BR112019014432A2

BR112019014432A2 - preparação de lactase filtrada de modo estéril que compreende sal com cátion monovalente

Info

Publication number: BR112019014432A2
Application number: BR112019014432A
Authority: BR
Inventors: Hobel Cédric; Jensen Karen
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 2017-01-13
Filing date: 2018-01-12
Publication date: 2020-04-14
Also published as: DK3568023T3; EP3568023B1; US20230225345A1; PL3568023T3; US11576393B2; CN110167352A; BR112019014432B1; US20200221721A1; EP3568023A1; WO2018130654A1

Abstract

a presente invenção refere-se a uma preparação líquida de lactase filtrada de mo-do estéril e a um método para a filtração estéril de uma preparação líquida de lac-tase. pelo menos 0,01% em p/p de pelo menos um sal que tem um cátion monova-lente é adicionado a fim de melhorar a filtrabilidade. o sistema pode compreender, ainda um estabilizador de poliol.

Description

PREPARAÇÃO DE LACTASE FILTRADA DE MODO ESTÉRIL QUE COMPREENDE SAL COM CÁTION MONOVALENTE

Referência à Listagem de Sequências [0001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em formato legível por computador O formato legível por computador é incorporado ao presente documento a título de referência.

CAMPO DA INVENÇÃO [0002] A presente invenção refere-se à filtração estéril de uma preparação líquida de lactase.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0003]As enzimas lactase, que são algumas vezes denominadas enzimas beta-galactosidase, são usadas comercialmente para decompor a lactose no leite de modo a produzir produtos lácteos que são adequados para pessoas com intolerância à lactose e/ou têm um sabor mais doce. As lactases foram isoladas a partir de uma grande variedade de organismos, incluindo micro-organismos, tais como levedura e bactérias.

[0004]0 documento n²WO 2009/071539 revela o uso de um fragmento truncado no terminal C da lactase extracelular de Bifidobacterium bifidum na produção de produtos lácteos com baixo teor de lactose.

[0005] Lactase pode ser adicionada ao leite antes ou depois da pasteurização ou esterilização. Em geral, a lactase será inativada durante o tratamento de pasteurização e esterilização. Quando a lactase é adicionada antes da esterilização, uma grande quantidade de lactase pode ser necessária a fim de reduzir o tempo de armazenamento entre a adição e a pasteurização/esterilização. Alternativamente, a lactase pode ser adicionado após a pasteurização/esterilização do leite. Nesse caso, a lactase pode ser adicionada em uma menor quantidade, visto que a enzima pode digerir a lactose durante o transporte e armaze

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2/31 namento na fábrica, loja e/ou no refrigerador do consumidor. A lactase a ser adicionada após a pasteurização/esterilização do leite tem que ser estéril. Uma forma preferencial para esterilizar a lactase é por filtração estéril. A filtração estéril da lactase pode ser realizada em linha no processo de produção do leite livre de lactose, por exemplo, com o uso do sistema Aldose® (Tetrapak International S.A., Fully, Suíça), ou pode ser realizada no sítio de produção do fabricante de lactase. A solução de lactase estéril é, então, dosada assepticamente no leite, por exemplo, por meio do sistema Flexdos® (Tetrapak International S.A., Fully, Suíça). A filtração estéril da solução de lactase é alcançada bombeando-se o concentrado de enzimas através de pelo menos um filtro com um tamanho de poro absoluto de 0,22 pm, e isso reterá partículas, tais com fungos, bactérias, esporos ainda presentes na solução. Antes de passá-la pelos filtros estéreis, a solução pode ser bombeada através de um ou diversos pré-filtros com um tamanho de poro maior que 0,22 pm e que reterá partículas grandes, mas não contribuirá para esterilidade da solução de lactase.

[0006] Preparações comerciais de lactase usadas pela indústria de processamento de laticínios são frequentemente soluções aquosas às quais um ou mais agentes estabilizantes foram adicionados, tais como glicerol. O glicerol promove a estabilização microbiana, bem como a enzimática. As preparações de lactase que compreendem, por exemplo, 50% de glicerol um pouco viscosas e podem não ser facilmente tratadas através de filtros estéreis.

[0007] Formulações melhoradas de lactase estéril ainda são necessárias, por exemplo, formulações líquidas que podem ser processadas mais facilmente através de filtros estéreis.

[0008]O documento n²WO2015/132349 revela o uso de, por exemplo, cloreto de sódio em uma formulação aquosa líquida de lactase. O documento n²WO 2016/071500 revela o uso de, por exemplo, cloreto de sódio em uma composição seca por aspersão de uma enzima beta-galactosidase. A ultrafiltração possível do caldo de fermentação contendo enzimas [e sugerida como um meio possível para a concentração da enzima antes de sua formulação. A filtração estéril não é mencionada em nenhuma dessas revelações.

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SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0009]Os presentes inventores constataram surpreendentemente que a adição de sal a uma preparação líquida de lactase melhora sua capacidade para ser passada através de um filtro estéril. Em particular, é surpreendente que a adição de cátion monovalente a uma preparação líquida de lactase melhora sua capacidade para ser passada através de um filtro estéril.

[0010] Portanto, a invenção fornece uma preparação líquida de lactase filtrada de modo estéril que compreende pelo menos um sal que tem um cátion monovalente ou divalente, sendo que a concentração total do dito pelo menos um sal é de pelo menos 0,01% em p/p.

[0011]A invenção, em uma modalidade, fornece uma preparação líquida de lactase filtrada de modo estéril que compreende pelo menos um sal que tem um cátion monovalente, sendo que a concentração total do dito pelo menos um sal é de pelo menos 0,01% em p/p.

[0012]A invenção fornece, ainda, um método para a filtração estéril de uma preparação líquida de lactase que compreende as etapas de:

a. fornecer uma preparação líquida de lactase que compreende pelo menos um sal que tem um cátion monovalente ou divalente, sendo que a concentração total do dito pelo menos um sal é de pelo menos 0,01% em p/p, e

b. filtrar de modo estéril a dita preparação de lactase.

[0013]A invenção fornece, ainda, um método para a filtração estéril de uma preparação líquida de lactase que compreende as etapas de:

a. fornecer uma preparação líquida de lactase,

b. adicionar, à dita preparação líquida de lactase, pelo menos um sal que tem um cátion monovalente ou divalente, sendo que o pelo menos um sal é adicionado a uma concentração de pelo menos 0,01% em p/p da preparação de lactase que deve ser filtrada de modo estéril, e

c. filtrar de modo estéril a preparação de lactase obtida na etapa b.

[0014]A invenção fornece, ainda, um método para a filtração estéril de uma preparação líquida de lactase que compreende as etapas de:

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a. fornecer uma preparação líquida de lactase que compreende pelo menos um sal que tem um cátion monovalente, sendo que a concentração total do dito pelo menos um sal é de pelo menos 0,01% em p/p, e

b. filtrar de modo estéril a dita preparação de lactase.

[0015]A invenção fornece, ainda, um método para a filtração estéril de uma preparação líquida de lactase que compreende as etapas de:

a. fornecer uma preparação líquida de lactase,

b. adicionar, à dita preparação líquida de lactase, pelo menos um sal que tem um cátion monovalente, sendo que o pelo menos um sal é adicionado a uma concentração de pelo menos 0,01% em p/p da preparação de lactase que deve ser filtrada de modo estéril, e

c. filtrar de modo estéril a preparação de lactase obtida na etapa b.

[0016]A invenção fornece, ainda, um método para melhorar a filtrabilidade de uma preparação líquida de lactase que compreende a adição, à preparação de lactase, de pelo menos um sal selecionado dentre NaCI, KCI, NH4CI, MgCL, Na2SO4, K2SO4, (NH4)2SO4, MgSO4 ou uma combinação dos mesmos, de preferência NaCI, KCI, MgCL, (NH4)2SO4, Na2SO4 ou uma combinação dos mesmos, sendo que 0 sal é adicionado a uma concentração de pelo menos 0,01% em p/p da preparação de lactase.

