DE2951793A1

DE2951793A1 - Verfahren zur thermischen destabilisierung von mikrobiologischem rennin

Info

Publication number: DE2951793A1
Application number: DE19792951793
Authority: DE
Inventors: Sven Branner-Joergensen
Original assignee: Novo Industri AS
Current assignee: DSM Delft BV
Priority date: 1978-12-28
Filing date: 1979-12-21
Publication date: 1980-07-10
Also published as: FR2445372A1; FR2445372B1; US4255454A; GB2038339B; NL190960B; DE2951793C2; BE880870A; NL7909211A; GB2038339A

Description

PATENTANWÄLTE

WUESTHOFF - ν. PECHMANN - BJ-HRFNS GOETZ

PROFESSIONAL KErKESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OPFICE MANDATAIKES ACRUS PRiS !.'OFFICE EUROPtEN DES BREVETS

rr.-ING. FRANZ VUrSTHOFF

DR. PHIL. FREDA TUESTHOFF (1927-19(6)

riPL.-ING. GERHARD PULS (1952-1971)

D1PL.-CHEM. DR. E. FREIHERR VON PECHMANN

DR.-ING. DIETER BEHRENS

DIPL.-ING.; DIPL.-VIRTSCH.-ING. RUPERT COETZ

NOVO INDUSTRI A/S
IA-52 971

D-8000 MÜNCHEN 90 SCHWEIGERSTRASSE 2

telefon: (089) 6610 ji

TELEGRAMM: FROTECTFATENT TELEX: 524O7O

Pat entanmeldung

Anmelder:

NOVO INDUSTRI A/S

Novo Alle DK-2880 Bagsvaerd, Dänemark

Titel:

Verfahren zur thermischen Destabilisierung von mikrobiologischem Rennin

6226

t)30028/079i

PATENTANWÄLTE

WUESTHOFF -ν. PECHMANN - BHHRrNS -GCETZ

PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE MANDATAIRES AGr££s PRES l'oFFICE EUROPtEN DES BREVETS

M..-1NG. FRAN2 TUESTHOFF

ΓΡ. PHIL. FREDA TUESTHOFP (1927-1956)

L-IPL.-ING. GERHARD PULS (195Z-I971) DIPL.-CHEM. DR. E. FREIHERR VON PECHIIANN DR.-INC. DIETER BEHRENS DIPL.-ING.; DIPL.-'WIRTSCH.-ING. RUPERT COBTZ

D-8000 MÜNCHEN 90 SCHWEIGERSTRASSE 2

telefon: (089) 6610 }i TELEGRAMM: PROTECTPATENT TB LE Χ: 524070

1A-52 971

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur thermischen Destabilisierung von mikrobiologischem Rennin. Rennin ist eine Bezeichnung für ein milchkoagulierendes Enzymprodukt.

Bei der Herstellung von Käse wird die Mich koaguliert, um den Quark von der Molke zu trennen. Produkte, die Labferment enthalten, das ein aus Kälbermägen isoliertes milchkoagulierendes Enzym ist, wurden lange Zeit für diesen Zweck angewandt. In der Vergangenheit konnte der Bedarf an Rennin durch Labferment (aus Kälbermägen) gedeckt werden, aber in den letzten Jahren wurden verschiedene Austauschstoffe für Labferment entwickelt, wie insbesondere mikrobiologisches Rennin von Mucor miehei und Mucor pusillus. Rennin von Mucor miehei wird zur Käseherstellung bevorzugt aufgrund seiner geringen Kosten, seiner geringen unspezifischen proteolytischen Aktivität und seiner großen Ähnlichkeit mit Labferment bezüglich der Empfindlichkeit gegen Calciumionen.

Eine andere Eigenschaft von Rennin von Mucor miehei, die man zunächst als vorteilhaft ansah wegen ihrem Beitrag zu der langen Lagerbeständigkeit, ist seine hohe thermische Stabilität.

