DE2424833B2

DE2424833B2 - Verfahren zur Herstellung von Maltose

Info

Publication number: DE2424833B2
Application number: DE2424833A
Authority: DE
Inventors: Takashi Adachi; Hidemasa Yokohama Kanagawa Hidaka; Kanagawa Kawasaki; Yutaka Machida Tokio Nakajima; Fumio Sugawara; Chobe Yomoto; Tsukasa Yoshida
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1973-05-22
Filing date: 1974-05-22
Publication date: 1980-03-27
Also published as: IN139775B; FR2230726B1; JPS505591A; FR2230726A1; IT1011854B; US3998696A; CA1017694A; NL163563B; GB1433847A; BE815415A; DE2424833C3; JPS5244378B2; NL163563C; NL7406921A; DE2424833A1

Description

15 bei einer Reaktionstemperatur von 45—65° C und einem pH-Wert von 5,0—7,0 beträgt

2. Verfahren nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Spaltung der verflüssigten Stärke durch gleichzeitige Einwirkung von /J-Amylase und der Streptomyces-Amylase bei einem pH-Wert von 4,5—7,0, einer Temperatur von 45—65°C und einer Reaktionszeit von 72 Stunden erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Spaltung der verflüssigten Stärke zunächst durch 0-Amylase bei einem pn-Wert von 4,5—6,0 und anschließend durch die Streptomyces-Amylase bei einem pH-Wert von 5,0—7,0 bei einer Gesamtreaktionszeit von nicht mehr als 72 Stunden erfolgt

4. Verfahren nach Anspruch 1—3, dadurch gekennzeichnet, daß eine verflüssigte Stärke mit einem DE-Wert unterhalb 10, insbesondere unterhalb 4 eingesetzt wird.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Maltose durch enzymatische Spaltung verflüssigter Starke durch Amylase unter Verwendung einer Kombination aus 0-Amylase und einer solchen Amylase, die von den im Hauptanspruch genannten Stämmen erhalten wurde.

Bekanntlich ist Maltose ein Disaccharid, bei dem zwei Moleküle D-Glukose über eine «-Bindung miteinander vereinigt sind. Sie bildet ein weißes Pulver oder farblose Kristalle, besitzt hohe Wasserlöslichkeit und eine erhebliche Süßkraft, die etwa einem Drittel bis der Hälfte derjenigen von Rohrzucker entspricht

Aus diesem Grunde wird Maltose als Süßstoff verwendet, wobei sie Eigenschaften entwickelt, die reinem Rohrzucker durchaus überlegen sein können, Außerdem findet Maltose u. a. Verwendung als Nährboden in der Gährungsindustrie sowie als Ausgangsmaterial für die Gewinnung von Maltoscderivaten wie Maltit usw.

Maltose kann nach einem bekannten Verfahren durch Einwirkung von «-Amylase auf verflüssigte Stärke gewonnen werden. Auch /J-Amylase, iso-Amylase oder Pulluianase wurden als Enzyme für die enzymatische Spaltung verflüssigter Stärke bereits vorgeschlagen.

Bei der kombinierten Anwendung dieser Enzyme bilden Maltose und Maltotriose die hauptsächlichsten Reaktionsprodukte, wobei mit dem Grad der Einwirkung von «-Amylase die Bildung von Maltotriose gefördert wird. Andererseits kann Maltotriose bekanntlich durch keines der vorgenannten Enzyme hydrolysiert werden.

Es ist daher erforderlich, die Menge der entstehenden Maltotriose so niedrig als möglich zu halten, um eine hohe Ausbeute an Maltose zu erzielen.

Bei der gleichzeitigen Einwirkung von a-Amylase und j9-Amylase auf verflüssigte Stärke wird im allgemeinen im Saccharifizierungsprodukt ein Maltosegehalt von etwa 40% bis max. 70% erhalten.

Um diesen Maltosegehalt zu erhöhen, wurde bisher so verfahren, daß man entweder eine verflüssigte Stärke mit sehr niedrigem Dextroseäquivalent einsetzt, was durch laufende Kontrolle der a-Amylaseeinwirkung j-> während der Verflüssigung erreichbar ist, oder es wurde eine durch mec ^mische Verflüssigung hergestellte Stärke mit 0-Amylase und iso-Amylase enzymatisch gespalten.

