DE2232996C3 - Verfahren zur Entfernung von Lipase Verunreinigungen aus mikrobiologischen Labfermenten - Google Patents
Verfahren zur Entfernung von Lipase Verunreinigungen aus mikrobiologischen LabfermentenInfo
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Description
in der wäßrigen Lösung ist nicht kritisch. Bekanntlich erfordern jedoch verdünnte Lösungen große Mengen
Lipase-Verunreinigungen die zu einem Ranzig- Flüssigkeit, die verarbeitet werden muß, um eine bewerden des Käses führen, können aus mikrobiolo- 30 stimmte Menge mikrobiologisches Renmn zu reigischem Rennin entfernt werden, indem man den nigen. Die stärker konzentrierten Losungen errnogpH-Wert einer mikrobiologischen Rennin-Lösung auf liehen es, eine bestimmte Menge mikrobioiogiscnes
einen Wert von ungefähr 4 bis ungefähr 6 einstellt. Rennin mit einem geringeren Aufwand und in kurwobei sich ein Niederschlag bildet, der die Lipase- zerer Zeit zu reinigen.
Aktivität enthält und die so gereinigte mikrobiolo- 35 Das erfindungsgemäße Verfahren kann gunstigergische Rennin-Lösung von dem Niederschlag ab- weise so durchgeführt werden, daß man eine ausreitrennt. chende Menge einer sauren Substanz, wie Schwefel-
Bei der allgemein üblichen Käseherstellung läßt säure, zu einer wäßrigen Lösung von mskrobioloman die Milch gerinnen oder koagulieren um einen gischem Rennin zugibt, um den pH-Wert einer
festen Quark zu bilden. Dieser Quark oder Käsebruch 40 solchen Lösung auf einen Wert von ungefähr 4 bis
wird in viele Stücke geschnitten, und die Stücke ungefähr 6 zu bringen. Die Ausflockung des die
werden zusammen erhitzt. Die flüssige Molke wird Lipase-Aktivität enthaltenden Materials tritt nahezu
von dem erhitzten Käsebruch abgetrennt, dieser dann augenblicklich ein. Der entstehende Niederschlag
in Blöcke geschnitten, gepreßt und einige Monate kann von der so gereinigten mikrobiologischen
lang ausgereift, um den gewünschten Käse zu bilden. 45 Rennin-Lösung durch Abfiltrieren oder Zentnfu-Das normalerweise verwendete Mittel um den Quark gieren und Dekantieren entfernt werden,
durch Gerinnen oder Koagulieren der Milch herzu- Wenn der pH-Wert auf einen Wert unte* 4 einstellen, ist das Enzym Rennin, das im Labmagen von gestellt wird, kann die Aktivität des mikrobiolo-Kälbern gefunden wird. gischen Rennins leicht verschlechtert werden. Wenn
Kälber-Rennin ist eine Substanz, die aus der 5» der pH-Wert auf mehr als etwa 6 eingestellt wird, ist
Schleimhaut des vierten Magens von nicht entwöhnten die Entfernung der Lipase nicht vollständig. Vorzugs-Kälbern hergestellt wird. Es ist einleuchtend, daß die weise wird der pH-Wert auf einen Wert zwischen
Qualität und Quantität von Rennin, das für die Käse- ungefähr 4,5 und ungefähr 4,7 eingestellt, um eine
herstellung verfügbar ist, direkt abhängt von der Zahl maximale Entfernung der Lipase bei einer gleichzeitig
und Art der Kälber, die für Nahrungszwecke ge- 55 minimalen Wirkung auf die Rennin-Aktivität zu
schlachtet werden. Das hat in der Vergangenheit zu erreichen. Es ist auch günstig, um die letzten Spuren