O30028/07JH

Ein Teil der pasteurisierten Molke wird als Zusatz zu Vollmilch angewandt, z.B. in Form von Molkenpulver, um eine angereicherte Milch herzustellen, z.B. als Babynahrung. Die pasteurisierte Molke, die bei der Herstellung von Käse mit Rennin von Mucor miehei anfällt, kann noch kleinere Mengen Renninaktivität enthalten aufgrund der hohen Stabilität von Rennin von Mucor miehei. Eine etwaige Restrenninaktivität im Molkenpulver ist unerwünscht, da eine Proteinkoagulation nicht mehr auftreten soll. Eine solche könnte jedoch auftreten, wenn das Molkenpulver angewandt wird zur Herstellung von angereicherter Milch als Babynahrung. Die angereicherte Milch kann koagulieren, bevor sie in den Magen des Säuglings kommt, z.B. in der Flasche, wodurch der Milchfluß verstopft wird.

In Biochim. ,Biophys. Acta 271 (1972) 93 - 101 (V.S. Rickert, Structural and functional determinants of Mucor miehei protease, I. Modification of the NHp terminus and lysine residues by carbamylation) ist angegeben, daß Protease von Mucor miehei (die wirksame Komponente von Rennin von Mucor miehei) mit Kaliumcyanat carbamyliert werden^kann und daß das carbamylierte Produkt eine geringe thermische Destabilisierung zeigt. Praktische Versuche haben gezeigt, daß die thermische Destabilisierung des carbamylierten Enzyms zu gering ist, um das oben erwähnte Problem der Renninaktivität in pasteurisierter Molke zu lösen.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein wirtschaftlich durchführbares Verfahren zu entwickeln, mit dessen Hilfe mikrobiologisches Rennin in einem solchen Ausmaß destabilisiert werden kann, daß die von der restlichen mikrobiologischen Renninaktivität stammenden Nachteile in pasteurisierter Molke wirtschaftlich überwunden werden können.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur thermischen Destabilisierung von mikrobiologischem Rennin durch Modifizierung des mikrobiologischen Rennins durch Acylierung mit einem aktiven

030028/07 B k

Derivat einer Carbonsäure (z.B. einem Säureanhydrid) in einem wäßrigen Medium "bei einem pH-Wert zwischen ungefähr 6 und ungefähr 11 und bei einer Temperatur zwischen ungefähr 0 und ungefähr 40⁰C in einem Reaktionsgemisch, in dem das Gewichtsverhältnis zwischen Acylierungsmittel und Gesamtmenge an Protein in der Enzymzubereitung zwischen 0,01 und 10 liegt. Vorzugsweise wird die Acylierung mit einer Verbindung mit einem Monocarbonsäureacylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen durchgeführt.

Es hat sich gezeigt, daß mikrobiologisches Rennin, das erfindungsgemäß acyliert worden ist, deutlich destabilisiert ist und daß die Destabilisierung ausreicht, um den Erfordernissen zu entsprechen, wie sie bei der Verwendung von Molke auftreten, ohne daß nachteilige Wirkungen auf die Lagerstabilität der Renninzubereitung auftreten.

Das Ergebnis dieser Destabilisierung ist überraschend, da aus Agric. Biol. Chem. 41 (11), 2163 - 2168 (1977) hervorgeht, daß die Acetylierung von Eiklar zu einer thermischen Stabilisierung führt.

Die Renninaktivität wird nach dem British Standard 3624, 1963 gemessen (Verfahren zur Bestimmung der Koagulationskraft von Rennin für Milch).

Da die Erfindung sich auf eine gesteuerte Destabilisierung von mikrobiologischem Rennin bezieht, sind im folgenden die Verfahren zur Messung der thermischen Stabilität und zur Quantifizierung der Verringerung der thermischen Stabilität näher ausgeführt, wobei die Verringerung der Stabilität in ⁰C angegeben ist.

