FI116143B - Uusia proteaaseja - Google Patents

Description

116143 ί

Uusia proteaaseja - Nya proteaser

Keksintö koskee alkalofiilisten Bacillus sp. kannoista peräisin olevia pesuaineproteaaseja. Tarkemmin keksintö koskee 5 uutta emäksistä proteaasia, joka on peräisin Bacillus sp. JP 395 -kannasta. Keksintö koskee myös menetelmää proteaasin valmistamiseksi, proteaasin käyttöä pesuaine-entsyyminä ja pesuainekoostumuksia, jotka sisältävät keksinnön mukaista proteaasia.

10 Pesuaine-entsyymejä on markkinoitu enemmän kuin 20 vuoden ajan ja ne ovat hyvin vakiintuneita tavallisina pesuaine-ainesosina sekä jauhe- että nestepesuaineissa kaikkialla maailmassa. Suuntauksen ollessa kohti alemmassa lämpötilassa suoritettavia pesuja kohti, pesuaine-entsyymin kulutus on 15 kasvanut viimeisten vuosien aikana. Entsyymit, joita on käytetty pesuformulatioissa, käsittävät proteaasit, lipaasit, amylaasit, sellulaasit kuten myös muut entsyymit tai niiden seokset. Kaupallisesti tärkeimpiä ovat proteaasit.

Pesuaineproteaasit on kehitetty eristämällä proteaaseja,

• I

20 joita on löydetty luonnosta, mitä on seurannut testaaminen !. ! pesuaineformulaatioissa. Useimmat pesuaineproteaasit saadaan ' ; Bacillus-suvun jäsenistä. Tällä hetkellä markkinoille tulee uuden tyyppisiä proteaaseja, tarjoten sen mahdollisuuden,

• ♦ I

• ·’ että saadaan parempi kustannus/tehokkuus-suhde erilaisissa .· · 25 spesifioiduissa olosuhteissa.

,·, Esimerkkejä kaupallisista proteaasituotteista ovat ALCALA- <!.* SEtm, ESPERASEtm ja SAVINASEtm , kaikki saatavissa firmasta

Novo Nordisk A/S, Tanska. Nämä ja samanlaiset entsyymituot-teet muista kaupallisista lähteistä ovat aktiivisia pesu-i(i 30 aineliuoksissa, so. pH-arvoissa alueella 8-11 ja sekvestraus-aineiden, pinta-aktiivisten aineiden ja valkaisuaineiden kuten natriumperboraatti läsnäollessa. ALCALASEtm -proteaasia tuottaa Bacillus licheniformis lajin kannat. ESPERASEtm ja 2 116143 SAVINASEtm -proteaasit saadaan kasvattamalla alkalofiilisia Bacillus-kantoja.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti tarjotaan uusia pesu-aineproteaasej a.

5 Ensimmäisessä näkökulmassa keksintö tarjoaa proteaasin, jonka näennäismolekyylipaino on 30 kD, pl yli 9,5, pH-optimi alueella pH 9-11 (25 °C:ssa), lämpötilaoptimialueella 40- 50 °C (pH 9,5:ssä), ja on johdettavissa Bacillus sp. JP 395:sta, NCIMB nro 40337, tai sen mutantista tai variantista.

10 Vielä spesifisemmässä näkökulmassa proteaasi on saatavissa Bacillus sp. JP 395:sta, NCIMB nro 40337:sta, tai sen mutantista tai variantista.

Toisessa näkökulmassa keksintö tarjoaa Bacillus sp. JP 395 -kannan eristetyn biologisesti puhtaan kasvuston. Spesifi-15 semmässä näkökulmassa tarjotaan Bacillus sp. JP 395, NCIMB nro 40337 -kanta.

Kolmannessa näkökulmassa keksintö tarjoaa menetelmän proteaasin valmistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista ;·(·# se, että kasvatetaan proteaasia tuottavaa Bacillus sp. JP 395 !. ! 20 -kantaa sopivassa ravintoelatusaineessa, joka sisältää hiili- *, ja typpilähteitä ja epäorgaanisia suoloja, mitä seuraa halu- • tun entsyymin talteenottaminen. Spesifisemmässä näkökulmassa ···· viljellään Bacillus sp. JP 395, NCIMB nro 40337 tai sen : ,· mutanttia tai variantia.

