JP2690339B2 - 新規プロテアーゼ - Google Patents

新規プロテアーゼ

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ノカルジオプシス（Nocardiopsis）のプロ
テアーゼ産生菌株、アルカリプロテアーゼの製造方法、
ノカルジオプシス（Nocardiopsis）に由来するアルカリ
プロテアーゼ調製物、洗剤添加剤および酵素洗剤添加剤
に関する。 発明の背景 バシラス（Bacillus）属に属する微生物を適当な栄養
培地中で培養して生産されるタンパク分解酵素は、洗剤
組成物において広く使用されている。かかる商業的に入
手可能なプロテアーゼ生産物の例は、アルカラーゼ（AL
CALASE（商標））、エスペラーゼ（ESPERASE（商
標））、サビナーゼ（SAVINASE（商標））であり、これ
らは全てノボ・インダストリー（NOVO INDUSTRIA/S,Den
mark）から供給される。これらおよび他の供給者に由来
する類似のバシラス（Bacillus）産生酵素生産物は、pH
値８〜11の範囲内で、そして通常の洗剤溶液中に存在す
る金属イオン封鎖剤、界面活性剤および漂白剤の存在す
る洗剤溶液中で酵素活性を有する。 ALCALASE（商標）中のプロテアーゼは、バシラス・リ
ケニフォルミス（Bacillus licheniformis）種の菌株の
培養により生産される。ESPERASE（商標）およびSAVINA
SE（商標）中のプロテアーゼは、好アルカリ性バシラス
種、例えばそれぞれNCIB 10147およびNCIB 10309菌株の
培養により得ることができる。商業的に入手可能なアル
カリプロテアーゼの至適温度は、約60℃である。しかし
ながら、これらの市販の酵素は、室温で相対的により低
い活性を示す。 発明の概要 本発明は、アクチノミセス類の微生物に由来する新規
なアルカリプロテアーゼの生産、単離、特性決定および
使用に関する。本発明のプロテアーゼは、従来アルカリ
プロテアーゼを生産することが知られていないアクチノ
ミセスに属するノカルジオプシス・エスピー（Nocardio
psis sp.）10R株およびノカルジオプシス・ダッソンビ
レイ（Nocardiopsis dassonvillei）M58−１株から単離
される。本発明で開示されるプロテアーゼは洗濯のため
の洗剤添加剤として有用である。東ドイツ特許、No.DD
2,004,328号に記載されるノカルジオプシス・ダッソン
ビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）菌株のZIMET4364
7株は、繊維素溶解性および生物学的スラッジの浄化を
目的とするプロテアーゼを生産することが知られてい
る。しかしながら、この菌株は、公衆にとって入手可能
でなく、基準菌株はプロテアーゼを生産せず、そしてこ
の種のいかなる他の菌株もプロテアーゼを生産すること
が知られていない。さらに、前述した特許のプロテアー
ゼは、本発明のプロテアーゼの温度分布および至適pHか
ら非常に相違する性質を有する。 第３図では、本発明のノカルジオプシス・エスピーの
プロテアーゼに対するpH分布が、特許のZIMET43647株に
由来するプロテアーゼについて報告されているものと比
較された。同じ実験条件下で、10R株とM 58−１株は両
方とも至適pH8を有するが、一方ZIMET43647のプロテア
ーゼのそれは、９〜10である。さらに、本発明のプロテ
アーゼは、広範囲の至適pHを有し、pH7〜11の間で極大
活性の少なくとも60％を示している。ZIMET43647のプロ
テアーゼは、pH7において極大活性の50％を有するにす
ぎず、そしてpH11では極大活性の０％である。pH11にお
ける高いタンパク分解活性の発現は、洗剤添加剤にとっ
て特に重要である。 本発明のプロテアーゼに対する温度分布は、ZIMET436
47に由来するプロテアーゼに対して報告されているそれ
と、第４図において比較された。40℃と50℃間では、ZI
MET43647のプロテアーゼは、その至適活性の70〜100％
を示し、本発明のプロテアーゼにより示される値（即
ち、25〜65％）より大きい。 前述した相違の他に、本発明の菌株におけるプロテア
ーゼの生産は、無機塩の添加に対して異なる応答をす
る。本発明の菌株は、無機塩が増殖培地に添加されても
されなくとも同じ程度のプロテアーゼ活性物を生産す
る。ZIMET43647菌株は、増殖培地へ無機塩の添加により
改良された応答を示すことが報告されていて、メタロプ
ロテアーゼの存在の可能性を示している。第2b図に明確
に示されるように、本発明のプロテアーゼは、いかなる
検出可能なメタロプロテアーゼ活性も持たない。 本発明のノカルジオプシス・エスピー10R株およびノ
カルジオプシス・ダッソンビレイM 58−１株のプロテア
ーゼは、商業的に入手可能なバシルスのプロテアーゼに
比し、低い洗濯温度、例えば冷水、いわば15〜25℃にお
ける洗剤添加剤として特に効果的である。さらに、本発
明のノカルジオプシス・エスピー10R株およびノカルジ
オプシス・ダッソンビレイM 58−１株のプロテアーゼ
は、バシラスのプロテアーゼより生ずるタンパク加水分
解パターンから相違するそのパターンを生ずる。 多くの類似点、即ち、至適pHおよび温度、安定性、イ
ンシュリン消化パターンを有するにもかかわらず、ノカ
ルジオプシス・エスピー10R株およびノカルジオプシス
・ダッソンビレイM 58−１株に由来するプロテアーゼ
は、識別することができる。例Ｖに記載されるように、
両プロテアーゼの分子量は、相違する（10Rについて
は、23,500〜25,000、M 58−１については、20,500）。
その上、２つのプロテアーゼの等電点は、相違する〔10
Rについては、p I9.5、M 58−１については、p I＝9.