Unter idealen Bedingungen kann ein Enzym bei einer entsprechenden (hohen) Temperatur so denaturiert werden, daß die Restaktivität des Enzyms abnimmt als Funktion der Zeit entsprechend einer exponentiell abfallenden Kurve, d.h. mit einer gut definierten Halbwertszeit, die eine Funktion der Temperatur ( C) ist.

030028/0734

Die Halbwertszeit T^y₂ kann nach der folgenden Formel berechnet werden:

Ct₂^t₁) In2

InA,- - InAo

in der A_x. die Enzymaktivität nach dem Erhitzen auf eine bestimmte Temperatur für die Zeit t. bedeutet, während A₂ die Enzymaktivität nach dem Erhitzen auf die gleiche Temperatur für die Zeit t₂ angibt. Die Halbwertszeit ist kürzer je höher die Temperatur ist bei sonst gleicher Arbeitsweise. Bei manchen Enzymen wird die Halbwertszeit wesentlich verändert durch eine Veränderung des pH-Werts der Enzymlösung und der lonenstärke, sowie das Vorhandensein bestimmter Salze. Außerdem kann die Halbwertszeit wesentlich verändert werden durch Bildung chemischer Derivate des Enzyms. Wenn ein chemisches Derivat eines bestimmten Enzyms zu einer thermischen Destabilisierung des Enzyms führt, ist der Grad der Destabilisierung n°C, wenn das ursprüngliche (nicht in ein Derivat umgewandelte) und das in ein Derivat umgewandelte Enzym die gleiche Halbwertszeit bei K⁰C und (K-n) C besitzen.

Kormalerweise wird die erfindungsgemäße Acylierung begleitet von einem Aktivitätsverlust und es hat sich gezeigt, daß aus wirtschaftlichen Gründen die Destabilisierung nicht weiter, als bis zu einem Aktivitätsverlust von ungefähr 50 % durchgeführt werden sollte.

In einem typischen Falle scheint die Destabilisierung von 3 bis 5°C mit einem Aktivitätsverlust, der auf 50% begrenzt ist, ein annehmbarer Kompromiß zwischen den oben angegebenen, sich widersprechenden Faktoren zu sein.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt die Acylierung mit einem Anhydrid einer Monocarbonsäure mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.

030028/0ViH

Ferner ist es bevorzugt, Eennin von Mucor miehei zu destabilisieren. Besonders günstig ist das erfindungsgemäße Verfahren unter Anwendung eines aktiven Derivats von Essigsäure als Acylierungsmittel, vorzugsweise von Essigsäureanhydrid. Weiter ist Propionsaureanhydrid ein günstiges Acylierungsmittel. Günstigerweise beträgt das Gewichtsverhältnis in dem Reaktionsgemisch zwischen dem Acylierungsmittel und der Gesamtmenge an Protein in der Enzymzubereitung 0,1 bis 1.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäß modifizierten Rennins zur Käseherstellung. Die bei dieser Käseherstellung anfallende Molke kann für angereicherte Milch ohne Probleme angewandt werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Beispiel 1_

Als Ausgangsmaterial wurden 15 1 eines Rennin-Konzentrats angewandt, das hergestellt worden war entsprechend "2. Pilot plant experiment" in der GB-PS 1 108 287, wobei nur die Kulturflüssigkeit auf eine Aktivität entsprechend einer I^oigen Lösung des reinen Enzyms konzentriert worden war (Comptes Rendus des Travaux du Laboratoire Carlsberg, Bd. 37, Nr. 14, 301 - 325) und 18 % NaCl zu dem rohen Konzentrat zugegeben worden waren.

Die folgenden Arbeitsstufen wurden alle unter heftigem Rühren durchgeführt.

1. Das Rennin-Konzentrat wurde auf ungefähr 5°C gekühlt und diese Temperatur während der folgenden Arbeitsstufen aufrechterhalten. Der pH-Wert wurde mit 0,56 1 3»7 η KaOH auf 10 eingestellt.

