DE2705878B2

DE2705878B2 - Beifuttermittel zur Förderung der Milchsekretion bei Tieren

Info

Publication number: DE2705878B2
Application number: DE2705878A
Authority: DE
Inventors: Minoru Murata; Naoyuki Tokio Unno; Mutsuyuki Yoshino
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1976-02-12
Filing date: 1977-02-11
Publication date: 1978-11-30
Also published as: DK60477A; US4144354A; AU2209977A; DE2705878A1; DE2705878C3; JPS5298171A; NZ183323A; JPS5832575B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Beifuttermittcl, nämlich ein Enzympräparat, mit dessen Hilfe die Milchsekretion bei Tieren, insbesondere von Kühen, erhöht werden kann.

Unter genetischen, ernährungswissenschaftlichen und tiermedizinischen Gesichtspunkten wurden in der Milchvichhaltung eine Reihe von Versuchen unternommen, die Milchsekretion und die Milchqualität zu erhöhen. Bei Tierzüchtern und Herstellern von Molkerciprodukten besteht aber immer noch das Bedürfnis nach einer weiteren Steigerung der Milchsekretion und einer Erhöhung der Milchqualität.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Bcifuttcrmittel zu schaffen, das die Aktivitäten von Ccllulasc, Laminarinase, Xylanase, Pectinase, Dextranase, Amylase und Protease aufweist und sich zur Förderung der Milchsekretion bei Tieren eignet. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß dieses Beifuttermittel beim Züchten von bestimmten Stämmen der Art Irpex lacteus anfällt. Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

In der modernen Tierhaltung werden Tieren mit einem Magen, wie Schweinen, Hühnern, Pferden und dergl., häufig Enzyme verabreicht, um die Tuttcrvcrwertung zu verbessern und die Verdauung zu fördern. Auch ist die Verwendung von Enzymen zur Herstellung von Molkcreiprodukten geläufig. Es wurde jedoch bisher noch nicht versucht, Tieren Enzyme zu verabfolgen, um die Milchsekretion zu erhöhen und außerdem die Milchqualität zu verbessern. Soweit ersichtlich, wird diese Aufgabe durch das Beifuttermittcl der Erfindung erstmals gelöst.

Die Menge der Milchausscheidung, der Anteil an Milchfett und festen Nichtfettbestandteilcn kann erhöht werden, wenn man den Tieren das crfindungsgcmäßc Beifuttermittel verabfolgt. Als Tiere kommen vor allem Kühe, Ziegen und Schafe in Frage.

Das Beifuttermiltrl der Erfindung läßt sich durch Züchten von Irpex lacteus NRRL 11063 und Irpex lacteus ATCC 20123 in einem festen oder flüssigen Medium erhalten.

Irpex lacteus NRRL 11063 wurde beim Northern Regional Research Laboratory, I8I5 North University Street, Pcoria, Illinois, 61604, V.St.A., hinterlegt. Der Stamm Irpex lacteus ATCC 20123 wurde bei der American Type Culture Collection, Rockvillc, Maryland, V.St.A., hinterlegt.

Die mikrobiologischen Eigenschaften der Stämme dicserGattungcn sind in »Genshoku Nippon Kinrui Zukan« (Enzyklopädie der japanischen Mikroorganismen), Bd. 1, 1957, Hrsg. Hoiku-sha, beschrieben.

Das Verfahren zur Züchtung von Basidiomycetcn ist

r> beispielsweise in Journal of Fermentation Technology, Japan, Bd. 50 (1972), S. 691 bis 697 beschrieben und dem Fachmann an sich geläufig.

Das BeifuUermittel wird im allgemeinen aus einer Enzymlösung hergestellt, die nach dem Entfernen der Zellen von der Gärbrühe erhalten worden ist Dazu bedient man sich herkömmlicher Verfahren zurReinigung von Enzymen, wie Fällung mit organischen Lösungsmitteln, Aussalzen, Eindampfen unter vermindertem Druck und Adsorption und Desorption an Ionenaustauschern.

Es können aber auch die nach der Züchtung im Medium erhaltenen Zellen, das Kulturfiitrat oder ähnliche Produkte direkt als Enzymquellc ohne weitere Behandlung verwendet werden.

