JPH06506354A - 新規プロテアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規プロテアーゼ 技術分野 本発明ｊよ、好ハう・ラスｓｐ、株由来の洗剤プロテアーゼの分野に存する。更 に詳しくは、本発明は、ハシラスｓｐ、ＪＰ３９５株由来の新規アルカリプロテ アーゼに関する。更に詳しくは、本発明はプロテアーゼの製造方法、洗剤用酵素 としてのプロテアーゼの使用、および本発明のプロテアーゼを含んでなる院則組 成物に関する。

背景技術 洗剤用酵素は、２０年以上も市場で取引されてきておりそして今や世界中で粉末 および液体の洗剤中の正規な洗剤成分として十分確立されている。

低温での洗たくに対する傾向と共に、洗剤用酵素の消費は近年において増加して きている。洗浄用製剤に於て用いられる酵素は、プロテアーゼ、リバーセ゛、ア ミラーゼ、セルラーゼ並びに他の酵素、又はそれらの混合物を含んでなる。商業 的に最も重要なものはプロテアーゼである。

院則用プロテアーゼは、天然に見出されるプロテアーゼを単離し、引き続き院則 用製剤中で試験することにより開発されてきた。大抵の洗剤用プロテアーゼは、 ハシラス属の構成員から得られる。近年、新しいタイプのプロテアーゼが市場に 表われ、種々の特定条件の下でより良い原価／性能割合を与える可能性を提供し ている。

商業上のプロテアーゼ製品の例は、アルカラーゼ（ＡＬＣＡＬＡＳＥ）　（１録 商標）、エスペラーゼ（ＥＳＰＥＲＡＳＥ）　（登録商標）およびサビナーゼ（ ＳＡＶＩＮＡＳＥ）　（登録商標）であり、全てノボノルディスク社、デンマー クより提供されている。これらの及び他の商業的起源からの類似の酵素製品は、 洗剤溶液中、８〜工１のｐＨｆｉｉでかつ金属イオン封鎖剤、界面活性剤および ホウ酸ナトリウムの如き漂白剤の存在下で活性である。アルカラーゼ（ＡＬＣＡ ＬＡ、ＳＥ）　（登録商標）は、種バシラスリケニホルミスの株によって生産さ れる。エスペラーゼ（ＥＳＰＥＲＡＳＥ）　（登録商標）およびサビナーゼ（Ｓ ＡＶＩＮＡＳＥ）　（登録商標）は、好アルカリ性バシリ（Ｂａｃｉｌｌｉ）を 培養することによって得られる。

発明の要約 本発明によれば、新規洗剤用プロテアーゼが提供される。

第一の面に於て、本発明は３０ｋＤの見掛分子量、９．５超のｐｒ、ｐＨ９〜１ １の範囲内に最適ｐＨ（２５°Ｃで）、４０〜５０°Ｃの範囲内に最適温度（ｐ Ｈ９，５で）およびハシラスｓｐ、　ＪＰ３９５、ＮＣＩＭＢ　Ｎｎ４０３３７ 由来のプロテアーゼの免疫化学的性質と同−又は部分的同一の免疫化学的性質を 有するプロテアーゼを提供する。より特異的な面において、プロテアーゼは、ハ シラスｓｐ、ＪＰ３９５の株から得ることができる。更に、より特異的面に於て 、プロテアーゼはハシラスｓｐ、　ＪＰ３９５、ＮＣＩＭＢＮｆ１４０３３７　 、又はこれらの突然変異体もしくは変異体から得ることができる。

他の面に於て、本発明はハシラス５ρｊＰ３９５０株の単離された生物学的に純 粋な培養物を提供する。より特異的な面に於て、ハシラスｓｐ、　ＪＰ３９５、 ＮＣＩＭＢ　Ｎｏ、４０３３７又はこれらの突然変異体もしくは変異体の株が提 供される。

第三の面に於て、本発明はプロテアーゼの製造方法を提供するものであり、この 方法は炭素および窒素源並びに無機塩を含有する適当な栄養培地中でハシラスｓ ｐ、　ＪＰ３９５のプロテアーゼ生産株を培養し、引き続き目的の酵素を回収す ることを含んでなる。より特異的な面に於て、バシラスｓｐ、　ＪＰ３９５、Ｎ ＣＩＭＢ　ｋ４０３３７　、又はそれらの突然変異体もしくは変異体を培養する 。

第四の面に於て、洗剤用酵素としての酵素の使用が権利要求される。より特異的 な面に於て、本発明は洗剤組成物およびプロテアーゼを含んでなる洗剤用添加側 が提供される。