2. Die Acylierung, während der der pH-Wert mit 3,7 η KaOH in einem pH-Stat konstant gehalten wurde, wurde durchgeführt durch Zugabe von Essigsäureanhydrid in kleinen Mengen in Übereinstimmung

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mit der Möglichkeit des pH-Stat den pH-Wert zwischen 9,7 und 10,0 zu halten. Die Zugabe von Essigsäureanhydrid wurde fortgesetzt, bis ungefähr die Hälfte der Enzymaktivität verloren gegangen war. Diese Stufe wurde ziemlich plötzlich erreicht, wenn 51 ml Essigsäureanhydrid zugegeben worden waren, woraufhin die Zugabe von Essigsäureanhydrid unterbrochen wurde. Die Acetylierung war nach ungefähr 30 min vollständig.

3. Nach Beendigung der Acetylierung wurde der pH-Wert durch Zugabe von 0,2 1 5,2n HCl auf 4,7 eingestellt. Die gesamte Volumenzunahme während der Stufen 1 bis 3 betrug ungefähr 5 /»> bezogen auf das Volumen des Ausgangsmaterials.

Bei 30 min langem Erhitzen des acetylierten Enzyms bei einem pH-Wert von 6,0 auf 60⁰C ergab sich eine Halbwertszeit von 55 bis 85 min entsprechend'einer Destabilisierung von 3 C. Ein Kontrollenzymmaterial besaß eine Halbwertszeit bei 60°C und einen pH-Wert von 6,0 von 300 min und dieses Kontrollenzym besaß eine Halbwertszeit von ungefähr 20 min bei 65°C und pH 6,0.

Beispiel 2

Es wurde das gleiche Ausgangsmaterial angewandt wie in Beispiel 1 nach dar (B-PS 11C8 2B7. Dieses Konzentrat wurde teilweBe durch Ausfällung mit (HH₇J₂SO. ' (40 g/100 ml Renninkonzentrat), Abfiltrieren des Niederschlags, Lösen des Niederschlags in Wasser und Dyalyse (Ultrafiltration) mit einer Membran DDS 800 (De Dansk Sukkerfabrikker) gereinigt (diese Membran hält Moleküle mit einem Molekulargewicht über 10 000 zurück).

Diese Flüssigkeit kann als "teilweise gereinigtes Renninkonzentrat" bezeichnet werden. 40 ml dieses teilweise gereinigten Renninkonzentrats,enthaltendungefähr 2,7 g Enzymprotein und ungefähr 1,3 S Nichtenzymprotein wurden mit Wasser auf 1600 ml verdünnt. Die Lösung wurde auf 30°C erwärmt und der pH-

030028/079Ä

Wert mit 1 η NaOH auf 8,0 eingestellt. Die Acetylierung wurde durchgeführt durch Zugabe von 100,ul Essigsäureanhydrid jede 10. Minute. Der pH-Wert wurde laufend mit 1 η HaOH auf 8,0 eingestellt. Nach Zugabe von 1100 /Ul Essigsäureanhydrid war die Enzymaktivität auf die Hälfte des ursprünglichen Wertes gefallen.

Dann wurde der pH-Wert mit 20^iger Essigsäure auf 6,0 eingestellt und die Lösung mit der oben angegebenen Membran (DDS-Typ 800) bis zu einem Konzentratgew:j.cht von 40 g ultrafiltriert. Dann wurden 40 g Sorbit zu den 40 3 Konzentrat zugegeben.

Wie oben angegeben, wurde eine Halbwertszeit von 30 bis 4$ min bei einem pH-Wert von 6,0 bei 6O⁰C bestimmt, entsprechend einer Destabilisierung von 4⁰C.

Beispiel 3

Drei Anteile von je 1 ml des teilweise gereinigten Renninkonzentrats nach Beispiel 2 wurden jeweils mit 20 ml 0,2 m Carbonatpuffer verdünnt und auf einen pH-Wert von 9? 10 bzw. 11 gebracht. Die so hergestellten Lösungen wurden mit 30 ,ul Essigsäureanhydrid bei O⁰C vermischt und der pH-Wert wieder auf 9» 10 bzw. 11 eingestellt.