25 Neljännessä näkökulmassa patenttivaatimusten kohteena on ent-; syymin käyttö pesuaine-entsyyminä. Spesifisemmässä näkökul- massa keksintö tarjoaa pesuainekoostumuksen ja pesuainelisä-

* I

·; aineen, joka sisältää proteaasia.

t···. Esillä olevaa keksintöä valaistaan edelleen viittaamalla » * 30 liitteenä oleviin piirroksiin, joissa:

> » M I

Kuva 1 esittää suhteen lämpötilan ja keksinnön mukaisen entsyymin proteolyyttisen aktiivisuuden välillä (entsyymi- 3 116143 valmiste saatu esimerkin 1 mukaisesti, kaseiinin ollessa substraattina ja pH 9,5:ssä); ja

Kuva 2 esittää suhteen pH:n ja keksinnön mukaisen entsyymin proteolyyttisen aktiivisuuden välillä (entsyymivalmiste saatu 5 esimerkin 1 mukaisesti, kaseiinin ollessa substraattina ja 25 °C: ssa) .

Mikro-organismi

Keksinnön mukaiset uudet mikro-organismit, jotka kykenevät tuottamaan keksinnön mukaista entsyymiä, eristettiin oleel-10 lisesti menetelmällä alkalofiilisten Bacillusten valikoimiseksi, joka menetelmä on kuvattu Brittiläisessä patentissa 1 243 784. Yksi sellainen kasvusto, Bacillus sp. JP 395, on talletettu Budapestin sopimuksen mukaisesti talletuslaitokseen NCIMB, numerolla 40337.

15 Tämän keksinnön mukainen mikro-organismi on aerobinen, itiöitä muodostava bakteeri, joka kuuluu sukuun Bacillus. Morfolo-gisesti se voidaan kuvata liikkuvina sauvoina, joiden halkaisija on 0,6-0,8 mikronia, ja pituudeltaan 2-3 mikronia. Itiöt ovat pyöreistä ellipsoideihin, eivät laajenna itiöpesäkettä, ;-*t 20 keskeisestä loppua edeltävään. Optimilämpötila kasvulle on

; 35-40 °C ja optimi pH kasvulle on 8,5-10, ei kasvua alle pH

* ; 8. Mikro-organismi muodostaa vaalean kellertäviä kasvustoja • i · )_·’’· ravinne agar-levyillä, eikä havaittu pigentin diffuusiosta ’ ·’ agar iin.

I · « 25 Mikro-organismien kasvatus • » • ► » '·! : Keksinnön mukaisia mikro-organismeja voidaan kasvattaa aerobisissa olosuhteissa ravintoelatusaineessa, joka sisältää *·. assimiloitavissa olevaa hiiltä ja typpeä yhdessä muiden oleellisten ravinteiden kanssa, elatusaineen koostuessa • _ 30 tunnetun tekniikan periaatteiden mukaisesti.

>;·· Sopivia hiililähteitä ovat hiilihydraatit kuten sakkaroosi, glukoosi ja tärkkelys, tai hiilihydraattia sisältävät aineet kuten soijapavut, puuvillansiemenjauho, maissijyvät, mallas, 4 116143 riisi ja durra. Hiilihydraattikonsentraatio, joka saadaan väliaineeseen voi vaihdella suuresti, esimerkiksi jopa ylös 25 %:iin ja alas 1-5 %:iin, mutta tavallisesti 8-10 % on sopiva, prosenttiosuuksien ollessa laskettu glukoosiekviva-5 lentteina.

Ravinne-elatusaineessa oleva typpilähde voi olla epäorgaaninen ja/tai orgaaninen luonteeltaan. Sopivia epäorgaanisia typpilähteitä ovat nitraatit ja ammoniumsuolat. Orgaanisten typpilähteiden joukosta useita käytetään säännöllisesti fer-10 mentointiprosesseissa. Havainnollistavia esimerkkejä ovat soijapapujauho, puuvillansiemenjauho, maapähkinäjauho, kaseiini, vilja, viljan liotus neste, hiivauute, urea ja albumiini. Lisäksi ravinne-elatusaineen pitäisi sisältää myös tavallisia hivenaineita.

