DE1767914C3

DE1767914C3 - Verfahren zur Isolierung von mikrobiell erzeugten hydrolytischen Enzymen

Info

Publication number: DE1767914C3
Application number: DE19681767914
Authority: DE
Inventors: Horst Dipl.-Chem.; Piesche Klaus Dipl.-Biol.; Schäfer Gerhardt Dipl.-Chem. Dr.-Ing.; χ 8122 Radebeul Töpfer
Original assignee: VEB Arzneimittelwerk Dresden, χ 8122 Radebeul
Filing date: 1968-07-01
Publication date: 1976-09-23

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von mikrobiell erzeugten hydrolytischen Enzymen aus Filtraten von biologischen Fermentationslösungen unter Verwendung einer Fällung mit Tannin.

Viele Mikroorganismen geben im Kulturverlauf hydrolysierende Enzyme (Hydrolasen) in das Kulturmedium ab.

Diese Hydrolasen sind in der Lage, verschiedene Proteine (wirksame Enzyme: Proteasen) und Polysaccharide (wirksame Enzyme: Amylasen und Cellulasen) zu spalten.

Dieser Wirkung verdanken wir eine vielfältige Anwendung in der Human- und Veterinärmedizin, in der Lebensmittelindustrie, in der Technik sowie in der Landwirtschaft.

Es werden z. B. Enzymkonzentrate aus Fermentationslösungen von Schimmelpilzen in Form von Tabletten und Dragees zur Therapie von Verdauungsinsuffizienzen eingesetzt. Im allgemeinen lassen sich auf den genannten Gebieten F.nzymrohprodukte verwenden.

Bekannt sind Verfahren zur Gewinnung von Hydrolasenkonzcniraten aus Fermcntaiionslösungcn durch Aussalzen, z. B. mit den Salzen Ammoniumsulfat, Natriumchlorid und Natriumsulfat. Die Hydrolasen, ihrer chemischen Natur nach Proleine, werden durch Zugabe eines entsprechenden Salze;; auf Sättigungswcrte von 20 bis 100% ausgefällt, abgetrennt und durch Dialysieren oder Behandeln mit Ionenaustauschern vom S:ilzübcrschulJ befreit.

Weiterhin ist bekannt, daß die Hydrolasen in mikrobiellen Kulturfiltraten durch Zugabe organischer, mit Wasser mischbarer Lösungsmittel, wie z. B. Äthanol oder Aceton, ausgefällt werden können. Zu diesem Zwecke wird im allgemeinen die wirkstoffhaltige Lösung mit dem 2- bis lOfachen Volumen an Lösungsmitteln versetzt und die entstehende Rohenzymfällung durch Waschen mit organischen Lösungsmittel zu einem Trockenpräparat aufgearbeitet.

Es ist auch bekannt, da3 Proteine, wie ζ. Β Enzyme, mit Tannin einen wasserunlöslichen Komplex bilden, aus welchem anschließend nach Entfernung der Tanninkomponente insbesondere mittels Aceton ein Enzymkonzentrat erhalten wird.

Der Enzymgewinnung aus biologischen Fermentationslösungen durch das Verfahren der Aussalzung haften verschiedene Mangel an. Dieses Verfahren ist auf Grund eines unverhältnismäßig hohen Verbrauchs an den jeweiligen Salzen für eine produktionsmäßige Enzymgewinnung unrentabel. Überdies ist in vielen Fällen ohne ein aufwendiges Konzentrieren dir Kulturfiltrate eine Wirkstoffausfällung auf Grund der geringen Enzymkonzentration nicht möglich. Weiterhin ist bei der Anwendung des Aussalzungsverfahrens für die Entfernung der im Enzymkonzentrat noch enthaltenen Salze durch umständliche Verfahren wie das Dialysieren oder Behandeln mit Ionenaustauschern Sorge zu tragen.