Nach Beendigung der Reaktion wurde der pH-Wert mit 20>iger Essigsäure auf 6,0 eingestellt und jede der drei Lösungen mit Wasser auf 25 ml verdünnt.

Die Aktivitäten, die durch Bestimmung der Renninaktivität berechnet wurden, waren:

pH-Wert bei der Aktivitätsausbeute Acetylierung (%>)

9 55

10 34

11 11

030028/07S4

γ.

⁰C

Die Halbwertszeiten in min bei pH 6,0 und 60⁰C betrugen

pH-Wert bei der	Halbwertszeit
Acetylierung	(min)
9	20
10	13
11	11

Diese Halbwertszeiten entsprechen den folgenden Destabilisierungswerten (⁰C):

pH-Wert bei der Destabilisierung

Acetylierung (⁰C)

9 5

10 5-6

11 ' 6

Beispiel

4 ml des teilweise gereinigten Renninkonzentrats nach Beispiel 2 wurden mit 160 ml Wasser verdünnt und der pH-Wert mit 1 η NaOH auf δ,Ο eingestellt und das Gemisch auf 0⁰C gekühlt.

Anschließend wurde ein gemischtes Anhydrid aus Ameisensäure und Essigsäure unter Rühren in Anteilen von 10 /ul zugegeben.

Nach Zugabe von 80 /ul des angegebenen gemischten Anhydrids war die Renninaktivität auf die Hälfte ihres ursprünglichen Wertes zurückgegangen und es wurde kein weiteres Anhydrid zugesetzt. In dieser Stufe wurde der pH-Wert erneut auf ungefähr 5 eingestellt.

Nach Wärmebehandlung des so formylierten Rennins bei 60⁰C und pH 6,0, betrug die Halbwertszeit des Rennins ungefähr 100 min entsprechend einer Destabilisierung von ungefähr 2⁰C.

030028/0 7 34

Beispiel 5

7 g handelsübliches Noury Rennin 1:220 000 (Chargen-Nr. 751 1-22) von Mucor pusillus wurden in 160 ml Wasser gelöst und mit 4 η NaOH auf einen pH-Wert von 8,0 gebracht.

Dann wurden 20/Ul Anteile Essigsäureanhydrid bei 30⁰C unter Rühren zu dem Gemisch zugegeben. Nach Zugabe von 300 /ul Essigsäure war die Renninaktivität auf 85 Vo der ursprünglichen Aktivität gefallen und es wurde kein weiteres Anhydrid zugesetzt. Dann wurde der pH-Wert mit 20%iger Essigsäure auf ungefähr 5>0 eingestellt.

Wenn das so behandelte Rennin von Mucor pusillus bei einem pH-Wert von 6,0 auf 55 C erwärmt wurde, fand sich eine Halbwertszeit von ungefähr 20 min. Eine Vergleichsprobe' des ursprünglichen (nicht acetylierten) Rennins von Mucor pusillus zeigte eine Halbwertszeit von 26 bis 28 min unter den oben angegebenen Temperatur- und pH-Bedingungen.

Beispiel 6

1 ml des teilweise gereinigten Renninkonzentrats nach Beispiel 2 wurde in 20 ml 0,2 m Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethan) bei pH 7*5 behandelt. Dieses gepufferte Gemisch wurde auf O⁰J gekühlt und 0,1 g N-Acetylimidazol zugegeben. Nach Beendigung der Reaktion wurde der pH-Wert mit Hilfe von 20%iger Essigsäure auf 6,0 eingestellt und das Gemisch auf 25 ml verdünnt. Die Aktivität betrug 40 % und die Halbwertszeit bei 60⁰C und pH 6,0 betrug 50 min entsprechend einer Destabilisierung von

