DE2532051C3

DE2532051C3 - Verfahren zur Herstellung von Cyctodextrtnen

Info

Publication number: DE2532051C3
Application number: DE19752532051
Authority: DE
Inventors: Yoji Shima Atsuyuki Kochi Tsuyoshi Kato Toshiyuki Misawa Fumio Okimoto Masayuki Saito Naohisa Matsubara Sadakazu Hino Tokio Suzuki (Japan)
Original assignee: Teijm Ltd, Osaka (Japan)
Priority date: 1974-07-19
Filing date: 1975-07-17
Publication date: 1977-08-18

Description

Lösung des Stürkehydrolysats in einer Konzentration von 34 g/100 ml bei 5O⁰C während 7 Tagen unter Verwendung von Toluol als Cyclodextrin-Kcmplexicrungsmittel.

Es ist ferner zu bemerken, daß in diesen Verfahren gemäß dem Stand der Technik, wenn höhere Konzentrationen an Stärkehydrolysat verwendet werden, um das Verfahren industriell vorteilhaft durchzuführen, größere D. Ä.-Weite niedrigere Ausbeuten an Cyclodextrinen bewirken. Dies bedeutet, daß, um das Stärkehydrolysat in einer höheren Konzentration zu verwenden, das D. Ä. des Stärkehydrolysats niedriger sein muß. Demzufolge kann das leicht Schwierigkeiten bei der Verfahrensführung bzw. im Betrieb herbeiführen. Experiment V der vorstehend genannten japanischen Patentschrift zeigt die mit variierenden D. Ä.-Werten bei einer hohen Konzentration von 30 Gewichtsprozent erhaltenen Ergebnisse. Diese Ergebnisse demonstrieren, daß der Betrieb schwierig ist, wenn das D. Ä. 5 beträgt; daß, wenn das D. Ä. 10 ist, die Ausbeute an Cyclodextrinen 45% beträgt, und daß, wenn das D. Ä. auf 18 erhöht wird, die Ausbeute auf 3O°/o abnimmt.

Beispiel III der vorstehenden US-PS 34 25 910 gibt die Ergebnisse von Experimenten wieder, die durchgeführt wurden unter Verwendung eines Stärkehydrolysats in einer Konzentration von 34 g/100 ml der Reaktionslösung und unter Variierung des D. Ä. des Hydrolysats von 0,4 bis 25,5. Diese Ergebnisse zeigen, daß, wenn die Reaktion unter Verwendung von Toluol als Cyclodextrin-Komplexierungsmittel bei 50° C während 4 bzw. 7 Tagen durchgeführt wird, die Ausbeute an Cyclodextrinen mit größeren D. Ä.Werten in beiden Fällen größer wird, und die Abnahme der Ausbeuten ist drastisch. Zum Beispiel ist die Ausbeute an Cyclodextrinen aus einem Stärkehydrolysat mit einem D. A. von 1,0 und einer Konzentration von 34 g/100 ml der Reaktionslösung 45% nach 4tägiger Reaktion und 51 % nach 7tägiger Reaktion. Wenn jedoch das D. A. des Hydrolysats 12,0 bei derselben Konzentration beträgt, nimmt die Ausbeute drastisch auf 17% nach 4tägiger Reaktionszeit und auf 22% nach 7tägiger Reaktionszeit ab.

Wie bereits erwähnt, ist die erreichbare Stärkekonzentration höchstens 5%, wenn Stärke direkt als Ausgangsmaterial verwendet wird, und wenn die Konzentration erhöht wird, ergeben sich Schwierigkeiten beim Betrieb des Verfahrens und unzufriedenstellende Ausbeuten. Es ist leicht verständlich, daß auch im Falle von Stärkehydrolysaten dieselben Schwierigkeiten auftreten würden, wenn deren D. Ä.Werte niedrig sind und denjenigen der Stärke nahekommen. Wenn z. B. ein Stärkehydrolysat mit einem D. Ä. von etwa 10 verwendet wird, kann es in gelöstem Zustand in einer Konzentration von mehr als 45 g/100 ml gehalten weiden. Wenn jedoch das D. Ä. etwa 2 beträgt, ist die erreichbare Konzentration höchstens 20 g/100 ml, und es ist schwierig, Lösungen mit einer höheren Konzentration zu bilden. Wenn darüber hinaus das Substrat ein niedriges D. Ä. aufweist, entsteht während der Reaktion ein unlösliches klebriges Material aus einem feinen unlöslichen Material und bewirkt eine drastische Verringerung der Filtrierbarkeit der Reaktionslösung. Diese verringerte Filtrierbarkeit kann selbst durch Erwärmen der Reaktioiislösung nicht verbessert werden und beeinflußt daher nachteilig die Reinigungsverfahrensweise der Cyclodextrine.

Es wurden nunmehr Untersuchungen durchgeführt, um die verschiedenen Nachteile und Schwierigkeiten zu überwinden, die bei der Verwendung von Stürkchydrolysaten angetroffen werden, wie schlechte Reproduzierbarkeit der Ausbeuten, Verringerung der Ausbeuten auf Grund der Verwendung von Stärkehydrolysaten hoher Konzentration, die notwendigen langen Reaktionszeiten und die erhebliche Verringerung der Ausbeuten durch die Verwendung von Stärkehydrolysaten mit einem großen D. Ä.-Wert.

Es wurde nunmehr gefunden, daß eine bedeutsame kritische Beschränkung hinsichtlich der gesamten Mengen von Maltose und Glucose in dem Stärkehydrolysat besteht, was bislang vollständig vernachlässigt wurde, und daß, wenn die Gesamtmenge von Maltose und Glucose in einem Stärkehydrolysat mit einem D. Ä. von nicht mehr als 20 5 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gewicht des Stärkehydrolysats, überschreitet, eine wesentliche Verringerung der Ausbeute an Cyclodextrinen eintritt, wie in den nachstehenden Vergleichsbeispielen veranschaulicht wird. Es wurde somit gefunden, daß die schlechte Reproduzierbarkeit von Ausbeuten dadurch verbessert werden kann, daß man Stärkehydrolysate mit einem D. A. von nicht mehr als 20 verwendet, welche das obige Erfordernis hinsichtlich der Gesamtmenge von Maltose und Glucose darin erfüllen.