Auch die Gewinnung von Enzymen aus mikrobiologischen Fermentationslösungen mittels des Verfahrens der Ausfällung mit mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln wie Aceton und Alkohol ist mit einigen Mängeln behaftet. Vor allem sind bei technischer Gewinnung der Enzyme aus Kulturfiltraten zur Ausfällung große Mengen organischer Lösungsmittel notwendig, was wiederum den Einsatz großdimensionierter Fällgefäße voraussetzt sowie an die Schaffung entsprechender Sicherheitsvorrichtungen gebunden ist. In manchen Fällen gelingt eine Enzymausfällung mit organischen Lösungsmitteln überhaupt erst nach vorangegangener kostspieliger Konzentrierung.

Obwohl die bekannte Ausfällung von Enzymen aus biologischen Fermentationslösungen mit Tannin zu keiner nennenswerten Volumensteigerung führt, keine Entsalzung notwendig ist und Tannin ein leicht erhältliches, preiswertes Fällungsmittel darstellt, zeigt auch dieses Verfahren entscheidende Mangel. So kann in Kulturfiltraten trotz hohen Enzymgehaltes mit Tannin allein oft keine oder nur eine geringe Fällung er7^;elt werden.

Zweck der Erfindung war die Entwicklung eines Verfahrens zur rationellen Isolierung von hydrolytischen Enzymen aus biologischen Fermentationslösungen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, hydrolytische Enzyme aus biologischen Fermentationslösungen in technischem Maße auf wirtschaftliche Weise zu gewinnen.

Vor allem galt es Wege zu suchen, um bei der Behandlung von mikrobiellen Kulturfiltraten mit Tannin eine Ausfällung hydrolytischer Enzyme zu erreichen bzw. aufgetretene Ausfällung zu vervollständigen.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß eine Ausfällung von hydrolytische Enzyme enthaltenden Fraktionen mit Tannin entweder überhaupt erst ermöglicht oder daß diese Fällung vervollständigt wird, wenn die Filtrate der biologischen Fermentationslösungen ausreichende Mengen mit Tannin fällbaren Eiweißes enthal-

ten. Da einerseits die Mikroorganismen in der Fermentationslösung für die volle Funktion ihres Stoffwechsels Eiweiß metabolisieren und andererseits die Enzymeiweißkonzentration meistens Für das Zustandekommen einer Fällung im Filtrat nicht ausreicht, sind dem Filtrat solche Mengen löslichen, fällbaren Eiweißes zuzusetzen, daß im Kulturfiltrat durch Tannin eine vollständige Mitfällung der Enzyme erzielt wird.

In Abhängigkeit von der Höhe des Zusatzes an löslichem tanninfäilbarem Eiweiß gelingt es, die spezifische Aktivität der Enzympräparate bei nahezu gleichbleibender Ausbeute zu steuern.

Bei Gewinnung der für pharmazeutische Präparate oder für Zwecke der Lebensmittelveredlung zu verwendenden Enzyme eignen sich als Zusatz folgende Produkte besonders gut:

Casein. Milch, Trockenmilch, Molke, Gelatine, Oxygelatine, Peptone und pflanzliche Eiweiße wie z. B. Maisquellwasser (MQW).

Insbesondere für die Enzymgewinnung in technischem Maße eignen sich das in großen Mengen zur Verfugung stehende Maisquellwasser, das auch einen vergleichsweise niedrigen Preis aufweist.

Bei als Substanz vorliegenden Eiweißstoffen ist ein Zusatz von 0.5 bis 10,0 g pro Liter Fermentationslösung zweckmäßig. Bei Verwendung von Milch oder Molke als Eiweißstoff empfiehlt sich ein Zusatz von 50 bis 200 ml pro Liter Fermentationslösung. Bei Einsatz von Maisquellwasser mit. einem durchschnittlichen Gesamtstickstoffgehalt von 3% als Eiweißstoff sind 10 bis 100 ml jeweils pro Liter Fermentationslösung vorteilhaft. Erfolgt der Eiweißzusatz erfindungsgemäß zum Filtrat der Fermentationslösung, so ist der die Enzymfällung überhaupt erst ermöglichende oder diese Fällung vervollständigende Einfluß des Eiweißzusatzes signifikant. Vor der Fällung mit Tannin sollte der pH-Wert der vom Myzel befreiten eiweißhaltigen Fermentationslösung 5 bis 6 betragen und ist erforderlichenfalls mit Säure oder Lauge einzustellen.

