DE1293105B - Verfahren zur Reinigung und Gewinnung von transglucosidaseinaktiven Pilzamylasen enthaltende Zubereitungen - Google Patents

Verfahren zur Reinigung und Gewinnung von transglucosidaseinaktiven Pilzamylasen enthaltende Zubereitungen

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DE1293105B
DE1293105B DEC25612A DEC0025612A DE1293105B DE 1293105 B DE1293105 B DE 1293105B DE C25612 A DEC25612 A DE C25612A DE C0025612 A DEC0025612 A DE C0025612A DE 1293105 B DE1293105 B DE 1293105B
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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und Gewinnung von transglucosidaseinaktiven Pilzamylasen enthaltenden Zubereitungen.
  • Durch Organismen der Aspergillus-niger- und Aspergillus-flavus-oryzae-Gruppen hergestellte Amylasezubereitungen finden ausgedehnte Verwendung in der Industrie, z. B. bei der enzymatischen Verzuckerung teilweise hydrolysierter Stärke zwecks Gewinnung Dextrose enthaltender Sirupe. Die Erfahrung hat jedoch gezeigt, daß die Bildung unvergärbarer Dextrosepolymeren ausreicht, um die Brauchbarkeit derartiger Zubereitungen zu begrenzen, insbesondere bei Verfahren zur Herstellung reiner kristalliner Dextrose.
  • Amylasezubereitungen mikrobiologischen Ursprungs, insbesondere diejenigen Zubereitungen, die durch Organismen der Aspergillus-niger- und Aspergillus-flavus-oryzae-Gruppen erhalten werden, besitzen drei Hauptarten enzymatischer Aktivität, die die Hydrolyse der rx-1,4-gebundenen Glucosepolymeren betrifft. Diese drei Aktivitätsarten können als x-Amylaseaktivität, Glucamylase-(maltase)-Aktivität und als Transglucosidaseaktivität bezeichnet werden.
  • Die a-Amylasewirkung auf Stärkepasten führt zu einer erheblichen Viskositätsverringerung. Wenn keine merkliche Glucamylase-(maltase)-Aktivität vorliegt, werden durch die a-Amylasewirkung erhebliche Maltosemengen ausgebildet.
  • Die Glucamylasewirkung auf Stärke und/oder Maltose führt zur Bildung von Dextrose. Diese Wirkung ist auch als Maltaseaktivität, Amyloglucosidaseaktivität, Glucogenaktivität oder Stärke-Glucogenaseaktivität bezeichnet worden.
  • Die Transglucosidaseaktivität führt, insbesondere von Maltose ausgehend, zur Bildung von nicht vergärbaren Dextrosepolymeren, die a-1,6-glucosidische Bindungen enthalten. P a n und Mitarbeiter (Arch. Biochem. Biophys., 42, S. 421 bis 434 [1953],) prüften die Transglucosidaseaktivität verschiedener Laboratoriums- und Industrie-Enzymzubereitungen und fanden, daß durch Mikroorganismen hergestellte Amylasezubereitungen eine erhebliche Transglucosidaseaktivität zeigen.
  • P a z u r und F r e n c h (J. Biol. Chem., 196, S. 265 bis 272 [1952]) zeigten, daß die wahrscheinlichste Wirkung der Transglucosidase darin besteht, daß ein Glucosylrest von der Maltose auf die 6-Stellung des Glucosemoleküls oder auf die 6-Stellung des nicht reduzierenden Endes des Maltosemoleküls übertragen wird, wodurch Isomaltose-(6)-oc-D-glucopyranosyl)-D-glucose bzw. Panose-(4-(6)-a-D-glucopyranosyl)-a-D-glucopyranoSyl)-D-glucose) gebildet wird.
  • Hieraus ergibt sich, daß unter anderen Faktoren, die die Ausbeute der durch Amylaseverzuckerung stärkehaltiger Materialien vermittels Mikroorganismen gewinnbaren Dextrose begrenzen, die erneute enzymatische Synthese von Kohlenhydraten gehört, die nicht vergärbar sind und die durch die in der Enzymzubereitung vorliegenden Enzyme nicht mit merklicher Geschwindigkeit zu Dextrose hydrolysiert werden.