15および8.2（２個のバンド）〕。さらに、10Rのプロテ
アーゼに対する抗体は、M 58−１のプロテアーゼに対し
てほんの部分的な同一性を示すにすぎず、そしてその逆
も同様である。 発明の検討 現在、プロテアーゼについては、洗剤工業での利用を
含む多くの商業的用途がある。以下の、新規なノカルジ
オプシス・エスピー10R株およびノカルジオプシス・ダ
ッソンビレイM 58−１株のプロテアーゼの詳細な検討
は、洗剤添加剤としての使用法に限定されている。しか
し、さらに本発明者等は、タンパク分解酵素に対する他
の用途も必ず存在することを認識している。 酵素は、pH、温度、および洗剤としての使用ではEDTA
のような金属イオン封鎖剤の存在を含む使用法の条件に
影響されることが認識されなければならない。従って、
高温（60℃）で綿織物を洗濯するために開発されたSAVI
NASE（商標）のようなバシラスのプロテアーゼは、多く
の昨今の織物について勧められる低い洗浄温度（15〜25
℃）において効果的でないかも知れない。 第４表で明らかなように、同じ酵素活性レベルで使用
した場合、ノカルジオプシス・エスピー10R株およびノ
カルジオプシス・ダッソンビレイM 58−１株に由来する
新規なアルカリプロテアーゼを含んでなるプロテアーゼ
配合物は、 SAVINASE（商標）プロテアーゼよりも、15℃における模
擬洗濯条件下で、綿（EMPA 116）上のタンパクに基づく
よごれを白くするための能力が約20〜50％優れることを
示す。 発明の詳細な記載 本発明のさらにそのほかの態様によれば、アルカリプ
ロテアーゼの製造方法が提供され、この方法は、プロテ
アーゼ産生ノカルジオプシス・エスピー（Nocardiopsis
sp.）の菌株を、資化し得る炭素源、窒素源およびリン
源を含有する栄養培地中、好気的条件下で培養し、次い
で発酵ブロスからプロテアーゼ製品を回収することを特
徴とする。 さらに本発明の理解のために、ここで添付した図面に
ついて言及する： 第１図は、ノカルジオプシス・エスピー10R株に由来
するプロテアーゼ並びにバシラスのプロテアーゼ生産物
ALCALASE（商標）、ESPERASE（商標）およびSAVINASE
（商標）によるインシュリンの酸化型Ｂ−鎖処理の15分
および2.5時間後の消化生成物の溶出クロマトグラムを
示す。ノカルジオプシス・ダッソンビレイM 58−１株に
由来するプロテアーゼは、ノカルジオプシス・エスピー
10R株に対する消化生成物と同様なものを与えた（デー
タは示していない）。 第２図は、ノカルジオプシス・エスピー10R株のカゼ
インに対する活性をpHおよび温度の関数として図示す
る。さらにまた、EDTA（10mM）およびフェニルメチルス
ルホニルフルオライド（PMSF、1mM）の影響を示した。
ノカルジオプシス・ダッソンビレイM 58−１株に由来す
るプロテアーゼは、PMSFについては10R株と類似の挙動
をするが、しかしEDTAは活性を阻害しない。これらの結
果は、10R株およびM 58−１株に由来するプロテアーゼ
は、セリンプロテアーゼであり、メタロプロテアーゼで
ないことを示す。 第３図は、ノカルジオプシス・エスピー10R株、ノカ
ルジオプシス・ダッソンビレイM 58−１株および特許の
ZIMET43647株間の至適温度の相違を示す。 第４図は、ノカルジオプシス・エスピー10R株、ノカ
ルジオプシス・ダッソンビレイM 58−１株および特許の
ZIMET43647株間の至適温度の相違を示す。 微生物 本発明の微生物は、ノカルジオプシス（Nocardiopsi
s）の好気性の放射菌に属する。 ２つの菌株は、米国のアグリカルチュラル・リサーチ
・コレクション（Agricultural Research Collection）
（NRRL）にブタペスト条約の条件下で次のごとく寄託さ
れている。 寄託者の参照記号 10R M 58−１
寄託番号 NRRL 18262 NRRL18133
寄託日 1987年11月10日 1986年11月13
日 分類名称 Nocardiopsis sp. N.dassonvill
ei 当該技術分野で既知の方法により得られるこれらの菌
株の変異株および変異体もまた、本発明の範囲内にあ
る。 両菌株とも増殖温度は、20℃〜30℃であり、35℃超で
は増殖しない。増殖のための至適pHは、９であり、そし
てpH8未満ではいかなる増殖も生じない。前記の増殖パ
ラメーターは、特許のZIMET43647菌株のものと相違す
る。ZIMET株は、25〜37℃（好ましくは28℃）の温度お