図面の簡単な説明 本発明は、添付の図面を参照することにより更に説明される：図中、第１図は本 発明に係る酵素の蛋白質分解活性と温度との関係を示す（実施例１に従って得ら れる酵素調製品、基質としてカゼインに関しそしてｐ）１９．５で）；そして第 ２図は、本発明に係る酵素の蛋白質分解活性とｐＨの関係を示す（実施例１に従 って得られる酵素調製品、基質としてカゼインに関しそして２５°Ｃで）。

発明の詳細な開示 微工春 本発明の酵素を生産し得る、本発明の新規微生物は、英国特許第１．２４３，７ ８４号に記載された好アルカリ性バシリの選択方法によって本質的に単離された 。一つのそのような培養株、バシラスｓｐ、ＪＰ３９５はブダペスト条約に従っ てＮα４０３３７をもってＮＣＩＭＢに寄託された。

本発明の微生物は、バシラス属に属する好気性の胞子形成細菌である。形態学的 には、該微生物は直径０．６〜０．８　ミクロンおよび２〜３ミクロンの長さを 有する自動性棒状体として記載できる。胞子は球形ないし楕円体であり、胞子の うを膨潤せず、サブターミナル（Ｓｕｂｔｅｒｍｉｎａｌ）に中心がある。増殖 のための最適温度は３５〜４０°Ｃ内であり、そして増殖のための最適ｐＨは８ ．５〜１０内にあり、ｐＨ８未満では増殖しない。微生物は栄養源寒天斜面上で 薄黄色のコロニーを形成し、そして色素の寒天内への拡散は観察されない。

盈工批至隻１ 本発明の微生物は、他の必須の栄養源と共に同化性の炭素および窒素を含有する 栄養源培地中、好気的条件のもとで培養することができ、培地は公知技術の原則 に従って構成される。

適当な炭素源は、スクロース、グルコースおよびデンプンの如き炭水化物、又は 穀物、麦芽、米およびモロコシの如き物質を含有する炭水化物である。培地中に 導入される炭水化物の濃度は、広く変化することができ、例えば２５％までそし て１〜５％までであるが、通常８〜１０％が適当であり、パーセントはグルコー スの当量として計算される。

栄養源培地中の窒素源は、無機性および／又は有機性のものであってよい。適当 な無機源はニドラードおよびアンモニウム塩である。

有機窒素源の内で、全く多くのものが、細菌の培養を含む発酵プロセスに於て正 規に用いられる。それらの例は、大豆ミル、綿実ミル、ビーナツツミル、カゼイ ン、とうもろこし、コーンスチーブリカー、酵母抽出物、尿素およびアルブミン である。加えて、栄養源培地は又通常の微量物質を含有すべきである。

本発明の新規バシラス種は、好アルカリ性でありかつｐＨ８未満では増殖できな いので、培養は好ましくはアルカリ性ｐＨ値で行なわれ、これは増殖培地の殺菌 後、炭酸ナトリウム、又は炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムの混合物の如き 適当な緩衝剤の添加によって得ることができる。タンク発酵器内での培養に対し 、人口の通気を用いることが必要である。通気の速度は、通常のタンク発酵内で 用いられる速度に類似している。

発酵後、液体の酵素濃縮物がブロスから粗い物質を除去することにより、生産さ れ又は所望ならば低温度で蒸発により又は逆浸透によりブロスの濃縮によって生 産される。

固体酵素調製品は、精製されおよび／又はＮａ、ＳＯａの如き塩、又はエタノー ルもしくはアセトンの如き水混和性溶剤を用いて沈殿せしめた濃縮ブロスから製 造でき、噴霧乾燥の如き適当な乾燥方法によってブロス中の水の除去も用いるこ とができる。

〜ηパ　の＼ 蛋白質分解活性は、基質としてカゼインについて測定される。１力ゼインプロテ アーゼ単位（ＣＰＵ）は、標準条件下、すなわち２５°ＣでかつｐＨ９，５で３ ０分間インキュベーションして毎分１ｓＭの第一級アミノ基（セリン標準と比較 することによって測定）を放出する酵素の量として比較される。分析法を記載す る、折りたたんだ印刷物ＡＰ２２８／１は、要求によりノボノルディスク社、デ ンマーク国から入手可能であり、この印刷物は参考のため本明細書に導入される 。