Zu der so vorbehandelten Fermentationslösung wird anschließend Tanninlösung gegeben, wobei sich unlösliche Tannineiweißkomplexe mit hohem Enzymge'.ialt bilden, die sich nach mindestens 2 bis maximal 24 Stunden Standzeit mit bekannten Methoden abtrennen lassen. Eine Ausfällung der Enzyme aus den Filtraten der Fermentationslösung kommt auch dann zustande, wenn im Anschluß an die Zugabe der Tanninlösung der Eiweißzusatz erfolgt.

Es ist zweckmäßig, pro Liter Fermentationslösung 30 ml einer Tanninlösung, die 3 bis 5 g Tannin enthalten, zuzugeben.

Aus der abgetrennten Fällung ist das Tannin mittels bekannter Verfahren, z. B. durch mehrmaliges Ausrühren mit Azeton, zu entfernen.

Das vom Tannin befreite Enzymkonzentrat wird im Vakuum getrocknet.

Die Auswirkungen der Erfindung beziehen sich auf die Möglichkeit, Fermentauonslösungen von enzymbildenden Schimmelpilzen rationell aufzuarbeiten.

Diese Feststellung wird durch die Angaben der Tabellen 1 und 2 erläutert.

Tabelle 1: Protease-Isolierung aus einer Aspergillus-Kultur (Aspergillus ochraceus Nr. 1079, hinterlegt beim Institut für Mikrobiologie und Experimentelle Therapie in Jena unter Nr. IMET PA 126)

Vers.- Eiweiß- Tannin- Spez. AkL Ausbeute

Nr zusatz fällung CE/mg CE/1

Kultur-Filtrat

89/1	' ohne	4 g/l	0,773	170
89/11	1% MQW	4 g/l	0,736	1075
89/111	2% MQW	4 g/l	0,489	. 1175

ίο Diese Angaben beweisen, daß unter dem Einfluß eines Zusatzes von Maisquellwasser (MQW) in Höhe von 1% oder 2% gegenüber der nicht mit Eiweiß versetzten Probe ungefähr das 6- bis 7fache der Proteaseaktivität isolien werden kann.

Tabelle 2: Amylase-Isolierung aus einer Aspergillus-Kultur (Aspergillus niger Nr. 1194, hinterlegt beim Institut für Mikrobiologie und Experimentelle Therapie in Jena unter Nr. ΪΜΕΤ PA 127)

Vers.
Nr.

Eiweißzusat/

Spez. Akt.
AE/mg

Ausbeute
AE/I
Kultur-Filtrat

71/1
71/11

ohne
2% MQW

13,15
11,90

10 500
20 700

Die Werte veranschaulichen, daß mittels der Tanninfällung unter dem Zusatz von 2% MQW gegenüber der nicht mit Eiweiß versetzten Probe ungefähr die doppelte Amylaseaktivität isoliert werden kann.

Durch den erfindungsgemäßen Zusatz von Eiweißstoffen, die nicht für Stoffwechselprozesse verbraucht werden, ?.u biologischen Fermentationslösungen ist es möglich, das Tannin-Verfahren bei niedrigen Kosten universell zur vollständigen Enzymisolierung anzuwenden.

Die proteolytische Aktivität, au gedrückt in caseinolytischen Einheiten (CE), wurde nach einem modifizierten Verfahren der Kunilz-Methode bestimmt [J. Ges. Physiol.,30,291 (1947)].

Die amylolytische Aktivität, ausgedrückt in amylolytischen Einheiten (AE), wurde nach einem modifizierten Verfahren der Methode von Street und Close bestimmt [Clin.chim.Acta, 1,256(1956)].