よびpH6.5〜7.2の酸性度で培養される。 ノカルジオプシス・エスピー（Nocardiopsis sp.）株
のツアペック・ドックス（Czapek Dox）寒天スラント上
での成熟コロニーは、黒い分泌を伴う灰−緑の気中菌糸
を示す。ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardio
psis dassonvillei）M 58−１株のツアペック・ドック
ス寒天スラント上での成熟コロニーは、白からクリーム
に着色した気中菌糸を有する。典型的なノカルジオプシ
ス・ダッソンビレイ菌株は、かすかな黄−灰色を伴なう
青白い気中菌糸を有する。 ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis d
assonvillei）（ATCC 23218）の基準株は、本発明のプ
ロテアーゼを産生しない。基準株（ATCC 23218）および
本発明の分離株ノカルジオプシス・エスピー（Nocardio
psis sp.）は、相違する変異株であると信じられる。さ
らに、10R株およびM 58−１株は、一般的なプロトプラ
スト化試薬、卵白リゾチームおよびノボザイム（NovoZy
m（商標））234に対する応答により相互に他のものから
相違する。10R株は、リゾチームおよび／またはZovoZym
（商標）234により細胞壁が溶解されないが、一方M 58
−１株は、リゾチーム単独でプロトプラスト化すること
ができる。典型的なノカルジオプシス・ダッソンビレイ
株は、リゾチームに感受性である（M.C.Shearer等、In
t.J.Syst.Bacteriol 33:369−374,1983）。これらは、
10R株の細胞壁ペプチドグリカンの結合が、M 58−１株
のそれとおそらく相違することを示している。細胞壁の
分類学的な解析は、10R株が新菌種であるかなりの可能
性を有することを示している。10R株についてのさらに
詳細な分類学的な同定は、実施中である。 タンパク分解活性に対するアッセイ ノカルジオプシス・エスピー培養物中のタンパク分解
活性は、周知のアンソン（Anson）ヘモグロビン法によ
り測定した（Journal of General Physiology, 22,79
−89,1959、参照）。１アンソン単位は、タンパク分解
酵素がpH9.0および温度25℃において、10分の反応時間
中にヘモグロビンを分解し、そこに形成されるトリクロ
ロ酢酸で沈殿され得ない分解生成物が、フェノール試薬
により１分当たりにチロシン１ミリ当量の量と同一の着
色を与える初速度を有するタンパク分解酵素の量であ
る。 また、タンパク分解活性は、カゼインの加水分解、次
いでTCA可溶性タンパクとｏ−フタールジアルデヒドお
よび２−メルカプトエタノールとの反応により測定し
た。得られる複合体の吸収を、340nmで測定し、セリン
標準と比較した。反応混合物は、2.0％（w/v）のハメル
スタイン（Hammerstein）カゼイン1.0ml及び適当な酵素
希釈液0.5ml〔いずれもBrittonおよびRobinsonユニバー
サル緩衝液（Univarsal Buffer）Ｉ（pH 9.5）（J.Che
m.Soc.1931,1451頁）中〕からなる。混合物を25℃で30
分間インキュベートした後、2.5mlの停止剤〔脱イオン
水中、3.6（w/v）％のトリクロロ酢酸、6.0（w/v）％の
酢酸ナトリウムおよび3.78（v/v）％の氷酢酸〕を加え
て反応を停止した。対照の反応物では、酵素を添加する
前に停止剤を添加した。25℃で20分後、反応混合物をワ
ットマン濾紙＃42を通して濾過するか、または遠心し
た。 濾液の既知量（200μ）を、0.05Mの四硼酸ナトリウ
ム、１（w/v）％のドデシルスルホン酸ナトリウム、0.8
mg/mlのｏ−フタルジアルデヒド（OPA）（最初はエタノ
ールの40mg/ml溶液として溶解している）および0.2（v/
v）％の２−メルカプトエタールを含有するOPA試薬3ml
に添加した。２分後に340nmにおける吸収を測定した。
同様に、セリンの標準（0.2mg/ml）200μを、OPA試薬
3mlに添加し、そしてA340を測定した。活性は、CPU（カ
ゼインプロテアーゼ単位）で表示されるが、ここで1 CP
Uとは、標準的な条件下で、セリン1mmolに相当する、１
分当たりのTCAで沈殿しない分解生成物の量を生成する
酵素量として定義される。 プロテアーゼ濃厚物の調製 本発明のノカルジオプシスは、他の微量栄養素と共に
資化し得る炭素および窒素源を含有する栄養培地であっ