Beispiel

6 Anteile von je 4 ml des teilweise gereinigten Renninkonzentrats

030023/07

- Y-/ib

nach Beispiel 2 wurden mit 80 ml 0,2 m Bicarbonatpuffer bei pH 9»0 verdünnt und das Gemisch auf 0°C gekühlt. Dann wurden 10/al Anteile der folgenden Anhydride zugegeben:

1) gemischtes Essigsäureameisensäureanhydrid

2) Essigsäureanhydrid

3) Propionsäureanhydrid

4) Buttersäureanhydrid

5) Isobuttersäureanhydrid

6) Valeriansaureanhydrid

Die Zugabe wurde solange fortgesetzt, bis die Aktivität des Rennins auf ungefähr die Hälfte des ursprünglichen Wertes gefallen war.

Dann wurde der pH-V/ert mit 20%iger Essigsäure auf 5,0 eingestellt und das Gemisch mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml verdünnt.

Die wichtigsten experimentellen Daten und Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

Anhydrid	zugesetzte Anhydridmenge	0300	Aktivi tätsaus beute (%)	Halbwerts zeit (min)	Destabili- sierung (⁰C)
gemischtes Essigsäure ameisensäure anhydrid	180	74	40	4
Essigsäure anhydrid	70	62	20	5
Propionsäure- anhydrid	80	44	12	6
Buttersäure anhydrid	20	61	65	3
Isobuttersäure anhydrid	90	47	.17	5
VaIeriansäure- anhydrid	100	44	20	5
	28/079^

/ff

Proben der in den vorhergehenden Beispielen destabilisierten Enzyme wurden angewandt zur Koagulierung von Milch. Die Molke wurde gewonnen, dann pasteurisiert und anschließend auf die Restrenninaktivität untersucht. Im Falle der Enzyme, die eine Destabilisierung von 3 C oder darüber zeigten, war in der pasteurisierten Molke im wesentlichen keine Renninaktivität vorhanden.

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Claims

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DIFL.-CHEM. DR. E. FREIHERR VON FECHMANN FKOFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE DR.-ING. DIETER BEHRENS

MANDATAIRES AGREES FRES !.'OFFICE EUROFEEN DES BREVETS DIFL.-ING.; DI PL.-'Wl RTSCH.-ING. RU PERT COETZ

D-8000 MÜNCHEN 90 SCHWEIGERSTRASSE 2

telefon: (089) 66 20 ji

TELEGRAMM: PKOTECTPATENT TELEX: 514070

Patentansprüche

1) Verfahren zur thermischen Destabilisierung von mikrobiologischem Rennin, dadurch gekennzeichnet , daii man das mikrobiologische Rennin mit einem aktiven Derivat einer l'ionocarbonsäure in wäßrigem Medium bei eine^i pH-V/ert zwischen ungefähr 6 und ungefähr 11 und einer Temperatur von ungefähr 0 bis ungefähr 40⁰C acyliert, wobei das Gewichtsverhältnis von Acylierungsmittel zu Gesamtmenge an Protein zwischen 0,01 und 10 liegt.

Z) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net , da.is man ein Anhydrid einer Nonocarbonsäure mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen verwendet.

5) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daii man als mikrobiologisches Rennin ein solches von Mucor miehei verwendet.

4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurcn gekennzeichnet , daü man als Acylierungsmittel ein aktives Derivat von Essigsäure verwendet.

5) Verfahren nach Anspruch 4, dadurch g e k e η η -

ζ ei c h η e t , daß man als Acylierungsmittel Essigsäureanhydrid verwendet.

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INSPECTED

6) Verfahren nach Anspruch 1 bis J, dadurch gekennzeichnet , daß man als Acylierungsmittel Propionsäureanhydrid verwendet.

7) Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß man bei einem Gewichteverhältnis von Acylierungsmittel zu Gesamtmenge an Protein zvisehen 0,1 und 1,0 arbeitet.

8) Anwendung des nach Anspruch 1 bis 7 erhaltenen Renninr zur Käseherstellung.

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