[0017] Finalmente, a invenção fornece 0 uso de pelo menos um sal selecionado dentre NaCI, KCI, NH4CI, MgCL, Na2SO4, K2SO4, (NFk^SCU, MgSÜ4 ou uma combinação dos mesmos, de preferência NaCI, KCI, MgCL, (NH4)2SO4, Na2SO4Ou uma combinação dos mesmos, para melhorar a filtrabilidade de uma preparação líquida de lactase.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0018]A presente invenção fornece uma preparação líquida de lactase filtrada de modo estéril que compreende pelo menos um sal que tem um cátion monovalente ou divalente, sendo que a concentração total do dito pelo menos um sal é de pelo menos 0,01% em p/p.

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5/31 [0019]O sal pode ser qualquer sal que tenha um cátion monovalente ou /divalente. A preparação de lactase pode compreender mais de um sal que tem um cátion monovalente ou divalente. Nesse caso, a característica de pelo menos 0,01% em p/p se refere às concentrações combinadas dos sais individuais.

[0020] O versado na técnica saberá como determinar as concentrações individuais de cada sal que tem um cátion monovalente ou divalente. As mesmas podem ser determinadas, por exemplo, por espectrometria de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES). Os ânions associados podem ser determinados por exemplo, por cromatografia iônica Dionex™ (Dionex™-IC; Thermo Scientific™, Waltham, MA, EUA).

[0021] A preparação líquida de lactase da invenção é uma preparação aquosa líquida de lactase e pode ser qualquer composição ou solução que compreenda água. A preparação pode compreender, por exemplo, pelo menos 20% em p/p de água, tal como pelo menos 30% em p/p, pelo menos 40% em p/p ou pelo menos 50% em p/p de água.

[0022]Filtrado de modo estéril”, no contexto da presente invenção, significa que a preparação líquida de lactase foi passada por um filtro estéril, de preferência um filtro estéril com um tamanho de poro absoluto de cerca de 0,22 pm. Com mais preferência, o filtro estéril é à base de membrana e é fabricado com o uso de fluoreto de polivinilideno hidrofílico (PVDF) ou polietersulfona hidrofílica (PES).

[0023]O pelo menos um sal pode ser um sal de Na⁺, K⁺, NH4⁺ ou Mg⁺⁺(também denominado no presente documento Mg²⁺), de preferência Na⁺ ou K⁺, com mais preferência Na⁺. O pelo menos um sal pode ser selecionado dentre NaCI, KCI, NH4CI, MgCl2, Na2SO4, K2SO4, (NH4)2SO4, MgSO4Ou uma combinação dos mesmos, de preferência NaCI, KCI, MgCl2, (NH4)2SO4, Na2SO4 ou uma combinação dos mesmos, com mais preferência NaCI.

[0024]O pelo menos um sal pode ser um sal que é aprovado para uso em alimentos pelo menos na UE.

[0025]A concentração final total do pelo menos um sal pode ser de pelo menos 0,01% em p/p, de preferência pelo menos 0,015% em p/p, com mais preferência pelo menos 0,02% em p/p, tal como pelo menos 0,1% em p/p.

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6/31 [0026]A concentração final total do pelo menos um sal pode ser de 0,01 a 5% em p/p, de preferência 0,015 a 4% em p/p, com mais preferência 0,02 a 3% em p/p ou 0,1 a 2% em p/p.

[0027] Em outras modalidades, a concentração final total do pelo menos um sal pode estar na faixa de 0,01 a 5%, tal como 0,01 a 4,5%, por exemplo, 0,01 a 4,2%, tai como 0,01 a 3,5% ou, por exemplo, 0,01 a 1,5%; ou por exemplo, na faixa de 0,01 a 5%, tai como 0,05 a 5%, 0,1 a 5%, 0,5 a 5%, 0,8 a 5%, 1,2 a 5%, 2 a 5% ou, por exemplo, na faixa de 0,5 a 5%, tai como 0,5 a 4% ou 0,6 a 3,8%, tai como 0,7 a 3,5%, por exemplo, 0,7 a 3%, tai como 0,7 a 2,5% ou, por exemplo, 0,8 a 2%, ou 0,8 a 1,5% ou, por exemplo, 1,2 a 3%, tai como 1,3 a 3% ou 1,3 a 2%, em particular, 0,8 a 1,5% ou 1,3 a 2%, sendo que todas as porcentagens estão em p/p.

[0028]A presente invenção fornece, ainda, uma preparação líquida de lactase filtrada de modo estéril que compreende pelo menos um sal que tem um cátion monovalente, sendo que a concentração total do dito pelo menos um sal é de pelo menos 0,01% em p/p.

[0029]O sal pode ser qualquer sal que tenha um cátion monovalente. A preparação de lactase pode compreender mais de um sal que tem um cátion monovalente. Também nesse caso, a característica de pelo menos 0,01% em p/p se refere às concentrações combinadas dos sais individuais.

[0030] O pelo menos um sal que tem um cátion monovalente pode ser um sal de Na+, K+ ou NH4+.

[0031]O pelo menos um sal que tem um cátion monovalente pode ser selecionado dentre NaCI, KCI, NH4CI, Na2SO4, K2SO4, (NH4)2SO4 ou uma combinação dos mesmos, de preferência NaCI, KCI, (NH4)2SO4, Na2SO4Ou uma combinação dos mesmos, com mais preferência NaCI.

[0032]A preparação líquida de lactase de acordo com a invenção pode compreender pelo menos um sal que tem um cátion monovalente, bem como compreender, ainda, pelo menos um sal que tem um cátion divalente. Também nesse caso, a característica de pelo menos 0,01% em p/p se refere às concentrações combinadas dos sais individuais.

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7/31 [0033] Uma modalidade específica refere-se a uma preparação líquida de lactase de acordo com a invenção que compreende pelo menos um sal que tem um cátion monovalente e compreende, ainda, pelo menos um sal que tem um cátion divalente, de preferência pelo menos um sal de Mg⁺⁺.

[0034] A concentração de lactase na preparação de lactase da invenção pode estar em qualquer lugar entre 10 e 5.000 LAU-B/g, tal como 20 a 2.600 LAU-B/g, 30 a 2.000 LAU-B/g, 50 a 1.300 LAU-B/g ou 200 a 1.300 LAU-B/g.

[0035] No contexto da presente invenção, a atividade em LAU-B/g de uma lactase específica pode ser determinada por medição direta de o-nitrofenila (ONP) liberada de o-nitrofenil β-D-galactopiranosídeo (ONPG) em um tampão que contém 1,46 mg/ml de substrato em MES 0,05 M, MgSCU 7H2O 1 mM, 450 mg/l de Brij 35 a pH 6,5 e 30 °C. Após uma incubação de 600 segundos, a reação é interrompida adicionando-se Na2COs 0,2 M, e a ONP liberada é medida a 405 nm após uma incubação de 126 segundos. O versado na técnica saberá como executar esse ensaio e determinar tal atividade. No presente documento, a atividade é obtida por meio de comparação com uma curva padrão executada com uma lactase de atividade conhecida, e a atividade da amostra desconhecida calculada a partir disso. A lactase de atividade conhecida pode, por exemplo, ser Saphera® obtida junto à Novozymes A/S, Dinamarca.