て、原則的に公知技術に従って構成されている栄養培地
において、好気条件下で培養することができる。 好ましい炭素源は、グルコースおよびマルトースのよ
うな炭水化物か、または穀類の種子、麦芽、米およびモ
ロコシのような物質を含有する炭水化物である。培地に
取り込まれる炭水化物濃度は、非常に広範囲、グルコー
スと等価のものとして計算されるパーセントで、例えば
１〜15％であってもよいが、通常８〜11％が好ましいで
あろう。 栄養培地中の窒素源は、有機天然物であり得る。有機
窒素源の中で非常に数多くのものが、アクチノミセス類
の培養に関連する発酵工程において通常使用される。例
えば、大豆粉、綿実粕、ピーナッツ粉、カゼイン、コー
ン・スティープ・リカー、酵母エキストラクトおよびア
ルブミンが挙げられる。さらにまた、栄養培地は、通常
の微量物質を含有せしめる。 本発明のノカルジオプシス菌株は、好冷性であるた
め、これらは、35℃以上で増殖することができず、培養
は20℃〜30℃の温度で、かつアルカリのpH値で行うのが
好ましい。アルカリpHは、適当な緩衝剤、例えば炭酸ナ
トリウムまたは炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムの
混合物を、添加（増殖培地の滅菌後）することにより得
ることができる。タンク発酵槽における培養では、人工
的な通気を行うことが必要である。通気速度は、通常の
タンク発酵に従うことが可能である。 発酵後、液状の酵素生成物は、ブロスから粗粒状物の
除去、さらに所望により低温での蒸発または逆浸透によ
る濃縮を経て生成することができる。最後に、濃厚物に
防腐剤を添加してもよい。 本発明によれば、また、アルカリプロテアーゼは、本
発明のノカルジオプシス菌株に由来するプロテアーゼお
よびその発現についてコードする遺伝子を含有する微生
物を培養し、次いで培養ブロスからのプロテアーゼの回
収により調製することができる。培養される前記微生物
は、ノカルジオプシス菌株それ自体（変異株および変異
体を含む）であるか、または遺伝子が組換えDNA手段に
より挿入された形質転換宿主生物体のいずれかである。
かかる手段は、当該技術分野て既知であり、そして一般
に次の段階： ａ）遺伝子の発現を促進する機能をコードするDNA配列
およびノカルジオプシスのプロテアーゼをコードするDN
A配列を含んでなる適当な組換えDNAクローニングベクタ
ーを用意し； ｂ）段階ａ）に由来するクローニングベクターで適当な
宿主生物体を形質転換し；そして ｃ）前記形質転換宿主を、適当な培地で培養し、そして
場合により培養培地からプロテアーゼを回収する を含んでなる。 好ましい宿主生物体は、ノカルジオプシス（Nocardio
psis）、ストレプトミセス（Streptomyces）、酵母およ
びアスペルギルス（Aspergillus）の菌株である。EP 23
8,023（Novo）における宿主のごとく、Ａ・オリーゼ
（A.Oryzae）を用いることが特に好ましい。 ペプチドのマッピング インシュリンの酸化型Ｂ鎖のプロテアーゼによる触媒
的分解により生成されるペプチドを、逆相HPLCで分離し
た。ノカルジオプシス・エスピー10R株のプロテアーゼ
の作用を通して得られ、そして例Ｖに記載されるように
精製されるペプチド分解生成物のクロマトグラムは、第
１図に示される。また、対照として、既知のアルカリプ
ロテアーゼ、ALCALASE（商標）、ESPERASE（商標）、SA
VINASE（商標）で消化して生じたペプチドも示した。酸
化型Ｂ鎖インシュリンの消化パターンに関しては、本発
明のプロテアーゼ（10R）が、バシラスのアルカリプロ
テアーゼのいずれからも明らかに相違することを理解し
得る。さらに、クロマトグラム上の完全なＢ鎖インシュ
リンに相当するピークは、10R株のプロテアーゼについ
てはバシラスのプロテアーゼを用いたものよりも早い時
点で消失する。ノカルジオプシス・ダッソンビレイM 58
−１株に由来するプロテアーゼは、10R株のそれに非常
に類似する消化パターンを生ずる（データは示していな
い）。 酵素の調製物 固体酵素調製品は、Na2SO4のような塩を用いるか、ま
たはエタノールもしくはアセトンのような水混和性溶媒
を用いる沈殿化により精製および／または濃縮したブロ
スから調製することができる。また、ブロスからの水の
除去には、スプレードライのような適当な乾燥方法を用
いることができる。こうして得られるプロテアーゼ調製
品のタンパク分解活性は、一般に0.2〜1.0AU/g（ほぼ0.
