JPH01501486A - 酵素洗剤添加剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素洗剤添加剤 本発明は、アルカリプロテアーゼを組合せた物を含んでなるタンパク分解性洗剤 添加剤、洗浄剤および洗浄方法に関する。

鼓ｊυと駈 洗剤の酵素添加剤から成る技術分野は、ここ１０年間で急速に発展してきた。例 えば、Ｃ１ａｕｓ　Ｄａｍｂｍａｎｎ、Ｐｏｕｌ　Ｈｏ１ｍ、ＶｉｌｌｙＪｅｎ ｓｅｎおよびＭｏｇｅｎｓ　Ｈｉｌｍｅｒ　Ｎ１ｅｌｓｅｎによるＤｅｖｅｌｏ ｐｍｅｎｔｓ　１ｎＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第１２ 巻、「どのようにして洗剤に酵素を入れればよいか、（Ｈｏｗ　Ｅｎｚｙａ＋ｅ ｓ　ｇｏｔ　１ｎｔｏ　Ｄｅｔｅｒｇｅ−ｎｔｓ）Ｊ　（Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏ ｒ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ＡｍｅｒｉｃａｎＩｎ ｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｓｅｓ、Ｗａｓｈｉ ｎｇｔｏｎ、Ｄ、Ｃ，１９７１，。

出版）、並びにモンテルー（Ｍｏｎｔｒｅｕｘ、　Ｓｗｉ　ｔｚｅｒｌａｎｄ） で開催された２ｎｄ　Ｗｏｒｌｄ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｄｅｔｅｒｇ ｅｎｔｓ　’において１９８６年１０月９日付で配付されたＰ、Ｎ、Ｃｈｒｉｓ ｔｅｎｓｅｎ＋　Ｋ、Ｔｈｏｍｓｅｎおよび５ｒａｎｎｅｒの論文「洗剤酵素の 開発（Ｄｅｖｅｌｏｐ＋ｏｅｎｔ　ｏｆＤｅｔｅｒｇｅｎｔ　Ｅｎｚ）＋＋５ｅ ｓ）Ｊの記事に言及がなされている。

殊に、バシラス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　肚、）を適当な栄養培地で培養 することにより生産されるアルカリプロテアーゼは、広く洗剤配合物として使用 されている。かかる市販のプロテアーゼ製品の例としては、アルカラーゼ（ＡＬ ＣＡＬＡＳＥＯ）、エスペラーゼ（ＥＳＰＥＲＡＳＥＯ）およびサビナーゼ（Ｓ ＡＶＩＮＡＳＥＯ）があり、これらのすべてはノボ（ＮＯＶＯＩｎｄｕｓｔｒｉ 　Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から供給される。これらおよび他の商業的な供給源 に由来する類僚酵素製品は、洗剤溶液、即ち、ｐ）１７〜１２の範囲内で、かつ 金属イオン封鎖剤、界面活性剤および過硼酸ナトリウムのような漂白剤の存在下 で活性を有する。ＡＬＣＡＬＡＳＥＯは、バシラス・リケニホルミス（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）種の菌株により産生される。ＥＳＰＥ ＲＡＳＥＯおよび５ＡＶＩＮＡＳＥ＠は、米国特許第３，７２３．２５０号に従 い、好アルカリ性バシルス苗株の培養により得られる。

過去２０年間に、改善された洗浄力を有する洗剤の開発に多大の努力が傾けられ 、そして既にそれらを経済的に生産することが可能である。これらの努力は、バ シラス・エスピー由来のアルカリプロテアーゼに集中し、今や洗剤工業において これらの類似品が使用されている。一般に、この群のプロテアーゼは、優れた洗 浄力を示す上に、バシラス・エスピー菌株改良および液内発酵の技術がかなり開 発されているので効率的に生産することができる。しかしながら、既に多大な努 力がなされているので、このよく調査された領域でより優れたプロテアーゼを発 見することは、困難さが増大してきている。

他の微生物、例えばカビおよび放線菌由来のプロテアーゼもまた、研究されてき た。例としては、米国特許第３．６５２．３９９号は、フゼリウム・オキシスポ ラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　７に由来するアルカリプロテアーゼが、ｐＨ８〜１１ ．５の範囲内で高い活性を有し、そして洗剤における使用が有効であることを公 表している。別の例としては東ドイツ特許公開ＤＤ−２，００４，３２８号は、 ｐＨ６〜１０の範囲内で活性を有するノカルジオプシス・ダッソンビレイ　（勤 μ圧虹」！堕ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）に属する放線菌に由来するアルカリプ ロテアーゼを公表する。

これらのプロテアーゼは、優れた洗浄力を示すが、しかしながら、一般にこれら を経済的に生産することは困難である。

今日、カビおよび放線菌プロテアーゼは、バシラスプロテアーゼに比し、価格の 面で利用できず、そしてそれらは洗剤において商業的に使用できないと信じられ ている。

本発明の目的は、改善された洗浄力を示す、２種以上のプロテアーゼの組合せか ら成るタンパク分解性洗剤添加剤を提供することである。驚くべきことに、この ような洗剤は、１以上のバシラスブロテアーゼと１以上のカビまたは放線菌プロ テアーゼを、バシラスプロテアーゼまたはプロテアーゼ類が総タンパク分解活性 の５０〜９５％を提供するように組合せることにより得られることが見い出され た。

弦歪煎宣景 １９８１年に、ＡＬＣＡＬＡＳＥ・およびＥＳＰＥＲＡＳＩＪ　、即ちバシラス ・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　並）由来の２種のアルカリプロテアーゼの混合 物を含んでなる酵素添加剤を含有する洗剤が、ヨーロッパ市場で販売された。