[0036] Uma lactase no contexto da presente invenção é qualquer hidrolase de glicosídeo que tenha a capacidade para hidrolisar a lactose dissacarídica em monômeros de galactose e glicose constituintes. O grupo de lactases compreende, porém sem limitação, enzimas atribuídas à subclasse EC 3.2.1.108. As enzimas atribuídas a outras subclasses, tais como, por exemplo, EC 3.2.1.23, também podem ser lactases no contexto da presente invenção. Uma lactase no contexto da invenção pode ter outras atividades diferentes da atividade de hidrolisação de lactose, tais como, por exemplo, uma atividade de transgalactosilação. No contexto da invenção, a atividade de hidrolisação de lactose da lactase pode ser denominada sua atividade lactase ou sua atividade beta-galactosidase.

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8/31 [0037]A lactase pode ser de origem animal, vegetal ou microbiana. Enzimas preferenciais são obtidas a partir de fontes microbianas, em particular, a partir de um fungo ou levedura filamentoso ou a partir de uma bactéria.

[0038] Em uma modalidade preferencial, a lactase é obtida a partir de uma bactéria, por exemplo, a partir da família Bifidobacteriaceae, tal como a partir do gênero Bifidobacterium, tal como a partir de uma cepa de B. bifidum, B. animalis ou B. longum. Em uma modalidade mais preferencial, a lactase é obtida a partir de Bifidobacterium bifidum.

[0039] Em uma outra modalidade preferencial, a lactase é uma forma truncada no terminal C de uma lactase obtida a partir da família Bifidobacteriaceae, tal como a partir do gênero Bifidobacterium, tal como a partir de uma cepa de B. bifidum, B. animalis ou B. longum. Em uma modalidade mais preferencial, a lactase é uma forma truncada no terminal C de uma lactase obtida a partir de Bifidobacterium bifidum.

[0040] Uma enzima preferencial é uma lactase que tem uma sequência que é pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 1 ou a um fragmento ativo de lactase da mesma. Tal fragmento ativo de lactase de SEQ ID NO: 1 pode ser qualquer fragmento de SEQ ID NO: 1 que tenha atividade lactase.

[0041] Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinado com o uso do algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443 a 453) conforme implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al. (2000) Trends in Genetics 16: 276 a 277), de preferência a versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle marcado “identidade mais longa” (obtido com o uso da opção -nobrief) é usado como a porcentagem de identidade e é calculado da seguinte forma:

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9/31 [0042](Resíduos idênticos x 100)/(Comprimento de Alinhamento Número de Total de Intervalos no Alinhamento) [0043]A lactase pode ter uma extremidade C-terminal que corresponde ao aminoácido 1.304 da SEQ ID NO: 1.

[0044]Alternativamente, a lactase pode ser um fragmento que é pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntico a um fragmento ativo de lactase da SEQ ID NO: 1. A mesma pode ser um fragmento que tem uma extremidade C-terminal que corresponde ao aminoácido 887 da SEQ ID NO: 1. Ou pode ser um fragmento que tem uma extremidade C-terminal que corresponde ao aminoácido 965 da SEQ ID NO: 1. Ou pode ser um fragmento que tem uma extremidade C-terminal que corresponde ao aminoácido 1.038 da SEQ ID NO: 1. Ou pode ser um fragmento que tem uma extremidade C-terminal que corresponde ao aminoácido 1.142, 1.211 ou 1.296 da SEQ ID NO: 1.

[0045]A lactase pode ser extracelular. A mesma pode ter uma sequência sinal em sua terminação N, que é clivada durante a secreção.

[0046]A lactase pode ser obtida a partir de qualquer organismo. O termo obtido a partir de significa nesse contexto que a enzima pode ter sido isolada a partir de um organismo no qual está nativamente presente, isto é, a identidade da sequência de aminoácidos da enzima é idêntica a uma enzima nativa. O termo obtido também significa que as enzimas podem ter sido produzidas de modo recombinante em um organismo hospedeiro, sendo que a enzima recombinantemente produzida tem uma identidade idêntica a uma enzima nativa ou tem uma sequência de aminoácidos modificada, por exemplo, que tem um ou mais aminoácidos que são deletados, inseridos e/ou substituídos, isto é, uma enzima recombinantemente produzida que é um mutante e/ou um fragmento de uma sequência de aminoácidos nativa. Dentro do significado de uma enzima nativa estão incluídas variantes naturais. Além disso, o termo obtido a partir de inclui enzimas produzidas sinteticamente, por exemplo, por síntese peptídica. O termo obtido a partir de também abrange enzimas que foram modificadas, por exemplo, por glicosilação, fosforilação, etc., in vivo ou in vitro. Em relação à

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10/31 enzima recombinantemente produzida, o termo obtido a partir de se refere à identidade da enzima e não à identidade do organismo hospedeiro no qual a mesma é recombinantemente produzida.

[0047] A lactase pode ser produzida a partir de um micro-organismo com o uso de qualquer técnica adequada. Por exemplo, uma preparação da enzima lactase pode ser produzida por fermentação de um micro-organismo adequado e isolamento subsequente de uma preparação de lactase proveniente do caldo fermentado ou micro-organismo resultante por métodos conhecidos na técnica. A lactase também pode ser produzida com o uso de técnicas de DNA recombinante. Tal método normalmente compreende o cultivo de uma célula hospedeira transformada com um vetor de DNA recombinante que compreende uma sequência de DNA que codifica a lactase em questão, e sendo que a sequência de DNA é operacionalmente ligada a um sinal de expressão apropriado de modo que tenha capacidade para expressar a lactase em um meio de cultura sob condições que permitem a expressão da enzima e recuperam a enzima da cultura. A sequência de DNA também pode ser incorporada no genoma da célula hospedeira. A sequência de DNA pode ser de origem genômica, cDNA ou sintética, ou quaisquer combinações dessas, e pode ser isolada ou sintetizada de acordo com os métodos conhecidos na técnica.

[0048]A lactase pode ser purificada. O termo purificada, conforme usado no presente documento, cobre proteína da enzima lactase essencialmente livre de componentes insolúveis do organismo de produção. O termo purificado também cobre proteína da enzima lactase essencialmente livre de componentes insolúveis do organismo nativo a partir do qual é obtida. De preferência, a mesma também é separada de alguns dos componentes solúveis do organismo e meio de cultura a partir dos quais é derivada. Com mais preferência, a mesma é separada por um ou mais das operações unitárias: filtração, precipitação ou cromatografia.

[0049] Consequentemente, a lactase pode ser purificada, em que, visualmente, apenas quantidades menores de outras proteínas estão presentes. A expressão outras proteínas refere-se, em particular, a outras enzimas. O termo purificada conforme usado no presente documento também se refere à remoção

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11/31 de outros componentes, particularmente outras proteínas e, com a máxima particularidades, outras enzimas presentes na célula de origem da lactase. A lactase pode ser substancialmente pura, isto é, substancialmente livre de outros componentes do organismo no qual é produzida, isto é, por exemplo, um organismo hospedeiro para a lactase recombinantemente produzida.

[0050] A lactase na preparação é, de preferência uma lactase neutra. A lactase neutra é, de preferência ativa ou tem sua atividade ideal a um pH entre pH 4 e pH 8, de preferência entre pH 5 e pH 7.

[0051]A lactase é, de preferência uma lactase neutra produzida extracelularmente.

[0052] A lactase na preparação da invenção pode ser obtida como um extrato opcionalmente concentrado, por exemplo, de uma cepa de produção fúngica, de levedura ou bacteriana. De preferência, tal extrato foi submetido a uma etapa de separação de sólido-líquido, por exemplo, por centrifugação ou filtração, para remover os sólidos. Tal extrato pode conter componentes naturais provenientes das células de produção, bem como remanescentes dos meios de fermentação. Exemplos de tais componentes são ácido nucleico, proteína, açúcares residuais, oligossacarídeos, enzimas intrínsecas, sais, minerais, componentes intracelulares, íons e nucleotídeos, ou outros componentes. Esses componentes podem terminar, até certo ponto, na preparação de lactase da invenção.