2〜1.0 CPU/g）の範囲にある。 本発明のプロテアーゼ調製品は、洗剤添加剤、具体的
には微粉末のない顆粒、安定化した液状または保護した
酵素のように、使用目的に適する剤型であるのが好まし
い。 微粉末のない顆粒は、例えば、NL 167,993（Novo）、
US 4,106,991（Novo）またはUS 4,661,452（Novo）に従
って調製することができ、そして場合により当該技術分
野で既知の原理に基づき被覆してもよい。 液状のプロテアーゼ調製品は、例えば、ポリプロピレ
ングリコール、他のグリコール類、糖、糖アルコールお
よび硼酸を添加することにより安定化し得る。 保護された酵素は、EP 238,216（Novo,Albright ＆ W
ilson）に準じて調製することができる。 洗剤組成物 本発明の洗剤組成物は、陰イオン性、非−イオン性、
陽イオン性もしくは両性イオン性、またはこれらの混合
物であることができる界面活性剤を含んでなる。陰イオ
ン界面活性剤の具体例は、アルカリ金属の直鎖アルキル
ベンゼンスルホネート（LAS）、α−オレフィンスルホ
ネート（AOS）、アルコールエトキシサルフェート（AE
S）および天然石ケンである。 本発明による洗剤は、当該技術分野で既知のその他の
洗剤成分、例えばビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、抗
腐蝕剤、金属イオン封鎖剤、汚物再付着防止剤、香料、
並びに酵素および漂白剤のための安定剤等を含むことが
できる。 本発明の洗剤組成物は、いずれかの都合のよい剤型、
例えば粉末、液体等に成形することができる。プロテア
ーゼは、酵素安定剤、例えば前述したものを入れること
により液体洗剤中で安定化することができる。 一般に、洗剤は、溶液としてpH7〜12、特に８〜10.5
を有する。本発明のプロテアーゼの広範囲な至適pHのた
め、本発明のプロテアーゼは前記の全範囲で高い活性を
有する。 本発明の洗剤は、本発明のプロテアーゼに加えて、１
以上の別の洗剤酵素を包ませることができる。例えば、
リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼおよびプロテアーゼ
（本発明のプロテアーゼ以外）、例えばアルカリ・バシ
ラス（Bacillus）のプロテアーゼである。２（または２
以上）の酵素を、別々にか、または組み合わせた添加剤
の剤型で加えることができる。 図面の簡単な説明 第１図は、本発明の10Rプロテアーゼによるインシュ
リンの酸化型Ｂ鎖の消化生成物の溶出クロマトグラムを
示す。消化していない基質並びにSavinase（商標）およ
びAlcalase（商標）（既知プロテアーゼ）による消化後
についての同様のクロマトグラムも示した。 第２図は、本発明の10Rプロテアーゼに対する温度−
活性およびpH−活性曲線を示す。 第３図および第４図は、本発明の２つのプロテアーゼ
（10RおよびM 58−１）に対するpH−活性および温度−
活性曲線を、ZIMET43647のプロテアーゼについて公表さ
れているデータと比較して示す。 例Ｉ ノカルジオプシス・エスピー（Nocardiopsis sp.）10
R株を、下記の組成の培地50mlを含有する250mlの３重の
じゃま板を備えた（triple−baffled）エーレンマイヤ
ーフラスコ中で、回転振盪性の台上、30℃において培養
した。 １当たり培地組成（ｇ）： マルトデキストリンＭ−100 20 大豆粉 20 酵母エキストラクト ２ K2HPO4 ９ CaCO3 ５ 滅菌後、炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム 緩衝