  • In der deutschen Auslegeschrift 1106 275 ist vorgeschlagen, daß Transglucosidase aus Pilzamylasezubereitungen im wäßrigen Medium dadurch entfernt werden kann, daß man dieselbe an Tonmineralien adsorbiert und das wäßrige Medium von dem Tonmineral abtrennt. Wie dört angegeben, ist es nach Adsorbieren der Transglucosidase auf dem Tonmineral notwendig, die Tonmineral-Transglucosidase-Kombination von dem wäßrigen Medium abzutrennen, das die gewünschten Pilzamylasen enthält. Wenn dies nicht erfolgt und die Zubereitung zu einem Stärkesubstrat zugegeben wird, wird die Transglucosidase von dem Tonmineral abgegeben, wodurch die gleichen geringen Ausbeuten an Dextrose erhalten werden, als wenn das Tonmineral nicht angewendet worden ist.
  • Es ist bekannt, daß Enzyme durch viele Adsorbentien adsorbiert werden. S t o n e adsorbierte Stärke hydrolysierende Enzyme an Kohle- und Tonadsorbentien unter derartigen Bedingungen, daß die stärkehydroIysierenden Enzyme nicht mehr wasserlöslich waren und nicht aus dem Adsorbens eluiert werden könnten (vgl. USA.-Patentschrift 2 717 852).
  • Aus der deutschen Auslegeschrift 1087 550 ist ferner bekannt, aus Pilzamylasezubereitungen die schädliche Transglucosidase durch Adsorption an ein wasserunlösliches, wasserhaltiges synthetisches Magnesiumsilikat bei einem pH von etwa 3,8 bis etwa 4,5 zu binden und das Magnesiumsilikat mit der adsorbierten Transglucosidase von der Kulturflüssigkeit, welche die stärkehydrolysierenden Pilzamylasen enthält, abzutrennen. Die Anwendung flüssiger Zubereitungen ist aber unbequemer und unwirtschaftlicher als die von festen Produkten sowohl hinsichtlich der Anwendung selbst, der Aufbewahrung und der Versendung. Außerdem sind solche flüssigen Zubereitungen Veränderungen, insbesondere Fermentierungen, erheblich leichter zugänglich, als es feste Produkte sind. Schließlich enthält dann die Kulturflüssigkeit, welche ja in ihrer Gesamtheit angewendet wird, stets mindestens unerwünschte, häufig aber auch nachteilige Fremdstoffe.
  • Die Erfindung überwindet diese Nachteile.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zur Reinigung und Gewinnung von transglucosidaseinaktiven Pilzamylasen enthaltende Zubereitungen, wobei eine wäßrige Lösung von rohen Pilzamylasen mit einem Tonmineral vermischt wird, ist dadurch gekennzeichnet, daß man die PiIzamylasen auf dem Tonmineral in an sich bekannter Weise mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel ausfällt und anschließend das erhaltene Tonmineral-Pilzamylasen-Gemisch von der Flüssigkeit abtrennt.
  • Es ist auch aus R. W e i d e n h a g e n »Ergebnisse der Enzymforschung«, 1950, S. 307, Abs. 2, bekannt, Enzyme mit Lösungsmitteln auszufällen.
  • Offensichtlich lag aber kein Anlaß vor, bei dem Verfahren der genannten Auslegeschrift eine Lösungsmittelfällung anzuwenden, weil dieses Verfahren ja die Entfernung der schädlichen Transglucosidase bereits zum Gegenstand hat, und daher kein Grund bestand, noch ein FäIlungsmitteI anzuwenden. Das erfindungsgemäße Verfahren wurde somit in keiner Weise durch den Stand der Technik nahegelegt.
  • Völlig überraschend ist aber auch die Wirkung des neuen Verfahrens. Es war nicht vorauszusehen, daß durch gleichzeitige Anwendung eines Tonminerals und eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels eine solche Adsorption der Fermente auf dem Tonmineral zu erzielen war, das die Transglucosidase irreversibel an das Tonmineral gebunden wird, während die stärkehydrolysierenden Fermente, nämlich Glucamylase und a-Amylase, in wasserlöslicher, aktiv bleibender Form darauf gebunden werden.
  • Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem aus der deutschen Auslegeschrift 1087 550 bekannten werden etwa die gleichen Dextroseausbeuten erzielt. Jedoch ergibt das erfindungsgemäße Verfahren die erwünschten Stärkespaltungsenzyme in fester Form, da a-Amylase und Glucamylase von dem Kukturfiiltrat abgetrennt und in trockener Form gewonnen werden.
  • Die Vorteile des Handhabens einer trocknen Zubereitung gegenüber einer flüssigen liegen, wie bereits erwähnt, auf der Hand.
  • Pilzamylasezubereitungen können von der Transglucosidaseaktivität durch Behandeln mit einem Tonmineral in wäßriger Lösung befreit werden, und die zweckmäßigen Amylasen, die Glucamylase und cx-Amylase, können durch Ausfällen vermittels eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels nach einem Verfahren gereinigt und gewonnen werden, bei dem lediglich eine Filtration benötigt wird. Hierdurch wird ein wesentlich wirtschaftlicheres Verfahren ermöglicht, als es bisher zur Verfügung stand.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zunächst eine wäßrige Lösung der Pilzamylasen mit einem Tonmineral behandelt, um so die Transglucosidase zu adsorbieren, und sodann wird (ohne das Tonmineral zu entfernen) ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel zugegeben, um die gewünschten Amylasen auszufällen. Abschließend wird der Feststoff durch Abfiltrieren von der flüssigen Phase abgetrennt. Der Feststoff enthält zusammen mit der inaktivierten Transglucosidase die gewünschten Amylasen.
  • Es ist eine durchaus überraschende Feststellung, daß die an dem Tonmineral adsorbierte Transglucosidase dadurch inaktiviert werden kann, daß dieselbe mit einer wäßrigen Lösung eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels in Berührung gebracht wird, wobei die Transglucosidase immer noch an dem Tonmineral adsorbiert ist, während bei Nichtdurchführen dieses Inberührungbringens mit dem Lösungsmittel das Enzym nicht inaktiviert, sondern in aktiver Form dann abgegeben wird, wenn die Tonmineral-Transglucosidase-Kombination einem Stärkesubstrat zugegeben wird. Dies ist insbesondere unter Berücksichtigung der Tatsache überraschend, daß bei einem Ausfällen der Transglucosidase zusammen mit den anderen Enzymen einer Pilzamylasezubereitung durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels - hierbei ist kein Tonmineral zugegeben worden - die Transglucosidase durch Inberührung bringen mit dem Lösungsmittel nicht inaktiviert wird.
  • Die Feststellung, daß Transglucosidase in dieser Weise inaktiviert werden kann, hat zu einem erheblich vereinfachten und wesentlich wirtschaftlichen Verfahren geführt, als es bisher zur Herstellung einer gereinigten Pilzamylysezubereitung bekannt war, die keine Transglucosidaseaktivität zeigt und in der Lage ist, Stärke in Dextrose bei wesentlich höheren Ausbeuten umzuwandeln, als sie durch nicht behandelte Enzymzubereitungen erhalten werden.
  • Beim Durchführen der Umsetzung sollte das Tonmineral und die Enzymzubereitung in wäßrigem Medium zunächst vermischt und sodann das mit Wasser mischbare Lösungsmittel zugegeben werden. Nach dem Abtrennen der Pilzamylase-Tonmineral-Zubereitung von der Flüssigkeit kann die Enzymzubereitung in diesem Zustand angewendet oder in üblicher Weise getrocknet werden.
  • Die Enzymzubereitung kann z. B. aus der gesamten Kulturflüssigkeit bestehen, die durch das unter der Flüssigkeitsoberfläche durchgeführte Wachstum eines Amylase bildenden Mikroorganismus erhalten wird, oder es kann die aus einer derartigen Kultur erhaltene geklärte Flüssigkeit angewendet werden, oder man kann eine Suspension einer getrockneten oder teilweise getrockneten Zubereitung anwenden, die gegebenenfalls Kleie, Stärke oder verschiedene weitere Verschnittmittel enthalten kann, die zur Standardisierung von Amylasezubereitungen benutzt werden. Man kann andererseits jedoch auch eine Lösung einer vollständig löslichen Enzymzubereitung anwenden.