Das nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltene Beifuttermittel weist folgende Enzymaktivitäten auf:

-" Enzym

Substrat

Aktivität

Cellulasc Filterpapier u/g 20 000-40000

Xylanase Xylan r/mg-Std. 1 600-3 400

-'"' Dextranase Dextrin r/mg-Sld. 10-120

Laminarinase Laminarin r/mg-Sld. 2 000-4 600

Amylasc Stärke u/mg 4-15

Protease Casein u/mg 2-20

"' Pectinase Pectin %/(),3 mg 26-81

r: Menge an reduziertem Zucker (wie Glucose), die innerhalb einer Stunde durch I mg des lin/yms gebildet wird.

Die im Patentanspruch genannten Fnzymakliviläten r. werden ausschließlich wie folgt bestimmt:

I. Messung der Cellulase-Aktiviläl

Verfahren
Verdünnte Enzymlösung¹)

<—— 2 Stücke Filterpapier⁵) L-Rcagcnzglas³)

4^ri I

Schütteln bei 40 C im Monod-Inkubator")

Messung der Zeil, die zum vollständigen Zerlall des Filterpapiers erforderlich ist (min)⁵)

¹J Verdünnte Knzymlösung: Kino entsprechende Menge der Probe wird in 0,1 m AcctutpulTcr vom pH-Wcrl4,5 gelöst, so daß die durchschnittliche Zcrl'allszeit etwa 60 Minuten beträgt, »ei der Verwendung einer lin/ymlösung mit einer _Vt Konzentration von 200 u/5 ml zerfällt das Filterpapier in 50 Minuten. Die l'ull'erlösungohne linzym wird als Kontrolle verwendet.

') Zum Messen der Cellulaseaktiviläl mittels der Zerlallsgcschwindigkeil von Filterpapier; Abmessungen I cm x I cm.

') L)-Reagenzglas: Innendurchmesser 17 bis IX mm, senkrechter Abschnitt 75 bis 76 mm hoch, horizontaler Abschnitt 150 mm lang.

") Monod-Inkubalor: 60SchüUelbewegunncn pro Minute mit einem Ausschlag von 4 cm.

^s) Durchschnittliche Zcrlallszcil: 5 Reagenzgläser mit den enl-•>^r> sprechenden Proben werden gleichzeitig dem Versuch unterworfen. Die längste und die kürzeste Zcrlalls/cit werden gestrichen, und aus den restlichen Zcrfalls/.citen wird der Mittelwert bestimmt.

Berechnung

Die Aktivität wird in Einheiten angegeben. 10000 Einheiten sind als die Enzymmenge definiert, die das Filterpapier innerhalb einer Minute vollständig zerfallen läßt. Die Aktivität wird nach nachstehender Gleichung berechnet:

..,.._,, . . 25 000 .. 1000

Aktivität (u/g) =

durchschnittliche Zcrfallszcit (min)

Probemenge in 5 ml der vcr- '" dünnten Enzymlösung (mg)

Zur Bestimmung der Aktivität einer Flüssigkeit wird zur Berechnung das Volumen in ml anstelle des Gc- η wichls in g herangezogen. Die Aktivität wird als u/ml angegeben.

11. Messung der Laminarinase-Aktivität

Verfahren
2,5prozcntigc Lösung von Laminarin in Wasser: 1 ml

0,1 m Acetalpuffer

vom pH-Wert 4,5 :3 ml _>->

verdünnte Enzym lösung: 1 ml')
Inkubationszeit bei 40 C: 60 min

I "'

Abbruch der Reaktion durch 5niinüliges Einlauchcn in siedendes Wasser

Bestimmung des reduzierenden /uckers in der
Reaklionslösung.

') Das lin/ryni wird in 0,1 in AceUilpufTcr vom pH-Wert 4,5 gelöst.

Zur Kontrolle wird anstelle dor verdünnten Enzymlösung Puller eingesetzt.

Berechnung

Die Enzymaktivität wird als die Menge (r) an reduziertem Zucker wiedergegeben, der innerhalb von 60 Minuten durch I mg Enzym gebildet wird.

V. Messung der Pcktinase-Aktivilat
Viskositäts-Dcprcssionsmethode

Verfahren
Ostwald-Viskosimeter

Acetatpuflcr vom pi I-Wcrt 4,5:2 ml

2prozcntigc Pcctinlösung: 2 ml¹)

lOminüligcs Vorerwärmen auf 40 C'^})

verdünnte Enzymlösung: 1 ml³l

Reduzierter
Zucker
in der
Reaktionslösung

Reduzierter
Zucker
in der
Konlrolllösung

Durch das Enzym reduzierter
Zucker in der
Reaktionslösung (r)

Nach Division durch die Enzymmenge in mg und durch die Zeit in Stunden, erhält man den Wert für die Enzymaklivität.