[0053]A lactase na preparação da invenção pode ser uma lactase concentrada não purificada ou pode ter sido purificada. Uma lactase concentrada não purificada pode ter sido obtida liberando-se a enzima das células hospedeiras, removendo-se os sólidos, por exemplo, por meio de filtração ou centrifugação e concentrando-se a fase líquida que compreende a lactase por meio de, por exemplo, ultrafiltração. Alternativamente, a lactase pode ter sido purificada, por exemplo, com o uso de cromatografia.

[0054]O pH de uma preparação de lactase da invenção pode estar na faixa de pH 4 a 9, tal como pH 5 a 8 ou pH 5,5 a 7,5.

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12/31 [0055]A preparação de lactase da invenção é, de preferência enzimaticamente estável, com mais preferência microbiana e enzimaticamente estável.

[0056] A preparação de lactase da invenção pode compreender pelo menos um produto químico de formulação estabilizante a uma concentração de 10 a 70% em p/p, de preferência 30 a 60% em p/p. O produto químico de formulação estabilizante pode ser um poliol, de preferência um poliol selecionado dentre glicerol, sorbitol, monopropilenoglicol, sacarose, glicose, galactose ou lactose, ou combinações dos mesmos, com mais preferência glicerol.

[0057] Modalidades específicas da invenção referem-se a uma preparação líquida de lactase filtrada de modo estéril que compreende pelo menos um sal que tem um cátion monovalente, sendo que a concentração total do dito pelo menos um sal é de pelo menos 0,01% em p/p, sendo que, adicionalmente, a dita preparação compreende um produto químico de formulação estabilizante conforme descrito acima. Outras modalidades específicas da invenção referem-se a uma preparação líquida de lactase filtrada de modo estéril que compreende pelo menos um sal que tem um cátion monovalente, bem como pelo menos um sal que tem um cátion divalente, sendo que a concentração total dos ditos sais é de pelo menos 0,01% em p/p; sendo que, adicionalmente, a dita preparação compreende um produto químico de formulação estabilizante conforme descrito acima.

[0058]A presente invenção também fornece um método de filtração estéril de uma preparação líquida de lactase que compreende as etapas de:

a. fornecer uma preparação líquida de lactase que compreende pelo menos um sal que tem um cátion monovalente ou divalente, sendo que a concentração total do dito pelo menos um sal é de pelo menos 0,01 % em p/p, e

b. filtrar de modo estéril a dita preparação de lactase.

[0059]O sal pode ser qualquer sal que tenha um cátion monovalente ou /divalente. A preparação de lactase a ser usada em um método da invenção pode compreender mais de um sal que tem um cátion monovalente ou divalente.

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Nesse caso, a característica de pelo menos 0,01% em p/p se refere às concentrações combinadas dos sais individuais. A preparação líquida de lactase a ser usada em um método da invenção é uma preparação aquosa líquida de lactase e pode ser qualquer composição ou solução que compreenda água. A preparação pode compreender, por exemplo, pelo menos 20% em p/p de água, tal como pelo menos 30% em p/p, pelo menos 40% em p/p ou pelo menos 50% em p/p de água.

[0060]O pelo menos um sal pode ser um sal de Na⁺, K⁺, NH4⁺ ou Mg⁺⁺, de preferência Na⁺ ou K⁺, com mais preferência Na⁺.

[0061]O pelo menos um sal pode ser selecionado dentre NaCI, KCI, NH4CI, MgCL, Na2SO4, K2SO4, (NH4)2SO4, MgSO4 ou uma combinação dos mesmos, de preferência NaCI, KCI, MgCL, (NH4)2SO4, Na2SO4 ou uma combinação dos mesmos, com mais preferência NaCI.

[0062]A concentração final total do pelo menos um sal pode ser de pelo menos 0,01% em p/p, de preferência pelo menos 0,015% em p/p, com mais preferência pelo menos 0,02% em p/p, tal como pelo menos 0,1% em p/p.

[0063]A concentração final total do pelo menos um sal pode ser de 0,01 a 5% em p/p, de preferência 0,015 a 4% em p/p, com mais preferência 0,02 a 3% em p/p ou 0,1 a 2% em p/p.

[0064]A presente invenção também fornece um método de filtração estéril de uma preparação líquida de lactase que compreende as etapas de:

b. filtrar de modo estéril a dita preparação de lactase.

[0065]O pelo menos um sal que tem um cátion monovalente pode ser qualquer sal que tenha um cátion monovalente, tal como selecionado dentre um sal de Na+, K+ ou NH4+. Em algumas modalidades, 0 pelo menos um sal que tem um íon monovalente pode ser selecionado dentre NaCI, KCI, NH4CI, Na2SO4, K2SO4, (NH4)2SO4 ou uma combinação dos mesmos, de preferência NaCI, KCI,

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14/31 (NH4)2SO4, Na2SO4 ou uma combinação dos mesmos, com mais preferência NaCI.

[0066]A preparação de lactase a ser usada em um método da invenção pode compreender mais de um sal que tem um cátion monovalente. Nesse caso, a característica de pelo menos 0,01% em p/p se refere às concentrações combinadas dos sais individuais.

[0067] A preparação líquida de lactase a ser usada em um método da invenção pode compreender pelo menos um sal que tem um cátion monovalente, bem como pelo menos um sal que tem um cátion divalente. Também nesse caso, a característica de pelo menos 0,01% em p/p se refere às concentrações combinadas dos sais individuais.

[0068] Uma modalidade específica refere-se a uma lactase líquida a ser usada no método da invenção, sendo que a dita lactase compreende pelo menos um sal que tem um cátion monovalente e compreende, ainda, pelo menos um sal que tem um cátion divalente, de preferência pelo menos um sal de Mg⁺⁺.

[0069] Uma modalidade específica refere-se a uma lactase líquida a ser usada no método da invenção, sendo que a dita lactase compreende pelo menos um sal que tem um cátion monovalente e pelo menos um sal que tem um cátion divalente, de preferência pelo menos um sal de Mg⁺⁺, e compreende, ainda, pelo menos um produto químico de formulação estabilizante conforme descrito acima.

[0070]A concentração de lactase na preparação de lactase a ser usada em um método da invenção pode estar em qualquer lugar entre 10 e 5.000 LAU-B/g, tal como 20 a 2.600 LAU-B/g, 30 a 2.000 LAU-B/g, 50 a 1.300 LAU-B/g ou 200 a 1.300 LAU-B/g.

[0071] Em uma modalidade preferencial, a lactase a ser usada em um método da invenção é obtida a partir de uma bactéria, por exemplo, a partir da família Bifidobacteriaceae, tal como a partir do gênero Bifidobacterium, tal como a partir de uma cepa de B. bifidum, B. animalis ou B. longum. Em uma modalidade mais preferencial, a lactase é obtida a partir de Bifidobacterium bifidum.

[0072] Em uma outra modalidade preferencial, a lactase é uma forma truncada no terminal C de uma lactase obtida a partir da família

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Bifidobacteriaceae, tal como a partir do gênero Bifidobacterium, tal como a partir de uma cepa de B. bifidum, B. animalis ou B. longum. Em uma modalidade mais preferencial, a lactase é uma forma truncada no terminal C de uma lactase obtida a partir de Bifidobacterium bifidum.

[0073] Uma enzima preferencial é uma lactase que tem uma sequência que é pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 1 ou a um fragmento ativo de lactase da mesma. Tal fragmento ativo de lactase de SEQ ID NO: 1 pode ser qualquer fragmento de SEQ ID NO: 1 que tenha atividade lactase.