Es wurde ferner ermittelt, daß eine spezielle Korrelation zwischen der Konzentration des Stärkehydrolysats und der Aktivitätsmenge von Cyclodcxlrin-transglycosylase bei Initiierung der Reaktion besteht.

Gegenstand der Erfindung ist demnach das im Anspruch definierte Verfahren.

Hierdurch kann der Nachteil der Erzielung schlechter Ausbeuten und der Benötigung langer Reaktionszeiten als Folge der Verwendung von Stärkehydrolysaten in hoher Konzentration eliminiert werden. Ebenso kann hierdurch die Verringerung der Ausbeuten auf Grund der Verwendung von Stärkehydrolysaten mit einem größeren D. Ä.-Wert und einer höheren Konzentration in wäßriger Lösung vermieden werden, wie in den nachstehenden Vergleichsbeispielen gezeigt wird. Keines der Beispiele der vorstehenden japanischen und amerikanischen Patentschrift erfüllt die vorstehende Gleichung, und in diesen Beispielen ist CR viel kleiner als 194/1/5.

Es wurde auch gefunden, daß, wenn in den vorstehenden Verfahren des Standes der Technik Stärkehydrolysate mit einem D. Ä.-Wert und einer höheren Konzentration verwendet werden, die Ausbeute an Cyclodextrinen erheblich verringert wird, daß jedoch, wenn die Korrelation im Anspruch erfüllt ist, ein solcher Nachteil nicht wesentlich auftritt, selbst wenn Stärkehydrolysate hoher Konzentration verwendet werden.

Es wurde somit bestätigt, daß, wenn die Gesamtmenge von Maltose und Glucose in dem Stärkehydrolysat und die durch die Gleichung im Anspruch ausgedrückten Bedingungen in den Bereichen der vorliegenden Erfindung liegen, alle Nachteile, die durch die Verwendung von Stärkehydrolysaten bewirkt werden, überwunden werden können und Cyclodextrine in ausgezeichneter Weise in industriellem Maßstab hergestellt werden können.

Das beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Stärkehydrolysat wird nach bekannten Verfahrensweisen hergestellt, z. B. durch Erwärmen von Stärke in Gegenwart einer Säure, wie Chlorwasser-

5 \ ⁶

stolTsuurc, oder durch Hydrolyse derselben mil einer wurde jedoch als Folge ausgcdel_inter Untersuchungen Λ-Amylase, wie von Bacillus sublilis, Bacillus steam- gerunden, daß Cyclodcxtr.n-t ansgycosylase überihcrmophilus, Aspergillus oryzae oder Aspergillus haupl nicht d.csem Gesetz folgt. Die Anmelde πη hai nigcr. Die Zusammensetzung des Saccharids in der Stärkehydrolysate mti einem D. A. von 5 b> 20, hcrgebildeten Stärke variiert je nach der Hydrolyse- 5 gestellt nach verschiedenen Methoden, mit Cyc omethode und den Hydrolyscbeding^gen. dextrin-transglycosylase in Gegenwart eines Cyclo-Es wurde gefunden, daß, wenn Cyclodexlrin-trans- dextnn-Komplcx.erungsm.Ue ^s ™¹ _ς *f ^'<;^d(;"^e» glycosylase auf verschiedene Stärkehydrolysate mit Konzentrationen an Stärkehydrolysaten (Subs rat) einem D. A. von 5 bis 20, hergestellt nach verschie- und Cyclodcxtnn-lransglycosylase umgesetzt und die denen Methoden, einwirken gelassen wird, die Aus- io Menge der gebildeten Cyclodextrine untersucht Es beute an Cyclodextrine.! je nach der Menge von GIu- wurde dabei gefunden, daß der schlußcndliche cose und Maltose in der, Stärkehydrolysaten inner- Glcichgewichtswert der Reaktion eine Gestimmte halb eines großen Bereiches variiert, selbst wenn die Korrelation mit der Aktiy.tatsrnenge des Enzyms pro Stärkchydrolysat-Substratc denselben D. Ä.-Wert auf- Volumeinheit der Reaklionslosung und der Aktiviwciscn. Es wurde z. B. ermittelt, daß, wenn die Ge- .5 tütsmcnge des Enzyms pro Gewichtseinheit des Subsamtmenge von Glucose und Maltose in dem Stärke- sträts aufweist. Es konnte jedoch keine geradlinige hydrolysat nicht mehr als 5 Gewichtsprozent beträgt, Proportionalrelation beobachtet werden.
Cyclodextrine in einer Ausbeute von 30 bis 70 »/0, Als die Reaktion bei 45° C wahrend 90 Stunden in bezogen auf das Gewicht des Ausganyimaterials, er- Gegenwart von Trichlorethylen unter Verwendung halten werden können, daß jedoch, wenn die Gesamt- 20 eines Stärkehydrolysats mit einem D. A. von 10,2 und menge 5 Gewichtsprozent überschreitet, die Ausbeute enthaltend Glucose und Maltose in einer Gesamtabrupt abnimmt, und wenn die Gesamtmenge etwa menge von 2,1 Gewichtsprozent in einer Substrat-20 Gewichtsprozent beträgt, die Ausbeule an Cyclo- konzentration von 40 g/100 ml durchgeführt wurde, dextrinen so wenig wie 15'V₁₁ beträgt. Ein solches wurde die maximal wahrend dieser Zeit erreichte Phänomen wurde beobachtet, selbst wenn Maltose 25 Ausbeute durch Variierung der Menge des zugegebeund/odcr Glucose einem Stärkehydrolysat zugegeben nen Enzyms untersucht,
werden, welches im wesentlichen keine Maltose und Die Ergebnisse sind in Tabelle I autgetunrt.
Glucose enthält, bevor es in der Reaktion eingesetzt
wird, und es wurde daher sichergestellt, daß eine enge Tabelle I ^^

Beziehung zwischen der Gesamtmenge von Glucose 3" ~ ~ I Γ7~ ,„,,„„ _un

, XA 1 · o*·· 1111 jj au. Enzym-Menge Enzym-Menge Ausbeute an

und Maltose im Stärkehydrolysat und der Ausbeute (Eichen pro (Einheiten pro Cyclodextrin

an Cyclodcxtrinen besteht. Die Reduktion der Aus- lOmlderReak- g Substrat) (°/o, bezogen auf

beute an Cyclodextrine!!, die durch die Gegenwart tionslösung) das Substrat)

von Glucose und/oder Maltose bewirkt wird, ist vcr- ~~~~
mutlich der Tatsache zuzuschreiben, daß Trans- 35
glycosylierungsreaktionen außer der Cyclisierung
durch die Gegenwart von Glucose und/oder Maltose
katalysiert bzw. aktiviert bzw. gefördert werden.

