DE2232996B2 - Verfahren zur entfernung von lipaseverunreinigungen aus mikrobiologischen labfermenten - Google Patents

Description

in der wäßrigen Lösung ist nicht kritisch. Bekanntlich erfordern jedoch verdünnte Lösungen große Mengen

Lipase-Verunreinigungen die zu einem Ranzig- Flüssigkeit, die verarbeitet werden muß, um eine be-

werden des Käses führen, können aus mikrobiolo- 30 stimmte Menge mikrobiologisches Rennin zu re!-

gischem Rennin entfernt werden, indem man den nigen. Die stärker konzentrierten Lösungen ermög-

pH-Wert einer mikrobiologischen Rennin-Lösung auf liehen es, eine bestimmte Menge mikrobiologisches

einen Wert von ungefähr 4 bis ungefähr 6 einstellt, Rennin mit einem geringeren Aufwand und in kür-

wobei sich ein Niederschlag bildet, der die Lipase- zerer Zeit zu reinigen.

Aktivität enthält und die so gereinigte mikrobiolo- 35 Das erfindungsgemäße Verfahren kann günstiger-

gische Rennin-Lösung von dem Niederschlag ab- weise so durchgeführt werden, daß man eine ausrei-

trennt. chende Menge einer sauren Substanz, wie Schwefel-

Bei der allgemein üblichen Käseherstellung läßt säure, zu einer wäßrigen Lösung von mikrobioloman die Milch gerinnen oder koagulieren um einen gischem Rennin zugibt, um den pH-Wert einer festen Quark zu bilden. Dieser Quark oder Käsebruch 40 solchen Lösung auf einen Wert von ungefähr 4 bis wird in viele Stücke geschnitten, und die Stücke ungefähr 6 zu bringen. Die Ausflockung des die werden zusammen erhitzt. Die flüssige Molke wird Lipase-Aktivität enthaltenden Materials tritt nahezu von dem erhitzten Käsebruch abgetrennt, dieser dann augenblicklich ein. Der entstehende Niederschlag in Blöcke geschnitten, gepreßt und einige Monate kann von der so gereinigten mikrobiologischen lang ausgereift, um den gewünschten Käse zu bilden. « Rennin-Lösung durch Abfiltrieren oder Zentrifu-Das normalerweise verwendete Mittel um den Quark gieren und Dekantieren entfernt werden,
durch Gerinnen oder Koagulieren der Milch herzu- Wenn der pH-Wert auf einen Wert unter 4 einstellen, ist das Enzym Rennin, das im Labmagen von gestellt wird, kann die Aktivität des mikrobiolo-Kälbern gefunden wird. gischen Rennins leicht verschlechtert werden. Wenn

Kälber-Rennin ist eine Substanz, die aus der so der pH-Wert auf mehr als etwa 6 eingestellt wird, ist Schleimhaut des vierten Magens von nicht entwöhnten die Entfernung der Lipase nicht vollständig. Vorzugs-Kälbern hergestellt wird. Es ist einleuchtend, daß die weise wird der pH-Wert auf einen Wert zwischen Qualität und Quantität von Rennin, das für die Käse- ungefähr 4,5 und ungefähr 4,7 eingestellt, um eine herstellung verfügbar ist, direkt abhängt von der Zahl maximale Entfernung der Lipase bei einer gleichzeitig und Art der Kälber, die für Nahrungszwecke ge- 55 minimalen Wirkung auf die Rennin-Aktivität zu schlachtet werden. Das hat in der Vergangenheit zu erreichen. Es ist auch günstig, um die letzten Spuren vielen Versuchen geführt, einen geeigneten Ersatz für von Lipase-Aktivität zu entfernen, das flüssige mikroKälber-Rennin zu finden. Es sind zur Zeit verschiedene biologische Rennin, das auf den oben angegebenen mikrobiologische Rennin-Zubereitungen erhältlich. pH-Wert eingestellt und filtriert worden ist, nach be-Diese werden erzeugt, z. B. durch Mucor miehei und 60 kanntem Verfahren einzuengen und die entstehende Mucor pusillus. Ein besonders günstiges mikrobiolo- konzentrierte Lösung nochmal zu filtrieren,
gisches Rennin wird gebildet von Mucor miehei Die Arbeitsbedingungen zur Durchführung des NRRL 3420 oder dessen Mutanten. Während diese erfindungsgemäßen Verfahrens sind nicht in engen mikrobiologischen Labfermente die erwünschte hohe Grenzen kritisch. Temperaturen von ungefähr 0 bis MUchgerinnungsaktivität besitzen, enthalten sie häufig 65 ungefähr 35°C können angewandt werden. Bei Tem-Lipase-Verunreinigungen, die zu einem Ranzigwerden peraturen unterhalb von ungefähr 0⁰C neigt die des damit hergestellten Käses führen. Enzymlösung dazu, auszufrieren. Bei Temperaturen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung oberhalb von ungefähr 35⁰C kann das mikrobiolo-