また、大阪市立大学生活科学協（Ｏｓａｋａ　５ｈｉｒｉｔｓｕ　Ｄａｉｇａｋ ｕＳｅｉｋａｔｓｕ　Ｋａｇａｋｕ　Ｋｉｙｏ）　２３＋１９７５　、によれば 、中性プロテアーゼおよびアルカリプロテアーゼの混合物を使用することが、し ばしば洗浄過程においてより有効であることを表す。しかし、組合せ効果のいか なるデータまたはそれ以上の詳細も示されていない。

また、米国特許第４．５１１．４９０号は、２種のプロテアーゼの相乗性混合物 を記載する。例示されたプロテアーゼは、すべてバシラス・エスピーに由来する アルカリプロテアーゼである。効果は、洗剤の不在中におけるカゼイン溶液の加 水分解を測定することだけが例示されている。プロテアーゼの組合せは、洗浄力 を改善する可能性があることを窺かわせるが、しかし洗浄試験に基づくデータは 提供されていない。最高の活性は、２種のプロテアーゼの活性に基づき約１：２ 〜２：１の混合比において見い出されている。

さらに、特公昭６１−１９．６７９号公報は、２種のプロテアーゼを組合した物 の洗剤における使用を記載する。これに例示される組合せは、バシラス・エスピ ーに由来するアルカリプロテアーゼを使用する。洗浄試験に由来するデータは、 単独のプロテアーゼの使用を越えるいかなる改良された洗浄力も示さず、その効 果は、各々の酵素単独の温度範囲よりも広い温度範囲まで拡張することのみであ る。２種のプロテアーゼの混合比は、活性に基づき１：１である。

従って、洗剤のためのバシラス・エスピーに由来する２種のアルカリアミラーゼ を含んでなる洗剤添加剤は、既知であるが、しかしながら改善した洗浄力を示す データは公表されていない。事実、本明細書に後述する例は、このような混合物 の洗浄力は、単独のプロテアーゼのそれよりもほんの僅かよくなるにすぎないこ とを示す。アルカリ細菌プロテアーゼとアルカリ性カビまたは放線菌プロテアー ゼを共に含んでなる洗剤添加剤は、従来の文献には記載されていなかった。

西ドイツ特許公開ＤＥ−２，３０１，５９１Ａ、　ＤＨ−２，３０７，６０３Ａ 、　ＤＨ−２，３０８，９６７ＡおよびＤＥ−２，３２１，６２９Ａ公報には、 なめし革の処理のためにアルカリ細菌プロテアーゼとカビプロテアーゼを一緒に 使用することが記載されている。これらで得られている効果は、なめし革の毛羽 立ちをなくし、ベーティングおよび軟化をすることであり、そして化学環境は、 硫化物、メルカプタンまたは亜硫酸塩のような還元性イオウ化合物を包含するが 、しかしながら界面活性剤または他の通常の洗剤組成分を包含しない。

主尻見凰！ 本発明は、少くとも１つはバシラス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ並、）に由来 するプロテアーゼであり、少くとも１つはカビまたは放線菌プロテアーゼである ところの少くとも２種のアルカリアミラーゼを組合せた物を含んでなるタンパク 分解性洗剤添加剤を提供する。好ましくは、混合比は、バシラス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ）プロテアーゼの活性が総タンパク分解活性（後述するようにＣＰＵで測定 される）の５０〜９５％、より好ましくは７０〜９５％を供給するようなもので ある。好ましい態様では、組合した物の洗浄力が各々のプロテアーゼの洗浄力が ら予期されるものより高く、好ましくは少くとも２０％高く、そして最も好まし くは少くとも４０％高い。

洗浄力の比較における洗浄試験は、本明細書の例８に示される方法によって行う ことができ、そこに示される条件のいずれのセットも使用することができる。

別法としての洗浄試験は、本明細書のいくつかの例に記載するような水の硬度、 洗剤組成および使用量を用いるターグー０−トーメーター（Ｔｅｒｇ　−０−Ｔ ｏｍｅｔｅｒ）により行うことができる。洗浄条件は、１５”、２５’または４ ０℃で１０　、２０または４０分であることができる。よごれ会見本の種類は、 本明細書ですべて後述される加熱変性血液見本、表面変性血液見本、加熱変性ホ ウレンソウ見本またはＥＭＰＡ　１１６であることができる。洗浄力は、本明細 書において後述されるように、反射率またはタンパク除去率によって評価するこ とができ、そしてΔＲ（反射率２％）またはＰＲ（タンパク除去率２％）として 示される。プロテアーゼを組合せた物は、０．０５または０、Ｉ　ＣＰＵ／／の 使用量とされる。比較洗浄試験は、同一の総使用量における単独プロテアーゼを 用いて行われる。プロテアーゼを組合せた物の洗浄力の比較は、純粋なバシラス ブロテアーゼ（最大の活性を与えるものとしての）洗浄力を用いるか、または各 々のプロテアーゼのより大きいものを用いるか、または各々のプロテアーゼの洗 浄力の重量平均（直線的内挿法）を用いるかの、いずれかで行うことができる。

好ましい態様では、アルカリプロテアーゼは、約ｐＨ９において、カゼインに対 する最高値（後述するようなＣＰＵ法による）を有する。かかるプロテアーゼは 、溶液としてのｐＨが一般に約９であるような粉末洗剤と共に使用するのが好ま しい。