Ein Verfahren ist bereits bekannt, welches die

Durchführung der vorstehenden Reaktion in Gegen- 40 Selbst wenn die Reaktionszeit verlängert wurde,

wart eines Cyclodexlrin-Komplexierungsmittels, wie konnte die Ausbeute nicht weiter erhöht werden.

Trichlorethylen oder 1-Decanol, welches eine Ein- Weitere ausführliche Untersuchungen, bezogen auf

schlußverbindung mit einer extrem niedrigen Löslich- die vorstehende Tatsache, führten zur Feststellung,

keit in dem Reaktionssystem durch Reaktion mit daß, um Cyclodextrine in guter Reinheit und hohen

Cyclodextrin bildet, in dem Versuch, zu erreichen, 45 Ausbeuten stabil bzw. gleichmäßig und innerhalb

daß eine Cyclodextrinbildungsrcaktion überwiegend kurzer Zeiten durch Umsetzung eines Stärkehydro-

abläuft. umfaßt. Es wurde jedoch überraschender- lysats mit einem hohen D. A. in einer hohen Konzen-

weisc gefunden, daß der Effekt der Gesamtmenge von tration zu erhalten, die. Menge des Enzyms bei

Maltose und Glucose im Stärkehydrolysat auch in Initiierung der Reaktion die Gleichung erfüllen

Gegenwart eines solchen Cyclodextrin-Komplexie- 50 muß. Es wurde festgestellt, daß, wenn CR weniger als

rungsmittels eintritt. 194/]^ beträgt, die Ausbeute an Cyclodextrinen

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird daher die drastisch abnimmt und die Reaktion sehr unstabil Reaktion einer wäßrigen Lösung eines Stärkehydro- bzw. ungleichmäßig wird und daß, selbst wenn verlysats mit einem D. Ä. von nicht mehr als' 20, vor- schiedene Reaktionsbedingungen konstant gehalten zugsweise 15 bis 7, mit Cyclodextrin-transglycosylase 55 werden, die Ausbeute innerhalb eines breiten Bein Gegenwart eines Cyclodcxtrin-Komplexierungs- reiches variiert und die Reproduzierbarkeit der Ausmittels nach Einstellung der Gesamtmenge von Mal- beulen schlecht ist.

tose und Glucose in dem Stärkehydrolysat auf nicht Stärkehydrolysate, die Maltose und Glucose in

mehr als etwa 5 Gewichtsprozent, bezogen auf das einer Gesamtmenge von nicht mehr als etwa 5 Ge-

Gcwicht des Stärkehydrolysats, durchgeführt. 6r wichtsprozcnt enthalten, können dadurch hergestellt

Im allgemeinen beeinflußt bei enzymatischen Re- werden, daß man die Hydrolysebedingungen bei den

aklioncn die Konzentration eines Enzyms nicht den bekannten, vorstehend erwähnten Hydrolysc-Metho-

cndgültigcn Gleichgewichiswcrt der Reaktion, und es den wählt bzw. steuert. Sie können auch dadurch

wurde davon ausgegangen, daß eine Reaktion zur hergestellt werden, daß man das Hydrolysat mit

Bildung von Cyclodextrine!! unter Verwendung von 65 Glucoseoxydasc behandelt oder daß man eine Hefe.

Cyclodextrin-transglycosylase dieses anerkannte Ge- wie Saccharomyces ccrevisiac, in dem Hydrolysat

sei/, in Gegenwart eines Rcaktionsbesehlcunigers, wie /iichiet, um dadurch im vorhinein Glucose und MaI-

Trichlorethylcn oiler 1-Dccanol. bcfoluen würde. Es lose zu assimilieren.

60	15	23,7
180	45	53,1
360	90	56,2

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann die Kon- \uu )se

zcntration des Stärkehydrolysats in der wäßrigen Lösung jegliche sein, bei der das Stärkehydrolysat in Bestimmt nach einer kohlenstorTchromatographi-

Wasser gelöst werden kann, und für den kommer- sehen Methode.

zicllcn Betrieb ist die Konzentration so hoch wie 5 λ-und ^-Cyclodextrine

möglich. Zum Beispiel betragt die bevorzugte Kon-,

zcntration mindestens etwa 30 g/100 ml der Rcak- Bestimmt nach einer cn/\ maiischen Methode

tionslösung. [Kobayashi et al., Proceedings öl the Sumposium

Das im erfindungsgcmäßen Verfahren verwendete on Amylase, Japan, Band 8, S. 29 (1973)1. Cyclodextrin - Komplexicrungsmittcl ist jegliches io Es wurde eine dünnschichtchromalographische

Komplexierungsmittel, das dazu befähigt ist, bei der Analyse, unter Verwendung einer dünnen Schicht aus

Reaktion mit dem gebildeten Cyclodextrin einen aus- mikrokristalliner Cellulose, durchgeführt, und die

fällbaren Komplex oder eine ausfällbare Einschluß- Probe wurde mit Butanol/Athanol/Wasser (4/3/5)

verbindung zu bilden. Typische Beispiele für solche entwickelt, wonach eine Jodlösung gesprüht wurde.