15 Koska tämän keksinnön uudet Bacillus-lajit ovat alkalofii-lisia eivätkä kasva pH:ssa alle 8, kasvatus suoritetaan edullisesti emäksisissä pH-arvoissa, jotka voidaan savuttaa lisäämällä sopivia puskureita kuten natriumkarbonaatti tai natriumkarbonaatin ja natriumbikarbonaatin seokset, kasvuela-, 20 tusaineen sterilisoinnin jälkeen. Tankkifermentoreissa kasvaja tusta varten on tarpeellista käyttää keinotekoista ilmastus- • ·* ta. Ilmastuksen nopeus on samanlainen, jota käytetään tavan- : omaisessa tankki f ermentoinnissa.

Fermentoinnin jälkeen nestemäiset entsyymikonsentraatit voi-25 daan tuottamalla poistamalla raaka-aine liemestä tai haluttaessa liemen konsentroinnilla haihduttamalla alhaisessa läm-, , Potilassa tai käänteisosmoosilla. Lopuksi konsentraattiin **· · voidaan lisätä säilöntäaineita.

Kiinteä entsyymivalmisteet voidaan valmistaa puhdistetusta 30 ja/tai konsentroidusta liemestä saostamalla suoloilla kuten > ·

Na2S04 tai veteen sekoittuvilla liuottimilla kuten etanoli tai asetoni, veden poistamista liemestä sopivilla kuivaus-·:*· menetelmillä kuten ruiskukuivaus voidaan käyttää.

5 116143

Proteolvvttisen aktiivisuuden analyysi

Proteolyyttinen aktiivisuus määritetään kasiini substraattina. Yksi kaseiiniproteaasiyksikkö, Casein Protease Unit (CPU) määritetään sen entsyymin määränä, joka vapauttaa 1 mM 5 primaarisia aminoryhmiä (määritettynä vertailuna seriinis-tandardin kanssa) minuuttia kohti standardiolosuhteissa, so. 30 minuutin inkubointi 25 °C:ssa ja pHrssa 9,5. Kansio AF 228/1, kuvaten analyyttisen menetelmän, on saatavilla pyydettäessä firmasta Novo Nordisk A/S, Tanska, joka kansio sisäl-10 lytetään tähän viitteenä.

Entsyymi

Keksinnön mukainen entsyymi on uusi pesuaineproteaasi. Se on emäksinen proteaasi, jota saadaan kasvattamalla keksinnön mukaista mikro-organismia, edullisesti Bacillus sp. JP 395, 15 NCIMB nro 40337, tai sen mutanttia tai varianttia, sopivassa ravintoelatusaineessa, joka sisältää hiili- ja typpilähteitä ja epäorgaanisia suoloja. Entsyymi voidaan saada myös yhdis-telmä-DNA-tekniikalla.

Keksinnön mukainen proteaasi voidaan kuvata seuraavilla tun-!. 20 nuspiirteillä.

• Molekyylipaino 30 kD, määritettynä SDS-PAGElla. pl yli 9,5 h” määritettynä isoelektrisellä fokusoimisella LKB Ampholine® ·*·’. PAG -levyillä. Proteaasiaktiivisuutta inhiboi PMSF, α-1-an- titrypsiini ja kalkkunan munanvalkuaisen proteinaasi-inhi-25 biittori. EDTA ja soijapapuproteiini-inhibiittori eivät vai- ; kuttaneet proteaasiaktiivisuuteen.

·...· Lämpötila-aktiivisuus-suhde määritettiin kaseiini substraat- tina. Edellä kuvattua proteolyyttisen aktiivisuuden analyysiä .**>. käytettiin sellaisella muutoksella, että inkubaatiolämpötilaa • t 30 vaihdeltiin 15-70 °C intervallein. Tulos on esitetty kuvassa ‘ * 1. Entsyymillä on proteolyyttistä aktiivisuutta lämpötiloissa alle 15 °C:sta yli 70 °C:een, ja lämpötilaoptimi rajoissa 50-65 °C, noin 60 °C.