[0074]A lactase pode ter uma extremidade C-terminal que corresponde ao aminoácido 1.304 da SEQ ID NO: 1.

[0075]A lactase pode ser extracelular. A mesma pode ter uma sequência sinal em sua terminação N, que é clivada durante a secreção.

[0076]A lactase na preparação a ser usada em um método da invenção é, de preferência uma lactase neutra. A lactase neutra é, de preferência ativa ou tem sua atividade ideal a um pH entre pH 4 e pH 8, de preferência entre pH 5 e pH 7.

[0077]A lactase a ser usada em um método da invenção é, de preferência uma lactase neutra produzida extracelularmente.

[0078]A preparação de lactase a ser usada em um método da invenção pode compreender um produto químico de formulação estabilizante a uma concentração de 10 a 70% em p/p, de preferência 30 a 60% em p/p. O produto químico de formulação estabilizante pode ser um poliol, de preferência um poliol selecionado dentre glicerol, sorbitol, monopropilenoglicol, sacarose, glicose, galactose ou lactose, com mais preferência glicerol.

[0079] A filtração estéril da preparação de lactase pode ser realizada de acordo com procedimentos operacionais padrão conhecidos pelo versado na técnica, mantendo-se constante o fluxo de alimentação da solução de lactase para o filtro estéril ou mantendo-se constante a pressão transmembranar (TMP) no sistema de filtro; o regime de filtração com uma TMP constante deve ser preferencial,

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16/31 seguindo recomendações gerais dos fabricantes de filtro. Ao realizar uma filtração estéril sob regime de TMP constante e à medida que o filtro acumular partículas indesejadas maiores que o corte de filtro, o fluxo de alimentação da solução enzimática para o filtro terá que ser gradualmente diminuído de acordo com os procedimentos conhecidos pelo versado na técnica.

[0080]A filtração estéril pode ser realizada em linha em um processo de produção de um produto lácteo.

[0081] Alternativamente, a filtração estéril pode ser realizada antes da adição da preparação de lactase ao produto lácteo, caso em que a solução de lactase estéril é dosada assepticamente no leite.

[0082] A preparação de lactase obtida a partir do fornecedor de enzimas pode ser diluída com, por exemplo, água antes de sua adição ao produto lácteo. Se a filtração estéril for realizada em linha em um processo de produção de um produto lácteo, a preparação de lactase obtida a partir do fornecedor de enzimas pode ser diluída antes da filtração estéril. Se a concentração de sal na preparação de lactase obtida a partir do fornecedor de enzimas for suficientemente alta, mesmo após a diluição, haverá presente sal suficiente para melhorar a filtrabilidade estéril.

[0083] Uma preparação de lactase a ser usada em um método da invenção tem, de preferência uma filtrabilidade melhorada. De preferência, a preparação de lactase a ser usada em um método da invenção tem uma filtrabilidade melhorada em comparação a uma segunda preparação líquida de lactase que tem a mesma composição, exceto que não compreende o pelo menos um sal.

[0084] A filtrabilidade melhorada pode ser determinada conforme descrito no Exemplo 1 do presente pedido.

[0085] Em uma modalidade, filtrabilidade melhorada significa que a quantidade de lactase estéril obtida por uma unidade de tempo definida, sob regime de TMP constante de filtração ou regime de filtração de fluxo de alimentação constante, é relativamente maior que para uma preparação líquida de lactase padrão.

[0086] Em uma modalidade, a preparação de lactase a ser usada em um método da invenção tem uma filtrabilidade melhorada em comparação com

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17/31 uma segunda preparação líquida de lactase que tem a mesma composição, exceto que não compreende o pelo menos um sal, cuja filtrabilidade melhorada é definida como uma quantidade maior de filtrado obtido por uma unidade de tempo definida, por exemplo, 600 segundos, e sob regime de filtração de TMP constante ou de fluxo de alimentação constante em comparação com a segunda preparação líquida de lactase.

[0087] Em uma outra modalidade, a preparação de lactase a ser usada em um método da invenção tem uma filtrabilidade melhorada em comparação com uma segunda preparação líquida de lactase que tem a mesma composição, exceto que não compreende o pelo menos um sal, cuja filtrabilidade melhorada é definida como uma quantidade maior de filtrado obtido por uma unidade de tempo definida, por exemplo, 600 segundos, e sob regime de filtração de TMP constante em comparação com a segunda preparação líquida de lactase.

[0088] Em uma outra modalidade, a preparação de lactase a ser usada em um método da invenção tem uma filtrabilidade melhorada em comparação com uma segunda preparação líquida de lactase que tem a mesma composição, exceto que não compreende o pelo menos um sal, cuja filtrabilidade melhorada é definida como uma quantidade maior de filtrado obtido por uma unidade de tempo definida, por exemplo, 600 segundos, e sob regime de filtração de fluxo de alimentação constante em comparação com a segunda preparação líquida de lactase.

[0089]A presente invenção também fornece um método de filtração estéril de uma preparação líquida de lactase que compreende as etapas de:

a. fornecer uma preparação líquida de lactase,

c. filtrar de modo estéril a preparação de lactase obtida na etapa b.

[0090] No método da invenção em que, na etapa b., pelo menos um sal é adicionado à preparação de lactase a uma concentração de pelo menos

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0,01% em p/p da preparação de lactase que deve ser filtrada de modo estéril, o pelo menos 0,01% em p/p se refere à quantidade de sal adicionado e não inclui qualquer possibilidade de transferência da produção da lactase.

[0091]A presente invenção também fornece um método para melhorar a filtrabilidade de uma preparação líquida de lactase que compreende a adição, à preparação de lactase, de pelo menos um sal selecionado dentre NaCI, KCI, NH4CI, MgCL, Na2SO4, K2SO4, (NH4)2SO4, MgSO4 ou uma combinação dos mesmos, de preferência NaCI, KCI, MgCL, (NH4)2SO4, Na2SO4Ou uma combinação dos mesmos, sendo que 0 sal é adicionado a uma concentração de pelo menos 0,01% em p/p da preparação de lactase.

[0092] A presente invenção também fornece 0 uso de pelo menos um sal selecionado dentre NaCI, KCI, NH4CI, MgCL, Na2SO4, K2SO4, (NH4)2SO4, MgSO4 ou uma combinação dos mesmos, de preferência NaCI, KCI, MgCL, (NH4)2SO4, Na2SO4Ou uma combinação dos mesmos, para melhorar a filtrabilidade de uma preparação líquida de lactase.

[0093]A presente invenção também fornece um método de filtração estéril de uma preparação líquida de lactase que compreende as etapas de:

a. fornecer uma preparação líquida de lactase,

b. adicionar, à dita preparação líquida de lactase, pelo menos um sal que tem um cátion monovalente, sendo que 0 pelo menos um sal é adicionado a uma concentração de pelo menos 0,01% em p/p da preparação de lactase que deve ser filtrada de modo estéril, e

c. filtrar de modo estéril a preparação de lactase obtida na etapa b.

[0094] No método da invenção em que, na etapa b., pelo menos um sal é adicionado à preparação de lactase a uma concentração de pelo menos 0,01% em p/p da preparação de lactase que deve ser filtrada de modo estéril, 0 pelo menos 0,01% em p/p se refere à quantidade de sal adicionado e não inclui qualquer possibilidade de transferência da produção da lactase.

MODALIDADES PREFERENCIAIS

1. Uma preparação líquida de lactase filtrada de modo estéril que compreende pelo menos um sal que tem um cátion monovalente ou divalente,

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19/31 sendo que a concentração total do dito pelo menos um sal é de pelo menos 0,01 % em p/p.