好ましい態様では、洗剤添加剤は、米国特許第３，７２３．２５０号に記載され ているＢ、リケニホルミス（旦、　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）または好アル カリ性バシラス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　肚、）に由来するバシラスプロ テアーゼを含んでなる。後者のプロテアーゼは、セリン型でありそしてアンソン （Ａｎｓｏｎ）法でヘモグロビンについて測定したタンパク分解活性が、約ｐＨ ９において至適タンパク分解活性を示し、さらにｐＨ１２において極大タンパク 分解活性の８０〜１００％が残存する特徴を有する。

これらのすべてのプロテアーゼは、優れた洗浄力を有し、そして経済的に生産す ることができるので、広く商業的に使用されている。

好ましい態様では、洗剤添加剤は、ペシロミセス・エスピー（Ｐａｅｃｉｌｏｗ ＋　ｃｅｓ　肚、）、フザリウム・エスピー（Ｆｕｓａｒｉｕ＋ｍ並、）または ノカルジオプシス・エスピー（釦■皿旦匹ハ　鉦、）に由来し、最も好ましくは Ｐ、マークアン・ジー（Ｐ、観皿虹ａｎｄｉｉ）、Ｆ、オキシスポラムユ肛　竺 ■匹匹紋またはＮ、ダソソンビレイ　（ｙエ　ｄａｓｓｏｎｖｉ　ｌ　Ｉｅｉ） に由来するカビまたは数本発明の好ましい態様では、洗剤添加剤が、当該技術分 野のいずれかの既知の方法、例えば英国特許第１，３６２．３６５号または米国 特許第４．１０６．９９１号に従い、調製され、粉立ちしていない顆粒として提 供される。プロテアーゼは、顆粒化の前または後に混合することができ、即ち酵 素調製物は、２種以上のプロテアーゼをそれぞれ含有する顆粒からなることがで きるか、または各々のプロテアーゼを含有する顆粒の混合物であることもできる 。粉立ちしない顆粒は、粉末洗剤に添加するために、最も好都合な剤型である。

他の好ましい態様では、洗剤添加剤は、酵素安定剤、例えばプロピレングリコー ルまたはプロテアーゼを安定化することが当該技術分野で既知の他の剤を伴う液 体として提供される。これは、液体洗剤に添加するために好都合である。

本発明の洗剤添加剤の好ましい態様では、総プロテアーゼ活性が０．１〜ｌ０Ｃ ＰＵ／ｇであり、好ましくは０．５〜５　ＣＰＩＪ／ｇである。このものが、０ ．０５％〜５％の量で、好ましくは０．１〜２％の量で洗浄剤に添加されている 場合には、この洗浄剤は、適当なプロテアーゼ活性を有する０、５〜２０ｇ／ｌ の濃度で、具体的には０．０２〜０．５ＣＰＬｌ／Ｉ！で用いるのが一般的であ ろう。

本発明の別の態様は、前述したような少くとも２種以上のプロテアーゼを組合せ た物を含有する洗浄剤（Ｃｌｅａｎｉｎｇ）組成物を提供する。洗浄剤は、粉末 洗剤かまたは液体洗剤であることができる。２種のプロテアーゼは、洗浄剤に別 々の添加剤として加えるか、または前記した酵素調製物のような組合せ添加剤の 剤型で加えることもできる。

洗浄剤のプロテアーゼ活性の好ましい態様は、０．００１〜０．０８　ＣＰυ／ ｇ、好ましくは０．００３〜０．０１２　ＣＰＵ／　ｇである。

このものは、適当なプロテアーゼ活性を有する０、５〜２０ｇ／ｌの濃度で、具 体的には、０．０２〜０．５Ｃｐｕ／ｌで用いる場合が一般的である。

本発明のさらに別の態様は、少なくとも２種のプロテアーゼを一緒に使用する洗 浄法を提供する。２種のプロテアーゼは、前述の酵素洗浄剤の剤型で添加するか 、または洗浄過程で別々に加えることもできる。

尤貝至詳史ムに考 タンパク　”活工のアッセイ タンパク分解活性は、周知のアンソン（Ａｎｓｏｎ）ヘモグロビン法により測定 した（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２２＋ ７９〜Ｂ９．１９５９、参照）。１アンソン単位は、タンパク分解酵素がｐＨ９ ，０および温度２５℃において、１０分の反応時間中にヘモグロビンを分解し、 そこに形成されるトリクロロ酢酸で沈殿され得ない分解生成物が、１分光たりに チロシン１ミリ当量が着色するのと同一のフェノール試薬による着色を与える初 速度を有するタンパク分解酵素の量である。

また、タンパク分解活性は、基質としてカゼインを用いて測定された。１力ゼイ ンプロテアーゼ単位（ＣＰ　Ｕ）は、標準条件下、即ち、２５℃およびＰＨ９， ５で３０分間インキュベート、で１分間に一級アミノ基のＩＩＩＩＭを遊離する 酵素量（セリン標準との比較により測定される）として定義される。カゼイン（ Ｈａ＋ｎ＋ａｒｓｔｅｒ、Ｍｅｒｃｋ　Ａ、Ｇ、西ドイツ、より入手）の２（Ｗ ／Ｖ）％の溶液を、Ｂｒ１ｔｔｏｎおよびＲｏｂｉｎｓｏｎにより記載されてい るユニバーサル緩衝液（Ｊｏｕｒｎ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　１９３１．１４５１ 頁）を用いて調製し、ｐＨ９，５に調節した。

基質溶液２ｄを、２５℃の水浴中で１０分間前もってインキュベートした。酵素 溶液１ｍｌを加えた。反応液を２５℃で３０分間インキュベートした後、停止剤 〔トリクロロ酢酸（１７，９ｇ）　、酢酸ナトリウム（２９，９ｇ　）および氷 酢酸（１９，８ｇ）を脱イオン水で５００艷に調合したものを含有する溶液５− 〕の添加により反応を停止した。ブランクは、酵素溶液に前もって停止剤を加え た外は、試験液と同様に調製した。