Cyclodcxtrin-Komplexierungsmiltcl umfassen Tri- 15 um Cyclodextrine zu ermitteln.

chloräthylen, Tetrachloräthan, Toluol, Cydohcxan, Die Einheit der Cyclodextrin-transglycosylasc

Brombenzol, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform, Ben- wurde nach der folgenden Methode gemäß der TiI-

zol, Kohlenstoffdisulfid, p-Xylol, Äthylbenzol, dcn-Hudson-Methodc [J. Bacteriol., 43, 527 (1942)]

p-Cumol, Cyclohexanol, 1-Heptanol, Hexan, 1-Dc- bestimmt.

canol und 1-Nonanol. Das Komplexierungsmitlel 20 1,0 ml einer Lösung eines Enzyms in destilliertem

kann in geeigneter Weise, je nach der gewünschten Wasser wird zu einer Mischung aus 1,5 ml einer

Art von Cyclodextrine!!, ausgewählt werden. Bei- 4" nigcn wäßrigen Lösung von löslicher Stärke und

spielswcisc kann die Verwendung von 1-Dccanol oder 0,5 ml eines 0,1 m-Acetatpuffcrs (pH-Wert 5,5) zu-

1-Nonanol überwiegend -v-Cyclodcxtrin ergeben. gegeben, und die Mischung wird 30 Minuten bei

Wenn Hexan, Trichloräthylen oder Toluol verwendet 25 45'C gehalten. (Selbst wenn die Temperatur auf

wird, wird überwiegend /('-Cyclodextrin gebildet. 40 C verändert wurde, trat kaum eine Veränderung

Wenn Tetrachloräthan oder !-Hcptanol verwendet der Enzymstärke ein.) Anschließend wurden 100 μ|

wird, werden ^Cyclodextrin und /i-Cyclodcxtrin der vorstehenden Reaktionslösung zu 40 al einer

gleichzeitig gebildet. 0,1 n-Jodlösung gefügt. 1 Mikroliter (ul) der crhaltc-

Der pH-Wert der Reaktionslösung und die Rcak- 3° neu Mischung wird auf eine Glasplatte getropft, bei tionstcmpcratur können in geeigneter Weise, je nach 20 bis 25 C bei einer relativen Feuchtigkeit von 50 dem optimalen pH-Bereich und der optimalen Rcak- bis 60" u getrocknet und mikroskopisch untersucht, tionstcmpcratur für die Cyclodextrin-transglycosylase, Die minimale Menge des Enzyms, in dem ein nadelgewählt werden. Zum Beispiel beträgt im Falle von förmiger Kristall bei dieser mikroskopischen Untcr-Bacillus maccrans der optimale pH-Wert etwa 5 bis 7 35 suchung beobachtet wird, wird als eine Einheit de- und die optimale Reaktionstemperatur etwa 40 bis liniert,

50° C. Die Reaktionszeit, die im erlindungsgemälJen Beispiel 1 und Vemleidisbcispiel 1

Verfahren ausreicht, betrügt etwa 24 bis 60 Stunden.

Die Reaktion kann auch während mehr als 60 Stun- Aspergillus niger wurde in einem flüssigen Medium,

den durchgeführt werden, jedoch ist kein Vorteil der 4» enthaltend Kartofl'elstärke als Haupt-KohlenstolT-

F.rhöhung der Ausbeute an Cyclodextrine!) zu er- quelle, gezüchtet. Die /.eilen wurden durch Filtration

warten, entfernt, und das Fillrat wurde als En/ymlösuug ver-

Die im crfindungsgcmäßcn Verfahren verwendete wendel. Die En/ymlösung wurde mit KaitoHelstärke

Cyclodextrin-lransglyeosylase kann /. B. wie folgt er- /ur Reaktion gebracht, um eine Stärkehydrolysat-

hallcn werden. <5 lösung /11 bilden. Die Lösung wurde gekocht, um das

Ein Kulturmedium, einhüllend 3"» Weizenkleic F.n/ym zu entaktivieren, und dann sprühgetrocknet,

und 0,5"Zu Cülciumcarbonat, mit oder ohne geeignete um ein Slärkchydrolysatpulvoi (1) mit einem D. Λ.

Mengen an organischen oder anorganischen Stick- von 15,0. enthallend l,^l> Gewichtsprozent (ilucose und

stofTqucllcn, wie Fleischextrakt, MaistiuclllUissigkeit ft.I Gewichtsprozent Maltose, zu erhalten. Andern

oder Ammoniumsulfat, oder einer KohlcnslolTquclle, so scils wurde aus KartoiTcIstiirke Dextrin (11) mit cineiv

wie Stiirkc, wird sterilisiert. Bacillus mnccrnns wird in D. Λ, von 12,0 und enthaltend 2,3 Gewichtspiw.eni

das Kulturmedium inokuliert bzw, eingeimpft und Maltose (Glucose wnr nichl nachweisbar) unter Vcr·

2 bis 4 Tage bei 37° C aerob gezüchtet. Das imlös- Wendung einer verflüssigenden Amylasc von Hucillu!

liehe Miitcrinl wird dann durch Zentrifugieren cnl- subtilis hergestellt.

fernt, und die überstehende Flüssigkeit kann in der 55 K)Og (I) oder (11) wurden zu 190 ml einer rohci

Reaktion als rohe Enzymlosung direkt oder nach dem Hnzymiösung (40 Rinheiten/ml) von Bacillus mncc

Konzentrieren derselben unter vermindertem Druck rans, hergestellt nach dem vorstehenden Verfahren

verwendet wurden. Ferner kann vor der Verwendung in ein Kulturmedium, enthaltend Wei/.enklcic, un

der überstehenden Flüssigkeit ein Fiillungsmittcl. wie eine Lösung mit einer Substratkon/.entration voi

Isopropanol, der überstehenden Flüssigkeit zugegeben 60 40 g/100 ml herzustellen, zugegeben. 20 ml Trichlor

werden, um d»s Enzym auszufüllen und zu sammeln. lithylcn oder I-Decanol wurden als Cyclodextrin

In der vorliegenden Beschreibung wurden die GIu- Komplexieiungsmillcl der Lösung zugegeben, und dl

cose-, Maltose- und λ- und //-Cyclodcxtriu-Mcngcn Mischung wurde unter Rühren 48 Stunden bei 45" <

mich dem folgenden Verfahren bestimmt: umgesetzt, wobei der pH-Wert der Lösung bei 6,1 gc

65 hallen wurde. Nach der Reaktion wurden Trichloi iithylen oder I-Decanol durch Destillation entfern und Cyclodextrine wurden quantitativ bestimmt. Di

Bestimmt nach der Tiuibcr-Klcincr-Mclhodc. Ergebnisse sind in Tabelle 11 aufgeführt.

ίο

Tabelle II	Substrat Typ	Π.Λ.	CH	194/1 .ν	Cyclodextrin-Komplexierungsmittel Trichloräthylen 1-Decanol Ausheilte Ausheute Ausbeute an n-C'D an/>'-CD an n-CD	35,8 24,0	Ausbeute an /)'-CD
Ansatz	Il I «-Cyclodextrin. /(-Cyclodextrin.	12,0 15,0	76 76	31 31	Spur 51,2 Spur 33,5		3,1 • 2,2
Vcrgleichs- bcispicl 1 Beispiel 1 η-CD -- Ii-CD --

Die Ausbeute der Cyclodextrine wird in °'n, bezogen auf das Gewicht des Substrats, ausgedrückt.