vielen Versuchen geführt, einen geeigneten Ersatz für von Lipase-Aktivität zu entfernen, das flüssige mikro-Kälber-Rennin zu finden. Es sind zur Zeit verschiedene biologische Rennin, das auf den oben angegebenen
mikrobiologische Rennin-Zubereitungen erhältlich. pH-Wert eingestellt und filtriert worden ist, nach be-Diese werden erzeugt, z. B. durch Mucor miehei und 60 kanntem Verfahren einzuengen und die entstehende
Mucor pusiüus. Ein besonders günstiges mikrobiolo- konzentrierte Lösung nochmal zu filtrieren,
gisches Rennin wird gebildet von Mucor miehei Die Arbeitsbedingungen zur Durchführung des
NRRL 3420 oder dessen Mutanten. Während diese erfindungsgemäßen Verfahrens sind nicht in engen
mikrobiologischen Labfermente die erwünschte hohe Grenzen kritisch. Temperaturen von ungefähr 0 bis
Milchgerinnungsaktivität besitzen, enthalten sie häufig 65 ungefähr 35° C können angewandt werden. Bei Tem-Lipase-Verunreinigungen, die zu einem Ranzigwerden peraturen unterhalb von ungefähr 00C neigt die
des damit hergestellten Käses führen. Enzymlösung dazu, auszufrieren. Bei Temperaturen
3 4
gische Rennin inaktiviert werden. Vorzugsweise werden 35° C gehalten. Während dieser Zeit wird der pH-Wert
Temperaturen von ungefähr 4 bis ungefähr 250C an- des gesamten Gemisches durch Zugabe der oben aii
gewandt. gegebenen N ati ium-hydroxid Lösung auf 8,0 gehalten.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird Lipase Die gesamte Zeit in Sekunden und die gesamte Menge
aus mikrobiologischem Rennin entfernt, so daß das 5 wäßriger 0,02 n-Natrium-hydroxid-Lösnng, die zugewünschte Produkt ein günstig hohes Verhältnis gegeben wird, um einen pH-Wert von 8,0 aufrechtvon Müchgerinnungsaktivitäl (clotting activity) zur zuerhalten, wird gemessen. Die Dpaseaktivität wird
Lipase-Aktivität besitzt. Die folgenden Verfahren dann folgendermaßen berechnet,
wurden angewandt, um die Milchgerinnungsaktivität y. J2Q
und die Lipase-Aktivität der ursprünglichen und der io Lipase-Einheiten =
gereinigten Substanzen zu bestimmen. T
wX iS^T"^1^** "urde rt,auA fol^n.de V = Natrium-hydroxid-Volumen (cm»),
Menge nicht fetter, trockener Milchbestandteile in 15 Die Enzymaktivität wird dann angegeben in Lipase-Wasser hergestellt. Zu dieser Lösung wurde dann einheiten (LE) pro cm3. Eine Lipaseeinheit ist definiert
CaCl4-2 Hj.O zugegeben, bis zu einer Konzentration als die Enzvmmenge, die erforderlich ist, um ein
von 0,01m Calcium. Ein Anteil von 5 cm3 der obigen Mikromol Fettsäure pro Minute unter den angege-Milchlösung wurde in ein Reagenzglas gegeben und benen Bedingungen zu bilden. Das zur Aufrechtauf 37,5°C erwärmt. 0,5 cm3 wäßriges verdünntes ao erhaltung des pH-Wertes zugegebene Natrium-hy-Enzym von 37,5° C wurden dann zu der Milchiösung droxid neutralisiert die gebildete Fettsäure und ist
in dem Reagenzglas zugegeben. Die Enzym-Milch- ein Maß für die Bildung einer solchen Fettsäure,
lösung wurde dann gerührt, und die Zeit bis zur Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele
ersten Ausflockung wurde gemessen. Die Enzym- näher erläutert,
konzentration wurde so gewählt, daß die Gerinnungs- 35 B e i s ρ i e 1 1
