DE2116791A1

DE2116791A1 - Verfahren zur Herstellung von körnigen Enzympräparaten

Info

Publication number: DE2116791A1
Application number: DE19712116791
Authority: DE
Inventors: Shinpei Hyogo; Goto Jisaku Osaka; Katagiri Kiyoshi; Nakatani Hiromi; Kyoto; Minato (Japan)
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1970-04-08
Filing date: 1971-04-06
Publication date: 1971-10-21
Also published as: US3798128A; CH542921A; JPS4946073B1; DK129132C; DK129132B; NL7104715A; FR2089342A5; GB1352432A; SE362092B; BE765507A

Description

PATENTANWÄLTE

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHÖNWALD DR.-tNG. TH. MEYER DR. FUES DIPL-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL.-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH

KÖLN 1, DEICHMANNHAUS.

Köln, den 2.4.1971 Kl/Ax

Takeda Chemical Industries, Ltd.,

27? Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan).

Verfahren zur Herstellung von körnigen Enzympräparaten

Das übliche Verfahren zur Herstellung von körnigen Enzympräparaten besteht darin, daß man ein pulverförmiges Enzym mit einem festen Träger mischt, das Gemisch beispielsweise mit Wasser benetzt, das feuchte Gemisch mechanisch granuliert oder klassiert und das Granulat abschließend trocknet.

Dieses übliche Verfahren zur Verarbeitung von Pulvern eignet sich jedoch nicht zu einer vollständigen Mechanisierung oder automatischen Verfahrensregelung, sondern hängt in gewissem Maße vom Handbetrieb ab. Ferner sind gewisse Enzyme, z_oB. Protease und Lipase, für den menschlichen Körper ziemlich schädlich, so daß ihre Verarbeitung zum Schutz des Personals gegen nachteilige Einflüsse des Enzyms kostspielige Hilfsvorrichtungen für pneumatische Evakuierung, Ventilation und andere hygienische Vorkehrungen erfordert. Außerdem eignen sich selbst beim Mischen eines solchen pulverförmigen Enzyms mit einem festen Träger und bei der Granulierung des Gemisches die Pulver nicht ohne weiteres für einen kontinuierlichen quantitativen Betrieb. Dies hat zur Folge, daß das endgültige Granulat zwangsläufig den Nachteil mehr oder weniger starker Qualitätsschwankungen beispiels-

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weise in Bezug auf Größe des Granulats und Verteilung der Wirksamkeit aufweist;

Me vorstehend genannten Nachteile werden durch die Erfindung "behoben. Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung Von körnigen Enzympräparaten nach einem Verfahren, bei dem man eine wässrige Lösung, die sowohl ein Enzym als auch ein wasserlösliches Salz enthält, mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel mischt, das gebildete Sediment isoliert und trocknete

Das Verfahren gemäß der Erfindung ist für die verschiedensten Enzyme geeignet, ZoB_o für Protease wie Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Catepsin, Papain, Bromelin, Ficin, bakterielle Protease, Pilzprotease und Hefeprotease, Amylase, Lipase, Cellulase, Lysozym und Urease. Das Verfahren kann auch erfolgreich zur Granulierung von Alkaliprotease, die in neuerer Zeit die Aufmerksamkeit als Enzym für Waschmittel auf sich gezogen hat, angewandt werden.

Als wasserlösliche Salze eignen sich für das Verfahren gemäß der Erfindung beispielsweise die verschiedenen anorganischen Salze einschließlich der Phosphate wie Natriumtripolyphosphat, Ealiumtripolyphosphat und Natriumpyrophosphat, Sulfate wie Natriumsulfat, Kaliumsulfat und Ammoniumsulfat, Carbonate wie Natriumcarbonat und Kaliumcarbonat, Bicarbonate wie Natriumbicarbonat und Kaliumbicarbonat, Alkalihalogenide wie Natriumchlorid und Kaliumbromid ., Nitrate wie Natriumnitrat und Ammoniumnitrat, Borate wie Natriumborat, Kaliumborat und Borax sowie die verschiedenen organischen Salze einschließlich Natriummonoglutamat, Natriumdiglutamat, Natriumciträt, Natriumascorbat, Calciumascorbat und Natriumacetat,, Außer den vorstehend genannten Salzen sind beliebige andere Salze geeignet, vorausgesetzt, daß sie wasserlöslich sind und die Aktivität und Stabilität des jeweils verarbeiteten Enzyms nicht beeinträchtigen,. Die