  • Im allgemeinen kann jedes Tonmineral als ein die Transglucosidase inaktivierendes Adsorbens angewendet werden. Die Tonmineralien sind im wesentlichen Wasser enthaltende Aluminiumsilikate, wobei Magnesium oder Eisen vollständig oder teilweise an die Stelle des Aluminiums bei einigen Mineralien tritt und Alkalien oder Erdalkalien in anderen Mineralien wesentliche Bestandteile bilden. Eine Reihe von Tonmineralien wird weiterhin als Fullererde, Floridin, Subbentonit, Feuerton, Chinaton und Kugelton bezeichnet. In ihrer Zusammensetzung können diese Mineralien von nahezu reinem Magnesiumsilikat bis zu Aluminiumsilikat schwanken und können ebenfalls aus den ihnen zugrunde liegenden Oxyden oder Salzen synthetisiert werden, oder dadurch gewonnen werden, daß kristalline Mineralien mit chemischen Reagenzien umgesetzt werden. Diesbezügliche Einzelheiten sind den Literaturstellen Nr. 204, American Colloid Company (1945), und Industrial Minerals and Rocks, Amer. Inst. Mining ans Met. Eng. (1949) ed. und Clay Mineralogy (R. E. Grim, MeGraw-Hil [1953], S. 18,19) zu entnehmen. Die für das Enzym als Adsorbens angewendete Menge des Tonminerals hängt von der Art des benutzten Tonminerals, der Menge der vorliegenden Transglucosidase sowie der Menge der vorliegenden Verunreinigungen ab. Bei einigen Enzymzubereitungen sollte die verwendete Menge mindestens etwa 1,0 g/ 100 ml Enzymzubereitung betragen.
  • Im folgenden ist der Transglucosidasegehalt einiger Amylase-Tonmineral-Komplexe angegeben, wie er durch den Dextrosegehalt des Stärkehydrolysates bestimmt wird.
    Menge Transglucosidase-
    Adsorbens gehalt der
    Enzymzubereitung
    1. kein .................. - 100
    2. Volclay (Bentonitton) ... 1,0 60
    3. Volclay ............... 2,0 0
    4. Volclay .............. 5,0 0
    5. Filtrol (Montmorillitton) 5,0 60
    6. Tixoton(Montmorillitton) 5,0 40
    7. Florex (Floridinton) .... 2,0 60
    B. Grundite (Illitton) . ..... 5,0 20
    9. Aicco-Sol
    (Magnesiumsilikat) ..... 5,0 60
    10 Magnesol
    (Magnesiumsilikat .... . . 2,0 40
    Die mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, die zur Inaktivierung der Transglucosidase in dem Transglucosidase-Tonmineral-Komplex angewendet werden können, sind diejenigen, die allgemein zum Ausfällen von Amylasen aus Lösungen benutzt werden, wie Aceton, Äthanol oder Isopropanol. Diese Lösungsmittel führen zu Enzym-Tonmineral-Zubereitungen, die die folgenden Transglucosidasegehalte aufweisen, wenn die Amylasen mit 2 °/o Volclay ausgefällt werden.
    Menge Transglucosidase-
    Lösungsmittel gehalt der
    o/' Enzymzubereitung
    1. kein .............. - 100
    2. Aceton ........... 60 60
    3. Äthanol .......... 60 40
    4.Isopropanol ....... 50 20
    5. Isopropanol ....... 60 0
    Obgleich ein Anteil des Lösungsmittels vor oder gleichzeitig zusammen mit dem Ton zugegeben werden kann, ist es wichtig, daß die Berührung des Tonminerals mit der Enzymzubereitung zu einem Zeitpunkt erfolgt, der vor demjenigen liegt, bei dem die Lösungsmittelkonzentration zu einem Ausfällen der Transglucosidase führt. Das Verhältnis Lösungsmittel zu Wasser sollte zwischen 1:1 und 2: 1, vorzugsweise 1,5: 1 liegen.