III. Messung der Dexlranasc-Aklivitiil

Das Verfahren und die Berechnung wird gemäß der Messung der Laminarinase-Aktivilät durchgeführt, wobei als Substrat eine 2,5prozcntige Dexlrinlösung in Wasser verwendet wird.

IV. Messung der Xylanase-Aktivitiil

Das Verfahren und die Berechnung wird gemäß der Messung der Laminarinasc-Aktivität durchgeführt, wobei eine 2,5prozcntigc Xylanlösung in Wasser als Substrat verwendet wird.

lüminütige Inkubation bei 40 C", anschließend Messung der Viskosität (see).

Berechnung

Die Aktivität wird wiedergegeben als die prozentuale Viskositätserniedrigung pro Einheilsmengc des verwendeten Enzyms.

Vo - Vi Vo - Vw

X 100% / verwendete Enzymnicnge;

Vo: Durchlau Γ/.eit (see) lur eine Flüssigkeit, die anstelle der

Hn/ymlösung vollenlsalztcs Wasser enthält.
Vv. I)urchlaul":-cil für eine Lösung, IO Minuten nach der

Zugabe der lin/.ymlösung.
Fit·: Durchlauf/eil lur vollcntsal/.tes Wasser.
¹I 2pro/entige l'eclinlösung in Wasser.
') /ur Viskositätsmessung muß großer Wert auf die Vor-

erwa'rmung gelegt werden.
³) Das Enzym wird in 0,1 ni Aeetalpufl'er vom pll-Wert 4,5 gelost.

Vl. Messung der Aniylase-Aktivilät

Die Messung der Amylase-Akliviliit ist in Method of Enzymatic Analysis, Bd. I (1974), S. 432, Academic Press, New York, beschrieben.

Testgemisch¹)

5minütigcs Erwärmen im siedenden Wasserbad

Abkühlen

Zugabe von 10,00 ml destilliertem Wasser

Ablesen der Extinktion bei 546 ηm (Quecksilbcrlinie) gegen einen Leerwert.

') 0,50ml Sliirkelösung (10mg Slärke/ml in 20milliniolarem l'hosphalpulTer vom pll-Wert 7,0 6,millimolnr NaCI)

0,4X ml destilliertes Wasser
0,02 ml Ιϊη/ymlösung in destilliertem Wasser
1,00ml Farhreagen/ (Ig 3,5-Dinilrosalicylsäure in 20ml 2 n-NaOII, .1Og Kaliumnatriumlartral, destilliertes Wasser auf 100 ml).

VII. Messung der Proteasc-Aktivität

Die Protease-Aktivität wird nach dem Cascin-Folin-Vcrlahren gemäß »KosoKcnkyu Method« (Verfahren in der En/ymforschung), Bd. 2 (1956), S. 237 bis 246, gemessen.

Das Bcil'uttermittel kann den Tieren direkt verabfolgt werden. Im allgemeinen wird es aber im Gemisch mit Futter gegeben.

Die wirksame Menge des zu verabfolgenden Bcifultermittcls besteht aus einer oder mehreren Kinhcilcn, bezogen auf die Ccllulusc-Aklivitäl, pro 1 g Trockenmasse des Futters. Am besten werden 2 bis 6 Hinhciten des Bcilullcrmittcls, bezogen auf die Ccllulasc-Aklivität, pro 1 g Futtcrlrockcnmassc, verwendet.

2 odcr3 Tage nach Beginn der Verabreichung beginnt die Milchsekretion zu steigen. Bei fortdauernder Vcrabfolgung des Beifuttermiltcls bleibt die hohe Milchsekretion iTrhaltcn. Dies gilt auch bis zu einem Zeitraum von 2 oder 3 Tagen nach dem Ende der Verabreichung. Demgemäß soll das Bcifuttermittel mindestens an 3 aufeinanderfolgenden Tagen verabfolgt werden.

Bei Vcrabfolgung des erfindungsgemäßen Beifuttermiltcls an Milchkühe steigt die Milchsekretion um 8 bis 12%, die Menge an festen Nichtfeltbestandteilen um etwa 3% und die Milchfettmenge um etwa 5%.