鼠！ 本発明の酵素は、新規洗剤用プロテアーゼである。この酵素は、アルカリ性プロ テアーゼであり、本発明の微生物、好ましくはノ＼シラスｓｐ、　ＪＰ３９５、 ＮＣＩＩ’ｌＢ　Ｎ１１４０３３７　、又はその突然変異体もしくは変異体を、 炭素および窒素源および無機塩を含有する適当な栄養源培地中で培養することに よって得ることができる。酵素は又組換え体ＤＮＡ手法によっても得ることがで きる。

本発明のプロテアーゼは次の特徴を有する。

豊理化ヱｎ箪！ ５０５−　ＰＡＧＥにより測定して分子量３０ｋＤ、　ＬＫＢアムホリン（Ａｍ ｐｈｏｌｉｎｅ）（登録商標）ＰＡＧプレートに関する等電点電気泳動により測 定して９．５を超えるｐ２゜ プロテアーゼ活性は、ＰＭＳＦおよびターキー−卵白プロテアーゼ阻害剤によっ て阻害される。ＥＤＴＡおよび大豆−蛋白質阻害剤は、プロテアーゼ活性に影響 しない。

温度活性の関係が基質としてカゼインを用いて測定された。前に記載した蛋白質 分解活性に対する分析が用いられたが、次の変更がなされた。すなわち、インキ ュベーション温度は１５°Ｃから７０°Ｃの間隔内で変化した。結果を第１図に 示す。酵素は、１５°Ｃ未満の温度から７０°Ｃ超までで蛋白質分解活性および ５０〜６５°Ｃの範囲内、約６０°Ｃに最適温度を有する。

活性のＰＨに関する依存性を、ｐＨ６〜１１内の予じめ定められたｐＨ値に調節 された緩衝剤を用い、同じ手順によって測定された。結果を第２図に示す。酵素 は６未満から１１超のｐＨ値で蛋白質分解活性を有し、最適ｐＨをｐＨＩＩ付近 に存しそしてｐＨ９〜１１の範囲内で９０％超の活性である。

本発明のプロテアーゼは、ヨーロッパおよびアメリカのタイプの洗剤中、バーポ レートおよびＮ０ＢＳの如き漂白剤と共にあるいはそれなしで、洗たく条件下、 ４０°Ｃで６０分間安定である。

免役止ヱ煎１１ 免疫化学的性質を交差反応同一性試験によって免疫学的に測定できる。同一性試 験は、周知のオフテルロニー二重免疫拡散法又はアレクセン、Ｎ、Ｈ，（Ｈａｎ ｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ−４ｎ−Ｇｅｌ　 Ｔｅｃｈｎｉ−ｑｕｅｓ　；ブランクウェル　サイエンティフィック　バブリケ ーション（１９８３）　、５章および１４章）に従った双頭交差免疫電気泳動に よって行うことができる。語句「抗原の同一性」および「部分的抗原の同一性ｊ は同書中、５章、１９章および２０章に記載されている。

単一特異性抗血清を本発明の精製プロテアーゼで兎を免疫することにより前記方 法に従って発生させた。免疫源をフロインドアジュバントと混合し、次いで２週 間毎に兎に皮下注入した。８通の全免疫期間後に抗血清を得、そして免疫グロブ リンを前記のＮ、　Ｈ，アレクセンによって記載される如くそれから調製した。

オフテルロ二−二重免疫拡散試験は、本発明のプロテアーゼと公知のアルカリセ リンプロテアーゼ、アルカラーゼ（ＡＬＣＡＬＡＳＥ）　（登録商標）、サビナ ーゼ（ＳＡＶＩＮＡＳＥ）　（登録商標）、エスヘラーゼ（ＥＳＰＥＲＡＳＥ） 　（登録商標）、ズブチリシンＢＰＮ　’およびカズサーゼ（ＫＡＺＵＳＡＳＥ ）　（登録商標）の間には交差反応を示さなかった。

丘旦皿人生 本発明の洗剤組成物は、１種又はそれ以上の界面活性剤を含むことができ、この 界面活性剤は、アニオン、非イオン、カチオン、両性又は双性イオンタイプ又は これらの混合物である。アニオン界面活性剤の典型的例は、直鎖アルキルベンゼ ンスルホナート（ＬＡＳ）、アルキルスルフェート（ＡＳ）　、αオレフィンス ルホナー）　（ＡＯ３）、アルコールエトキシスルフェート（ＡＥＳ）および天 然脂肪酸のアルカリ金属塩である。非イオン界面活性剤の例は、アルキルポリエ チレングリコールエーテル、ノニルフェノールポリエチレングリコールエーテル 、スクロースおよびグルコースの脂肪酸エステルおよびポリエトキシル化アルキ ルグルコシドである。