反応混合物を、前記水浴中で１０分間維持した後、すぐさまそれらをワットマン （Ｗｈａｔｍａｎ　Ｏ）　４２を通して濾過した。

−級アミノ基は、Ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰ　Ａ）によるそれらの発色によ り測定される。

四硼酸デカヒドロ二ナトリウム塩（７，６２ｇ　）およびドデシルスルホン酸ナ トリウム（２，０ｇ）を、水１５０−に溶解した。

０ＰＡ（１６０■）を、メタノール４ｉに溶解し、次いでβ−メルカプトエタノ ール４００　Ｊｌｌと共に添加し、その後、溶液を水で２００　ｍｌにした。

ＯＰＡ試薬（３−）に、前記の濾液４００μｌを混合しながら添加した。３４０ 　ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を約５分後に測定した。

また、ＯＰＡ試験は、Ｂｒｉ　ｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液（ｐＨ９，５ ）１００１ｎＲ中にセリン１０■を含有するセリン標準についても実施した。こ の緩衝液をブランクとして使用した。

プロテアーゼ活性は、次の式により光学濃度の測定値から計算した。

（前記式中、ＯＤｔ　、　ＯＤｂ　、　００−Ｆおよび００ｍは、それぞれ試験 溶液、ブランク、セリン標準および緩衝液の光学濃度であり、Ｃｓｉｒは、標準 中の■／−でのセリン濃度、ＮＷｓｅｒセリンの分子量、Ｑは酵素についての希 釈率、そしてｔｉはインキュベート時間である。） 洗土装！ 洗浄試験は、Ｊａｙ　Ｃ，Ｈａｒｒｉｓ：洗浄力の評価および試験（Ｄｅｔｅｒ ｇｅｎｃｙ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｅｓｔｉｎｇ）、　Ｉｎｔｅｒ ｓｃｉｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｌｔｄ、＋１９５４．６０〜６１頁、に記 載されているようなＴｅｒｇ　−０−Ｔｏ＋＊ｅｔｅｒにより行った。

ス（並見本 洗浄試験では、３種類のよごれ見本を使用した。これらは、次のごとく調製した 。

扉１１ＪＩｍ主 白生地（ポリエステル５０％、綿５０％）を、アミラーゼ（ＢＡＮ　Ｎｏｖｏ） を用いて糊抜きをし、そして乾燥した。

見本を試験片（１０Ｘ２０ｃｍ）に裁断し、ウシの血液（凝固を防ぐためのクエ ン酸塩を伴う）に浸漬し、次いで２つのローラー間で絞った。その後、これらを タンブラ−中（６０℃）で乾燥した。

見本は、６０℃の熱水中で８分間変性し、冷水で濯ぎそしてタンブラ−中（６０ ℃）で乾燥した。

表　−ｍ’Ｌｌ主 白生地（綿１００％）を、アミラーゼ（ＢＡＮ　Ｎｏｖｏ）で糊抜きをし、そし て乾燥した。

見本を、試験片（１０Ｘ２０ｃｍ）に裁断し、ウシの血液（凝固を防ぐためのク エン酸塩を伴う）に浸漬し、次いで空気乾燥した。

見本を室温で２週間放置し、生地への血液の付着を確実にした。その後、これら を使用するまで一１８℃で保存した。

■熱亥１ホウレンソウ　本 白生地（綿１００％）を、アミラーゼ（ＢＡＮ　Ｎｏｖｏ）を用いて糊抜きをし 、そして乾燥した。

見本を試験片（１０Ｘ２０ｃｍ）に裁断し、ホウレンソウ・ジュースに浸漬し、 次に２つのローラー間で絞った。その後、それらをタンブラ−中（６０℃）で乾 燥した。これを２度繰り返した。

変性は、前記のように行った。

洗五搭斂 別に記載するものを除き、約ｐ）１９．５を有する５　ｇ　／　ｌ溶液は、９° ジヤ一マン硬度（ｇｅｒｍａｎ　ｈａｒｄｎｅｓｓ）の水に、次のものを溶解す ることにより調製した。

ＬＡＳ（Ｎａｎｓａ　Ｓ　８０）　０．４０　ｇ　／　ＩＡＥ（Ｂｅｒｏｌ　０ ６５）　０．１５　−石けん　ｏ、ｉｓ　− ５ＴＰＰ　１．７５　− ケイ酸ナトリウム　０．４０　− ＣＭＣ０，０５− ＥＤＴＡ　Ｏ，０１− ＮａｚＳＯａ　２．１０　− 迭」じ贋夫 別に記載するものを除き、洗浄試験は、見本当たり洗剤溶液１００＋ｎｊ！中の ９．　ＯＸ　５．５　ｃｍの見本（約１ｇ）を用いて、１１００ｒｐを有するＴ ｅｒｇ　−０−Ｔｏｍｅｔｅｒ中で実施し、そして酵素の使用量は、各例中に示 した。

見本を洗浄した後、水道水で１５分間濯ぎ、そして空気乾燥した。その後、反射 率をエルレボ・レフレクトメーター（Ｅｌｒｅｐｈｏ　ｒｅｆｌｅｃｔｏｍｅｔ ｅｒ）における４６０ｎｍで測定し、そして／または残存するタンパクを、以下 にｉ己載する方法で測定した。