6 116143

Aktiivisuuden riippuvuus pH:sta määritettiin samalla menetelmällä käyttämällä puskureita, jotka säädettiin edeltä määrättyihin pH-arvoihin pH-alueella 6-11. Tulokset on esitetty kuvassa 2. Entsyymillä on proteolyyttistä aktiivisuutta pH-5 arvoissa alle 6:sta yli ll:een, pH-optimin ollessa noin pH 11 ja yli 90 % aktiivisuudesta on alueella pH 9-11.

Keksinnön mukainen proteaasi on stabiili 60 minuuttia 40 °C:ssa ja pesuolosuhteissa, sekä valkaisuaineiden kuten perboraatti ja NOBS kanssa että ilman eurooppalais- tai ame-10 rikkalaistyyppisissä pesuaineissa.

Immunokemialliset ominaisuudet

Immunokemialliset ominaisuudet voidaan määrittää immunologi-sesti ristireaktio-identiteettikokeilla. Identiteettikokeet voidaan suorittaa hyvin tunnetulla Ouchterlony kaksois-15 immunodifuusiomenettelyllä tai kaksoisristi-immunoelektrofo-reesilla teoksen Axelsen, N. H.; Handbook of Immunoprecipita-tion-in-Gel Techniques; Blackewell Scientific Publications (1983), luvut 5 ja 14, mukaisesti. Termit "antigeeninen identtisyys" ja "osittainen antigeeninen identtisyys" kuva-20 taan samassa kirjassa, luvut 5, 19 ja 20.

I.I Monospesifinen antiseerumi kehitettiin edellä kuvatun mene- • ; telmän mukaisesti immunisoimalla kaniineja keksinnön mukai- •**: sella puhdistetulla proteaasilla. Immunogeeni sekoitettiin : .' Freundin apuaineen kanssa ja injektoitiin ihonalaisesti ’·.* : 25 kaniineihin joka toinen viikko. Antiseerumia saatiin 8 viikon kokonaisimmunisaatiojakson jälkeen ja immunoglobuliini val-: mistettiin siitä kuten on kuvattu viitteessä N. H. Axelsen, edellä.

,j·’ Ouchterlony-kaksoisimmunodiffuusiokokeet eivät osoittaneet : : 30 ristireaktiota keksinnön mukaisen proteaasin ja tunnettujen ’ . emäksisten seriiniproteaasien ALCALASEtm, eSPERASEtm ja SA- ! VINASEtm, subitilisin BPN’ ja KAZUSASEtm välillä.

7 116143

Pesuainekoostumukset

Keksinnön mukainen pesuainekoos tunnus voi käsittää yhtä tai useampaa pinta-aktiivista ainetta, joka voi olla tyypiltään anionista, ionitonta, kationista, amfoteerista tai kaksois-5 ionista tai näiden seosta. Tyypillisiä esimerkkejä anioni- sista pinta-aktiivisista aineista ovat lineaariset alkyyli-bentseenisulfonaatit (LAS), alkyylisulfaatit (AS), aflaole-fiinisulfonaatit (AOS), alkoholietoksisulfaatit (AES) ja luonnollisten rasvahappojen alkalimetallisuolat. Esimerkkejä 10 ionittomista pinta-aktiivisista aineista ovat alkyylipo- lyetyleeniglykolieetterit, nonyylifenolipolyetyleeniglykoli-eetterit, sakkaroosin ja glukoosin rasvahappoesterit, poly-etoksyloitujen alkyyliglukosidien esterit.

Keksinnön mukainen pesuainekoostumus voi sisältää myös muita 15 pesuaine-ainesosia, jotka tunnetaan tekniikan tasossa, kuten bilderit, valkaisuaineet, valkaisuaktivaattorit, korroosion-estoaineen, sekvesterointiaineet, sakkauman uudelleenkerros-tumisen estoaineet, parfyymit, entsyymien ja valkaisuaineiden stabilisaattorit, formulaatiohapot, optiset kirkastajat, 20 vaahdon voimistajat, kelatointiaineet, täyteaineet, kankaan .* pehmentäjät jne. Keksinnön mukainen pesuainekoostumus voidaan i formuloida oleellisesti kuten J. Falbe on kuvannut [Falbe, | \· J. ; Surfactants in Consumer Products. Theopry, Technology and *:* Application; Springer Verlag 1987, katso erityisesti osa, 25 jonka otsikkona on "Frame formulations for liquid/powder heavy-duty detergents"].