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gische Rennin inaktiviert werden. Vorzugsweise werden 35° C gehalten. Während dieser Zeit wird der pH-Wert Temperaturen von ungefähr 4 bis ungefähr 25° C an- des gesamten Gemisches durch Zugabe der oben angewandt, gegebenen Natiium-hydroxid Lösung auf 8,0 gehalten.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird Lipase Die gesamte Zeit in Sekunden und die gesamte Menge aus mikrobiologischem Rennin entfernt, so daß das 5 wäßriger 0,02 n-Natrium-hydroxid-Lösung, die zugewünschte Produkt ein günstig hohes Verhältnis gegeben wird, um einen pH-Wert von 8,0 aufrechtvon Milcbgerinnungsaktivität (clotting activity) zur zuerhalten, wird gemessen. Die Lipaseaktivität wird Lipase-Aktivität besitzt Die folgenden Verfahren dann folgendermaßen berechnet
wurden angewandt, um die Milchgerinnungsaktivität γ. -, ?qo

und die Lipase-Aktivität der ursprünglichen und der io Lipase-Einheiten = -—

gereinigten Substanzen zu bestimmen. T

Die Milchgerinnungsaktivität wurde auf folgende _{y = Natri}um-hydroxid-Volumen (cm"),

Weise bestimmt: Eine 10%ige (Gew./Vol.) wäßrige T=Zeitisec1

Lösung wurde durch Lösen der entsprechenden

Menge nicht fetter, trockener Milchbestandteile in 15 Die Enzymaktivität wird dann angegeben in Lipase-Wasser hergestellt. Zu dieser Lösung wurde dann einheiten (LE) pro cm³. Eine Lipaseeinheit ist definiert CaCl₂ · 2 H₂O zugegeben, bis zu einer Konzentration als die Enzymmenge, die erforderlich ist, um ein von 0,01m Calcium. Ein Anteil von 5 cm³ der obigen Mikromol Fettsäure pro Minute unter den angege-Milchlösung wurde in ein Reagenzglas gegeben und benen Bedingungen zu bilden. Das zur Aufrechtauf 37,S^:C erwärmt. 0,5 cm³ wäßriges verdünntes ao erhaltung des pH-Wertes zugegebene Natrium-hy-Enzym von 37,5° C wurden dann zu der Milchlösung droxid neutralisiert die gebildete Fettsäure und ist in dem Reagenzglas zugegeben. Die Enzym-Milch- ein Maß für die Bildung einer solchen Fettsäure, lösung wurde dann gerührt, und die Zeit bis zur Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele

ersten Ausflockung wurde gemessen. Die Enzym- näher erläutert,
konzentration wurde so gewählt, daß die Gerinnungs- »5 B e i s ρ i e 1 1

zeit ungefähr 4 Minuten betrug. Die Milchgerinnungs-

aktivität des Enzyms wurde wie folgt berechnet: Ein mikrobiologisches Labferment wurde herge-

. -Mnn r stellt, indem man eine Kultur von Mucor miehei

Soxhlet- ^M(cm > 2400 (see) ₁₀₀₀ NRRL 3420 in einem sterilisierten Medium züchtete,