結果は、反射率の差 ΔＲ＝Ｒ−Ｒ，または、 タンパク除去率の差 ΔＰ　Ｒ”　Ｐ　ＲＰ　Ｒｏとして表した。

（Ｒ，およびＰＲｏは、同じ条件下でプロテアーゼを有していない洗剤で洗浄す ることにより得られる値である。）′　上に　するタンパクの渉 見本を、ｌ　ｃｍ　Ｘ　ｌ　ａｎの試験片に裁断した。タンパク０．５〜０．８ ■に相当する量を計り分はハーゲドーン（Ｈａｇｅｄｏｒｎ）容器に置いた。前 記洗剤４−を添加した０次に、ｌ０ＣＰＬＩ／ｌの濃度でＥｓｐｅｒａｓｅＯ（ Ｎｏｖｏ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉ　Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を含有するプロテアー ゼ溶液２ｄを加えた。

エスペラーゼ（ＥｓｐｅｒａｓｅＯ）の添加後、この混合物を４０℃の振盪浴中 で４時間インキュベートした。

インキュベートが終わって、反応を１０％の酢酸２−を加えて停止した。

ブランクは、洗剤２　ｍｌおよびエスペラーゼ（Ｅｓｐｅｒａｓｅｌ）　）ｌ　 ｍｌで調製し、そして１０％の酢酸１−で停止した。

インキュベートした後、反応混合物をワットマン４２濾祇を通して濾過した。濾 液４００ＩをＯＰＡ試薬（前述のように調製した＞３ｓｎｌと混合し、約５分後 に３４０ｎｍにおける光学濃度を測定した。

また、ＯＰＡ試験は、Ｂｒ１ｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液（ｐＨ９，５） １００−中にセリン１０■を含有するセリン標準と共に実施した。この緩衝液を ブランクとして使用した。

タンパク量（セリン当量として）は、次の式により計算した。

（前記式中、ａは、見本の重量（ｇ）である）洗浄する前の見本のタンパク量と の比較により、残存タンパク％（ΔＰＲ）を計算した。

カビおよび　６　プロテアーゼ 本発明に使用されるプロテアーゼを調製するために用いる菌株は、次に示すよう にブタペスト条約に基づき特許出願手続のために寄託されている。

ｉ　！ｉ　１ａＪＪ　！丘蚕豆　！丘旦なお、ＮＲＲＬは、アグリカルチエラル ・リサーチ・カルチャー１コレクシヨン（八ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ−ｔｉｏｎ、１８１５　Ｎｏｒｔｈ　 Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　５ｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ　６１ ６０４＋ＵＳＡ）を示す。ＤＳＭは、トイチェ・ザームルンク・フォノ・ミクロ オーガニスメン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏ ｒｇａｎ−ｉｓｍｅｎ、Ｇｅ５ｅｌｌｓｃｈａｆｔ　ｆｉｉｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｉｓｃｈｅ　Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ　ｍｂＨ。

Ｇｒｉｓｅｂａｃｈｓｔｒ、８．３４００　Ｇるｔｔｉｎｇｅｎ、Ｆｅｄ、Ｒｅ ｐ＋ｏｆ　Ｇｅｒｍａｎｙ）を示す。

本明細書の例において用いられるフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼ ば、菌株Ｊ　７９　（ＤＳＭ　２６７２）を用いて、米国特許第３．６５２，３ ９９号に従って調製されるプロテアーゼを示す。

本明細書の例において用いられるノカルジオプシス（胚Ω−晟圏り旦）プロテア ーゼは、菌株Ｍ５８−１を用いて、東ドイツ特許公開ＤＯ−２，００４，３２８ 号に従ってｔＮ製されるプロテアーゼを示す。

ペシロミセス・マークアンジーからプロテアーゼの８゜１このプロテアーゼの２ バツチを、例で使用する目的で調製した。１バンチは、次のように調製した。

ペシロミセス・マークアンシー（ハ匹■竺匹二息匡勉主団月りＮＲＲ１８０４８ 株を、次の組成からなる培地（ｇ　／　ｌ　）で培養した。

マルトデキストリン　２０ 大豆粉　２０ ＫｚＨＰＯ４９ ＣａＣＯｓ　５ 酵母エキストラクト　２ プロニツク（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ＠　）２５Ｒ２Ｉオートクレーブした後、０．１ Ｍの最終濃度になるまでＮａｚＣＯ３／ＮａＨＣＯ，緩衝剤を添加してｐＨ９， ２に調節した。菌を接種した培地を、２５０ｒｐｍ、　３０℃で２４時間培養し た。この増殖期後、培養物（６００ｄ）を使用して、次の培地（ｇ／ｉり１０１ を含有する発酵槽に接種した。

グルコース　５０ 大豆粉　１００ 滅菌後、培地は２ＭのＮａ、ＣＯ，でｐ！（８，２に調節されている。

発酵の初期増殖期を通じてｐＨは約７゜Ｏに低下する。温度を最初は３０℃に制 御し、ｐＨが約７．０になり始めたときに２５℃まで下げた。この時点で、ｐＨ が７．０以下にならないようにＫＯＨまたはＮａｚＣＯｚを添加し、そしてまた ｐ）ｌが７．６を越えないようにＨｓＰＯａの添加により制御した。プロニンク （Ｐ！ｕｒｏ−ｎｉｃ＠）は、発泡を抑制するために使用した。攪拌および通気 は、０２消費の増加に従い増大せしめ、発酵は２４時間ごとの最大酸素移動速度 において操作した。１２０時間後、ブロテアーゼの含有量をアンソン（Ａｎｓｏ ｎ）アッセイ法を用いて測定したところ、２５アンソン単位（ＡＵ）／Ｊの値を 示した。

