ajan. Super-natantti koottiin, ja se suodatettiin 10 μΐη:η suodatinverkon 15 läpi.

Täten saatiin 7,5 litraa supernatanttia, joka myöhemmin konsentroitiin 1,0 kg:ksi ultrasuodattamalla se Filtron-lait-·*· teistoa käyttämällä, polysulfonimembraanilla, jonka katkaisu- raja oli 1000.

···· 20 Proteaasit puhdistettiin edelleen anioninvaihtajakromatogra- ···! fian avulla, jota HPLC-pylväässä suoritettu af f initeettikro- : ,· matografia seurasi.

Anioninvaihtokromatografiaa varten yllä saadun konsentraatin ; annettiin reagoida eräprosessina DEAE-Sephadex A-50:n kanssa i a i 25 25-millimolaarisessa boraatissa, joka sisälsi 5 mmoolia » t

CaCl2:ta, pH 8,5. Proteaasit jäivät materiaaliin, joka ei si- » toutunut matriisiin.

a · a a

Anioninvaihtajasta saadun proteaasia sisältävän materiaalin * · affinitetttikromatografia suoritettiin HPLC-pylväässä.

♦ » · ' i 30 Täten saatu proteaasivalmiste sisälsi kaksi proteaasia. D. arenarian kantaa DSM nro 6260 viljelemällä saatua proteaasi- 10 116144 valmistetta luonnehtivat pl 9,1 isoelektrisellä fokusoinnilla LKB Ampholine” PAG -levyillä määritettynä (pH 3,5 - 9,5) sekä molekyylipaino, joka oli noin 20 000 SDS-PAGE:lla määritettynä. Pienempää komponenttia luonnehtivat pl >9,5 sekä molekyy-5 lipaino, joka oli noin 28 000. SDS-PAGE:n perusteella prote-aasit käsittivät noin 50 %:a kokonaisproteiinisisällöstä.

Pääproteaasikomponentille oli edelleen ominaista sen kyky pilkkoa kaseiinia (HammersteinR) , hemoglobiinia, kuorittua maitoa sekä N-sukkinyyli-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilidia. 10 Proteaasilla ei ollut ollenkaan tai sillä oli erittäin alhaista aktiivisuutta kromogeenisia substraatteja ΒΑΡΝΑ:ta (N-a-bentsoyyli-DL-Arg-p-nitroanilidi) :a ja Z-Glu-pNA(N-bentso-yylioksikarbonyyli-Glu-p-nitroanilidi):a kohtaan. EDTA ei inhiboinut proteaasia.

15 Proteaasi, joka saatiin viljelemällä D. salinan kantaa DSM nro 6331, puhdistettiin suurin piirtein yllä kuvatulla tavalla. Lisäksi sitä luonnehti molekyylipaino, joka oli noin 18 000 - 20 000 SDS-PAGE:lla määritettynä, sen kyky pilkkoa kaseiinia (HammarstenR) , hemoglobiinia, kuorittua maitoa sekä 20 N-sukkinyyli-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilidia. Proteaasilla ei I 1 · ...ί ollut ollenkaan tai sillä oli alhaista aktiivisuutta kromo- geenisiä substraatteja ΒΑΡΝΑ: ta ja Z-Glu-pNA:ta kohtaan.

• < * *

Esimerkki 3 t · * • · » : .· Pesusuoritus » i » * I * « 25 Pesusuoritustestit pantiin täytäntöön mallipesussa, jossa ; t>( käytettiin ruohonesteen likaamaa puuvillaa 20 °C:ssa ja joka t i < kesti 10 minuutin ajan.

» * ,1. Kokeessa käytettiin American Type -pesuaineformulaatioita, ,··, pesuainejauhekoostumusta ja nestemäistä pesuainekoostumusta .

t I

T 30 Pesutesteihin käytettiin esimerkissä 2 kuvattuja entsyymival- ’ misteita. Käytetty entsyymiannostus mainitaan esimerkkinä i alla esitetyssä taulukossa. Tekstiilin ja pesunesteen välinen suhde oli 6 g tekstiiliä litraa kohti pesunestettä.

11 116144

Kaupallista, jauhemaista American Type -pesuainetta käytettiin 2,0 g/1. Pesuaine liuotettiin veteen, jonka kovuus oli noin 6 °dH (saksalaista kovuutta). PH oli 9,5.

Kaupallista, nestemäistä American Type -pesuainetta käytet-5 tiin 2,0 g/1. Pesuaine liuotettiin veteen, jonka kovuus oli noin 6 °dH. PH oli 7,8.

Pesun jälkeen kangasta huuhdottiin juoksevan vesijohtoveden alla 25 minuutin ajan, ja se kuivattiin ilmassa. Proteaasin teho määritettiin remission (%R) muutoksena ( R), joka mitat-10 tiin Datacolor Elrephometer 2000:11a, R:n ollessa remissio, joka on saatu lisätyn proteaasin kanssa suoritetun pesun jälkeen vähennettynä remissiolla, joka on saatu ilman proteiini-lisäystä suoritetun pesun jälkeen.