剤の1M溶液（pH9.2）5mlの添加により培地のpHを9.0に
調節した。インキュベーションの２ないし５日後、ブロ
スのタンパク分解活性を、前記のAnsonアッセイ法を用
いて測定した。93.5時間インキュベーション後の10Rブ
ロスの酵素活性は、13.3AU/であった。 ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis d
assonvillei）M 58−１を、インキュベーションが25℃
である以外は、記載されているのと同様に培養した。イ
ンキュベーションの140.5時間後、ブロスは9.6AU/の
酵素活性を有していた。 例II ノカルジオプシス・エスピー10R株を例Ｉに記載した
のと同様の培地および条件下で培養した。26時間増殖
後、その培養物２を用い発酵槽中の例Ｉに記載した培
地50（培地のpHは滅菌後調節していない）に接種し
た。 接種後、発酵槽の増殖pHは、2MのNa2CO3および10％の
H3PO4で8.7に調節した。温度を30℃に維持した。90時間
後、プロテアーゼの力価は、Ansonアッセイ法を用いて
測定したところ11.5Anson単位／を示した。 培養ブロスを遠心して細胞を除去した。次に、上澄を
濾過し（0.45μ）そして限外濾過（10,000分子量カット
−オフ）により、以下の例で使用される生成物になるま
で濃縮した。 ノカルジオプシス・ダッソンビレイM 58−１株を、イ
ンキュベーション温度を25℃とした以外は例Ｉに記載し
たのと同じ培地および同じ条件下で培養した。24時間の
増殖後、培養物２を用いて次の成分（g/）からなる
発酵槽培地50に接種した。 マルトデキストリン 40 セレロース（Cerelose） 40 大豆粉 60 K2HPO4 5.5 MgSO4 0.40 CaCl2 0.30 微量ミネラル溶液 7ml 発酵温度は、30℃に制御した。初発pHは8.6に設定
し、そして8.5以下にならないように2MのNa2CO3を添加
して調節し、またさらに8.8を越えないようにH3PO4の添
加により調節した。グルコースが消費されそしてD.O.の
パーセントが上昇し始めた場合は、グルコースをフィー
ドした。フィード流は、グルコース溶液（水500g中セレ
ロース500g）からなる。グルコースは、20g/のグルコ
ースが加えられるまで（約12時間）、3.5ml/／時の一
定速度で供給した。プロテアーゼは、40時間で蓄積し始
め、120時間で最高の力価53AU/を得た。 培養ブロスを遠心して細胞を除去した。次に、上澄液
を濾過（0.45μ）し、そして限外濾過（10,000分子量カ
ット−オフ）により、次の例で使用される生成物になる
まで濃縮した。 例III pHおよび温度の関数としての例II由来の10R株のプロ
テアーゼ活性を、前述のアッセイ方法に従い、基質とし
てカゼインを用いて測定した。さらに、プロテアーゼ活
性に対するEDTA（10mM）およびフェニルメチルスルホニ
ルフルオライド（PMSF,1mM）の影響を試験した。結果を
第２図にグラフ化した。第２（ａ）図から理解できるよ
うに、市販のプロテアーゼAlcalaseと同様に、至適温度
は60℃に等しいか、またはそれ以上にある。プロテアー
ゼは、pH8〜９間に極大活性を示し、そしてpH7〜11の範
囲内で極大活性の少くとも85％の活性を示す。EDTAは、
プロテアーゼ活性に何等の影響も及ぼさないが、一方PM
SFの添加は、殆んど完全な阻害をもたらし、本プロテア
ーゼがセリン型であることを示している。 例IV 25℃または40℃において種々の洗剤成分の存在下で、
10R株およびM 58−１株に由来するプロテアーゼの安定
性を次のように測定した。 第Ｉ表に示した添加成分の存在下または不存在下で0.