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Salze können ferner allein oder als Gemisch, z.B» als Pufferlösung, verwendet werden»

Die gemäß der Erfindung verwendete wässrige Lösung des Enzyms und des Salzes kann nach beliebigen Verfahren hergestellt werden, z.B. nach einem Verfahren, bei dem man das Enzym und das Salz getrennt in Wasser löst und die erhaltenen Lösungen mischt, ferner nach einem Verfahren, bei dem man eine konzentrierte Lösung des Salzes herstellt und dann eine bestimmte Menge des Enzyms in der Lösung löst oder dispergiert, oder nach einem Verfahren, bei dem das Salz in einer vorher hergestellten Lösung des Enzyms gelöst wird. Die Enzymlösung kann die Bestandteile des Kulturmediums, das zur Herstellung des Enzyms verwendet wird, ZoB. Polysaccharide und lösliche Stärke, sowie die zur p_H—Einstellung verwendeten organischen oder anorganischen Salze enthaltene Ein Bindemittel, z.B. lösliche Stärke oder Natriumcarboxymethylcellulose, kann der Enzymlösung ebenfalls zugesetzt werden. Die wässrige Lösung enthält das Enzym gewöhnlich in einer Konzentration von 5 bis 155», vorzugsweise 5 bis 10$, und das Salz in einer Konzentration von 5 bis 50$, vorzugsweise 30 bis 50$. Die Konzentrationen werden vorzugsweise möglichst hoch, doh. so gewählt, daß sie möglichst dicht bei den jeweiligen Sättigungspunkten liegen. Das Verhältnis des Enzyms zum Salz im Rahmen der Erfindung hängt von der Aktivität oder den Enzymeinheiten ab, die im endgültigen granulierten Enzympräparat gewünscht werden. Im allgemeinen liegt das Verhältnis im Bereich von 1s3 bis 1:10»

Als organische Lösungsmittel können für die Zwecke der Erfindung beliebige hydrophile Lösungsmittel verwendet werden. Für alle praktischen Zwecke können jedoch Alkohole, z.B. Methanol und Äthanol, niedere Ketone, z.B. Aceton, oder beliebige Gemische dieser Lösungsmittel verwendet werden.

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Die zur Vermischung mit der wässrigen Lösung des Enzyms und des Salzes verwendete Menge des organischen Lösungs-• mittels liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 10 Raumteilen, vorzugsweise etwa 2 bis 5 Raumteilen pro Raumteil der wässrigen Lösung, jedoch kann sie "beliebig - in Abhängigkeit von der gewünschten Korngrößenverteilung und dem spezifischen Volumen des körnigen Enzympräparats gewählt werden»

Zur Herstellung der körnigen Enzympräparate gemäß der Erfindung wird die wässrige Lösung des Enzyms und des

^ Salzes mit dem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel vorzugsweise unter Rühren gemischt. Das Gemisch kann mit einer Geschwindigkeit des Rührers von 50 bis 12000 UpM etwa 1 bis 10 Minuten gerührt werden, wenn ein Becherglas mit einem Passungsvermögen von beispielsweise 1 1 verwendet wird_o Bei Verwendung eines großen Tanks ist eine UmdrehungBgeschwindigkeit, die mit einem vergleichbaren Rühreffekt im Einklang ist, erwünscht. Die Temperatur während des Rührens kann im Bereich von 5°bis 4O⁰C liegen und beträgt vorzugsweise 15°bis 25. C. Zur Vermischung der Lösung des Enzyms und des Salzes mit dem organischen Lösungsmittel kann das Lösungsmittel in die Lösung gegossen oder der Lösung tropfenweise zugesetzt

ψ werden,, Es ist auch möglich, die Lösung dem organischen Lösungsmittel tropfenweise zuzusetzen oder in das organische Lösungsmittel zu gießen«, Die Korngrößenverteilung und, das spezifische Volumen des körnigen Enzympräparats können nach. Belieben durch Einstellung der Temperatur, der Konzentrationen der Lösung, des Volumens des Lösungsmittels und der Rührgeschwindigkeit geregelt werden» Wenn beispielsweise das Enzympräparat bei niedriger Temperatur und hohen Konzentrationen mit einem großen Lösungsmittelvolumen und mit hoher Rührgeschwindigkeit hergestellt wird, ist die Korngröße des Granulats verhältnismäßig klein.