Einheiten E(mg) Γ (see) 30 das in bekannter Weise aus Maisstärke, gemahlenem

M — Milchvolumen, Mais, Sojamehl, Calciumcarbonat und Wasser be-

E = Enzymgewicht, stand. Die entstehende Fermentationsbrühe wurde

T = Zeit bis zum ersten Ausflocken. dann von dem Mycel abfiltriert. Gleiche Mengen

dieses Filtrats, die jeweils 6,7 Lipaseeinheiten pro

Die Enzymaktivität wird dann in Soxhleteinheiten 35 cm³ enthielten, wurden bei Raumtemperatur mit (SE) pro Gramm ausgedrückt. Wenn das Enzym in Schwefelsäure vermischt, um einen pH-Wert von 5,5, der ursprünglichen flüssigen Form verwendet wird 5,0 bzw. 4,5 einzustellen. Die gebildeten Niederschläge und nicht als gelöstes pulvriges Enzym in Wasser, wurden jeweils getrennt abfiltriert. Die erhaltenen wird in der obigen Formel für E das entsprechende Filtrate enthielten 3,7, 2,6 bzw. 1,8 Lipaseeinheiten Volumen in mm³ μΐ eingesetzt, und die Enzymaktivität 40 pro cm³, was einer Lipase-Entfernung von 44,8, wird in Soxhleteinheiten pro cm³ angegeben. Eine 61,2 bzw. 73,1% entspricht. Das zeigt deutlich eine Soxhleteinheit gibt die Enzymmenge an, die 1 cm³ Entfernung der Lipase durch Einstellung des pH-der obigen Milchlösung in 40 Minuten zum Gerinnen Wertes "auf ungefähr 4 bis ungefähr 6.
bringen kann.

Die Lipaseaktivität wurde folgendermaßen be- 45 B e i s ρ i e 1 2

stimmt. Ein Reaktionsgemisch wurde hergestellt durch

Emulgieren von 15 cm³ Tributyrin in 135 ecm einer Einige 25-cm³-Anteile einer filtrierten Fermen-10%igen (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung von Gummi tationsbrühe, die der im Beispiel 1 beschriebenen arabicum. Die entstehende Tributyrinemulsion wurde ähnlich war und die jeweils 11,1 LE pro cm³ entdann mit 60 ecm einer wäßrigen 0,001m Lösung von 50 hielten, wurden einzeln mit Schwefelsäure behandelt, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-Puffer bei so daß sich verschiedene pH-Werte ergaben. Die geeinem pH-Wert von 8,0, 60 ecm einer wäßrigen 3,0m bildeten Niederschläge wurden abzentrifugiert und Natrium-chlorid-Lösung und 180 ecm destillierten die überstehenden Flüssigkeiten dekantiert. Die Nie-Wasser vermischt. 5 ecm des oben angegebenen Ge- derschläge wurden dann einzeln in 5 cm³ einer wäßmisches wurden auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt 55 rigen 0,01 m Phosphat-Puffer-Lösung mit einem und in den Reaktionsraum (reaction well) eines In- pH-Wert von 6,1 suspendiert. Die suspendierten strumentes gegeben, bei dem man eine ausreichende Niederschläge wurden auf ihre Lipase-Aktivität unter-Menge einer wäßrigen 0,02m Natrium-hydroxid-Lö- sucht, wobei man die folgenden Ergebnisse erhielt, sung zugeben kann, um den pH-Wert des Reaktions- T h 11 I
gemisches auf 8,0 zu halten. Das zu bestimmende 60 a e e LE/cm^a

Enzym wird, falls es ein Pulver ist, in einer wäßrigen * .,,

0,01m Lösung von Tris-(hydroxymethyl)-aminome- * '

than-HCl-Puffer von pH 8,0 gelöst. Wenn ein flüssiges *'° v!'.