Tulokset esitetään taulukoissa 1 ja 2.

15 fit • » t ► » * s * » » f • > 12 116144

O

(ti ^ VO

5 ° H . n 1 g ai cm tn tn___ 0)--- X tn 3 A! o 6 . 3 tn 3 π g

-P ' 1X1 0X1 3 O LO

en ° _r ' -p ίο g g 01 CT!

O oq CNI 0 H

M--- o___ Φ Λ1 p Φ

"(0 S -H

m o °i P H ™ O /—\ /~i~\ CO s f ° - a ° s 5 --- I--- (1) a o) S ή a

E-1 O >1 CD

' ο- vo E-ι oltioo a o ...

(ti Ή O rl o VO LO

U rH CN (Ö rH iH

•H .-_ U___

U -H

Φ P

g in 0 ^

< ° g O

O <J

(0 - vo n o ^ ld tn ° ·(ö ' tn vo ^ tn ro cm o ή tn ή <h tn--- Φ--- ·· *» ‘H m ^

S CM :¾ -H

S g ε • I, 'ρ θ'0ϋ1 5 OiHCSl ··; .g ^ vo' g r-' in *;· p Φ--- --- P ~ Ό * * P Π i—i ή P P -—- ,, 4-i Φ h tn P Φ i—i -h >· -φφρφ -p φ \ tn (ti A! P-ι tti -h tJ M p to -h -P I—I U Φ Φ (ö rH PU (ti tn -H ;(ti ^ JJ (ti -P :(ti u Φ (ti £ -n O (ti -H -n — -P (ti P Φ £ _ O Φ • · ' p a 4J p p -u oip o ' p a o

. . tn m ι p oicn tn ι P

Φ o a Φ o a . - a α φ i ' a πφι 1 P p -h o n -h *; ^ ρ p (öp<ti tHpp <op(ö ···· Φ P -h (OP Φ P -H (tip

·*· O O -Ρ ερ-Η OO-P g p -H

• . A Ή φ >ιΦΉ A -H Φ S Φ rH

*’· A tn -P S p ίο Λί tn -P >iP(ti P tn -h tn (ti tn P tn -h tn <o tn

• *» » s rH ·Η P jj i—I -H P 4J

ρεο e·· ρεο p · ·

(0 Φ p M Ρ Ρ (0ΦΡ MP P

>;··; Eh Ml tn Eh Pl tn m 13 116144

Kuten remissioerot osoittavat, esillä olevan keksinnön mukaiset proteaasit soveltuvat käytettäviksi detergenttientsyymei-nä.

Esimerkki 4 5 Erillisten proteaasikomponenttien eristäminen D. arenaarian kantaa DSM 6260 viljeltiin Chemap-käymisastias-sa 160 tunnin ajan 10 litrassa seuraavaa substraattia:

Soijahiutaleita 50 g/1

MgS04.7H20 0,2 g/1 10 Na2HP04.2H20 10 g/1 K2HP04 2 g/1

Glukoosia 10 g/1

PluronicR L61 1 ml/1 pH säädetty 7,0:ksi ennen sterilointia 15 Käymisen kuluessa pH pidettiin 8,0:ssa lisäämällä laimeaa H3P04:a.

.Kasvatusliemi väkevöitiin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.

t · *.*.* Konsentraatin pH säädettiin 7,5:ksi. 100 ml:aan tätä konsent- raattia lisättiin 70 ml asetonia, ja saostuma poistettiin i#G* 20 sentrifugoimalla ja heitettiin pois. Supernatanttiin lisät- tiin 100 ml asetonia. Proteaasit sisältävä saostuma otettiin talteen sentrifugoimalla, ja se liuotettiin 25 millimolaari- seen boraattiin, joka oli 5 millimolaarinen CaCl2:n suhteen, ; . . pH 8,5.

• » » » 25 Tämä materiaali puhdistettiin anioninvaihtajalla ja affini-.·· teettikromatografiällä, kuten kuvataan esimerkissä 2.

**;*’ Kaksi proteaasia eluaatista, joka oli saatu HPLC-affiniteet- ·:·’· tikromatograf iästä, erotettiin kationinvaihtokromatograf iän •p-j avulla Mono S HR 5/5-pylväässä (Pharmacia). HPLC-pylväästä 30 saatua eluaattia dialysoitiin yön yli puskuria vastaan, joka sisälsi 20 millimoolia Na-asetaattia, 50 mmoolia boorihappoa.

14 116144 2 millimoolia CaCl2:a; pH 4,5. Tämä pantiin Mono S -pylvääseen, josta kaksi proteaasia eluoitiin NaCl-gradientissa erillisissä jakeissa.