  • Im allgemeinen sollte der pH-Wert des Enzyms während der Berührung mit dem Tonmineral 3,0 bis 5,5 betragen oder der pH-Wert ein solcher sein, bei dem die Transglucosidase durch das Tonmineral adsorbiert wird. Für die meisten Amylasezubereitungen führt ein pH-Wert von 3,8 bis 4,2 zu der besten Inaktivierung der Transglucosidase unter maximaler Gewinnung der Glucamylase und a-Amylase.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich insbesondere auf Enzymzubereitungen anwenden, die aus Vertretern der Aspergillus-niger-Gruppe (vgl. »A Manual of the Aspergilli« von T h o m und R a p e r, Williams und Wilkins Company,1945) erhalten worden sind, wie z. B. Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Aspergillus phoenicis, Aspergillus fonsecaeus, Aspergillus carbonarius, Aspergillus luchuensis. Das Verfahren läßt sich ebenfalls auf Enzymzubereitungen anwenden, die aus Organismen des Rhizopusstammes erhalten worden sind, wie z. B. Rhizopus delemar.
  • Im folgenden wird eine Beschreibung bezüglich der Bestimmung der Glucamylase gegeben.
  • Bestimmung der Glucamylaseaktivität Das Substrat ist ein 15 bis 18 D. E. sprühgetrocknetes Säurehydrolysat aus Maisstärke. Dieses Material wird in Wasser gelöst und auf 4,0 g Trockensubstanz je 1C0 ml Lösung verdünnt. Es werden genau 50 m1 der Lösung in einen 100-ml-Kolben pipettiert. In den Kolben werden 5,0 ml einer 1,0molaren Natriumacetat-Essigsäure-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 4,3 gegeben. Der Kolben wird sodann in ein Wasserbad bei einer Temperatur von 60°C gebracht und nach 10 Minuten die geeignete Menge der Enzymzubereitung zugegeben. Genau 120 Minuten nach Zugabe der Enzymzubereitung wird die Lösung mit 1n-Natriumhydroxydlösung auf den Umscldagspunkt von Phenolphthalein eingestellt. Die Lösung wird sodann auf Raumtemperatur abgekühlt und bis auf 100 ml aufgefüllt. Es wird mit der verdünnten Probe der Gehalt an reduzierenden Zuckern, berechnet als Dextrose, bestimmt und die gleiche Bestimmung bei einer Kontrollprobe durchgeführt, zu der keine Enzymzubereitung zugegeben wurde. Die Glucamylaseaktivität wird in der folgenden Weise berechnet: Hierbei ist A = Glucamylaseaktivität, Einheiten/ml oder g der Enzymzubereitung, S = reduzierende Zucker in der durch Enzyme umgewandelten Probe, g/100 ml, B = reduzierende Zucker in der Kontrollprobe, g/100 ml, E = Menge der angewendeten Enzymzubereitung, ml oder g.
  • Die Konzentration der reduzierenden Zucker sollte in der durch Enzyme umgewandelten Probe nicht mehr als 1,0 g/100 ml betragen.
  • Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung.
  • Beispiel 1 Durch Rühren während etwa 30 Minuten werden in 11 einer wäßrigen Aspergillus-niger-Zubereitung mit einem pH-Wert von 4,0 20 g Volclay dispergiert. Unter fortgesetztem Rühren werden innerhalb 10 Minuten zu der Dispersion 1,51 Isopropanol zugegeben. Die suspendierten Feststoffe und Amylase auf dem Tonmineral werden auf einem Filter gesammelt und das Filtrat verworfen. Die Enzymzubereitung wird 24 Stunden lang bei einer Temperatur von 25°C und unter einem Druck von 63,5 mm Hg getrocknet. Die getrocknete Enzymzubereitung wird zum Konvertieren von Maisstärkehydrolysat mit einer D. E. (Dextroseäquivalent) von 16 °/o in Dextrose in der folgenden Weise angewendet.
  • Ein Anteil der getrockneten Enzymzubereitung, die 49 Einheiten Glucamylase enthält, wird zu 1000 g (35 °/a Trockengehalt) Stärkehydrolysat mit einer D. E. von 16 zugegeben. Die Konvertierung des Hydrolysates mit einer D. E. von 16 wird bei einer Temperatur von 60°C und einem pH-Wert von 4,2 bis 4,5 72 Stunden lang durchgeführt. Nach der Konvertierung wird das durch Enzymzubereitung verzuckerte Hydrolysat auf den Dextrosegehalt hin analysiert. Die Verfahrensweise wird unter Anwendung unterschiedlicher Mengen Volclay wiederholt. Es werden die folgenden Dextrosegehalte der Hydrolysate für die Enzym-Volclay-Zubereitungen erhalten, die unter Anwendung von 1 bis 5 °/p Volclay, bezogen auf das Volumen der wäßrigen Amylasezubereitung, hergestellt wurden.