Nach der Reaktion wurde die durch Verwendung von Trichloräthylen als Cyclodextrin-Komplcxierungsmittel erhaltene Reaktionsmisclumg behandelt, um Trichloräthylen durch Dampfdestillation zu entfernen, und zur Bildung von Kristallen gekühlt. Die Kristalle wurden aus Wasser umkristallisiert, um /i-Cyclodextrinpulver zu erhalten. Das so erhaltene /f-Cyclodcxtrinpulver wog im Fall des Substrats (1) 26,5 g und 42,8 g im Falle des Substrats (II). Die Reinheit dieser Pulver war fast 100°, n, wie sich dünnsehiehtchromatographisch und durch cnzymatischc Untersuchungen zeigte.

Wenn I-Decanol als Cyclodextrin-Komplexierimgsmiltel verwendet wurde, wurde ein CyelohexanüberscIw 1.1 der Reaktionsmisclumg nach Entfernung von I-Decanol zugegeben. Die Mischung wurde zentrifugiert. Der Niederschlag wurde isoliert und in Was- ,15 scr suspendiert. C'yclohexan wurde durch Dampldestillation entfernt, und anschließend wurde Wasser zur Trockne verdampft, wobei ein rohes Pulver erhalten wurde. Das rohe Pulver wurde zweimal aus Wasser umkiislallisiert. Das erhaltene \-Cyclodextrin- -t» pulver wog IK,d i; im Falle des Substrats (I) und 28.2 g im Falle des Substrats (II).

B c i s ρ i e I e 2 bis 4
und Vergleichsbeispiele 2 bis 4

Eine Wassersuspension von Kartoffelstärke wurde unter Verwendung einer verflüssigenden \-AmyIase von Bacillus subtilis partiell hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde sprühgetrocknet und mit ¹K)⁰Z_n Äthano gewaschen, um ein Dextrin mit einem D. Ä. von 9,f zu erhalten, das frei von Glucose und Maltose war Vorbestimmte Mengen von Glucose und Maltosf wurden dem erhaltenen Dextrin zugegeben. 19 ml dei rohen F.nzymlösung (40 Einhcitcn/ηϊϊ), hergestellt in Heispiel I, wurden zu 10g der erhaltenen Mischung (Substrat) zugegeben, um eine Lösung mit einer Konzentralion von 4OgZlOOm! zu bilden. Anschlicßcnc wurden 2 ml Trichloralhylen oder I-Decanol der Lösung zugegeben, und die Mischung wurde 50 Stundet bei 45" C umgesetzt, wobei der" pH-Wert der Mi schung bei 6,3 gehalten wurde. Trichloräthylen odci I-Decanol wurden dann durch Destillation entfernt und die erhaltene Reaktionsniischung wurde zur Be Stimmung der Cyelodexlrm-Aiisbeule analysiert. Di< erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IM aufgeführt

Tabelle

Ansatz.	Menge tier zugegebenen	M ti 11 öse	Π.Λ.	O!	l'J4/\|.v	Ausheule im //-CD	Ausbeute tin <i-CI5
	Cilticosc oucr MiiIIohc Kiew,·¹"», bezogen auf dns Ciesnmisitccliiirld)	0				bei Verwendung von Triclilorllthy- lcn iiIh Cyclo-	bei Verwendung vor I-I)cci\moI ills Cyclodextrin-
		0				dextiln-Komplc·	Koinplexicrungg·
		3				xleningsmlttcl	mllicl
	Oliicose					KIcW₁-¹¹Zo, bezogen nur ilits Suhstnii)	(GcW₁-¹V(I, bezöge, mif dos Substrat)
Heispiel 2	0	3	9,5	76	31	5H.H	38,3
Beispiel 3	2		11.3	76	31	55,3	36,1
Beispiel 4	I	I	ll.fi	76	31	52.7	36,0
Vci'gleiehs-
beispicl 2	3	5	13.4	76	31	42.1	25,1
Vcrglclchs-
beispicl 3	5	14,4	76	31	37,5	23.4
Vcrgleichs-
bcispiel 4	5	16,1	76	31	30.0	10.7

Beispiel 5 und Vergleichsbeispiel 5

100 ml einer Kultur von Saccharornyccs cerevisiae, die während 12 Stunden in einem Kulturmedium, das Glucose als Hauptkomponente enthielt, gezüchtet wurde, wurden zu einer Lösung von 400 g des im Beispiel 1 verwendeten Stärkehydrolys.ats(l) in 660 ml Wasser gefügt, und der pH-Wert der Lösung wurde auf 5,5 mit Essigsäure eingestellt. Die Lösung wurde dann 30 Stunden inkubiert, um Glucose und Maltose, die darin enthalten waren, zu assimilieren. Die Trennung durch Zentrifugieren ergab eine klare Dextrinlösung mit einem D. A. von 10,6, enthaltend 0,2 Gewichtsprozent Glucose und 1,0 Gewichtsprozent Maltose.

2 g eines rohen Pulvers von Cyclodextrin-transglycosylasc (8000 Einheiten/g), erhallen durch Lyophilisation eines Filtrats einer Kultur von Bacillus macerans, wurden zu 500 ml der vorstehend hergestellten Dcxtrinlösung gefügt. Nach Einstellung des pH-Wertes der Lösung auf 6,1 wurden 50 ml 1-Decanol oder Trichlorälhylcn zugegeben. Die CR-ZaIiI der Mischung betrug 80, und 194/V¹S betrug 31. Die Mischung wurde 48 Stunden bei 45° C umgesetzt. Bei der Verwendung von 1-Decanol als Cyclodextrin-Komplcxicrungsmittcl wurde Λ-Cyclodcxtrin in einer Ausheute von 36,O¹Vn, bezogen auf das Dextrin, gebildet. Wenn andererseits Trichloräthylen als Cyclodextrin-Komplcxicrungsmiltel verwendet wurde, wurde /»'-Cyclodextrin in einer Ausbeute von 53,1¹Vo, bezogen auf das Dextrin, erhalten.