Ausführungsbeispiel 1

5 Liter des Filtrates der Fermentationslösung eines Stammes von Aspergillus ochraceus Nr. 1079 (s. Tabelle 1) werden unter Rühren mit 100 ml Maisquellwasser versetzt. Diese Lösung ist mit 1 N Natronlauge auf pH 5,5 einzustellen. Anschließend wird zur Enzymauslallung eine Lösung von 20 g Tannin in 150 ml Wasser langsam unter leichtem Rühren zugegeben. Dabei flockt ein voluminöser Niederschlag aus, der nach 2 Stunden Standzeit bei Raumtemperatur nach Abhebern eines klaren Überstandes durch Zentrifugieren bei 5000 g gewonnen wird. Der erhaltene feuchte Niederschlag wird danach 3ma! 10 Minuten lang mit jeweils etwa 250 ml Aceton ausgerührt, um das Tannin aus dem Tanninenzymkomplex herauszulösen. Das acelonfeuchte Enzymkonzentrat trocknet man unter Vakuum bei Raumtemperatur und erhält 8,65 g Trockensubstanz mit einer spezifischen Aktivität von 0,81 CE/mg. Das entspricht einer Ausbeute von 1400 CE pro Liter Fcrmentalionslösung.

Ausführungsbeispiel 2

300 ml Kulturfiltrat eines Stammes von Aspergillus ochraceus Nr. 1079 (s. Tabelle 1) eingestellt mit 1 N Salzsäure auf pH 5,5, werden mit 600 mg Caseinpepton. gelöst in 7,5 ml Wasser, versetzt. Für die Proteasenfällung sind 9 ml einer Tanninlösung mit 1,2 gTannin unter leichtem Rühren zuzugeben, wobei der Tanninenzymkomplex dusflockt. Diese Fällung wird bei 5000 g abzentrifugiert und zur Entfernung des Tannins 4mal mit Aceton ausgerührt. Das erhaltene Produkt wird im Vakuum-Exsikkator getrocknet Man erhält 520 mg Protease mit der spezifischen Aktivität 0,58 CE pro mg. Das entspricht einer Ausbeute von 1005 CE/Liter.

Ausführungsbeispiel 3

1 Liter Kulturfiltrat eines amylasebildenden Stammes von Aspergillus niger Nr. 1194 (s. Tabelle 2) wird mit

20 ml Maisquellwasser versetzt und auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt. Die Amylase wird durch Zugabe von 30 ml Tanninlösung, enthaltend 4 g Tannin, ausgefällt und nach einer Standzeit von 2 Stunden bei Raumtemperatur durch 10 Minuten langes Zentrifugieren bei 6000 g isoliert. Aus dem unlöslichen Amylase-Tannin-Komplex ist das Tannin durch 5mnliges Ausrühren mit Aceton zu entfernen. Der tanninfreie Niederschlag wird Vakuum getrocknet und ergibt 1,34 g eines

im

Amylasekonzentrates mit einer spezifischen Aktivität von 11.2 A E/mg, was einer Ausbeute von 15 000 AE pro Liter Kuhurfiltrat entspricht.

Weitere Beispiele für die Vielseitigkeit des angegebenen Verfahrens zur Enzymisolierung und seine Überlegenheit gegenüber der Tanninfällung ohne den erfindungsgemäßen Zusatz von Eiweißstoffen gehen aus den nachfolgenden Tabellen hervor.

Tabelle 3: Protease-Isolierung aus Aspergillus-Kulturen (Aspergillus ochraceus Nr. 1079, s. Tabelle 1)

Vers.-Nr.

Eiweißzusatz

Spez. Akt.
CE/mg

Ausbeute

CE/1 Kultur-Filtrat

57/1

57/11

57/111

57/IV

57/V

57/Vl

57/VII

57/VI11

2,5% MQW
0,1% Caseinpepton
0,1 % Gelatine
0,1% Fleischpepton
0,1% Trockenvollmilch 5,0% Magermilch
5,0% Vollmilch
5,0% Molke

0,302
0,924
0,672
0,950
0,782
0,462
0,478
0,722

1650
1385
1765
1300
1355
1585
1550
1540

Während in der verwendeten Aspergillus-Kulturlö- 35 wurde, konnte mit den oben angegebenen Zusätzen sung ohne den erfindungsgemäßen Zusatz eines tierischer und pflanzlicher löslicher Proteine eine hohe Eiweißstoffes keine nennenswerte Ausfällung erzielt proteolytische Aktivität isoliert werden.