2. A preparação líquida de lactase, de acordo com a modalidade 1, sendo que o sal é um sal de Na⁺, K⁺, NH4⁺ ou Mg⁺⁺.

3. A preparação líquida de lactase, de acordo com a modalidade 1, sendo que o sal é selecionado dentre NaCI, KCI, NH4CI, MgCL, Na2SO4, K2SO4, (NH4)2SO4, MgSO4 ou uma combinação dos mesmos, de preferência NaCI, KCI, MgCL, (NH4)2SO4, Na2SO4 ou uma combinação dos mesmos, com mais preferência NaCI.

4. A preparação líquida de lactase, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que a concentração total do pelo menos um sal é de 0,01 a 5% em p/p, de preferência 0,015 a 4% em p/p, com mais preferência 0,02 a 3% em p/p ou 0,1 a 2% em p/p.

5. A preparação líquida de lactase, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a dita preparação de lactase tem uma atividade lactase de 10 a 5.000 LAU-B/g.

6. A preparação líquida de lactase, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que a lactase tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO: 1.

7. A preparação líquida de lactase, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que a lactase é uma forma truncada no terminal C de uma lactase obtida a partir de Bifidobacterium, de preferência Bifidobacterium bifidum.

8. A preparação líquida de lactase, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que a lactase tem uma extremidade C-terminal que corresponde ao aminoácido 1.304 da SEQ ID NO: 1.

9. A preparação líquida de lactase, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, que compreende, ainda, um produto químico de

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20/31 formulação estabilizante a uma concentração de 10 a 70% em p/p, de preferência 30 a 60% em p/p.

10. A preparação líquida de lactase, de acordo com a modalidade anterior, sendo que o produto químico de formulação estabilizante é um poliol, de preferência um poliol selecionado dentre glicerol, sorbitol, monopropilenoglicol, sacarose, glicose, galactose ou lactose, com mais preferência glicerol.

11. Um método para a filtração estéril de uma preparação líquida de lactase que compreende as etapas de:

b. filtrar de modo estéril a dita preparação de lactase.

12. O método, de acordo com a modalidade 11, sendo que o sal é um sal de Na⁺, K⁺, NH4⁺ ou Mg⁺⁺.

13. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 11 ou

12, sendo que o sal é selecionado dentre NaCI, KCI, NH4CI, MgCL, Na2SO4, K2SO4, (NH₄)2SO₄, MgSO4 ou uma combinação dos mesmos, de preferência NaCI, KCI, MgCk, (NH4)2SO4, Na2SO4 ou uma combinação dos mesmos, com mais preferência NaCI.

14. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 11 a

13, sendo que a concentração total do pelo menos um sal é de 0,01 a 5% em p/p, de preferência 0,015 a 4% em p/p, com mais preferência 0,02 a 3% em p/p ou 0,1 a 2% em p/p.

15. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 11 a

14, sendo que a preparação de lactase tem uma atividade lactase de 10 a 5.000 LAU-B/g.

16. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 11 a

15, sendo que a lactase tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO: 1.

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17. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 11 a

16, sendo que a lactase é uma forma truncada no terminal C de uma lactase obtida a partir de Bifidobacterium, de preferência Bifidobacterium bifidum.

18. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 11 a

17, sendo que a lactase tem uma extremidade C-terminal que corresponde ao aminoácido 1.304 da SEQ ID NO: 1.

19. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 11 a

18, sendo que a preparação líquida de lactase compreende, ainda, um produto químico de formulação estabilizante a uma concentração de 10 a 70% em p/p, de preferência 30 a 60% em p/p.

20. O método, de acordo com a modalidade anterior, sendo que o produto químico de formulação estabilizante é um poliol, de preferência um poliol selecionado dentre glicerol, sorbitol, monopropilenoglicol, sacarose, glicose, galactose ou lactose, com mais preferência glicerol.

21. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 11 a

20, sendo que a preparação de lactase tem uma filtrabilidade melhorada em comparação com uma segunda preparação líquida de lactase que tem a mesma composição, exceto que não compreende o pelo menos um sal.

22. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 11 a

21, sendo que a dita filtração estéril é realizada em linha em um processo de produção de um produto lácteo.

23. Um método para a filtração estéril de uma preparação líquida de lactase que compreende as etapas de:

a. fornecer uma preparação líquida de lactase,

b. adicionar, à dita preparação líquida de lactase, pelo menos um sal que tem um cátion monovalente ou divalente, sendo que o pelo menos um sal é adicionado a uma concentração de pelo menos 0,01 % em p/p da preparação de lactase que deve ser filtrada de modo estéril, e

c. filtrar de modo estéril a preparação de lactase obtida na etapa b.

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24. O método, de acordo com a modalidade 23, sendo que o sal é um sal de Na⁺, K⁺, NH4⁺ ou Mg⁺⁺.

25. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 23 ou

24, sendo que o sal é selecionado dentre NaCI, KCI, NH4CI, MgCL, Na2SO4, K2SO4, (NH₄)2SO₄, MgSO4 ou uma combinação dos mesmos, de preferência NaCI, KCI, MgCL, (NH4)2SO4, Na2SO4 ou uma combinação dos mesmos, com mais preferência NaCI.

26. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 23 a

25, sendo que a concentração total do pelo menos um sal é de 0,01 a 5% em p/p, de preferência 0,015 a 4% em p/p, com mais preferência 0,02 a 3% em p/p ou 0,1 a 2% em p/p.

27. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 23 a

26, sendo que a preparação de lactase tem uma atividade lactase de 10 a 5.000 LAU-B/g.

28. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 23 a

27, sendo que a lactase tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO: 1.

29. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 23 a

28, sendo que a lactase é uma forma truncada no terminal C de uma lactase obtida a partir de Bifidobacterium, de preferência Bifidobacterium bifidum.

30. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 23 a

29, sendo que a lactase tem uma extremidade C-terminal que corresponde ao aminoácido 1.304 da SEQ ID NO: 1.

31. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 23 a

30, sendo que a preparação líquida de lactase compreende, ainda, um produto químico de formulação estabilizante a uma concentração de 10 a 70% em p/p, de preferência 30 a 60% em p/p.

32. O método, de acordo com a modalidade anterior, sendo que 0 produto químico de formulação estabilizante é um poliol, de preferência um poliol

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23/31 selecionado dentre glicerol, sorbitol, monopropilenoglicol, sacarose, glicose, galactose ou lactose, com mais preferência glicerol.

33. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 23 a

32, sendo que a preparação de lactase tem uma filtrabilidade melhorada em comparação a uma segunda preparação líquida de lactase que tem a mesma composição, exceto que não compreende o pelo menos um sal.

34. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 23 a

33, sendo que a dita filtração estéril é realizada em linha em um processo de produção de um produto lácteo.

35. Um método para melhorar a filtrabilidade de uma preparação líquida de lactase que compreende a adição, à preparação de lactase, de pelo menos um sal selecionado dentre NaCI, KCI, NH4CI, MgCl2, Na2SO4, K2SO4, (NH4)2SO4, MgSO4 ou uma combinação dos mesmos, de preferência NaCI, KCI, MgCl2, (NH4)2SO4, Na2SO4Ou uma combinação dos mesmos, sendo que 0 sal é adicionado a uma concentração de pelo menos 0,01% em p/p da preparação de lactase.

36. Uso de pelo menos um sal selecionado dentre NaCI, KCI, NH4CI, MgCl2, Na2SO4, K2SO4, (NH4)2SO4, MgSO4 ou uma combinação dos mesmos, de preferência NaCI, KCI, MgCl2, (NH4)2SO4, Na2SO4 ou uma combinação dos mesmos, para melhorar a filtrabilidade de uma preparação líquida de lactase.

OUTRAS MODALIDADES PREFERENCIAIS

1. Uma preparação líquida de lactase filtrada de modo estéril que compreende pelo menos um sal que tem um cátion monovalente, sendo que a concentração total do dito pelo menos um sal é de pelo menos 0,01% em p/p.