Zum Vergleich wurden 200 g des Stätkehydrolysats (1) (D.X 15,0; CR 80; 194/1/7? 31) in 380 ml Wasser gelöst, und dieselbe Reaktion wie vorstehend wurde durchgeführt. Bei der Verwendung von I-Dclanol wurde ^Cyclodextrin in einer Ausbeute von

22,3 °/o und bei der Verwendung von Trichloräthylen /i-Cyclodextrin in einer Ausbeute von 32,3 %> gebildet.

B e i s ρ i e 1 e 6 bis 11
und Vergleichsbeispielc 6 bis 8

0,1 g einer verflüssigenden Λ-Amylase (10 000 Einheiten) von Bacillus subtilis wurden einer 3O°/oigen wäßrigen Stärke-Suspension, enthaltend 1 kg Kartoffelstärke, zugegeben, und die Mischung wurde auf etwa 80° C erhitzt. Die Mischung wurde 10 Minuten in einem Autoklav auf 120° C gehalten. Das unlösliche Material wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde durch ein Sprühtrocknungsverfahren in Pulverform überführt. Das Pulver wurde mit Äthanol gewaschen, um ein Dextrinpulver mit einem D. A. von 9,7, enthaltend 2,0% Maltose (Glucose war nicht nachweisbar) zu erhalten.

Das vorstehende Dextrin wurde in einer vorbestimmten Konzentration zu rohen Enzymlösungen von Bacillus macerans mit verschiedenen Enzym-Einheiten, hergestellt nach der vorstehenden Methode, unter Verwendung von Wcizcnkleie enthaltendem Kulturmedium, gefügt. Der pH-Wert einer jeden Mischung wurde auf 6,5 eingestellt, und es wurde 48 Stunden bei 45° C in Gegenwart von Trichloräthylen umgesetzt. Nach der Reaktion wurde das Trichloräthylen auf einem Wasserbad entfernt, und das erhaltene Cyclodextrin wurde quantitativ bestimmt. Die nach Entfernung desTrichloräthylens verbliebene Lösung wurde konzentriert und gekühlt. Die erhaltenen Kristalle wurden aus Wasser umkristallisicrt, um ein /i-Cyclodextrinpulver zu erhalten.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IV aufgeführt.

Tabelle IV	O.A.	liiiheit dor vollen l-'n- /.ymlösunn (I inlu'i- ten'ml)	V ((JlI)O	cit Mil) (l'inlieiten pro μ Substrat)	2')
Ansät/.	9,7	15	■\s	24	2')
Veigleichs- beispicl (>	9,7	30	45	49	29
Beispiel (1	⁽>,7	80	45	130	35
Beispiel 7	0.7	IO	30	27	35
Vcrgleichs- beispiel 7	9,7	15	30	41	35
Beispiel K	9,7	80	30	219	61
Beispiel 9	9,7	*'Jl*	10	47	61
Vergleichs beispiel H	9,7	15	10	141	61
Beispiel IO	9,7	30	U)	282
Beispiel 11

Cyeloilexirin- Ausheuic Kiew.·"Ό, Ικ/ομοη iiiif «.Isis Substrat)	Ausheule im /f-Cyclodextrin- pulver (dew.-¹¹ n. bezogen «uf ilas Substrat)
28,4	26
53,9	50
60,1	55
35,5	31
60,8	55
61,2	56
27,3	23
57,4	51
60,7	55

Bei Verlllngeruna tier Roukllons/.eli auf 72 Stunden wurden im wesentlichen dieselben Ergebnisse wie In «5 der vorstehenden Tnbello erhalten, und es wurde gefunden, daß die Reaktion bereits nach 48 Stunden ein Gleichgewicht erreicht hatte,

Beispiele 12 bis 17
und Vcrglcichsbcisplcle 9 bis 11

Hin Dextrinpulver mit einem D. Ä. von 10,5, cn
haltend 0,4¹Vo Glucose und 2,1 ⁿ/ti Maltose, wurde at

SüßkartolTelstärke in im wesentlichen derselben Weise wie im Beispiel 6 erhalten.

Das erhaltene Dextrin wurde in einer vorbestimmten Konzentration in derselben rohen Hn/ymlösimg, die im Beispiel 6 verwendet wurde, gelöst. Der pH- 5 stimmt.

schließend wurde die Lösung 50 Stunden bei 4.VC in Ciegenwart von 1-Dccanol zur Reaktion gebracht. Nach der Reaktion wurde 1-Dccanol durch Destillation entfernt, und Cyclodextrin wurde quantitativ be-

Wert der Lösung wurde auf 6,3 eingestellt, und an-

Die lirgebnissc sind in Tabelle V aufgeführt.

Tabelle V	D. Λ.	l-inheit tier rollen Knzyinlüsung (Hinheitcn ml)	S (g/100 ml)	CR (Finhcilcn μ Substrat)	194/μ	Ausbeute an Cyclodextrinpulver (Gew.-'/ο, bezogen auf das Substrat)
An.xalz	10,5	15	45	24	20	24,2
Vcrglcichs- beispiel 9	10,5	30	45	4<>	2*)	35,8
Beispiel 12	10,5	80	45	130	2^l)	37,2
Beispiel 13	10,5	10	30	27	35	28,3
Vcrglcichs- beispiel 10	10,5	15	30	41	35	36,0
Beispiel 14	10,5	80	30	21')	35	38,1
Beispiel 15	10,5	5	10	47	61	22,2
Vergleichs beispiel 11	10,5	15	10	141	61	37,7
Beispiel 16	10,5	30	10	282	61	38,7
Beispiel 17

Bei der dünnsehichtchromatographischen Analyse /!-Cyclodextrin charakteristische gelbe Flecken nur in wurde ein violetter Flecken von \-Cyclodextrin in Spuren gefunden,

allen Ansätzen beobachtet, jedoch wurde der für

Beispiele 18 und l^l> und Vergleichsbeispicl 12

Dieselbe Reaktion wie im Beispiel 12 wurde durch- «to wurde und Teirachloräthan als Cyclodextrin-Konv geführt, wobei jedoch das Dexlrinpulvcr mil einem plexierungsmiltcl verwendet wurde. Die Ergebnisse D. A, von 10,5, hergestelll im Beispiel 12, verwendet sind in Tabelle Vl aufgeführt.