    Dextrosegehalt
    Adsorbens Menge des Hydrolysats,
    °/o der
    o/' Trockensubstanz
    1. kein ................. - 86
    2. Volclay . . . . . . . . . . . . . . 1,0 88
    3. Volclay . . . . . . . . . . . . . . 2,0 91
    4. Volclay . . . . . . . . . . . . . . 5,0 91
    Beispiel 2 Durch Rühren während etwa 30 Minuten werden in 11 wäßrige Aspergillus-niger-Zubereitung mit einem pH-Wert von 4,0 20 g Grunditton dispergiert. Zu dieser Dispersion werden unter weiterem Rühren während 10 Minuten 1,51 Isopropanol zugegeben. Das suspendierte feste Enzym auf dem Tonmineral wird auf einem Filter gesammelt und das Filtrat verworfen. Die Enzymzubereitung wird bei einer Temperatur von 25°C 24 Stunden lang unter verringertem Druck getrocknet. Die getrocknete Enzymzubereitung wird zum Konvertieren eines Maisstärkehydrolysats mit einer D. E. von 16 in Dextrose in der Weise angewendet, wie es im Beispiel 1 beschrieben ist. Das angegebene Verfahren wird noch mit anderen Tonmineralien durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Zubereitungen bei der Konvertierung von Maisstärkehydrolysat in Dextrose sind in der folgenden Aufstellung gezeigt.
    Dextrosegehalt
    Tonmineral Menge des Hydrolysats,
    °/o der
    o/o Trockensubstanz
    1. kein ................. - 86
    2. Grundite ....... ..... 5,0 90
    3. Magnesol ............ 2,0 89
    4. Tixoton ............. 5,0 89
    5. Filtrol ............... 5,0 88
    6. Aicco-Sol ............ 5,0 88
    7. Florex ............... 2,0 88
    Beispiel 3 Durch Rühren während etwa 30 Minuten werden in 11 wäßriger Aspergillus-niger-Zubereitung mit einem pH-Wert von 4,0 20g Volclay dispergiert. Unter weiterem Rühren während 10 Minuten werden zu der Dispersion 1,51 Äthanol zugegeben. Die suspendierten Feststoffe werden auf einem Filter gesammelt und in der gleichen Weise getrocknet, wie dies für andere Enzymzubereitungen beschrieben ist. In der oben beschriebenen Weise werden zwei weitere Enzymzubereitungen mit der Abänderung erhalten, daß Aceton und Isopropanol als Lösungsmittel angewendet werden. Die Zubereitungen werden zum Konvertieren eines Maisstärkehydrolysats mit einer D. E. von 16 in Dextrose angewendet, wie die im Beispiel 1 beschrieben ist.
    Dextrosegehalt
    Tonmineral Lösungsmittel des Hydrolysats,
    /o der
    Trockensubstanz
    1. kein . . . . . . . . . - 86
    2. Volclay ...... Äthanol 89
    3. Volclay ...... Aceton 88
    4. Volclay ...... 2-Propanol 91
    Beispiel 4 Durch Rühren während etwa 30 Minuten werden in 11 wäßriger Aspergillus-niger-Zubereitung mit einem pH-Wert von 4,0 20 g Volclay dispergiert. Zum Ausfällen der Amylasen auf dem Tonmineral wird ein gleiches Volumen Isopropanol angewendet. Nach weiteren 10 Minuten Rühren wird der Enzym-Volclay-Feststoff auf einem Filter gesammelt und das Filtrat verworfen. Die Zubereitung wird getrocknet und zum Konvertieren eines Maisstärkehydrolysats mit einer D. E. von 16 auf einen Dextrosegehalt von 900/0 angewendet. Beispiel s Durch Rühren während etwa 30 Minuten werden in 11 wäßriger Aspergillus-niger-Zubereitung mit einem pH-Wert von 4,0 20g Volclay dispergiert. Unter weiterem Rühren während 10 Minuten werden 1,51 Isopropanol zugegeben. Der Enzym-Volclay-Feststoff wird auf einem Filter gesammelt und das Filtrat verworfen. Der feuchte Kuchen wird unter Rühren in 11 Wasser suspendiert. Der Volclay wird auf einem Filter gesammelt und verworfen. Das die Stärke hydrolysierende Enzyme enthaltende Filtrat wird auf Glucamylase untersucht. Hierbei wird gefunden, daß praktisch die gesamte ursprüngliche Glucamylaseaktivität vorhanden ist. Ein Teil des Filtrats, der 49 Einheiten Glucamylase entspricht, wird zum Konvertieren von Maisstärkehydrolysat mit einem D. E. von 16 in 92°/oige Dextrose (Trockensubstanz) nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren angewendet.