培養物を、濾過して例７で使用するペシロミセスプロテアーゼとした。

プロテアーゼの第２番目のバッチは次のように調製した。

微生物：　２Ｒ−１２６株（ＮＲＲＬ　１８０４８）発酵槽の容量：５５０！ 種母発酵槽　生産発酵槽 大豆ミール　ｇ／ｌ　２０　１００ 酵母エキストラクト　２２ ＫＨｚＰＯ４８５ ジャガイモ澱粉　２０ ＣａＣＯｓ　４．８　５ 熱安定性α−アミラーゼ 接種前に、Ｎａ、ＣＯ，の添加によりｐＨ９，２に調節した。

３０％グルコース溶液を、発酵の間中生産発酵槽に連続的にフィードした。発酵 槽にフィードしたグルコースの総量は、初期容量の１１当たり１４３ｇであった 。

生産発酵槽の接種容量：　１０　（Ｖｏｌ／Ｖｏｌ）％発酵時間：ａ）種母培地 　６２時間 ｂ）生産培地　１１３時間 発酵条件： 種母発酵槽　生産発酵槽 温　度　３０℃　２５−３０℃ 通気容量／容量分　０．８　１．０ 圧（気圧）　０．５　０．５ 攪拌翼の速度ｒｐｍ、　１４０−３００　４００−４２０ｐ）ｌ　８．４−９． ４　７．６−９．０培養ブロスのプロテアーゼ活性は、３．５　Ａ　Ｕ　／　ｋ ｇであった。

プロテアーゼの回収は、次のとおりである。

１）発酵からの培養ブロスを、ドラム濾過機上で濾過した（ｐＨ７，５）。

２）濾液を空（ｂｌａｎｋ）濾過した。

３）濾液をＵＦ−濃縮した。

４）ＬＪＦ−濃厚物を空濾過した。

５）その後、微生物を濾去した。

６）酵素を塩析し、そして減圧下で乾燥した。

生成物の活性を測定したところ、０．４５　ＣＰｔ１／　ｇであった。

この調製物をＰＤＦ−２９と称し、そして例１，２．５および６で使用した。

五−上 この例は、サビナーゼ（ＳａｖｉｎａｓｅＯ）単独の洗浄効果並びにサビナーゼ および他のプロテアーゼ（本発明と先行技術による両者を含む）とを組合した物 の洗浄効果を比較することにより本発明を説明するものである。例中では、加熱 変性血液見本を、総プロテアーゼの使用ｉ１０．Ｉ　ＣＰＵ／ｌにより２５℃で ２０分間洗浄した。

各々の場合に、（ＬＩＣＰＵ／ｆの第２のプロテアーゼの単独使用による結果を 括弧内に示した。

プロテアーゼ　（ＣＰＵ／ｆｉ）　反■皇」Ａ尺）０．１　サビナーゼ　７．６ 本発明 ０．０７５　サビナーゼ＋０．０２５ノカルジオブシス　１０．３（１，５）０ ．０７５　サビナーゼ＋０．０２５フザリウム　１０．７　（６，７）０．０７ ５　サビナーゼ＋０．０２５ペシロミセス　１０．１　（４，６）先行技術 ０．０７５　サビナーゼ＋０．０２５アルカラーゼ　９．Ｈｌ、１）０．０７５ 　サビナーゼ＋０．０２５エスペラーゼ　７．３（５，３）■−主 この例は、洗浄作用における２種のプロテアーゼの混合比の効果を示す０本発明 による２種を組合した物を用い、そして対照として先行技術の組合した物を包含 させた。条件は、例１と同じである。

ＣＰＵ／１の　ｆ　におけるΔＲ サビナーゼ　＋ペシロミセス　７．６　１０．１　＊　８．４　＊　７．１　＊ 　＊　４．６サビナーゼ　＋７ずリウム　？、６　１０．９＊　１０．６＊　７ ．９＊　＊　６．７先行技術 サビナーゼ　＋ニスペラ−ｆ　、　７．６　７．３　６．９　５．５　５．３＊ ）　本発明によりプロテアーゼを組合した物＊＊）本発明の範囲外にあるプロテ アーゼを組合した物（対照）前記の系のそれぞれにおいて、総プロテアーゼの使 用量は、０．１　ＣＰＵ／ｌの一定量に維持され、プロテアーゼＡとプロテアー ゼＢとの間の比率を変動させた。先行技術の組合した物は、純粋なサビナーゼ以 上の改善を全く示さないが、しかしながら、驚くべきことに本発明の組合した物 は、少量のカビプロテアーゼと細菌プロテアーゼとの混合により顕著な改善加熱 変性血液見本を２５℃で２０分間洗浄し、タンパクの除去率を測定したところ、 次のとおりであった。

プロテアーゼ　（ＣＰＵｌ）　ΔＰＲ サビナーゼ　２４．４ ０．１ フザリウム　２３．３ サビナーゼ＋フザリウム　０．０７５　＋０．０２５　３０．５■−土 本発明を、ホウレンソウ見本についての洗浄試験を通して説明するものである。

条件は、総プロテアーゼ１０．１　ＣＰＬＩ／Ｅを用いて２５℃で１０分間洗浄 し、そして反射率を測定した。

アルカラーゼ　ノカルジオプシス　６．５　６．９　７．３アルカラーゼ　フザ リウム　６．５　７．７　８．１アルカラーゼ　フザリウム　８．２　８．４　 ９．８別−」− ここでは、表面変性血液見本に対する本発明の作用を通して、本発明を説明する ものである。本発明によりプロテアーゼを組合した物を、先行技術の組合した物 と比較した。洗浄条件は、１５℃で１０分間であり、そして反射率を測定した。