Enzym bestimmt werden soll, wird es auf einen ' , '

pH-Wert von 8,0 eingestellt. 1 cm³ der flüssigen 65 j4 du,d

Enzymprobe wird zu den oben angegebenen 5 cm³ ' '

des Reaktionsgemisches zugegeben und das Reak- Diese Werte zeigen, daß bei einer Einstellung des

tionsgemisch mit dem Enzym 3 bis 4 Minuten auf pH-Wertes auf ungefähr 4,5 bis ungefähr 4,7 die

größte Menge an Lipaseaktivität entfernt wird, da die in diesem pH-Bereich gebildeten Niederschläge die größten Mengen an Lipase enthalten.

Beispiel 3

Eine mifeobiologische, renninhaltige Fermentationsbrühe wurde wie im Beispiel 1 beschrieben von Mucor miehei NRRL 3420 gebildet, anschließend filtriert und von dem Mycel entfernt. Dieses erste Filtrat enthielt 73 LE pro cm³ und hatte bezogen auf eine Standardlösung mit einer Milchgerinnungsstärke von 54 000 SE pro cm³. Es wurde Schwefelsäure zugegeben, um den pH-Wert auf 4,6 einzustellen. Der entstehende Niederschlag wurde über Diatomeeuerde abfiltriert, wobei man ein Filtrat erhielt, das 9,4 LE pro cm³ enthielt, bezogen auf eine Standardlösung mit einer Milchgerinnungsaktivität von 54 000 SE pro cm³. Dieses Filtrat wurde dann durch Eindampfen im Vakuum auf eine standartisierte Gerinnungsaktivität von 54 000 SE pro cm³ eingestellt und dann durch Filtrieren über Diatomeenerde weil« gereinigt. Dieses Endprodukt enthielt 2,4 LE pro cm³ und ein günstig hohes Verhältnis von Gerinnungsaktivität zu Lipaseaktivität von 22 500. Insgesamt waren 96,8 ⁰Z₀ der in dem Ausgangsmaterial enthaltenen Lipase durch dieses Verfahren entfernt worden.

Beispiel 4

Das Verfahren des Beispiels 3 wurde wiederholt, wobei man ein erstes Filtrat verwendete, das 34 LE pro cm³, bezogen auf eine Standard-Milchgerinnungslösung, besaß. Das Filtrat nach der Einstellung des pH-Wertes und dem Filtrieren enthielt 2,02LE pro cm³, bezogen auf die Standard-Gerinnungsstärke. Das Endprodukt nach dem Einengen und dem erneuten Filtrieren zur Reinigung enthielt keine nachweisbare Lipase.

Beispiel 5

Pasteurisierte, vollständige Milch wurde auf bekannte Weise mit einer Milchsäure Starter-Kultur und mit mikrobiologischem Rennin, das entsprechend dem Beispiel 1 bis 4 zur Entfernung der Lipaseaktivität behandelt worden war, behandelt. Die Milch gerann, und es wurde ein guter Quark erhalten. Aus diesem Quark wurde anschließend Kä.-e hergestellt, der nach einer entsprechenden Lagerung normal war und gute Eigenschaften besaß. Käse, der mit mikrobiologischem Rennin hergestellt worden war, das nicht wie oben beschrieben zur Entfernung der Lipase behandelt worden war, war nach einer ähnlichen Lagerung leicht ranzig.

Beispiel 6

Es wurde ein Keim-Medium hergestellt und in vier Teile aufgeteilt, die jeweils ein Gemisch aus 0,05 g eines oxoiden mycologischen Peptons, 1,0 g Dextrose, 420 mg einbasischem Natriumphosphat, 2,13 mg zweibasischem Natriumphosphat und 50 cm³ destilliertem Wasser darstellten. Jeder Anteil wurde dann in einen 250 cm³ Erlenmeyer-Kolben gegeben und sterilisiert.