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Wirkung bei der Vcrabfolgung des erfindungsgemäßen Beifuttcrmittcls.

Versuch 1

Futter von gleichbleibender, feststehender Zusammensetzung (nachstehend als Standardfutter bezeieh-

net) wird während einer Vorbcreüungszeit von 10 Tagen an 10 Holstein-Milchkühe gegeben. Dabei werden pro Tier und Tag etwa 15 kg Trockenbcstandtcilc verfüttert, die sich aus 5 kg Grünfutier, 3 kg Stroh, 3 kg lleuwürfcl, 2 kg Rübenbrei, 7 kg Bohnen und Bohncnabfall, 5,5 kggcpreßlcüerslc, 1 kgWci.zcnkIeicund 1,5 kgSojabohncnmchl zusammensetzen. Die Menge an Milch, festen Nichtfettbestandteilen und Milchfett wird während dieser Zeit gemessen. Anschließend erhalten die Kühe 30 Tage lang das Standardfutter, das pro Tier und Tag mit 30 g Beifuttcrmittel mit einer Cellulasc-Aktivität von 1000 Einhcitcn/g vesetzt wird. Dieses Bcifutlcrmittel weist ferner folgende Enzymaktivitäten auf: Xylanasc 120 r/mg-Std., Dextranase 4 r/mg-Std., Laminarinasc 100 r/mg-Std., Amylase 0,5 u/mg. Protease 0,5 u/mg und Pectinasc 2,5 Prozent/0,3 mg. Auch während dieser Zeit wird die Menge an Milch, festen Nichtfcttbcslandteilcn und Milchfett gemessen. Anschließend erhalten die Tiere 20 Tage lang nur das Standardisier, wobei wieder Milch, Teste Nichtfettbcslandteile und Milchfett gemessen werden. Die Mittelwerte der während dieser Zeit ermittelten Werte sind in nachstehender Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I

Tage

Anzahl der Kühe Durchschnittliche
Milchleistung

Gehalt an festen

NiChUcIt-

bcstandlcilcn

Milchlctl-

gchalt

Vorbcrcitungszcil	10	IO	17,4 kg	8,40 %	3,20 %
Vcrabfolgung von Bcifultermiltcl	30	9*)	19,3 kg	8,60%	3,35 %
Restliche Beobachtungszeil	20	8**)	17,7 kg	8,45%	3,25 %

*) Durchschnitt aus 9 Kühen, da eine Kuh ausfiel.
**) Durchschnitt aus 8 Kühen, da bei einer Kuh Verdacht auf eine Erkrankung (Mastitis) bestund.

Versuch 2

15 Milchkühe mit einer unterdurchschnittlichen Milchleistung werden aus einer Gruppe von erwachsenen Holstcin-Wcidckühcn ausgewählt und in drei Gruppen von jeweils 5 Tieren dem nachstehenden Versuch unterworfen.

Die drei Gruppen Λ, B und C, die aus jeweils 5 Tieren bestehen, erhalten Futter und mit Bcifuttermittel angereichertes Futter nach dem in der Tabelle Il angegebenen Plan.

Tabelle II	Tage 1. - Tag	10.	11. - 25. Tag	26. - 40. Tag	41. - 55. Tag	56. - 70. Tag	71. -80 Tag
	A, B	,C	A B, C	A, B C	B, C - A	C A, B	A, B, C
Mit Beiruttermittel Ohne Beifuttermittel

Pro Tag und Tier werden etwa 13 kg Trockcnbeslandtcilc verfüttert, die sich aus 6,5 kg gepreßtem Hafer, 1,6 kg Weizenkleic, 3,9 kg MischfuUcr (Zcnraku Nr. 2), 2,1 kg Heuwürfel und 5 kg zerkleinertem Reisstroh zusammensetzen. Als Beifuttermittel dienen 30g des in Versuch 1 verwendeten Enzympräparats pro Tag Während des Versuchs werden die Kühe gruppenweise 2mul täglich jeweils morgens und abends gemolken. Die durchschnittliche Milchleistung (kg) und der durchschnittliche Milchfcttgehalt (%) pro Tier wird gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.