本発明の洗剤組成物は、又業界公知の他の洗剤用成分、例えばビルダー、漂白剤 、漂白活性化剤、耐蝕剤、金属イオン封鎖剤、抗土壌−再付着剤、香料、酵素用 安定剤および漂白剤、配合助剤、蛍光増白剤、起泡増進剤、キレート化剤、充て ん剤、布帛柔軟剤等を含有することができる。本発明の洗剤組成物は、Ｊ、フォ ルへによって記載される如く実質的に製剤化できる〔フォルベ、Ｊ、　；５ｕｒ ｆａｃｔａｎｔｓｉｎ　Ｃｏｎｓｕｍｅｒ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｔｈｅｏｒｙ 、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ；スブリンゲル　フ ェルラーク１９８７　、特に「液体ン粉末重質洗剤用フレーム裂開化」の標題が 付けられた節を参照のこと〕。

現在、以下のように考察されている。すなわち、本発明の洗剤組成物は、洗液１ １当たり蛋白質分解酵素のｏ、ｏｏｏｓ〜０．５　ＣＰＵに相当する量の酵素調 製品を含有できる。

本発明の洗剤組成物は、任意の好都合の形態、例えば粉末、液体等に製剤化でき る。

本発明の洗剤組成物は、好都合には１種又はそれ以上の他の酵素、例えばリパー ゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、および／又はペルオキシダーゼを 洗剤組成物中に好都合に含まれて含有できる。

本発明のプロテアーゼは、洗剤用プロテアーゼを含む別個の添加剤を添加するこ とにより、又は異なる洗剤用酵素を含んでなる混合添加剤を添加することにより 洗剤組成物中に含有せしめることができる。

本発明の添加剤は、例えば粒質物、液体、スラリー等として配合できる。好まし い洗剤用添加剤裂開は、無粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラＩＪ−１ 又は保護された酵素である。無塵の粒質物は、例えば英国特許１３６２．３６５ 又は米国特許４，１０６，９９１に従って製造でき、そして所望により業界公知 方法により被覆できる。洗剤用酵素は造粒前又は造粒後混合できる。

液体酵素調製品は、例えば、確立された方法に従い例えばプロピレングリコール の如きポリオール、垢もしくは糖アルコール、乳酸又はホウ酸を添加することに より安定化できる。他の酵素安定化剤は当業者に十分周知である。保護された酵 素はヨーロッパ特許公開公報第２３８．２１６号に開示された方法に従って調製 できる。

有用なり欅に於て、本発明のプロテアーゼは例えばヨーロッパ特許公開公報第３ ４２．１７７号、同３６８．５７５号、同３７８．２６１および同３７８．２６ ２に従って洗剤配合物中に導入できる。

本発明を更に次の実施例において説明するが、これはいかなる場合もクレームさ れた如き本発明の範囲を制限するものではない。

実施例１ 豊ｆｌ バシラスｓｐ、　ＪＰ３９５を、以下の組成（！当たり）の培地１００−を含有 スる５００Ｈ１のバフル化エルレンマイヤーフラスコ中、回転振動テーブル（２ ４Ｏｒ、ｐ、ｍ、）上で３０°Ｃで培養した：ポテトデンプン　１００　ｇ 大豆粉末　５０　ｇ Ｎａ２ＨＰＯ，Ｘ　１２Ｈｚ０　１０　ｇプルロニック　（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ） 　（登録商標）　０．１ｇ培地中のデンプンは、α−アミラーゼにより液化され そして培地は１２０°Ｃで４５分間加熱することにより殺菌される。

殺菌後、培地のｐｔ＋を５モル溶液の炭酸ナトリウム（ＮａｚＣＯｉ）　１０ｄ を添加することにより１１．５に調節する。

インキュベージぢンの５日後、培養物の蛋白質分解活性を前記方法を用いて測定 した。

固形物質を分離後、プロテアーゼを通常のクロマトグラフィー法にまり精製した 。

８００ｄの培養ブロスからの収率は５０　ＣＰＵ＃！を有する５０ｄであった。

純度はＳＤＳ　−ＰＡＧＥにより判断される如＜９０％以上であった。

二の実施例に従って調製される製剤の特徴は、本明細書中の初め部分で言及され ており、ここで参照される。

実施例２ 洗亙左二皿 洗たく性能試験を、２０°Ｃのモデルミニ洗たくシステム中、等温的に１０分間 、綿布上の草の汚れについて実行した。

商業上の米国タイプの液体洗剤２．０ｇ／ｌを試験において用いた。

洗剤は、本発明の添加前、如何なる酵素も含まなかった。洗剤は、約６″’　ｉ 　（ドイツ硬度）水に溶解され、そしてｐＨは約８に測定された。繊維／洗液比 は、洗剤溶液１１当たり約６ｇの繊維であった。