ίο Die vier Kolben wurden dann getrennt beimpft mit Kulturen von Mucor pusillus NRRL 2543, Mucor miehei A 7772, Mucor miehei ATCC 16 457 und Macor miehei NRRL A 13 042 und 24 Stunden auf einem Kreiselschüttler mit einem Hub von 2,54 cm und einer Geschwindigkeit von 250 UpM inkubiert. Ein Wachstumsmedium wurde in vier Anteilen hergestellt, wovon jeder aus einem Gemisch aus 3,2 g Dextrose, 2,3 g Cudahy Pepton M, 193 mg einbasischem Na*.riumphosphat, 483 mg zweibasischem

ao Natriumphcsphat, 5,0 g gemahlenem, ganzem Mais, 40 mg bakterieller \-Amylase und 100 cm³ Leitungswasser bestand. Jeder Anteil wurde in einen 1-Liter-Erlenmeyer-Kolben gegeben und sterilisiert. Die vier Kolben wurden dann getrennt mit 2 ecm der oben

as angegebenen Impfkulturen beimpft und 6 Tage bei 37° C in einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung mit einem Hub von 5,08 cm und einer Frequenz von 232 Bewegungen pro Minute inkubiert.

Das Mycel wurde dann abfiltriert und die entstehenden Filtrate auf ihre Lipaseaktivität hin untersucht. 10 cm³ Anteile jedes Filtrats wurden mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 gebracht und anschließend zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert. Die entstehenden Filtrate wurden auf ein Volumen von 3 cm³ mit destilliertem Wasser aufgefüllt und ihre Lipase-Aktivität untersucht. Man erhielt die folgenden Ergebnisse :

40	Kultur	Tabelle II	Lipase-Einheiten im suspendierten Niederschlag 3 ecm	Prozentuale Entfernung der Lipase
45 2543 A 7772 16457 A13042	Lipase-Einheiten im ursprüng lichen Filtrat 10 ecm	4,8 12,0 3,6 17,7	44,4 21,5 34,0 27,9
10,8 55,8 10,6 63,5

D. ms ersieht man, daß das erfindungsgemäße Verfahren zur Entfernung von Lipase aus mikrobiologischen Labfermenten aus verschiedenen Quellen geeignet ist.

Claims (4)

von Lipase-Verunreinigungen aus mikrobiologischem Patentansprüche: Labferment, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den pH-Wert einer mikrobiologischen Rennin-

1. Verfahren zur Entfernung von Lipase-Ver- Lösung auf einen Wert von ungefähr 4 bis ungefähr 6 unreinigungen aus mikrobiologischen Labfermen- 5 einstellt und die mikrobiologische Rennin-Lösung ten, dadurch gekennzeichnet, daß von dem entstehenden, die Lipase-Aküvität enthalman den pH-Wert einer mikrobiologischen Rennin- tenden Niederschlag abtrennt.

Lösung auf einen Wert von ungefähr 4 bis un- Das als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße gefahr 6 einstellt und die Rennin-Lösung von Verfahren geeignete mikrobiologische Labfemient dem dabei entstehenden, die Lipaseaktivität ent- io bzw. Rennin kann nach bekannten Verfahren erhaltenden Niederschlag abtrennt, halten werden. Ein besonders geeignetes bekanntes

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- mikrobiologisches Rennin kann hergestellt werden, zeichnet, daß man den pH-Wert auf einen Wert indem man unter aeroben Bedingungen eine Kultur von ungefähr 4,5 bis ungefähr 4,7 einstellt. von Mucor miehei und besonders eine Kultur von

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch 15 Mucor miehei NRRL 3420 oder dessen Mutanten gekennzeichnet, daß man als Labferment ein von in einem Medium züchtet, das geeignete Nährstoffe Mucor miehei, besonders Mucor miehei NRRL enthält und dann das Enzym daraus gewinnen (deut-3420 oder dessen Mutanten, erzeugtes Ferment sehe Offenlegungsschrift 1 945 447).

verwendet. Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet zur

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch 30 Reinigung von mikrobiologischem Rennin in vergekennzeichnet, daß man die gereinigte, mikro- schiedenen Formen. Es kann in Form bekannter, biologische Rennin-Lösung einengt und nochmals ganzer wäßriger Kulturen oder Fermentationsbrühen filtriert. vorliegen. Es kann auch in Form einer trockenen

Substanz vorliegen, die dann in einem wäßrigen as Medium für das erfindungsgemäße Verfahren gelöst

wird. Die Konzentration an mikrobiologischem Rennin