01Mの硼酸緩衝液（pH9.5）中にプロテアーゼを0.5AU/
まで希釈した。 試験したノカルジオプシス・エスピーのプロテアーゼ
の両方とも、25℃かまたは40℃のいずれかにおいてもそ
れらの本来の活性の少くとも83％を維持した。例Ｖ 例IIで生産したノカルジオプシス・エスピー10Rに由
来するプロテアーゼを、次のように精製した。 まず最初に、濃厚細胞除去ブロスを、0.05MのHEPES緩
衝液（pH7）で平衡化したセファデックス（Sephadex）
−G25カラム（並のグレード）にかけた。タンパクを、
同じ緩衝液で溶出し、プロテアーゼ活性を含有する画分
を集めた。所望により、集めた酵素溶液を水または緩衝
液を用いて希釈して適当なイオン強度を与えた後、0.05
MのHEPES（pH7）で平衡化したCM−セファロース（Sepha
rose）速流性カラムにかけた。約50％の総プロテアーゼ
活性を樹脂に吸着させ、次いで直線塩グラージェント
（０〜75mMのNaCl）で連続的に溶出した。 このCM−セファロース（Sepharose）精製プロテアー
ゼは、21.0AU/g（15CPU/g）の比活性を有する。 SDS−PAGEに分析した場合、精製プロテアーゼは、そ
れぞれの25,000および23,500の分子量を有する１の主成
分および１の副成分の２つの組成分を含有することがわ
かった。ノカルジオプシス・ダッソンビレイM 58−１株
に由来するプロテアーゼを、同様に精製したところ、分
子量20,500を有するSDS−PAGE上に１のバンドから構成
されていた。 例VI ノカルジオプシス・エスピー由来のプロテアーゼは、
商品プロテアーゼALCALASE（商標）,SAVINASE（商
標）、およびESPERASE（商標）から、インシュリンの酸
化型Ｂ鎖の消化についてのそれらのパターンにより識別
された。プロテアーゼ（2.7×10-5CPU）を、pH9.0の緩
衝液中のインシュリンの酸化型Ｂ鎖〔0.17（w/v）％〕
に加え、そして25℃で15分間または2.5時間インキュベ
ートした。反応を停止するために20分煮沸した後、サン
プルを0.1Mの硫酸アンモニウム（pH3）で平衡化した逆
相HPLCカラム（Bakerbond Widepore C18）に注入した。
ペプチドは、０〜50％のアセトニトリルの直線的グラー
ジェントにより溶出した。 クロマトグラムは第１図に示され、そして本発明のプ
ロテアーゼが、バシラスアルカリプロテアーゼのいずれ
からも、酸化型インシュリンＢ鎖消化のクロマトグラム
パターンに関して異なることを示す。さらに、10R株の
プロテアーゼでは、クロマトグラム上の完全なインシュ
リンのＢ鎖に相当するピークが、バシラスのプロテアー
ゼ用いたものよりも早い時点で消失する。 例VII 洗浄試験は、テスト・ファブリックス社（Test Fabri
csInd.,Middlesex NJ.）より供給されるEMPA 116試験布
見本（血液、ミルクおよびカーボンブラックにより染が
つけられている綿）を用い、15℃で10分間Terg−Ｏ−To
meter中で実施した。0.025,0.05,0.1CPU/の酵素量を
タイド（Tide ）（リン酸塩：＜0.5、酵素未含有、pH1
0.4）に添加した。プロテアーゼは、10R株由来のものお
よびSAVINASE（商標）を使用した。 プロテアーゼの清浄性は、反射率の変化（ΔＲ）、即
ち、酵素洗浄試験見本の反射率値を、酵素用いないで洗
浄した試験見本のそれで差し引いたもの、により測定し
た。反射率値は、ガーディナー・レフレクトメーター
（Gardiner Reflectometer）XL 800（Betheda,MD）を使
用して読み取った。 結果を第III表に表す。これらは、同じ使用量におい
て、10RプロテアーゼはSavinaseを用いるよりも20〜50
％大きい清浄性を得ることができることを示す。 例VIII 洗浄試験は、ノカルジオプシス・エスピー10R株およ
びノカルジオプシス・ダッソンビレイM 58−１株に由来
するプロテアーゼを用い、市販のプロテアーゼALCALASE
（商標）およびSAVINASE（商標）との比較のために実施
した。EMPA 116試験布見本（血液、ミルクおよびカーボ
ンブラックにより染がつけられている綿）は、テスト・
ファブリックス社（Test Fabrics Ind.,Middlesex,NJ）
から入手し、そしてホウレンソウ見本および血液見本
は、新鮮なホウレンソウ抽出液またはウシの血液を所望
の綿布に付着した後、空気乾燥して自社調製した。洗浄
試験は、次の組成の洗剤において15℃で10分間、Terg−
Ｏ−Tometer中で実施した。 組成 g/ LAS（Nansa 80S,80％の活性） 0.4 AE（Berol 065） 0.15 石ケン（Sunlight,80％の活性） 0.15 トリポリリン酸ナトリウム 1.75 ケイ酸ナトリウム 0.4 カルボキシメチルセルロース 0.05 EDTA 0.01 硫酸ナトリウム 2.1 水 （ドイツ硬度９゜dH、pH9.5に調節） 0.05CPU/の酵素量をEMPAおよびホウレンソウの染に
使用し、0.5CPU/の酵素量を血液の染に使用した。 反射率値は、ガーディナー・レフレクトメーターXL 8
00（EMPAおよびホウレンソウ）を用いるか、または460n
m（血液）においてエルレポ（Elrepho）2000を用いて読