ＣＰＵ／　ｉ！にお番るΔＲ 本発明 サビナーゼ　フザリウム　４．２　３．７　３．３　４．３　２．７サビナーゼ 　ペシロミセス　３．５　２．７　３．４　４．２　２．７先行技術 サビナーゼ　アルカラーゼ　２．２　２．０　１．８　１．８　２．７サビナー ゼ　エスペラーゼ　２．２　１．１　２゜４　１．９　２．７■−工 表面変性血液見本を、１５℃で１０分間洗浄し、そしてタンパク除去率を測定し た。本発明のプロテアーゼを組合した物を、先行技術の組合した物と比較した。

なお、すべてエスペラーゼを含有する。　０．１　ＣＰＵ／ｌの第２のプロテア ーゼ単独による洗浄の結果を括弧内に示した。

プロテアーゼ　（ＣＰＵ／１）　ΔＰＲ０，１エスペラーゼ　２８ 本発明 ０．０９　エスペラーゼ＋０．０１フザリウム　３１　（３１）０．０９　エス ペラーゼ＋０．０１ペシロミセス　３１　（１７）０．０９　エスペラーゼ＋０ ．０１ノ力ルジオブシス　３４　（２９）先行技術 ０．０９　エスペラーゼ＋０．０１アルカラーゼ　２４　（２８）０．０９　エ スペラーゼ＋０．０１サビナーゼ　２８　（２０）五−１ 洗浄試験を、リン酸塩を有していないタイド（Ｔｉｄｅ’ｅ　）溶液の存在下（ ０，１５（Ｗ／Ｖ）％）で、ＥＭＰＡ　１１６試験布見本、５ｃ１１１×５１（ 血液、ミルクおよびカーボンブラックのよごれがついている綿）（Ｅｉｄｇｅｎ ｏｓｓｉｓｃｈｅ　Ｍａｔｅｒｉａｌｐｒｕｆｕｎｇｓ−ｕｎｄ　Ｖｅｒｓｕ− ｃｈａｎｓｔａｌｔ、５ａｎｋｔ　Ｇａ１ｌｅｎ、５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄより 入手）を用い、１５℃で１０分間Ｔｅｒｇ　−０−Ｔｏｍｅｔｅｒ中で実施した 。

プロテアーゼの洗浄力は、酵素を用いないで洗浄した見本に対する酵素洗浄試験 見本の反射率を比較した反射率の変化（ΔＲ）により測定した。反射率値は、ガ ーディナー・レフレフトメーター（Ｇａｒｄｉｎｅｒ　Ｒｅｆｌｅｃｔｏｍｅｔ ｅｒ）ＸＬ　８００（Ｂｅｔｈｅｓｄａ。

ＭＤ）を介して読み取った。

アルカラーゼ（ＡＬＣＡＬＡＳＥ■）は、単独（０〜０．６ＡＵ／ｆ）かまたは ペシロミセスプロテアーゼとの混合物（アルカラーゼ０．４ＡＵ／ｌ＋ペシロミ セスプロテアーゼ０．０５〜０．４　Ａ　Ｕ／１）のいずれかを用いた。

結果を、下記の表および第１図に示した。カビプロテアーゼの添加は、同じ総使 用量におけるアルカラーゼ（ＡＬＣＡＬＡＳＥｅ　）単独により得られるものよ りも明らかに大きい反射率変化（優れた洗浄効果）をもたらした。

０．４　．０５　１６．６ 使用前に、表面変性血液見本を、一度洗剤で洗浄し、洗剤だけで洗い落せるもの をすべて除去した。その後、見本をＱ、５　ｃｓ　Ｘ　Ｑ、　５　ｃｓ片に裁断 し、そして混合した。

見本２００■を平底の試験管に入れ、そしてｐ）１９．５の溶液（緩衝液または 洗剤Ａまたは洗剤Ｂ、下記を参照）４ＩＩｌｊを添加した０次に、酵素液（下記 を参照）２ｒｄを添加した。

酵素の添加後、試験管を２５℃または４５℃で３０分間攪拌した。

３０分後、１０％の酢酸２−を添加することにより反応を停止し、さらに１０分 後ワフトマン（Ｗｈａｔｍａｎ　＠　）　４２濾紙を通して濾過を行った。濾液 を、本明細書に前述したＯＰＡ法により分析した。

下記の３つの溶液の１つをインキュベートした。

１）ブリトン（Ｂｒｉｔｔｏｎ）およびロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）　［１ 街液、ｐＨ９，５゜ （１０００ｍＺ中、０．０８ｍｏ１の酢酸、０．０８ｉＩｌｏｌのリン酸、およ び０．０８ｍｏｌの硼酸’）　２８８ｍ１゜脱イオン水６００ａｆ、　ｐＨ９， ５に調節した後、その容量を脱イオン水で１０００−に調整した。

２）および３）次の組成の洗剤を含有する同じ緩衝液からなる。

ｐＨは９．５に調節した。

緩衝液または洗剤と混合した後に総括性が０．１ＣＰｔｌ／！になるように、酵 素液は０．３ＣＰＵ／ｌの総括性を有する２種のプロテアーゼ（ＡおよびＢ１下 記を参照）を含有させた０次の活性を組合した物を使用した。

Ａの％　０　５０　６７　９０　１００Ｂの％　１００　５０　３３　１０　０ 本発明による次のプロテアーゼを組合した物を試験し、そして結果を、示される ように図で表した。

プロテアーゼＡ　プロテアーゼＢ　１度第１Ａ図　エスペラーゼ　フザリウム　 ２５℃第１Ｂ図　エスペラーゼ　フザリウム　４０℃第２Ａ図　エスペラーゼ　 フザリウム　２５℃第２Ｂ図　エスペラーゼ　フザリウム　４０℃第３Ａ図　エ スペラーゼ　フザリウム　２５℃第３Ｂ図　エスペラーゼ　フザリウム　４０℃ 図中の点線は、各フザリウムプロテアーゼ単独による結果間の直線的内挿を行っ たものを示す。