Da aber verflüssigte Stärke bekanntlich schon bei relativ niedrigen Konzentrationen zur »Umkehr« neigt und diese Reaktion mit steigender Konzentration zunimmt, kann ein Endprodukt mit hohem Maltosegehalt im industriellen Maßstab aus hochkonzentrierter Stärke nur sehr schwer gewonnen werden. r. Aus diesem Grunde war es bisher im allgemeinen erforderlich, mit relativ niedrigen Stärkekonzentrationen zu arbeiten, was sich aber als erheblichen Nachteil auf die Produktionsquantität auswirkt.

Erfolgt die enzymatische Spaltung der verflüssigten Vi Stärke durch iso-Amylase, so ist es erforderlich, bei Temperaturen von 50—55'C in Gegenwart von

^-Amylase zu arbeiten. Dabei bilden sich jedoch in erheblichem Maße Nebenprodukte und schwerlösliche

Abscheidungen im Endprodukt, die weitere ernsthafte

ν-) Probleme aufwerfen.

Es wurde nun gefunden, daß die vorstehend abgeleiteten Nachteile überwunden werden können, und daß Saccharifizierungsprodukte mit einem erheblich höheren Anteil an Maltose gegenüber den bisher ho bekannten Verfahren gewonnen werden können, wenn gemäß der Erfindung gearbeitet wird.

Erfolgt die enzymatische Spaltung der verflüssigten Stärke durch gleichzeitige Einwirkung von 0-Amylase und der Streptomyces-Amylase, so liegen die Reakh'. tionsbedingungen bevorzugt bei einem pH-Wert von 43—7,0, einer Temperatur von 45—65°C und einer Reaktionszeit von 72 Stunden.

Wird die verflüssigte Stärke jedoch nacheinander mit

/J-Amylase und Streptomyces-Amylase behandelt, so wird vorzugsweise zunächst die /Ϊ-Amylase bei einem PH-Wert von 4,5—6,0 zur Einwirkung gebracht und anschließend die Streptomyces-Amylase bei einem PH-Wert von 5,0—7,0, Die Gesamtreaktionszeit beträgt dabei nicht mehr als 72 Stunden.

Für das Verfahren ist es besonders vorteilhaft, wenn eine verflüssigte Stärke eingesetzt wird, die einen DE-Wert von unterhalb 10, insbesondere unterhalb 4 aufweist

Es ist zwar aus der DE-OS 20 17 043 bereits bekannt, verflüssigte Stärke mit einer Kombination aus 0-Amylase und «-1,6-Glukosidasen umzusetzen, wobei als a-l,6-Glukosidasen ganz bestimmte, aus hitzebeständigen Strahlenpilzen wie z. B. Streptomyces diastatochromogenes gewonnene Enzyme verwendet werden.

Bei diesem bekannten Verfahren werden nicht nur andere Enzymquellen genutzt, es erfordert auch ein komplexes SysteJi von Kontroll- und Regelorganen, verbunden mit großem apparativen?. Aufwand, um begrenzte Temperatur- und pH-Bereiche einzuhalten.

Weiter bedient sich dieses bekannte Verfahren vorwiegend eines Zweistufenprozesses bei differenzierten Temperaturen und Zeiten, cm die pH-Empfindlichkeit aufzufangen.

Es wird nämlich — wie bekannt — das Amylopektin, als vorwiegendes oder ausschließliches Produkt mit Stärkekonstitution, während der Verzuckerung leicht in geradkettige Amylose umgewandelt, die ihrerseits zur Rückläufigkeit neifA

Durch eine unvorhergesehene pn-Erniedrigung in der Reaktionsmasse kann die Mmylasc schnell inaktiviert werden, so daß die Ausbeute an Maltose wegen Vergiftung erheblich zurückgeht.

Niedrige Temperaturen und lange Reaktionszeiten, umfangreicher Apparateaufwand und ein hohes Regel- und Kontrollniveau sind daher Voraussetzung für ein einigermaßen brauchbares Verfahren nach dem Vorschlag der DE-OS 20 17 043.

Demgegenüber erfolg! die Saccharifizierung der verflüssigten Stärke nach dem Verfahren der Erfindung ohne Akkumulation von Amylose, ohne die Gefahr von deren Rückläufigkeit und ohne die Notwendigkeit umfangreicher Apparate- und Kontrollorgane.