Tabelle VI	IVA.	Hinhcit ilei rollen Hn-	(μ'ΙΜιηΙ)	(W	I¹M	/\| .s Ausbeute. Hit ii-('l>	Ausbeute an /U'O
Λ lisa I /.		(lin- hcitcn/ml)	40 '	(I inltei- tcn/g Substtni)		((iew. "n, be/.ogen mil uns Substrat)	((ilW. "Ί>, lH'7.O\|!ell nut (Ins butan nt)
	10,5	10	40	19	31	17,6	10,9
Vergleichs- bcispicl 12	10,5	30	40	57	31	29,3	24,9
Beispiel 18	10,5	80		152	31	20,4	37,9
Beispiel 19		Beispiel 20		6u den	8 I	Triohlorltthylen zu der	Lösung gefügt. D

40 kg eines pulverigen Dextrins mil einem D. Ä. von 10,3, enthaltend 0,3"/« Glucose und 2,1 <·/» Mallose, erhallen durch Behandlung von SUIJknrlolTelslltrkc mil verlUlsslgeiuler A-Amylase, wurden in 76 I einer rohen Unzymlosung von Bacillus maecrnns mit einer Lin/.ymslllrke von HO lilnhcllen/ml gelüsl. Nach ninstcllimg des pll-Wertes der Lösung auf 6,5 wur-

65

¹W - 152, Ι94/1Λ9 31). Andererseils wurden 89 1 der vorstehenden rohe lin/ymlösung mit einer lin/.ymstUrkc von 80 Einhc ten/ml zu 18 kg eines Stärkehydrolysat« mit eine D. A, von 2,4, enthaltend im wesentlichen keine GIi eosc und Maltose, gefügt. Nach Einstellung des pl Wertes der Lösung auf 6,5 wurden 8 ITriehlorhthyli

zugegeben. Die Mischung wurde 45 Stunden bei 45° C gerührt (CR = 340, 194/VS = 46).

Nach der Reaktion wurde die Reaktionsmischung zur Entfernung von Trichloräthylen durch Dampfdestillation erhitzt. Anschließend wurde die Reaktionsmischung auf 90 bis 95° C gehalten und durch Diatomeenerde unter Verwendung einer Filterpresse filtriert. Im Falle des Cyclodextrins mit einem D. Ä. von 10,3 als Substrat konnte ein klares Filtrat leicht erhalten werden. Das Filtrat wurde auf 5° C gekühlt, und die ausgefällten Kristalle wurden durch Filtration gesammelt und aus Wasser umkristallisiert, wobei 19,8 kg reines ^-Cyclodextrin als kristallines Pulver (Ausbeute 49,5<Vo, bezogen auf das Gewicht des Substrats) erhalten wurden.

Wenn andererseits das Stärkehydrolysat mit einem D. Ä. von 2,4 verwendet wurde, wurde die Reaktionsmischung auf die Hälfte ihres ursprünglichen Volumens nach Entfernung von Trichloräthylen durch Dampfdestillation konzentriert und unmittelbar danach auf 5° C zur Bildung von Kristallen gekühlt. Die Kristalle wurden in Wasst r gelöst und auf einer Filterpresse filtriert. Das Filtrai wurde in derselben Weise wie vorstehend behandelt, wobei 8,8 kg reines /^-Cyclodextrin als kristallines Pulver (Ausbeute 48,9"/O₁ bezogen auf das Gewicht des Substrats) erhalten wurden.

Beispiele 21 und 22 und Vergleichsbeispiel 13

Ein Kulturmedium, enthaltend l,2°/o Stärke, l,O°/o Maiswasser, 0,6 %> Ammoniumsulfat und 0,3% CaI-ciumcarbonat, wurde sterilisiert. In das Medium wurde Bacillus macerans eingeimpft und aerob bei 37° C während 1 bis 3 Tagen gezüchtet, um rohe Enzymlösungen mit verschiedenen Enzym-Einheiten zu bilden.

30 g eines Stärkehydrolysate mit einem D. Ä. von 9,7, enthaltend 2,0% Maltose (Glucose war nicht nachweisbar), wurden in 82 ml einer jeden der Enzymlösungen gelöst. Nach Einstellung des pH-Wertes einer jeden der Lösungen auf 6,5 wurden 10 ml Trichloräthylen zugegeben, und die Mischung wurde 48 Stunden bei 45° C gerührt.

Nach der Reaktion wurde Cyclodextrin quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII aufgeführt. Die dünnschichtchromatographische Analyse ergab, daß das Produkt fast ausschließlich /3-Cyclodextrin war.

Tabelle VlI

Ansatz

D.Ä.

Stärke der	CR	194/l's	Ausbeute an
rohen Enzym			Cyclodextrin
lösung
(Einheiten/ml)	(Einheiten/g		(Gew.-Vo,
	Substrat)		bezogen auf das
			Substrat)
10	27	35	31,2
15	41	35	58,9
30	82	35	62,0

Vergleichsbeispiel 13

Beispiel 21
Beispiel 22

9,7
9,7
9,7

Auf die Teile der Beispiele und Vergleichsbeispiele, die die Herstellung der Stärkehydrolysate betreffen, wird kein Schutz beansprucht.

Claims

keiten des Standes der Technik wurden bislang VerPatentanspruch: fahren vorgeschlagen, bei denen die Konzentration

des Ausgangsmaterials durch Verwendung eines

Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrinen Stärkehydrolysate erhöht wird, welcher, durch Hydrodurch Umsetzung einer wäßrigen Lösung eines 5 lyse von Stärke mit einem Enzym oder einer Saure Stärkehvdrolysats mit einem D. Ä. von nicht mehr auf ein D. Ä. (Dextrose-Äquivalent) von 15 oder a!s 20 mit Cyclodextrin-transglycosylase in Gegen- nicht mehr als 20 erhalten wird, um Cyclodextrine mit wart eines Cyclodextrin-Komplexierungsmittele, guter industrieller Wirksamkeit zu erhalten,
d a d u r c h g e k e η η ζ e i c h η e t, daß Ein solcher Vorschlag — japanische Patentschrift

ίο 2380/71 — lehrt, daß eine Starke zuerst mit

(i) die Gesamtmenge von Maltose und Glucose, Λ-Amylase oder einer Säure auf ein D. Ä von nicht

die in dem Stärkehydrolysat bei Initiierung mehr als 15 partiell hydrolysiert wird und eine wäß-

der Reaktion enthalten ist, nicht mehr als rige Lösung des erhaltenen Stärkehydrolysate mit