Tabelle 4: Protease-Isolierung aus Aspergillus-Kultur (Aspergillus ochraceus Nr. 1079, s. Tabelle 1) Steuerung des Reinheitsgrades

Vers.-	Eiweißzusatz	Spez. Akt.	Ausbeute
Nr.		CE/mg	CE/I Kultur-
			Filtrat
58/1	0,5% MQW	0,594	702
58/11	1,0% MQW	0,510	1104
58/111	2,0% MQW	0,380	1310
58/IV	2,5% MQW	0,25'4	1125

Weiterhin gelingt es, die spezifische Aktivität der Enzymkonzentrate durch eine Variierung in der Höhe des Eiweißzusatzes zu steuern. Dabei ist zu beachten, daß Zusätze von weniger als 1% an Maisquellwasser zu größeren Wirkstoffverlusten, gemessen am Zusatz von 1 % Maisquellwasser, führen.

Tabelle 5: Protease-Isolierung aus Aspergillus-Kultur (Aspergillus ochraceus Nr. 1079, s. Tabelle 1) Reihenfolge der Zugabe von Tannin und Eiweiß

Vers-Nr.

Reihenfolge der Zugabe I. 2.

Spez. Akt.
CE/mg

Ausbeute

CE/I Kultur-Filtrat

54/1	2,5% MQW	Tannin	0,263	1170
54/111	Tannin	2,5% MQW	0,252	1015
54/IV	Tannin	_	0,593	266

Für eine vollständige Enzymausfällung ist der Eiweißzusatz unabdingbare Voraussetzung, der Zeitpunkt der Zugabe des Eiweißes spielt dabei keine Rolle. In der Tabelle kommt auch zum Ausdruck, daß bei Umstellung der Reihenfolge der Zugabe des Maisquellwassers zum Kulturfiltrat, also vor oder nach Tanninzusatz, nur unwesentlich differierende Enzymausbeuten erzielt werden.

Claims

β:. Patenti :isprüche:

1. Verfahren zur Isolierung von mikrobiell erzeugten hydrolytischen Enzymen aus Filtraten von biologischen Fermentationslösungen unter Verwendung einer Fällung mit Tannin, dadurch gekennzeichnet, daß man die Filtrate mit solchen Mengen löslichen, fällbaren Eiweißes versetzt, daß durch Tannin eine Mitfällung der Enzyme überhaupt erst erreicht oder diese Fällung der Enzyme vervollständigt wird, wobei man nach Bedarf durch Veränderung der Höhe des Eiweißzusatzes die spezifische Aktivität der zu isolierenden Enzyme einstellt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß /um Zwecke der vollständigen Mitfällung der Enzyme durch Tannin als Eiweißstoffe Casein, Milch, Trockenmilch, Molke, Peptone, Gelatine und Oxygelatine als tierische Eiweißstoffe sowie Maisquellwasser als pflanzliches Eiweiß ein/ein oder im Gemisch zugesetzt werden.

3. Verfahren nach den Ansprüchen i und 2. dadurch gekennzeichnet, daß man bei als Substanz vorliegenden Eiweißstoffen einen Zusatz, von 0,5 bis 10,0 g, beim Einsatz von Milch oder Molke als Eiweißstoffe einen Zusatz von 50 bis 200 ml und beim Linsatz von Maisquellwasser mit einem durchschnittlichen Stickstoffgehalt von 3% als Eiweißstoff einen Zusatz von 10 bis K)OmI, jeweils pro Liter Fermentalionslösung. verwendet.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fihrate zunächst mit Tannin und anschließend mit dem Eiweiß versetzt.

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