	7	- 10.	17.3	11.	27	- 25.	05	878	41.	8	19,6	C	17,8	A	- 70.	71.	- 80.
		Tag	(2,90)	Tag					Tag		(3,12)		(2,96)			Tag
Tabelle III	Tage		17,5						B		19,2			B
	1.		(2,90)	A		19,2*)				- 55. 56.	(3,14)				19,7
		17,4		(3,15)	26.	-40.	C	Tag					(3,17)
		(2,92)			Tag
Mit Beifuttermittel	A				A	19,5				A	17,4
			B	17,5		(3,17)			17,4		(2,92)
	B			(2,90)	B	19,3	A		(2,92) ,	B	17,6
			C	17,3		(3,10)		17,8		(3,04)
Ohne Beifuttermittel	C		(2,91)				(3,08)	C	17,5
									(3,02)
			C	17,4
				(2,92)

*) Die Zahlen in der oberen Reihe geben die Milchleistung in kg und die in runde Klammern gesetzten Zahlen in der unteren Reihe den Milchfettgehalt in % an.

Das nachstehende Beispiel erläutert die Herstellung eines Beifuttermittels der Erfindung.

Beispiel

Als Anzuchtstamm wird Irpex lacteus Nr. 82, (NRRL 11063) verwendet. Das Nährmedium enthält 40 g/ Liter Rohrzucker, 30 g/Liter lösliche Rückstände der Alkoholdestillation, 3 g/Liter pulverförmigen Hefeextrakt, 1 g/Liter KH₂PO₄ und 0,2 g/Liter MgSO₄ · 7H₂O. Der pH-Wert dieses ersten Nährmediums vor der Sterilisation beträgt 4,0. Der Anzuchtstamm wird mit einer Öse auf 30 ml des vorgenannten ersten Anzuchtmediums, das sich in einem 250-ml-Erlenmeyer-Kolben befindet, übergeimpft. Anschließend wird 4 Tage bei 30⁰C unter Schütteln gezüchtet. Sodann werden 30 ml der auf diese Weise erhaltenen ersten Anzuchtkultur auf 300 ml eines zweiten Anzuchtmediums übergeimpft, das sich in einem 2-Liter-Kolben befindet. Das zweite Anzuchtmedium hat die gleiche Zusammensetzung wie das erste Anzuchtmedium. Die zweite Züchtung wird 2 Tage bei 30°C unter Schütteln durchgeführt. Anschließend werden 300 ml der zweiten Anzuchtkultur auf 15 ml des Hauptmediums, das sich in einem 30 Liter fassenden Fermenter befindet, übergeimpft. Das Hauptmedium 2^r) enthält 20 g/Liter Cellulosepulver, 30 g/Liter Sojabohnenmehl, 5 g/Liter Trockenhefe, 5 g/Liter KH₂PO₄ und 0,5 g/Liter MgSO₄ · 7H₂O. Vor der Sterilisation beträgt der pH-Wert dieses Hauptmediums 4,0. Die Züchtung wird unter Belüftung und Rühren (Drehzahl 400 U/min, Belüftungsgeschwindigkeit 15 Liter/ min) 3 Tage bei 28°C durchgeführt.

Nach beendeter Züchtung wird die Cellulase-Aktivität des nach dem Abfiltrieren der Mikroorganismenzellen erhaltenen Kulturfiltrats zu 600 u/ml bestimmt.

10 Liter dieses Filtrats werden mit 6,5 kg Ammoniumsulfat versetzt. Der gebildete Niederschlag wird in Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit dem am Anmeldetag unter der Handelsbezeichnung Sephadex G-25 bekannten, mit Epichlorhydrin vernetzten Dextran behandelt. Nach dem Gefriertrocknen erhält man 150 g Beifuttermittel mit folgenden Enzymaktivitäten:

Cellulase

Xylanase

Laminarinase

Dextranase

Amylase

Protease

Pectinase

23000 u/g
2 800 r/mg-Std.
2300r/mg-Std.
80 r/mg/Std.
14 u/mg
9 u/mg
53 %/0,3 mg

Claims

Patentanspruch:

Beifuttermittel zur Förderung der Milchsekretion bei Tieren, dadurch gekennzeichnet, daß es ■-> aus 20000 bis 40 000 u/g Ccllulasc, 1600 bis 3400 r/mg-Std. Xylanase, 10 bis 120 r/mg-Std. Dextranase, 2000 bis 4600 r/mg-Std. Laminarinasc,4 bis 15 u/mg Amylase, 2 bis 20 u/mg Protease und 26 bis 81%/0,3mg Pecünase besteht und durch i< > Züchten von Irpex lacteus NRRL 11063 oder Irpex lacteus ATCC 20123 erhalten worden ist.