SDS-PAGE:n perusteella proteaasin pääkomponentin, jonka pl 5 oli 9,1 ja molekyylipaino oli 20 000, puhtaus oli enemmän kuin 90 %.

Pieni proteaasikomponentti, jonka pl > 9,5 ja molekyylipaino oli 28 000, oli yli 50-prosenttisesti puhdas, mutta se sisälsi vielä merkittävän määrän toista proteiinia, jonka molekyy-10 lipaino SDS-PAGE:lla määritettynä oli noin 33 000. Kontami-noivalla proteiinilla ei ollut yhtään proteolyyttistä aktiivisuutta .

Esimerkki 7 N-terminaaliset sekvenssit 15 Proteaasivalmisteiden pääkomponenteille, joita yllä kuvat tiin, suoritettiin N-terminaalisen sekvenssin määrittäminen.

Pääkomponentin, joka eristettiin D. arenarian kannalta DSM ;* nro 6260, N-terminaalisen sekvenssin havaittiin olevan seu- • V. raava: • · » ··; 20 A-T-V-R-G-G-D-A-Y-Y-I-N-R-A-G-R-S-S-V-G-F-S-V-S-X-G-Y-V-. . .

Pääkomponentin, joka eristettiin D. salinan kannalta DSM nro .·;·. 6331, N-terminaalisen sekvenssin havaittiin olevan seuraava: X-X-V-R-G-G-D-A-Y-Y-I-N-R-A-G-R-X-S-V-G-F-S-V-S-G-G-Y-V-S-A-...

Dendryphiella-proteaasien N-terminaaliset sekvenssit ovat 25 käytännällisesti katsoen identtiset, ja sen tähden proteaasit ovat toisilleen läheisiä.

Claims

116144

1. Proteaasi, tunnettu siitä, että se on saatavissa Dendryp-hiella- tai Scolecobasidium-su^mlt& ja että sillä on seuraa-vat ominaisuudet: 5 (a) pl on noin 9,1; (b) molekyylipaino on noin 18 - 20 kD; (c) se on aktiivinen hemoglobiinia, kaseiinia, kuorittua maitoa sekä Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA:ta kohtaan; tai 10 (d) pl >9,5; (e) molekyylipaino on noin 28 kD.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen proteaasi, tunnettu siitä, että se on saatavissa D. salinan, D. arenarian, D. infuscan-sin, D. vinosan, S. gyrocarpin, S. fusiformen, S. anellin,

15 S.constrictumin tai S. cateniphorumin kannalta tai niiden mu-tanteilta tai varianteilta.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen proteaasi, tunnettu siitä, että se on saatavissa D. salinan (Sutherland) Pugh & Nicot ”'j. tai D. arenarian Nicot tai S. gyrocarpin M.B. Ellis -kannalta 20 tai niiden mutanteilta tai varianteilta. • · · i » V

* 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen proteaasi, tunnettu siitä, että se on saatavissa D. arenarian Nicot-kannalta DSM nro ; f; 6260 tai D. salinan (Sutherland) Pugh et Nicot -kannalta DSM nro 6331 tai S. gyrocarpin M.B. Ellis -kannalta nro 6332 tai ·_ 25 niiden mutanteilta tai varianteilta.

5. Menetelmä minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukaisten proteaasien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää suvun Dendryphiella tai Scolecobasidium proteaasia tuottavan kannan viljelemisen sopivassa ravintoalustassa, joka sisältää hiili- ja typpilähteitä sekä epäorgaanisia suoloja, minkä jälkeen haluttu entsyymi otetaan talteen. 116144

6. Menetelmä minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen proteaasin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä 5 käsittää proteaasia koodittavan DNA-fragmentin eristämisen, DNA-fragmentin yhdistämisen sopivan ilmentymissignaalin kanssa sopivassa plasmidivektorissa, plasmidivektorin viemisen sopivaan isäntään joko autonomisesti replikoituvana plasmidi-na tai kromosomiin integroituna, isäntäorganismin kasvattami-10 sen olosuhteissa, jotka johtavat proteaasin ilmentymiseen, ja proteaasin talteen ottamisen kasvatusalustasta.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäorganismi on E.coli tai Bacillus-, Aspergillus-tai Sreptomyces-suvun jäsen.

8. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen proteaasin käyttö pesuaine-entsyyminä.

9. Pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen proteaasin.

<··! 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen pesuainekoostumus, tunnet- 20 tu siitä, että se lisäksi sisältää yhden tai useampia muita .,‘1* entsyymejä, nimenomaan amylaaseja, lipaaseja, sellulaaseja, oksidaaseja ja (tai) peroksidaaseja. I.!

11. Pesuaineen lisäaine, tunnettu siitä, että se sisältää * · · ‘ minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen proteaasin, 25 joka annetaan käyttöön pölyämättömän granulaatin, nesteen, · nimenomaan stabiloidun nesteen, lietteen tai suojatun entsyy- ’...· min muodossa. 116144