Tällä hetkellä ollaan siinä käsityksessä, että keksinnön : mukainen pesuainekoostumus voi sisältää entsyymi valmistetta määrässä, joka vastaa 0,0005-0,5 CPU: ta proteolyyttistä 30 entsyymiä pesuliuoksen litraa kohti.

Keksinnön mukaiset pesuainekoostumukset voidaan formuloida • ;> · mihin tahansa tarkoituksen mukaiseen muotoon, kuten jauheet, nesteet jne.

8 116143

Keksinnön mukainen pesuainekoostumus voi edullisesti sisältää yhtä tai useampaa muuta entsyymiä, esimerkiksi lipaaseja, amylaaseja, sellulaaseja, oksidaaseja ja/tai peroksidaaseja, jotka tavallisesti kuuluvat pesuainekoostumuksiin.

5 Keksinnön mukaiset proteaasit voidaan sisällyttää pesuaine-koostumukseen lisäämällä erillisiä lisäaineita, jotka sisältävät pesuaineproteaasin, tai lisäämällä yhdistetty lisäaine, joka käsittää erilaisia pesuaine-entsyymejä.

Keksinnön mukainen lisäaine voidaan formuloida esimerkiksi 10 rakeiksi, nesteiksi, lietteiksi jne. Edullisia pesuainelisä-aineformulaatioita ovat pölyämättömät rakeet, nesteet, erityisesti stabiloidut nesteet, lietteet tai suojatut entsyymit. Pölyämättömät rakeet voidaan tuottaa esimerkiksi GB-pa-tenttijulkaisun 1 362 365 tai US-patentin 4 106 991 mukaises-15 ti ja voidaan mahdollisesti päällystää tekniikan tason tunnetuilla menetelmillä. Pesuaine-entsyymit voidaan sekoittaa ennen rakeistusta tai sen jälkeen. Nestemäiset entsyymivalmisteet voidaan esimerkiksi stabiloida lisäämällä polyolia kuten esimerkiksi propyleeniglykolia, sokeria tai sokerialko-20 holia, maitohappoa tai boorihappoa, vakiintuneiden menetel- : ,* mien mukaisesti. Muut entsyymistabilisaattorit ovat hyvin • V tunnettuja tekniikan tasossa. Suojatut entsyymit voidaan val- | ' : mistaa EP-patenttijulkaisussa 238 216 esitetyn menetelmän ·· mukaisesti. 1 Käyttökelpoisessa toteutusmuodossa keksinnön mukainen pro- ·’ ’ teaasi voidaan liittää pesuaineformulaatioihin esimerkiksi EP-patenttijulkaisujen 342 177, 368 575, 378 261 ja 378 262 · mukaisesti.

»

Keksintöä valaistaan seuraavissa esimerkeissä, joiden ei ·· 30 tarkoiteta millään tavalla rajoittavan patenttivaatimuksissa '...· esitetyn keksinnön piiriä.

9 116143

Esimerkki 1

Vili elvesimerkki

Bacillus sp. JP 395:ttä viljeltiin 30 °C:ssa pyöröravistus-pullossa (300 rpm) 500 ml:n Erlenmeyerpulloissa, jotka sisäl-5 sivät 100 ml elatusainetta, jolla oli seuraava koostumus (litraa kohti):

Perunatärkkelys 100 g

Jauhettu ohra 50 g

Na2HP04 x 12 H20 10 g 10 Pluronic® 0,1 g

Elatusaineessa oleva tärkkelys nesteytetään α-amylaasilla ja elatusaine steriloidaan kuumentamalla 120 °C:ssa 45 minuuttia .

Steriloinnin jälkeen elatusaineen pH säädetään ll,5:een li-15 säämällä 10 ml 5 M natriumkarbonaatin (Na2C03) liuosta.

5 päivän inkuboinnin jälkeen viljelmän proteolyyttinen aktiivisuus määritettiin käyttämällä edellä kuvattua menetelmää.

Kiinteän aineen erottamisen jälkeen proteaasi puhdistettiin !. ! tavanomaisella kromatografisella menetelmällä.