zeit ungefähr 4 Minuten betrug. Die Milchgerinnungsaktivität des Enzyms wurde wie folgt berechnet: Ein mikrobiologisches Labferment wurde hergestellt, indem man eine Kultur von Mucor miehei
Spxhlet- M(cm ) _2400Jsec) lQQQ
NRRL 3420 in einem sterilisierten Medium züchtete,
dieses Filtrats, die jeweils 6,7 Lipaseeinheiten pro
Die Enzymaktivität wird dann in Soxhleteinheiten 35 cm3 enthielten, wurden bei Raumtemperatur mit
(SE) pro Gramm ausgedrückt. Wenn das Enzym in Schwefelsäure vermischt, um einen pH-Wert von 5,5,
der ursprünglichen flüssigen Form verwendet wird 5,0 bzw. 4,5 einzustellen. Die gebildeten Niederschläge
und nicht als gelöstes pulvriges Enzym in Wasser, wurden jeweils getrennt abfiltriert. Die erhaltenen
wird in der obigen Formel für E das entsprechende Filtrate enthielten 3,7, 2,6 bzw. 1,8 Lipaseeinheiten
Volumen in mm3 μΐ eingesetzt, und die Enzymaktivität 40 pro cm3, was einer Hpase-Entfernung von 44,8,
wird in Soxhleteinheiten pro cm3 angegeben. Eine 61,2 bzw. 73,1 °/0 entspricht. Das zeigt deutlich eine
Soxhleteinheit gibt die Enzymmenge an, die 1 cm3 Entfernung der Lipase durch Einstellung des pH-der obigen Milchlösung in 40 Minuten zum Gerinnen Wertes auf ungefähr 4 bis ungefähr 6.
bringen kann.
stimmt. Ein Reaktionsgemisch wurde hergestellt durch
100/o«gen (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung von Gummi tationsbrühe, die der im Beispiel 1 beschriebenen
arabicum. Die entstehende Tributyrinemulsion wurde ähnlich war und die jeweils 11,1 LE pro cm3 entdann mit 60 ecm einer wäßrigen 0,001m Lösung von 50 hielten, wurden einzeln mit Schwefelsäure behandelt,
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-Puffer bei so daß sich verschiedene pH-Werte ergaben. Die geeinem pH-Wert von 8,0, 60 ecm einer wäßrigen 3,0m bildeten Niederschläge wurden abzentrifugiert und
Natrium-chlorid-Lösung und 180 ecm destillierten die überstehenden Flüssigkeiten dekantiert. Die Nie-Wasser vermischt. 5 ecm des oben angegebenen Ge- derschläge wurden dann einzeln in 5 cm* einer wäßmisches wurden auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt 55 rigen 0,01 m Phosphat-Puffer-Lösung mit einem
und in den Reaktiansraum (reaction well) eines In- pH-Wert von 6,1 suspendiert. Die suspendierten
strumentes gegeben, bei dem man eine ausreichende Niederschläge wurden auf ihre Lipase-Aktivität unter-Menge einer wäßrigen 0,02m Natrium-hydroxid-Lö- sucht, wobei man die folgenden Ergebnisse erhielt,
sung zugeben kann, um den pH-Wert des Reaktions- Tabelle T
gemisches auf 8,0 zu halten. Das zu bestimmende 60 H.Wert ' LE/cm'
0,01m Lösung von Tris-(hydroxymethyl)-aminome- ' ^49
than-HCl-Puffer von pH 8,0 gelöst. Wenn ein flüssiges 1'? ^'^
pH-Wert von 8,0 eingestellt. 1 cm3 der flüssigen 65 Λ
497
des Reaktionsgemisches zugegeben und das Reak- Diese Werte zeigen, daß bei einer Einstellung des
tionsgemisch mit dem Enzym 3 bis 4 Minuten auf pH-Wertes auf ungefähr 4,5 bis ungefähr 4,7 die
größte Menge an Lipaseaktivität entfernt wird, da die in diesem pH-Bereich gebildeten Niederschläge
die größten Mengen an Lipase enthalten.