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Das nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren ausgefällte Enzymgranulat kann nach an sich "bekannten Verfahren, z.B. durch Zentrifugieren oder Filtration, isoliert werden. Das Granulat wird dann mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel wie Methanol, Äthanol oder Aceton gewaschen und getrocknet„ Die Trocknung des Granulats erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von nicht mehr als 50⁰G, jedoch kann auch bei höheren Temperaturen, bis zu 70⁰C getrocknet werden, wenn unter Vakuum gearbeitet wird.

Da beim Verfahren gemäß der Erfindung der gesamte Granulierungsprozess in einer Lösungsmittelphase stattfindet, besteht keine Gefahr einer Schädigung des menschlichen Körpers durch Staub und Enzymteilcheno Da außerdem sowohl bei der Vermischung als auch bei der Granulierung nur Flüssigkeiten gehandhabt werden, ist das Verfahren leicht zu kontrollieren und zu regulieren, d.h. es erfordert weniger Hilfseinrichtungen und ermöglicht größere Einsparungen in Bezug auf erforderliche Arbeitskräfte.

Das nach dem Verfahren gemäß der Erfindung herstellbare, aus dem Enzym und dem Salz bestehende Granulat hat ein sehr großes spezifisches Volumen und eine Korngröße zwischen 0,074 und 3,36 mm. Bei dem erfindungsgemäß herstellbaren Granulat ist das Mengenverhältnis von Enzym und Salz in jedem Korn im wesentlichen identisch unabhängig von der Größe jedes Korns. Demgemäß ist kein wesentlicher Unterschied in der enzymatischen Aktivität selbst zwischen Granulat unterschiedlicher Größe festzustellen. Außerdem ist jedes Granulat so stabil, daß es selbst bei längerer Lagerung bei Raumtemperatur keine Reduzierung an Enzymeinheiten erleidet ο

In den nachstehend beschriebenen Versuchen und Beispielen verhalten sich Gewichtsteile zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter. Die Abkürzung "PE/ml" bedeutet Proteaseeinheiten/ml.

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Versuch

Die in den folgenden Beispielen verwendete Protease wird in der nachstehend beschriebenen Weise hergestellt«

500 Raurateile eines flüssigen Mediums, das 5$ entfettetes Sojabohnenmehl, 5?» Glucose' und 2°/> Natriumdihydrogenphosphat enthält und auf pg 7 eingestellt ist, wird in einen Permenter gegeben, der ein Fassungsvermögen von 2000 Raumteilen hat,,sterilisiert und mit Fusarium sp.S-19-5 (IPO 8884) geimpft, worauf zur Herstellung einer Impfkultur 5 Tage bei 28⁰C unter Belüftung und Bewegung bebrütet wird.

Mit der Kultur werden 30000 Raumteile eines flüssigen Mediums der oben genannten Zusammensetzung in einen Permenter geimpft, der ein Fassungsvermögen von 50000 Raumteilen hat, worauf 144 Stunden bei 25°C unter Belüftung mit 45OOO Raumteilen/Minute bebrütet wird, während mit 500 UpM gerührt wird. Während der Bebrütung wird die Schaumbildung verhindert, indem von Zeit zu Zeit Sojabohnenöl in geeigneter Menge zugesetzt wird. Die Änderung des ρττ-Wertes und der Protease-Aktivität im Verlauf der Kultivierung ist in der folgenden Tabelle angegeben.

Kultivierungsdauer	P₁,-Wert der Kultur	7,30	Enzym-Aktivität,
Stunden	il	6,40	PE/ml
0 .	6,30	—
18	6,12	67
30	6,35	141
42	6,72	1430
54	7,3.0	2250
66	7,09	2270
78	7,50	2520
90	7,50	2520
122	2760
144	2540

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Die nach 144 Stunden erhaltene Kultur wird auf etwa 5 C gekühlt und dann durch eine Filterpresse unter Verwendung eines Filterhilfsmittels der Handelsbezeichnung "Hyflo Super-Cel" (Hersteller Johns-Manville Products Corp., USA) geleitet, wodurch das Mycel entfernt wird. Zu den erhaltenen 20000 Raumteilen des Filtrats wird Ammoniumsulfat bis zu 60$iger Sättigung gegeben. Die ausgesalzte Fällung wird mit.dem Filterhilfsmittel abfiltriert. Die erhaltene Ammoniumsulfatfällung, die das Filterhilfsmittel enthält, wird in etwa 6000 Raumteilen kalten Wassers gelöst. Unlösliche Stoffe werden abfiltriert. Dann wird 0,6-gesättigtes Ammoniumsulfat zum FiI-trat gegeben, wodurch das Enzym erneut ausgefällt wird. Das Enzym wird durch Zentrifugieren isoliert, in 1000 Raumteilen kaltem V/asser gelöst, mit Hilfe einer Fisch-•^hautmembran 4 Tage gegen kaltes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet, wobei ein rohes Enzympulver von bräunlicher Farbe erhalten wird. Die in dieser V/eise erhaltene Protease war im p_H-Bereieh von 8,0 bi3 12,0, insbesondere 10,0 bis 11,5, wirksam.