Das neue Verfahren kann somit in allen bekannten, einfachen Verzuckerungssystemen durchgeführt werden. Vergiftungserscheinungen treten nicht auf, weil die verwendeten speziellen Enzyme, wie sie im Kennzeichen des Hauptanspruchs aufgeführt sind, selbst bei Temperaturen bis 65°C noch beständig sind.

Das neue Verfahren hat gegenüber den bekannten Arbeitsweisen auch noch den Vorteil, daß eine erheblich geringere Enzymmenge bei höheren Stärkekonzenfi-ationen und kürzerer Saccharifizierzeit gegeben ist.

Die nacheinander oder gleichzeitig mit /7-Amylase verwendeten ganz bestimmten Streptomyces-Amylasen /eigen eine sehr starke Maltose-Bildungsaktivität sowie eine erhebliche Stärkeverflüssigungsfähigkeit.

Werden diese Eigenschaften in richtiger und den Maßnahmen der Erfindung entsprechender Weise mit denjenigen von />-Amylase kombiniert, so tritt ein synergistischer, die Maltoseausbeute steigender Effekt ein.

Herstellung der speziellen durch Streptomyces gebildeten Amylasen:

Ein geeignetes Verfahren ist in der FR-PS 21 10 070 beschrieben. Auch die spezifischen Eigenschaften der Enzyme werden in dieser Patentschrift abgehandelt. Die Nummern der Hinterlegungen und die Hinterlegungsstellen der verwendeten Streptomyces-Stämme geht aus Tabelle 1 hervor:

Tabelle 1

Stamm

Hinterlegungsstelle
und Nummer

FERM

ATCC

Streptomyces tosaensis 601 21723 Streptomyces hygroscopicus¹) 602 21722 Stvsptomyces viridochromogenes²) 603 21724 Streptomyces albus³) 604 21725 Streptomyces flavus 605 31378 Streptomyces aureofaciens 606 31379

Streptomyces hygroscopicus var. 607 31380 angustomycetes

) Dieser Stamm isi identisch mit Streptomyces hygroscopicus, wie in Waksman, »The Actinomycites«, Bd. 2 (1961) und in »Applied Microbiology«, IO (1962), S. 25S-263 beschrieben.

²) Dieser Stamm ist identisch mit Streptomyces viridochromogenes, wie in Waksman (I.e.) und in J. Bacteriol.. 85 (1963) S. 676-690 beschrieben.

³) Dieser Stamm ist identisch mit Streptomyces albus wie in Waksman (I.e.) beschrieben.

Die Herstellung der Streptomyces-Stämme erfolgt in bekannter Weise und unter Bedingungen, wie sie für Streptomyces üblich sind, d. tu es kann sowohl flüssig als auch fest kultiviert werden. Dabei wird im vorliegenden speziellen Falle die submerse und aerobe Kultivierung in flüssiger Phase bevorzugt.

Geeignete Kohlenstofflieferanten für das Zuchtmedium der genannten Streptomyces-Stämme zur Gewinnung der Amylase sind u. a. lösliche Stärke, Glukose, Maisstärke usw. Als Stickstofflieferanten eignen sich z. B. entöltes Sojamehl, entöltes Leinsamenmehl, Weizenkorn, Erdnußmehl, Fischmehl, Trockenhefe, entrahmte Milch, Kasein, Malzextrakt, Hefeextrakt, Natrium- und Kaliumnitrat usw.

Zusätzlich können dem Medium eines oder mehrere anorganische Salze wie Monokaliumphüsphst, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Eisensulfat, Calciumcarbonat u. a. zugesetzt werden.

Um das Wachstum des Microorganismus zu fördern und die Enzymbildung zu steigern ist auch der Zusatz von Spurenelementen geeignet.

Erfolgt die Inkubation der Streptomyces-Stämme, wie sie gemäß der Erfindung zur Anwendung kommen, bei einer Temperatur von 25—37°C und einem pn-Wert im Bereich zwischen schwach sauer und schwach alkalisch unter submers-aeroben Bedingungen (Belüften und Rühren) so erreicht die Bildung von Amylase in 3 bis 5 Inkubationstagen ein Maximum.

Für die Gewinnung der erzeugten Amylase wird die Kultur, in der die Inkubation der Streptomyces-Stämme erfolgte, in bekannter Weise aufgearbeitet. So wird z. B. durch Filtration zunächst der Mycelkuchen abgetrennt und das Filtrat durch Zusatz eines anorganischen Salzes ausgesalzen.

Ein hierzu besonders geeignetes Salz ist Ammoniumsulfat.