20 Saanto 800 ml:sta kasvustolientä oli 50 ml, jonka aktiivisuus oli 50 CPU/1. Puhtaus oli enemmän kuin 90 % kuten määri-tettiin SDS-PAGElla.

Tämän esimerkin mukaisesti valmistetun valmisteen tunnus-· > piirteisiin on viitattu aikaisemmin tässä selityksessä ja ·...· 25 tässä viitataan aikaisempaan kohtaan.

·;;; Esimerkki 2 • i * »

Pesuteho ! Pesutehokokeet suoritettiin ruoholla tahratulla puuvillalla, mallipesusysteemissä 20 °C:ssa, isoterminen 10 minuuttia.

10 116143 Tässä kokeessa käytettiin 2,0 g/1 kaupallista amerikkalaistyyppistä jauhepesuainekoostumusta. Pesuaine ei sisältänyt mitään entsyymiä ennen keksinnön mukaisen proteaasin lisäämistä. Pesuaine liuotettiin noin 6° dH (saksalainen kovuus) 5 veteen ja pH:n mitattiin olevan noin 8. Tekstiili/pesuneste-suhde oli noin 6 g tekstiiliä pesuaineliuoksen litraa kohti. Esimerkin 1 mukaista entsyymivalmistetta käytettiin entsyymi-konsentraatioissa 0,001; 0,01 ja 0,1 CPU/1.

Pesun jälkeen kangasta huuhdottiin juoksevassa vesijohtove-10 dessä 25 minuuttia ja ilmakuivattiin. Proteaasin tehokkuus määritettiin remission (%R) muutoksena (AR) 460 nm:ssä mitattuna laitteella Datacolor Elrephometer 2000, Δ:η ollessa remissio proteaasilisäyksellä pesun jälkeen miinus remissio pesun jälkeen ilman proteaasin lisäystä.

15 Tulokset on esitetty taulukossa 1.

Taulukko 1

Entsvvmikonsentraatio delta R

0,001 CPU/1 3,1 : 0,01 CPU/1 10,3 fv 20 0,1 CPU/1 16,1

Differentiaaliset remissioarvot osoittavat, että keksinnön mukaisella proteaasilla on hyvä pesutehokkuus.

t « · » * t » • t · 1«; i

Claims (8)

11 116143 Patentt ivaat imukset

1. Proteaasi, tunnettu siitä, että sillä on seuraavat ominaisuudet : (a) näennäismolekyylipaino 30 kD; 5 (b) pl yli 9,5; (c) pH-optimi pH-alueella 9-11 (25 °C:ssa); (d) lämpötilaoptimi alueella 50-65 °C (pH 9,5:ssä); (e) on johdettavissa Bacillus sp. JP 395:sta, NCIMB nro 40337, tai sen mutantista tai variantista.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen proteaasi, tunnettu siitä, että proteaasi on saatavissa Bacillus sp. JP 395:n kannasta, NCIMB nro 40337, tai sen mutantista tai variantista.

3. Bacillus sp. JP 395 kannan, NCIMB nro 40337, eristetty, biologisesti puhdas viljelmä.

4. Menetelmä minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-2 mukaisen * ; proteaasin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään proteaasia tuottavaa Bacillus sp. JP 395 kantaa, NCIMB nro 40337, tai sen mutanttia tai varianttia sopivassa elatusai-neessa, joka sisältää hiili- ja typpilähteitä ja epäorgaani-1 : 20 siä suoloja, mitä seuraa halutun entsyymin talteen ottaminen. : 5. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-2 mukaisen proteaasin käyttö pesuaine-entsyyminä. 'X ' 6. Pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-2 mukaista proteaasia. ’!!· 25 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen pesuainekoostumus, tunnet- 1 tu siitä, että se käsittää lisäksi yhtä tai useampaa muuta • : entsyymiä, erityisesti amylaaseja, lipaaseja, sellulaaseja, i : oksidaaseja ja/tai peroksidaaseja. 12 116143

8. Pesuaineen lisäaine, tunnettu siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-2 mukaista proteaasia, pölyämättömien rakeiden, nesteen, erityisesti stabiloidun nesteen, lietteen tai suojatun entsyymin muodossa.

5 Patentkrav