み取った。プロテアーゼの清浄性は、反射率変化（Δ
Ｒ）、即ち、酵素洗浄試験見本の反射率値から酵素を用
いないで洗浄した見本のそれを差し引いて測定した。結
果を、第IV表にまとめた。 この結果から、ノカルジオプシス・エスピー10R株お
よびノカルジオプシス・ダッソンビレイM 58−１株のプ
ロテアーゼは、すべてのタイプの染の試験において、等
しい使用量に基づき同等の優れた挙動を示すことが明ら
かである。 特に、M 58−１株由来のプロテアーゼは、EMPA 116に
ついて使用するために好ましく、10R株由来のプロテア
ーゼは、血液の染について使用するために好ましい。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ストロベル，ロバート，ジョージフ，ジ ュニア アメリカ合衆国，コネチカット 06810, ダンバリー，オール マスケット レイ ン 19 (72)発明者 オーバーホルト，ジャネット，エム. アメリカ合衆国，コネチカット 06811, ダンバリー，オールド ブロックフィー ルド ロード 166，ユニット 17―６ (56)参考文献 東独国特許200432（ＤＥ，Ｂ)

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 １．ノカルジオプシス ダッソンビレイ（Nocardiopsis
    dassonvillei）M58−１（NRRL 18133として寄託され
    た）又はノカルジオプシス（Nocardiopsis）sp.10R（NR
    RL 18262として寄託された）であり、そして20〜30℃に
    増殖のための最適温度を有しかつ35℃超では本質的に増
    殖しないことを特徴とする、プロテアーゼ生産ノカルジ
    オプシス。 ２．アルカリプロテアーゼの製造方法であって、菌株ノ
    カルジオプシス ダッソンビレイ（Nocardiopsis dasso
    nvillei）M58−１（NRRL 18133として寄託された）又は
    ノカルジオプシス（Nocardiopsis）sp.10R（NRRL 18262
    として寄託された）を、適当な炭素源および窒素源を含
    有する培地中、アルカリ性のpHおよび20〜30℃の温度
    で、液内培養下で好気的に培養し、次いでしかる後培養
    ブロスからプロテアーゼを回収することを含んでなる、
    前記製造方法。 ３．前記培養を、pH8〜10で行う、請求の範囲第２項記
    載の方法。 ４．ノカルジオプシス ダッソンビレイ（Nocardiopsis
    dassonvillei）M58−１（NRRL 18133として寄託され
    た）又はノカルジオプシス（Nocardiopsis）sp.10R（NR
    RL 18262として寄託された）から由来するアルカリプロ
    テアーゼ調製品であって、基質としてカゼインを用いて
    測定した場合に、７〜11のpH範囲内にその最大活性の少
    なくとも60％を有することを特徴とする、前記アルカリ
    プロテアーゼ調製品。 ５．請求の範囲第４項記載の調製品であって、菌株ノカ
    ルジオプシス ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonv
    illei）M58−１（NRRL 18133として寄託された）又はノ
    カルジオプシス（Nocardiopsis）sp.10R（NRRL 18262と
    して寄託された）を、適当な炭素源および窒素源を含有
    する培地中、アルカリ性のpHおよび20〜30℃の温度で、
    液内培養下で好気的に培養し、次いでしかる後培養ブロ
    スからプロテアーゼを回収することを含んでなる方法に
    より製造された前記調製品。 ６．前記培養をpH8〜10で行う、請求の範囲第５項記載
    の調製品。 ７．洗剤添加剤の形態にある、請求の範囲第４〜６項の
    いずれか１項に記載の調製品。 ８．無粉塵性粒質物または安定化液体として提供され
    る、請求の範囲第７項記載の調製品。 ９．0.5〜10 CPU/gのタンパク分解活性を有する、請求
    の範囲第７又は８項記載の調製品。 １０．アルカリバシラス（Bacillus）プロテアーゼを更
    に含有する、請求の範囲第７〜９項のいずれか１項に記
    載の調製品。 １１．酵素洗剤組成物であって、基質としてカゼインを
    用いて測定した場合に、７〜11のpH範囲内にその最大活
    性の少なくとも60％を有することを特徴とする、 ノカルジオプシス ダッソンビレイ（Nocardiopsis das
    sonvillei）M58−１（NRRL 18133として寄託された）又
    はノカルジオプシス（Nocardiopsis）sp.10R（NRRL 182
    62として寄託された）から由来するアルカリプロテアー
    ゼを含んでなる、前記酵素洗剤組成物。 １２．0.001〜0.5CPU/gのタンパク分解活性を有する請
    求の範囲第11項記載の組成物。 １３．アルカリバシラス（Bacillus）プロテアーゼを更
    に含有する、請求の範囲第11又は12項記載の組成物。
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