Die Amylase kann aber auch durch Fällung mit einem wassermischbaren organischen Lösemittel wie Äthanol, Methanol, Isopropanol, Aceton usw. oder durch ein

Adsorptions-Eluierverfahren aus dem Filtrat erhalten werden.

Durch bekannte Verfahren wie Heißlufttrocknung, Sprühtrocknung, Vakuumtrocknung, Gefriertrocknung usw. wird die abgetrennte Amylase dann in ein rohes Amylasepulver übergeführt

Durch Reinigung dieser rohen Amylase, z. B. nach dem Verfahren der FR-PS 2110 070, kann schließlich eine elektrophoretisch einheitliche reine Amylase gewonnen werden.

Die enzymatische Reaktion

Wird eine z.B. aus Streptomyces hygroscopicus (FERM 602; ATCC 21 722) gewonnene reine Amylase mit Stärke und Amylose umgesetzt, so werden die Kohlehydrate hydrolysiert unter Bildung einer kleinen Menge Glukose und eines erheblich größeren Anteils an Maltose, wie dies aus Tabelle 2 hervorgeht:

Tabelle 2

Substrat

Grad der Hydrolyse¹) Relative Zuckermenge²) Glukose Maltose

Maltooligozucker

Stärke
Amylose

74,8%
78,6%

3,2% 0,0%

58,2%
62,8%

38,6% 3-1,9%

') Der Hydrolysengrand wurde bestimmt durch Reaktion der Amylase mit dem Substrat bei pH 5,5-5,8, 50 C und 20 Std. bei einer Substratkonzentration von 1% (die Amylase wurde in einer Menge von 500 Saccharifizier-Einheiten per g Substrat zugesetzt), Messung des Gesamtgehalts an reduzierendem Zucker nach der Methode von SOMOGYI, Berechnung des ermittelten Gesamt-Zuckergchalt als Maltose und anschließend Bestimmung des Hydrolysegrads nach folgender Gleichung: Hydrolysegrad = Gesamtmenge an gebildeten Zuckern, berechnet als Maltose _y ^q

Menge an Stärke, berechnet als Maltose Der Begriff »Menge an Stärke berechnet aus Maltose« entspricht der vollständigen Subsirathydrolyse durch Erhitzen mit ausreichenden Mengen 2 N HCl, Neutralisation mit NaOH, Ermittlung der Menge gebildeter Glukose nach der Titrationsmethode von SOMOGYI und Berechnung der Glukose als Maltose durch Multiplikation mit 0,95.

²) Die »Relative Zuckermenge« wurde ermittelt durch chromatographische Fraktionierung des hydrolisierten Substrats sowie durch Bestimmung der Menge einer jeden Zuckerverbindung und Ermittlung der Verhältnisse untereinander in Gew.-%.

Spezifikation des Substrats

Beim Umsatz gereinigter Amylase von Streptomyces hygroscopicus (FERM 602; ATCC 2172?> mit verschiedenen Substraten werden folgende Hydrolyseprodukte erhalten:

Tabelle 3

Substrat

Grad der	Gebildete Zucker²)	±
Sacchari-		+ +
fizierung')	Gi G₂	++
100,0%	± (- + +
92,8%	± +++
45,8%	+++
106,5%	+++
91,0%	± +++
0,0%	-
0,0%
0,0%
0,0%

G₄

Lösliche Stärke

Maisstärke

Glykogen

Amylose

Dextrin

^-Cyclodextrin

»-Cyclodextrin

Maltohexose

Maltopentose

Fortsetzung

Substrat

Grad der Saccharifizierung¹) Gebildete Zucker²)
G, G,

Maltotetrose Maltotriose

Maltose

Phenyl- -D-glukoside

0,0% 0,0% 0,0% 0,0%

') Der »Grad der Saccharifizierung« ist bestimmt durch den Grad der Hydrolyse von löslicher Stärke durch die Fiinwirkuni einer bestimmten Menge gereinigter Amylase von Streptomyces hygroscopicus (FHRM 602; ATCC 21722) zur Erreichuni

von 100%.
²) Die »gebildeten Zucker« wurden analysiert durch Bestimmung mit Hilfe der Papierchromatographischen Methode im Anschluß an den Umsatz des Enzyms mit dem Substrat bei pn = 5.5, einer .Substratkonzentration von 0,8% und einer Enzym

knn7pntratinn vnn 000017°/. ht*i 40 (' während ί»Π Miniitnn

Die Symbole Gi, G2, Gi. G4. G5 stehen in der Reihenfolge für Glykose. Maltose. Maltotriose. Maltotelrose und Malto pentose.