B e is ρ i el 3
Eine mikrobiologische, renninhaltige Fermentationsbrühe wurde wie im Beispiel 1 beschrieben
von Mucor miehei NRRL 3420 gebildet, anschließend filtriert und von dem Mycel entfernt. Dieses erste
Filtrat enthielt 73 LE pro cm3 und hatte bezogen
auf eine Standardlösung mit einer Milchgerinnungsstärke von 54 000 SE pro cm3. Es wurde Schwefelsäure
zugegeben, um den pH-Wert auf 4,6 einzustellen. Der entstehende Niederschlag wurde über Diatomeenerde
abfiltriert, wobei man ein Filtrat erhielt, das 9,4 LE pro cm3 enthielt, bezogen auf eine Standardlösung
mit einer Milchgerinnungsaktivität von 54 000 SE pro cma. Dieses Filtrat wurde dann durch Eindampfen
im Vakuum auf eine standartisierte Gerinnungsaktivität von 54 000 SE pro cm3 eingestellt
und dann durch Filtrieren über Diatomeenerde weiter gereinigt. Dieses Endprodukt enthielt 2.4 LE pro
cm3 und ein günstig hohes Verhältnis von Gerinnungsaktivität zu Lipaseaktivität von 22 500. Insgesamt
waren 96,8 % der in dem Ausgangsmaterial enthaltenen Lipase durch dieses Verfahren entfernt
worden.
Das Verfahren des Beispiels 3 wurde wiederholt, wobei man ein erstes Filtrat verwendete, das 34 LF.
pro cm3, bezogen auf eine Standard-Milch gerinnungslösung,
besaß. Das Filtrat nach der Einstellung des pH-Wertes und dem Filtrieren enthielt 2,02 LE pro
cm3, bezogen auf die Standard-Gerinnungsstärke. Das Endprodukt nach dem Einengen und dem erneuten
Filtrieren zur Reinigung enthielt keine nachweisbare Lipase.
Pasteurisierte, vollständige Milch wurde auf bekannte Weise mit einer Milchsäure Starter-Kultur
und mit mikrobiologischem Rennin, das entsprechend dem Beispiel 1 bis 4 zur Entfernung der Lipaseaktivität
behandelt worden war, behandelt. Die Milch gerann, und es wurde ein guter Quark erhalten. Aus
diesem Quark wurde anschließend Käse hergestellt, der nach einer entsprechenden Lagerung normal war
und gute Eigenschaften besaß. Käse, der mit mikrobiologischem Rennin hergestellt worden war, das
nicht wie oben beschrieben zur Entfernung der Lipase behandelt worden war, war nach einer ähnlichen
Lagerung leicht ranzig.
Es wurde ein Keim-Medium hergestellt und in vier Teile aulgeteilt, die jeweils ein Gemisch aus 0,05 g
eines oxoiden ideologischen Peptons, 1,0 g Dextrose, 420 mg einbasischem Natriumphosphat, 2,13 mg zweibasischem
Natriumphosphat und 50 cm3 destilliertem Wasser darstellten. Jeder Anteil wurde dann in einen
250 cm3 Erlenmeyer-Kolben gegeben und sterilisiert.
ίο Die vier Kolben wurden dann getrennt beimpft mit
Kulturen von Mucor pusillus NRRL 2543, Mucor miehei A 7772, Mucor miehei ATCC 16457 und
Mucor miehei NRRL A 13 042 und 24 Stunden auf einem Kreiselschüttler mit einem Hub von 2,54 cm
und einer Geschwindigkeit von 250 UpM inkubiert. Ein Wachstumsmedium wurde in vier Anteilen
hergestellt, wovon jeder aus einem Gemisch aus 3,2 g Dextrose, 2,3 g Cudahy Pepton M, 193 mg einbasischem
Natriumphosphat, 483 mg zweibasischem Natriumphosphat, 5,0 g gemahlenem, ganzem Mais,
40 mg bakterieller \-Amyiase und 100 cm3 Leitungswasser bestand. Jeder Anteil wurde in einen 1-Liter-Erlenmeyer-Kolben
gegeben und sterilisiert. Die vier Kolben wurden dann getrennt mit 2 ecm der oben
as angegebenen Impfkulturen beimpft und 6 Tage bei
370C in einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung mit einem Hub von 5,08 cm und einer Frequenz
von 232 Bewegungen pro Minute inkubiert.