Beispiel 1

500 Raumteile einer wässrigen Lösung, die 100 Gew.-Teile Protease (71300 PE/ml) enthält, werden mit einer Lösung von 500 Gewo-Teilen Natriumsulfat (wasserfrei) in 2000 Räumt eilen V/asser (37⁰G) gemischt» Während die Temperatur des Gemisches bei 2O⁰Ms 25⁰C gehalten wird, werden 5000 Raumteile Aceton unter Rühren mit 300 UpM zugesetzt. Das Gemisch wird weitere 3 Minuten bei der gleichen Temperatur gerührt und dann einige Zeit stehen gelassen, wobei sich ein Granulat abscheidet. Das Gemisch wird zur Isolierung des Granulats zentrifugiert. Das Granulat wird mit 5000 Raumteilen Aceton gut gewaschen und unter vermindertem Druck bei 35°C getrocknet. Hierbei werden 566 Gew.-Teile eines körnigen Enzympräparats erhalten, dessen Eigenschaften in der Tabelle am Schluß der Beschreibung genannt sind. Während des vorstehend beschrie-

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benen Verfahrens tritt praktisch keine Reduzierung an-Enzymeinheiten ein. - ■ ~ .

Beispiel 2

500 Raumteile einer wässrigen Lösung, die 100 Gew.-Teile Protease (48500 PE/ml) enthält, wird mit einer Lösung von 500 Gew.-Teilen Natriumtripolyphosphat (wasserfrei) in 2000 Raumteilen heißem V/asser (8O⁰C) gemischt. Während das Gemisch unter Rühren (300 UpM) bei 25^i?bis 4O⁰C gehalten wird, werden 5000 Raumteile Äthanol zugesetzt. Das Gemisch wird weitere 3 Minuten bei der gleichen Tem-™ peratur "gerührt und etwa 1 Minute stehen gelassen, wobei sich ein Granulat, abscheidet. Das von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennte Granulat wird mit 2500 Raumteilen Aceton gewaschen und unter vermindertem Druck bei 60 C getrocknet. Hierbei werden 758 Gew.-Teile eines körnigen Enzympräparats erhalten.

Beispiel 3

500 Raumteile einer wässrigen Lösung von 100 Gew.-Teilen Protease (61300 PE/ml) werden mit einer Lösung von - 680 Gewo-Teilen Borax (Hydrat mit 10 Mol Wasser) in

2000 Raumteilen heißem V/asser (80⁰C) gemischt. Während das w Gemisch unter Rühren (200 UpM) bei 30°bis 40°C gehalten wird, werden 5000 Raumteile Aceton zugesetzt«

Das Gemisch wird weitere 3 Minuten bei der gleichen Temperatur gerührt und dann einige Zeit stehen gelassen, wobei sich ein Granulat abscheidet. Das von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennte Granulat wird zweimal mit je 2500 Raumteilen Aceton gewaschen und in einem Luftstrom bei 40 C getrocknet. Hierbei werden 591 Gew_o-Teile eines körnigen Enzympräparats erhalten» Während des vorstehend beschriebenen Verfahrens tritt praktisch keine Reduzierung der Enzymeinheiten ein«

wrv..-.109843/1 282

_ 9 —

Beispiel 4

500 Raurate ile einer wässrigen Lösung, die 100 Gew.-Teile Protease (36800 PE/ml) enthält, werden mit einer wässrigen Lösung von 500 Raumteilen Natriumtripolyphosphat in 2000 Raumteilen heißem Wasser (8O⁰C) gemischte Das Gemisch wird bei 30⁰Ms 40⁰G in 5000 Raumteile Methanol gegossen, während mit 300 UpM gerührt wirdo Das Gemisch wird weitere 3 Minuten bei der gleichen Temperatur gerührt und dann einige Zeit stehen gelassen, wobei sich ein Granulat abscheidet» Das Granulat wird abfiltriert und mit 5000 Raumteilen Aceton gewaschen und dann unter vermindertem Druck bei 35 G getrocknet. Hierbei werden 640 Gew.-Teile eines körnigen Enzympräparats erhalten.