2. A preparação líquida de lactase, de acordo com a modalidade 1, sendo que 0 sal é um sal de Na⁺, K⁺ ou NH4Ã

3. A preparação líquida de lactase, de acordo com a modalidade 1, sendo que 0 sal é selecionado dentre NaCI, KCI, NH4CI, Na2SO4, K2SO4, (NH4)2SO4 ou uma combinação dos mesmos, de preferência NaCI, KCI,

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24/31 (NH4)2SO4, Na2SÜ4 ou uma combinação dos mesmos, com mais preferência NaCI.

5. A preparação líquida de lactase, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, que compreende, ainda, um poliol, de preferência um poliol selecionado dentre glicerol, sorbitol, monopropilenoglicol, sacarose, glicose, galactose ou lactose, ou combinações dos mesmos, com mais preferência glicerol, a uma concentração de 10 a 70% em p/p, de preferência 30 a 60% em p/p.

7. A preparação líquida de lactase, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que a lactase tem uma extremidade C-terminal que corresponde ao aminoácido 1.304 da SEQ ID NO: 1.

8. A preparação líquida de lactase, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 7, que compreende, ainda, pelo menos um sal que tem um cátion divalente, de preferência pelo menos um sal de Mg⁺⁺, ou a preparação líquida de lactase, de acordo com qualquer uma das modalidades 5 a 7, que compreende, ainda, pelo menos um sal que tem um cátion divalente, de preferência pelo menos um sal de Mg⁺⁺.

9. Um método para a filtração estéril de uma preparação líquida de lactase que compreende as etapas de:

b. filtrar de modo estéril a dita preparação de lactase.

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10. O método, de acordo com a modalidade 9, sendo que o pelo menos um sal é selecionado dentre um sal de Na⁺, K⁺ ou NH4⁺.

11.0 método, de acordo com qualquer uma das modalidades 9 ou 10, sendo que o pelo menos um sal é selecionado dentre NaCI, KCI, NH4CI, Na2SO4, K2SO4, (NH4)2SO4 ou uma combinação dos mesmos, de preferência NaCI, KCI, (NH4)2SO4, Na2SÜ4 ou uma combinação dos mesmos, com mais preferência NaCI.

12. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 9 a 11, sendo que a concentração total do pelo menos um sal é de 0,01 a 5% em p/p, de preferência 0,015 a 4% em p/p, com mais preferência 0,02 a 3% em p/p ou 0,1 a 2% em p/p.

13. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 9 a 12, sendo que a lactase tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO: 1.

14. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 9 a 13, sendo que a preparação de lactase tem uma filtrabilidade melhorada em comparação com uma segunda preparação líquida de lactase que tem a mesma composição, exceto que não compreende 0 dito pelo menos um sal que tem um cátion monovalente.

15. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 9 a 14, sendo que a dita filtração estéril é realizada em linha em um processo de produção de um produto lácteo.

EXEMPLO 1

Filtrabilidade melhorada de lactase de Bifidobacterium bifidum através de filtro estéril como uma função do teor de sal:

[0095] Um concentrado de enzimas não padronizado de lactase de B. bifidum (SEQ ID NO: 1) expresso em Bacillus licheniformis e que foi produzido em grande escala foi escolhido como material de partida. O concentrado não padronizado foi originalmente formulado em grande escola com 66% em p/p de glicerol a pH 5,7. Os íons totais de sódio, potássio, magnésio, cloreto e sulfato

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26/31 foram medidos no concentrado não padronizado por meio de ICP-OES e Dionex™ IC, respectivamente.

Método Dionex™ IC para cloreto total	Concentração iônica total no concentrado não padronizado [mg/kg]
Dionex™ IC para sulfato total	Abaixo do limite de detecção de 100
ICP-OES para magnésio total	17
ICP-OES para potássio total	50
ICP-OES para sódio total	42

[0096]O concentrado foi, então, diluído com glicerol e água na ausência ou presença de diferentes sais até uma concentração enzimática equivalente a 900 LAU-B/g de unidades de lactase: o concentrado de lactase não padronizado foi primeiro pré-diluído com glicerol puro antes da adição de sal como pó; uma amostra de controle não continha sal adicionado. Água foi eventualmente adicionada a um volume final de 1L, conforme descrito na tabela abaixo no presente documento. A concentração final de glicerol foi de 50% em p/p em todas as amostras. Após a diluição do concentrado de lactase não padronizado, os cátions e ânions presentes no concentrado foram diluídos tão extensivamente que a quantidade total de íons restantes nas amostras diluídas foi muito baixa a negligenciável em comparação com o sal diferente adicionado voluntariamente nesse experimento.

Amostras	Concentrado	de Sal	Agua de
	lactase	[g]	torneira fria
			[g]

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900 LAU-B/g (controle)	não padronizado glicerol [g] >SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSà 575	+ ΚΧΧ\ΛΛΛΛΛΧ*ΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛ. ⁰	<ΧΧΧΧΧΧ\ΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛ\ΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΧΧ 425
900 LAU-B/g + 0,1 % em p/p de NaCI	575	11	424
900 LAU-B/g + 1 % em p/p de NaCI	575		415
900 LAU-B/g + 2 % em p/p de NaCI	575	I 20	405
900 LAU-B/g + 1 % em p/p de Na2SÜ4	575	¹⁰	415
900 LAU-B/g + 1 % em p/p de (NH₄)₂SO₄	575	¹⁰	415
900 LAU-B/g + 1 % em p/p de MgCI₂,6 H₂O	575	I 10	415
900 LAU-B/g + 1 % em p/p de KCI	575	I io	415

[0097]O concentrado de lactase não padronizado e a solução pura de glicerol foram, ambos, mantidos a temperaturas entre 5 °C e 10 °C antes do início. Todos os sais testados tinham qualidade de grau alimentar e foram fornecidos pela Sigma Aldrich Corp. (St. Louis, MO, EUA). A mistura completa foi alcançada com uma barra de agitação magnética sob condições frias (5 a 10 °C).

[0098]Todas as soluções enzimáticas diluídas foram filtradas de modo estéril em discos de membranas filtrantes de 47 mm Fluorodyne® II DFL (Pall, Port Washington, NY, EUA) com um corte de 0,2 pm. Os discos de filtração foram mantidos em um retentor de filtro de aço inoxidável em linha de 47 mm (Sartorius, Gottingen, Alemanha), e as soluções enzimáticas diluídas foram bombeadas através dos filtros por meio de um sistema de filtração de fluxo normal

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FilterTec (Parker Hannifin Corp., Oxnard, CA, EUA) sob regime de fluxo constante de 10 ml/min e até que a pressão do sistema alcançasse um máximo de 1,8 bar. As filtrações foram realizadas à temperatura ambiente, dentro de 30 a 60 min após a diluição do concentrado de enzimas não padronizado.

[0099] A tabela abaixo no presente documento lista o volume V_max das diferentes soluções que foram necessárias para alcançar um ponto de ajuste de pressão máxima arbitrário de 1,8 bar no sistema de filtração. O volume V_max da amostra de controle foi ajustado para 100%; os volumes para as outras soluções são, portanto, proporcionais à base 100.