Das Mycel wurde dann abfiltriert und die entstehenden Filtrate auf ihre Lipaseaktivität hin untersucht.
10 cm3 Anteile jedes Filtrats wurden mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5
gebracht und anschließend zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert. Die entstehenden
Filtrate wurden auf ein Volumen von 3 cm3 mit destilliertem Wasser aufgefüllt und ihre Lipase-Aktivität
untersucht. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:
4° | Kultur | Tabelle II |
Lipase-Einheiten
im suspendierten Niederschlag 3 ecm |
Prozentuale
Entfernung der Lipase |
45 2543 A 7772 16457 A13042 |
Lipase-Einheiten
im ursprüng lichen Kiltrat 10 ecm |
4,8 12,0 3,6 17,7 |
44,4 21,5 34,0 27,9 |
|
10,8 55,8 10,6 63,5 |
Daraus ersieht man, daß das erfindungsgemäße Verfahren zur Entfernung von Lipase aus mikrobiologischen
Labfermenten aus verschiedenen Quellen geeignet ist.
Claims (4)
1. Verfahren zur Entfernung von Lipase-Ver- LBi^arfdwWertim^*^»^«
unreinigungen aus mikrobiologischen Labfermen- S einstellt und die fati^f^/SSi en haf
ten, dadurch gekennzeichnet, daß von dem entstehenden, die Lipase-Aktivitat enthalman den pH-Wert einer mikrobiologischen Rennin- tenden Niederschlag abtre.™h. ernnduneseemäße
Lösung auf einen Wert von ungefähr 4 bis un- Das als Ausgangsmaterial fur {«£™™*g™**
gefahr 6 einstellt und die Rennin-Lösung von Verfahren geeignete »'^^^^JgS^.1
dem dabei entstehenden, die Lipaseaktivität ent- i. bzw. Rennin kann nach }*^n*" Jerfaton er
haltenden Niederschlag abtrennt halten werden. Ein besonders 8»0«« bekanntes
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- mikrobiologisches Renmn kann hergestellt werden
zeichnet, daß man den pH-Wert auf einen Wert indem man unter proben Bedingungen eine Kultur
von ungefähr 4,5 bis ungefähr 4,7 einstellt. von Mucor rieh« und ponders eine Kütur^ von
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch 15 Mucor miehei NRRL 3420 oder dessen Mutanten
gekennzeichnet, daß man als Labferment ein von in einem Medium züchtet, das geegi^ Nährstoffe
Mucor miehei, besonders Mucor miehei NRRL enthält und dann das Enzym daraus gewinnen (deut-3420 oder dessen Mutanten, erzeugtes Ferment sehe Offenlegungsschnft 1 f« 4*»)· .
verwendet Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet zur
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch »o Reinigung von mikrobiologischem Renmn in vergekenn/eichnet, daß man die gereinigte, mikro- schiedenen Formen. Es kann in horm bekannter,
biologische Rennin-Lösung einengt und nochmals ganzer wäßriger Kulturen oder Ferraentationsbruhen
filtriert vorliegen. Es kann auch in Form einer trockenen
Substanz vorliegen, die dann in einem wäßrigen
25 Medium für das erfindungsgemäße Verfahren gelost
wird. Die Konzentration an mikrobiologischem Renmn
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- 1972-02-25 IT IT4857572A patent/IT1000016B/it active
- 1972-03-10 AR AR24088972A patent/AR194472A1/es active
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) |