Beispiel 5

500 Raumteile einer wässrigen Lösung von 100 Gew„-Teilen gereinigter Protease (143000 PE/ml) werden mit einer Lösung von 500 Gew.-Teilen Natriumsulfat (wasserfrei) in 2000 Raumteilen lauwarmem Wasser gemischt. Während das Gemisch unter Rühren mit 300 UpM bei 30^Dbis 40⁰C gehalten wird, werden 5000 Raumteile Aceton zugesetzt. Das Gemisch wird weitere 3 Minuten bei der gleichen Tempera-, tür gerührt und dann einige Zeit stehen gelassen, wobei sich ein Granulat abscheidet» Das Granulat wird durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Aceton gewaschen und unter vermindertem Druck bei 40⁰C getrocknet„ Hierbei wird ein Granulat erhalten, dessen Eigenschaften in der Tabelle am Schluß der Beschreibung genannt sind. Während des vorstehend beschriebenen Verfahrens tritt im wesentlichen keine Reduzierung der Enzymeinheiten ein.

Beispiel 6

50 Raumteile einer wässrigen Lösung von 10 Gew„-Teilen Protease (58000 PE/ml) werden mit einer Lösung von 57 Gew.-Teilen Natriumeitrat (Hydrat mit 2 Mol Wasser) in 150 Raumteilen Wasser gemischt. Das Gemisch wird tropfenweise zu 500 Raumteilen Aceton bei 30-4O⁰C gegeben,.

109843/1282 ,.

-1Q-

während mit 500 UpM .gerührt wird* Das Gemisch wird veitere 3 Minuten gerührt und dann einige Zeit stehen gelassen, wobei sich ein Granulat abscheidet. Die überstehende Flüssigkeit wird durch Dekantieren entfernt. Das Granulat wird mit 250 Raumzellen Aceton g-ewaschen und unter vermindertem Druck bei 40⁰G getrocl
61 Gew„-Teile Granulat erhalten,

mindertem Druck bei 40⁰G getrocknet. Hierbei werden

Ergebnisse	d	er	in	den	Beispielen	bes	chrietenen	Vers u	ehe
Beispiel					1 2	3	4- 5		6

Spezifisches Volumen

»des rohen Produkts, 3,75 1,9 2,70 2,2 3,15 2,50 ml/g

p_w-Wert (0,1j6ige

L&sung) 6,8 9,3 '9,0 9,3 6,8 7,12

Enzymeinheiten

(PE/mg) 63 28,8 51,4 23 161 48

Ausbeute, bezogen

auf Enzymeinheiten,# 100 90 98 80 100 100 Korngrößenverteilung

0,074-3,36 mm . 100 100 100 100 100 100

0,175-1,397 mm 92 62 62 .64 91 . 67

Größtes Korn,, mm 0,42 0,81 1,0 0,81 0,5 1,0

Feuchtigkeitsgehalt,

#■ 2,5 17 21,4 19 3,8 19

BADOBiGINAL 109843/1282

Claims

Patentansprüche

1) Verfahren zur Herstellung Von"3cörnigen Enzympräparaten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wässrige Lösung, die etwa 5 his 15$ Enzym und etwa 5 "bis 50$ eines wasserlöslichen Salzes enthält, mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel in einem Volumenverhältnis von 1:1 bis 1:10 "bei einer Temperatur von etwa 5°"bis 4O⁰C unter Rühren mischt und das gebildete Granulat isoliert und trocknet.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wässrige Lösung verwendet., die etwa 5 bis 10$ Enzym und etwa 30 bis 50$ wasserlösliches Salz enthält, und das Verhältnis von wässriger Lösung zu hydrophilem organischen Lösungsmittel 1 :2 bis 1:5 beträgt ο

3) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym Alkaliprotease und als Salz Natriumsulfat verwendet wird.

Ό Verfahren nach- Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wässrige Lösung, die etwa 5 bis einer durch Fermentation von Fusarium sp. S-19-5 (IFO 8884) erhaltenen Alkaliprotease und etwa 30 bis 50$ eines wasserlöslichen Salzes enthält, mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel in einem Volumenverhältnis von etwa 1:2 bis 1:5-mischt.

BAD ORIGINAL

1098Λ3/Τ282