実施例１に係る酵素調製品をＯ，ＯＯＬ：０．０１＃よび０．Ｉ　ＣＰＵ／ｌの 酵素濃度で用いた。

洗たくに続いて、布帛を流れる水道水で２５分間すすぎ次いで風乾した。プロテ アーゼの性能を、データーカラーＩＣフナメーター２０００を用い、４６０ｎｎ ａで測定した規約反射率（％Ｒ）の変化−（ΔＲ）によって測定した。ΔＲはプ ロテアーゼを添加して洗た（した規約反射率からプロテアーゼを添加しないで洗 たくした規約反射率を差し引いたものである。

試験結果を表１に示す。

０．００１　ＣＰＵ／１　３．１ ０．０１　ＣＰＵ／＋　１０．３ 示差規約反射率値は、本発明のプロテアーゼが良好な洗たく適性を有することを 示す。

ｐＨ６ｐＨ７Ｉ）Ｈ８ｔ）Ｈ９ｏｆ−１１０ｐＨＩＩ国際調査報告 圓ｅｍｓ１１１１，１＋Ｉ＾ｐＨｌ＋ａｌｌ＋ｖｅ　Ｎｏ　ρｃＴ／ＤＫ　９２ １００１０５国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　クリスチャンセン、マルグレッテデンマーク国、デーコー−２ ９３０クランペンポルグ、エステー０．ディレハベバイ（７２）発明者　アース リング、トリット　アニタデンマーク国、デーコー−４０００口スキルデ、スボ ゲルスレウ、フィレン　８

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．次の特性を有することを特徴とするプロテアーゼ：（ａ）３０ｋＤの見掛分 子量； （ｂ）９．５を超えるｐＩ； （ｃ）ｐＨ９〜１１の範囲内に最適ｐＨ（２５℃で）；（ｄ）５０〜６５℃の範 囲内に最適温度（ｐＨ９．５で）（ｅ）バシラスｓｐ．ＪＰ３９５、ＮＣＩＭＢ Ｎｏ．４０３３７由来のプロテアーゼの免疫化学的性質と同一又は部分的同一の 免疫化学的性質。
2. ２．プロテアーゼがバシラスｓｐ．ＪＰ３９５の株から得ることのできるもので ある、請求の範囲第１項記載のプロテアーゼ。
3. ３．バシラスｓｐ．ＪＰ３９５、ＮＣＩＭＢＮｏ．４０３３７、又はその突然変 異体もしくは変異体から得ることのできるものである、請求の範囲第２項記載の プロテアーゼ。
4. ４．バシラスｓｐ．ＪＰ３９５の株の単離された生物学的に純粋な培養物。
5. ５．株がバシラスｓｐ．ＪＰ３９５、ＮＣＩＭＢＮｏ．４０３３７、又はその突 然変異体もしくは変異体である、請求の範囲第４項記載の培養物。
6. ６．請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のプロテアーゼの製造方法であって 、バシラスｓｐ．ＪＰ３９５のプロテアーゼ生産株を、炭素および窒素源並びに 無機塩を含有する適当な栄養液培地中で培養し、引き続き所望の酵素を回収する ことを含んでなる、前記製造方法。
7. ７．バシラスｓｐ．ＪＰ３９５、ＮＣＩＭＢＮｏ．４０３３７、又はその突然変 異体もしくは変異体を培養する、請求の範囲第６項記載の方法。
8. ８．洗剤用酵素としての請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のプロテアーゼ の使用。
9. ９．請求の範囲１〜３項のいずれかに記載のプロテアーゼを含んでなる洗剤組成 物。
10. １０．更に１種又はそれ以上の他の酵素、特にアミラーゼ、リパーゼ、セルラー ゼ、オキシダーゼ、および／又はペルオキシダーゼを含んでなる、請求の範囲第 ９項記載の洗剤組成物。
11. １１．無粉塵性の粒質物、液体、特に安定化された液体、スラリー、又は保護さ れた酵素の形態で提供される、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のプロテ アーゼを含んでなる洗剤用添加剤。