  • Beispiel 6 Durch Rühren während etwa 30 Minuten werden in 11 wäßriger Aspergillus-niger-Zubereitung (2000 Glucamyllaseeinheiten) mit einem pH-Wert von 4,0 20 g Volclay dispergiert. Unter weiterem Rühren während 10 Minuten werden der Dispersion 1,51 Isopropanol zugegeben. Das Enzym auf dem Volclay wird auf einem Filter gesammelt und 24 Stunden lang bei einer Temperatur von 25°C unter einem Druck von 63,5 mm Hg getrocknet. Hierbei werden 28 g Enzymzubereitung mit 1840 Glucamylaseeinheiten erhalten.
  • Das 28 g Muster des Volclay-Enzyms wird in 11 Wasser suspendiert. Der pH-Wert wird auf 4,0 gebracht und das Gemisch 10 Minuten lang gerührt. Das unlösliche Material wird auf einem Filter gesammelt und verworfen. Das Filtrat enthält 1800 Einheiten Glucamylaseaktivität, was einer 90°/oigen Gewinnung der Glucamylase aus der ursprünglichen wäßrigen Amylasezubereitung entspricht. Diese Enzymzubereitung wandelt ein Stärkehydrolysat mit einer D. E. von 16 in 92°/jge Dextrose (auf Trockenbasis) um.
  • Die Beispiele 5 und 6 zeigen, daß die Enzyme, die für die Hydrolyse der Stärke in Dextrose in den Tonmineral-Amylase-Komplexen wirksam sind, in wasserlöslicher Form vorliegen.

Claims (1)

  1. Patentanspruch: Verfahren zur Reinigung und Gewinnung von transglucosidaseinaktiven Pilzamylasen enthaltende Zubereitungen, wobei eine wäßrige Lösung von rohen Pilzamylasen mit einem Tonmineral vermischtwird,dadurch gekennzeichnet, daß man die Pilzamylasen auf dem Tonmineral in an sich bekannter Weise mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel ausfällt und anschließend das erhaltene Tonmineral-Pilzamylasen-Gemisch von der Flüssigkeit abtrennt.
DEC25612A 1960-11-30 1961-11-28 Verfahren zur Reinigung und Gewinnung von transglucosidaseinaktiven Pilzamylasen enthaltende Zubereitungen Pending DE1293105B (de)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3303102A (en) * 1964-08-31 1967-02-07 Corn Products Co Production of dextrose
US3332851A (en) * 1964-09-10 1967-07-25 Grain Processing Corp Process of purifying glucoamylase
US3311542A (en) * 1965-02-19 1967-03-28 Ralph W Kerr Method of making solid total hydrolyzate of starch
DK438283D0 (da) * 1983-09-26 1983-09-26 Novo Industri As Syrestabilt alpha-amylaseenzymprodukt og fremstilling deraf
DE4037530A1 (de) * 1990-11-26 1992-05-27 Henkel Kgaa Faellungsverfahren fuer exocellulaere proteine

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1087550B (de) * 1957-12-30 1960-08-25 Corn Products Company Eine Ges Verfahren zum Reinigen einer Amyloglukosidaseenzym enthaltenden Zubereitung

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1087550B (de) * 1957-12-30 1960-08-25 Corn Products Company Eine Ges Verfahren zum Reinigen einer Amyloglukosidaseenzym enthaltenden Zubereitung

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