Amostras Vmax de filtrado para alcançar uma pressão do sistema de 1,8 bar , 900 LAU-B/g (controle), 100 | 9ÕÕ LÀU-B/g + 0,1 % em p/p de NaCI |Ϊ27 | 9ÕÕ LÀU-B/g + 1 % em p/p de NaCI |122

900 LAU-B/g + 2 % em p/p de NaCI.................... 116.............................................................................................

| 900 LAU-B/g + 1 % em p/p de Na2SÜ4,115 _{900 LAU}__{B/g + 1 o/oem p/pde}(_NH4)2SQ₄₁₃₂ , 900 LAU-B/g + 1 % em p/p de MgCl2,6 |

I H₂OI 135 , 900 LÀU-B/g + 1 % em p/p de KCI | 148 [0100]Todas as soluções de lactase de 900 LAU-B/g que contêm sal testadas no presente documento mostraram uma melhora mensurável na filtrabilidade através de um filtro estéril em comparação com a amostra de

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29/31 controle: o volume V_max da solução de lactase necessário para alcançar o ponto de ajuste de pressão máxima foi maior em todas as considerações.

EXEMPLO 2

Filtrabilidade melhorada de lactase de Bifidobacterium bifidum através de filtro estéril sob condições de teor de sal muito baixo.

[0101 ] Um concentrado de enzimas não padronizado de lactase de B. bifidum (SEQ ID NO: 1) expresso em Bacillus licheniformis e que foi produzido em grande escala foi escolhido como material de partida. O concentrado não padronizado foi originalmente formulado em grande escola com 66 % em p/p de glicerol a pH 5,7.

[0102]O concentrado foi, então, diluído com glicerol e água na ausência ou presença de cloreto de sódio até uma concentração enzimática equivalente a 900 LAU-B/g de unidades de lactase: o concentrado de lactase não padronizado foi primeiro pré-diluído com glicerol puro antes da adição de sal como pó; uma amostra de controle não continha sal adicionado. Água foi eventualmente adicionada a um volume final de 1L, conforme descrito na tabela abaixo no presente documento. A concentração final de glicerol foi de 50% em p/p em todas as amostras. Após a diluição do concentrado de lactase não padronizado, os cátions e ânions presentes foram diluídos tão extensivamente que a quantidade total de íons restantes nas amostras foi muito baixa a negligenciável em comparação com o sal diferente adicionado voluntariamente durante esse experimento.

Amostras

Concentrado de

Sal

Água de lactase torneira fria não padronizado [g] glicerol [g]

Ϊ 900 LAU-B/g (controle) Ϊ 575

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900 LAU-B/g + 0,01 % em 575 p/p de NaCI	0,1 \| 424,9
\| 900 LAU-B/g + 0,1 % em \| 575	1 \| 424
p/p de NaCI

[0103]O concentrado de lactase não padronizado e a solução pura de glicerol foram, ambos, mantidos a temperaturas em torno de 10 °C a 15 °C antes do início. Todos os sais testados tinham qualidade de grau alimentar e foram fornecidos pela Sigma Aldrich Corp. (St. Louis, MO, EUA). A mistura completa foi alcançada com uma barra de agitação magnética sob condições levemente frias (15 °C) em um banho de água.

[0104]Todas as soluções enzimáticas diluídas foram filtradas de modo estéril em discos de membranas filtrantes de 47 mm Fluorodyne® II DFL (Pall, Port Washington, NY, EUA) com um corte de 0,2 μιτι. Os discos de filtração foram mantidos em um retentor de filtro de aço inoxidável em linha de 47 mm (Sartorius, Gottingen, Alemanha), e as soluções enzimáticas diluídas foram bombeadas através dos filtros por meio de um sistema de filtração de fluxo normal FilterTec (Parker Hannifin Corp., Oxnard, CA, EUA) sob regime de fluxo constante de 10 ml/min e até que a pressão do sistema alcançasse um máximo de 1,8 bar. As filtrações foram realizadas à temperatura ambiente, dentro de 30 a 60 min após a diluição do concentrado de enzimas não padronizado.

[0105] A tabela abaixo no presente documento lista o volume V_max das diferentes soluções que foram necessárias para alcançar um ponto de ajuste de pressão máxima arbitrário de 1,8 bar no sistema de filtração. O volume V_max da amostra de controle foi ajustado para 100%; os volumes para as outras soluções são, portanto, proporcionais à base 100.

Amostras Vmax de filtrado para alcançar uma | pressão do sistema de 1,8 bar [%]

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I 900 LAU-B/g (controle) | 100 | 900 LAU-B/g + 0,01 % em p/p de NaCI | 105 | 900 LAU-B/g + 0,1 % em p/p de NaCI | 120 [0106]A adição de uma quantidade muito baixa de cloreto de sódio (0,01% em p/p) ao concentrado de lactase já mostrou uma melhor mensurável na filtrabilidade através de um filtro estéril em comparação com a amostra de controle. A % de V_max para a amostra que contém 0,1% em p/p de NaCI é muito próxima da observada no Exemplo 1.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Preparação líquida de lactase filtrada de modo estéril caracterizada por compreender pelo menos um sal que tem um cátion monovalente, sendo que a concentração total do dito pelo menos um sal é de pelo menos 0,01% em p/p.
2. Preparação líquida de lactase, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o sal ser um sal de Na⁺, K⁺ ou ΝΗΛ
3. Preparação líquida de lactase, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o sal ser selecionado dentre NaCI, KCI, NH4CI, Na2SO4, K2SO4, (NH4)2SO4 ou uma combinação dos mesmos, de preferência NaCI, KCI, (NH4)2SO4, Na2SÜ4 ou uma combinação dos mesmos, com mais preferência NaCI.
4. Preparação líquida de lactase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizada por a concentração total do pelo menos um sal ser de 0,01 a 5% em p/p, de preferência 0,015 a 4% em p/p, com mais preferência 0,02 a 3% em p/p ou 0,1 a 2% em p/p.
5. Preparação líquida de lactase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizada por compreender, ainda, um poliol, de preferência um poliol selecionado dentre glicerol, sorbitol, monopropilenoglicol, sacarose, glicose, galactose ou lactose, ou combinações dos mesmos, com mais preferência glicerol, a uma concentração de 10 a 70% em p/p, de preferência 30 a 60% em p/p.
6. Preparação líquida de lactase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizada por a lactase ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO: 1.
7. Preparação líquida de lactase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizada por a lactase ter uma extremidade C-terminal que corresponde ao aminoácido 1.304 da SEQ ID NO: 1.

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8. Preparação líquida de lactase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizada por compreender, ainda, pelo menos um sal que tem um cátion divalente, de preferência pelo menos um sal de Mg⁺⁺.
9. Método para a filtração estéril de uma preparação líquida de lactase caracterizado por compreender as etapas de:

a. fornecer uma preparação líquida de lactase que compreenda pelo menos um sal que tem um cátion monovalente, sendo que a concentração total do dito pelo menos um sal é de pelo menos 0,01% em p/p, e

b. filtrar de modo estéril a dita preparação de lactase.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o pelo menos um sal ser selecionado dentre um sal de Na⁺, K⁺ ou ΝΗΛ
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 ou 10, caracterizado por o pelo menos um sal ser selecionado dentre NaCI, KCI, NH4CI, Na2SO4, K2SO4, (NH4)2SO4 ou uma combinação dos mesmos, de preferência NaCI, KCI, (NH4)2SO4, Na2SO4 ou uma combinação dos mesmos, com mais preferência NaCI.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9, 10 ou 11, caracterizado por a concentração total do pelo menos um sal ser de 0,01 a 5% em p/p, de preferência 0,015 a 4% em p/p, com mais preferência 0,02 a 3% em p/p ou 0,1 a 2% em p/p.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9, 10, 11 ou 12, caracterizado por a lactase ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO: 1.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9, 10, 11, 12 ou 13, caracterizado por a preparação de lactase ter uma melhor filtrabilidade em comparação com uma segunda preparação líquida de lactase que tem a mesma composição, exceto que não compreende 0 dito pelo menos um sal que tem um cátion monovalente.

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15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9, 10 11, 12, 13 ou 14, caracterizado por a dita filtração estéril ser realizada em linha em um processo de produção de um produto lácteo.