本発明によるすべての組合した物は、プロテアーゼＢを１０％しか有しないもの でさえも直線的内挿から予期されるものよりもはるかに優れた洗浄力を示すこと がわかる。

対照として、先行技術の組合した物を同様に、そしてまた酵素液の総活性が０． ３Ｃｐｕ／ｚで、かつ緩衝液または洗剤と混合した後の総活性が０．ＩＣｐｕ／ ｚとして試験した。次の活性を組合した物を使用した。

Ａの％　０　１０　５０　９０　９０　１００Ｂの％　１００　９０　５０　１ ０　１０　０プロテアーゼの次の先行技術の組合した物を試験し、そして結果を 、示されるように図で表した。

プロ・テアーゼＡ　ブ０−７７−ゼＢ　１度第４Ａ図　サビナーゼ　エスペラー ゼ　２５℃第４Ｂ図　サビナーゼ　エスペラーゼ　４０℃第５Ａ図　アルカラー ゼ　エスペラーゼ　２５℃第５Ｂ図　アルカラーゼ　エスペラーゼ　４０℃第６ Ａ図　アルカラーゼ　サビナーゼ　２５℃ｉ６Ｂ図　アルカラーゼ　サビナーゼ 　４０℃マクサカール（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ　Ｎ、Ｖ、、Ｎｅｔｈｅｒ ｌａｎｄｓ＋　の商標名）は、アルカリバシラス（Ｂａｃｉ　１１ｕｓ）プロテ アーゼである。

これらは、直線的内挿に比し、あまり大きくない改善が、いくつかの組合した物 にだけ見られるにすぎず、かつ５０％代替物のみに見られるにすぎないことがわ かる。サビナーゼとマクサカールを組合した物は、実質的に何等の改善した洗浄 力をも示さないことは特に注目すべきである。

国際出願番号ＰＣＴ／ 国際出願番号ＰＣＴ／ 国際出願番号ＰＣＴ／ ＦＩＧ、　ＬＡ ＦＩＧ、　ＩＢ ＦＩＧ、　２Ａ ＦＩＧ、　３Ｂ ＦＩＧ、　ｆ４Ａ ＦＩＧ、　４Ｂ ＦＩＧ、　５Ａ ＦＩＧ、　５Ｂ ＦＩＧ、　６Ａ ｌｅ１Ｍｎ＠−ａ＊ｍｍｓ嘗−”ｅＰＣＴ／ＤＫＥ１７１００１４５

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも１つがバシラス・エスピー（Ｂａｃｌｌｕｓ　ｓｐ．）に由来す るプロテアーゼであり、そして少なくとも１つがカビまたは放線菌プロテアーゼ であることを特徴とする、少なくとも２種のアルカリプロテアーゼを組合せた物 を含んでなるタンパク分解性洗剤添加剤。
2. ２．バシラス（Ｂａｃｌｌｕｓ）プロテアーゼを、総タンパク分解活性ＣＰＵの ５０〜９５％、好ましくは７０〜９５％供給する請求の範囲第１項記載の洗剤添 加剤。
3. ３．プロテアーゼを組合した物の洗浄力が各々のプロテアーゼの洗浄力から予期 されるもの以上である請求の範囲第１項または第２項記載の洗剤添加剤。
4. ４．アルカリプロテアーゼが、カゼインに対して９以上の至適ｐＨを有する請求 の範囲第１項または第３項記載の洗剤添加剤。
5. ５．Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来するバシラ ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼを含んでなる請求の範囲第１−４項記載の 洗剤添加剤。
6. ６．セリン型のバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼであって、約９以上 のｐＨ値で至適タンパク分解活性を示し、かつｐＨ１２において極大タンパク分 解活性の８０〜１００％を維持し、そして前記活性がアンソン法によりヘモグロ ビンに対して測定されたものである前記プロテアーゼを含んでなる請求の範囲第 １−４項記載の洗剤添加剤。
7. ７．ペシロミセス・エスピー（ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）に由来し、 好ましくはＰ．マークアンジー（Ｐ．　ｍａｒｑｕａｎｄｉｉ）に由来するカビ プロテアーゼを含んでなる請求の範囲第１−６項記載の洗剤添加剤。
8. ８．フザリウム・エスピー（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｐ．）に由来し、好ましくは Ｆ．オキシスポラム（Ｆ．　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）に由来するカビプロテアーゼ を含んでなる請求の範囲第１−６項記載の洗剤添加剤。
9. ９．ノカルジオプシス・エスピー（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ　ｓｐ．）に由来 し、好ましくはＮ．ダフソンビレイ（Ｎ．　ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）に由来 する放線菌プロテアーゼを含んでなる請求の範囲第１−６項記載の洗剤添加剤。
10. １０．粉立ちしていない顆粒として供給される請求の範囲第１−９項記載の洗剤 添加剤。
11. １１．安定化した液体として供給される請求の範囲第１−９項記載の洗剤添加剤 。
12. １２．総プロテアーゼ活性が、０．１〜１０　ＣＰＵ／ｇである請求の範囲第１ −１１項記載の洗剤添加剤。
13. １３．請求の範囲第１−１２項記載の洗剤添加剤を含有することを特徴とする酵 素洗浄剤組成物。
14. １４．総プロテアーゼ活性が０．００１〜０．０８ＣＰｕ／ｇであることを特徴 とする請求の範囲第１３項記載の組成物。
15. １５．請求の範囲第１３項または第１４項記載の洗浄剤を使用することを特徴と する洗浄方法。