5 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gewicht einem D. Ä. von nicht mehr als 15 mit einer Starke-

des Stärkehydrolysats, beträgt, und 15 konzentration von mindestens 8% mit Cyclodextrin-

(ii) die Aktivitätsmenge der Cyciodextrin-trans- transglycosylase in Gegenwart eines Cyclodextrin-

glycosylase in der Reaktionslösung bei Komplexierungsmittels (oder Ausfallungsmittels) um-

Initiierung der Reaktion die folgende Glei- gesetzt wird. Auch die US-PS 34 25 910 (die der

chung erfüllt: GB-PS 1185 207, der CA-PS 8 57 304 und der FR-PS

CR Ξ> 194/1/5, *° 15 41 576 entspricht) lehrt, daß eine wäßrige Lösung

eines Stärkehydrolysats mit einem D. Ä. von nicht

worin 5 die Konzentration in g pro 100 ml der mehr als 20 in einem ähnlichen Verfahren verwende! Reaktionslösung des Stärkehydrolysats bei der wird.

Initiierung der Reaktion ist und eine positive Zahl Es wurde nunmehr bei der Untersuchung der en-

von 10 bis 50 darstellt, und CR die Zahl ist, die »5 zymatischen Herstellung von Cyclodextrinen unter die Einheiten von Cyclodextrin-transglycosylase Verwendung einer wäßrigen Lösung eines Stärkepro g des Stärkehydrolysats angibt. hydrolysats gefunden, daß, selbst wenn wäßrige Lösungen von Hydrolysaten derselben Stärke mit demselben Dextrose-Äquivalent, die jedoch von verschie-30 denen Ansätzen erhalten wurden, in derselben Stärkehydrolysatkonzentration verwendet werden, die Aus-

Cyclodextrine, ebenso als Cycloamylase oder beuten der durch die enzymatische Reaktion unter Schardinger-Dextrine bekannt, können aue Stärke deneelben Bedingungen erhaltenen Cyclodextrine in durch die Einwirkung eines Enzyms hergestellt wer- unvorhersehbarer Weise variieren und die Ausbeuteden, das im allgemeinen als Cyclodextrin-trans- 35 reproduzierbarkeit schlecht ist. Dies ist ein sehr glycosylase (B. macerans-Amylase) bekannt ist. Die schwerwiegender Nachteil für die industrielle Durch-Quelle des Enzyms ist im allgemeinen eine Kultur führung dieser Verfahren. Es wurde auch gefunden, von Bacillus macerane. Diese CycSodextrine werden daß, wenn die Konzentration des Stärkehydrolysats auf Grund der Anzahl von Glucose-Einheiten klassi- bei den vorstehenden experimentellen Verfahren erfiziert bzw. eingeteilt und werden als a-Cyclodextrin 4° höht wird, beim Versuch, die Verfahren für den in-(6 Glucose-Einheiten), /Ϊ-Cyclodextrin (7 Glucose- dustriellen Betrieb vorteilhaft zu gestalten, die Cyclo-Einheiten) und y-Cyclodextrin (8 Glucose-Einheiten) dextrinausbeuten manchmal niedriger werden,
bezeichnet. Dieses Ergebnis, welches im Hinblick auf die Aus-

Die Verfahren zur Herstellung dieser Cyclodextrine rüstung bzw. die Geräte und die zu behandelnde werden z. B. von E. B. Tilden und C. S. Hudson 45 Menge für ein industrielles Verfahren sehr nachteilig in »J. Am. Chem. Soc«, 44, 143?. (1942) und von ist, folgt auch aus den Ergebnissen der Beispiele der D. French in »J. Am. Chem. Soc«, 71, 353 (1949) vorstehenden japanischen Patentschrift 2380/71. Zum beschrieben. Gemäß den in diesen Literaturstellen be- Beispiel wird im Versuch V dieser Patentschrift ein schriebenen Verfahren wird eine Kulturbrühe bzw. Stärkehydrolysat mit einem D. Ä. von 5 (welcher Kulturflüssigkeit von Bacillus macerans mit einer 5° Wert in dieser Patentschrift als bevorzugt angesehen Stärkelösung gemischt, um eine enzymatische Reak- wird), erhalten durch Hydrolyse von Kartoffelstärke tion bei 35 bis 40° C zu bewirken. Wenn die Kon- mit im Handel erhältlicher verflüssigender Amylase, zentration der Stärke in der Reaktionslösung auf über in einer Konzentration von 11 Gewichtsprozent ver-5 Gewichtsprozent erhöht wird, wird die Viskosität wendet und 4 Tage bei 37° C unter Verwendung von der Lösung jedoch ebenfalls höher. Als Folge davon 55 Trichloräthylcn als Cyclodextrin-Komplexierungsunterliegt die Lösung einer »Retrogression« (»Retro- mittel umgesetzt. Cyclodextrine werden in einer Ausgradation«) bei der verwendeten Temperatur und wird beute von 58% erhalten. Wenn andererseits die vorhalbfest. Das halbfeste Material ist schwer zu hand- stehende Reaktion wiederholt wird mit dem Unterhaben und verringert merklich die Wirkung des En- schied, daß die Konzentration des Stärkehydrolysate zyms, was eine Verringerung der Ausbeute des End- ^6o auf 35 Gewichtsprozent erhöht wird, nimmt die Ausproduktes zur Folge hat. Aus diesem Grunde beträgt beute an Cyclodextrinen auf 35 Gewichtsprozent ab. die bei diesem Verfahren erreichbare Konzentration Darüber hinaus lehrt Beispiel II der US-PS 34 25 910, des Ausgangsmaterials etwa 5 Gewichtsprozent hoch- daß, wenn ein Stärkehydrolysat mit einem D. A. von stens, so daß die Verfahren gemäß dem Stand der 2,0 (innerhalb des Bereiches von 0,5 bis etwa 6, was Technik eine geringe Effizienz bzw. einen niedrigen ⁶5 gemäß dieser Patentschrift bevorzugt ist) in einer Wirkungsgrad aufweisen, wenn sie industriell durch- höheren Konzentration verwendet wird, die Ausbeute geführt werden, an Cyclodextrinen zunimmt, jedoch beträgt die Aus-

Im Hinblick auf die Überwindung dieser Schwierig- beute nur 52°/o nach der Umsetzung einer wäßrigen