Die erzeugten Mengen sind durch die Indizes definiert. Dabei bedeuten:
+ + + = Überwiegender Anteil:
+ + - hoher Anteil;

+ ^ erheblicher Anteil:

± = Spuren;

- = kein Zucker nachweisbar.

Eigenschaften der von Streptomyces hygroscopicus (FERM 602; AiCC 21722) erhaltenen reinen Amylase:

Tabelle 4

p_M-Wert der optimalen Aktivität: Temperatur der optimalen Aktivität: Pn-Abhangigkeit der Stabilität:

Thermische Stabilität:
Spezifische Aktivität:
Elementaranalvxc:

Molekulargewicht:

UV-Absorption:

Isoelektrischer Punkt:

Elektrophorese (in Celluloseacetat-Gel):

4,5-5,0 50-60 C Resiaktivität nach Behandlung des Enzyms bei 40 C währenc 60 Minuten bei p_H = 4,5-9,8 nicht unter 90% der Ursprungsaktivität Restaktivität nach Behandlung des Enzyms bei 30-95 C während 15 Minuten bei p,_t = 6,8 nicht unter 50% der Ursprungsaktivität Verflüssigungspotential.· 23100 Einheiten/mg N: Saccharifizie· rungspotential: 5900 Einheiten/mg N.

C = 44,87%

H = 6,84%

N = 13,84% Ca. 35000 (bestimmt nach der Gelfiltrationsmethode).

EiX = 13,1 bei 280 mu und p_H = 6,8.

Etwa bei pn = 4.3 (durch Elektrophorese gemessen).

Wanderung zum positiven Pol 2,2 cm während 65 Minutenbei einen Strom von 0,8mA/cm in Pufferlösung aus Tris-HCl') bei p_H = 8.7

PufTergemisch aus riydroximethylaminomethan und HCI einer Molarität von 0.005 bezüglich Hydroximethylaminomethan

Einzelheiten zum neuen Verfahren gemäß der Erfindung

Grundlage des nejen Verfahrens ist die Feststellung, daß eine verflüssigte Stärke mit ^-Amylase reagiert, wobei die Amylose- und Amylopektin-Ketten abgebaut werden. Diese Tatsache ist an sich bekannt

Anschließend werden nun weitere Kettenglieder durch den Einfluß der aus den Streptomyces-Stämmen gemäß Hauptanspruch erhaltenen Amylasen (Streptomyces-Amylasen) abgebaut bzw. zu Ende hydroüsiert

Da die Reaktionsgeschwindigkeiten der beiden Amylasen, also der jJ-Amylase und der Streptomyces-Amylasen, wie festgestellt wurde, verschieden sind, können die speziellen Streptomyces-Amylasen der Erfindung entweder gleichzeitig mit der jS-Amylase dem 55 Substrat zugegeben werden oder sie werden erst nach der Einwirkung der ^-Amylase zugesetzt

Durchführung des neuin Verfahrens zur Herstellung vo ι Maltose

60 Zunächst muß die als Substrat verwendete Stärke verflüssigt werden, da die gewöhnlich eingesetzter Stärken für Stärkehydrolysate wie Getreidestärke Kartoffelstärke, Tapiokastärke, Reisstärke, Weizenstärke sowie deren «-Inversionsprodukte direkt nicht

65 verwendbar sind.

Geeignete bekannte Verflüssigungsverfahren sind mechanische Einwirkung zusammen mit Erhitzung oder bekannte enzymatische Verfahren mit «-Amylase oder

Streptomyces-Amylasen.

Von Vorteil ist ein Kettenabbau gemäß einem DE-Wert von unter 10, insbesondere unter 4, doch sind höhere DE-Werte nicht unbedingt als negativ zu werten.

Nach beendeter Verflüssigung wird das Gemisch geHihlt. Hierbei soll möglichst ein Temperaturbereich von etwa 45—65°C eingestellt werden, weil dieser für die Reaktion der ^-Amylase besonders günstig ist.

Anschließend wird der pn-Wert auf 1,5 — 6,0 eingestellt und die /?-Amylase zugegeben.

Die Reaktionszeit richtet sich nach der Menge des eingesetzten Enzyms, nach der Reaktionstemperatur und nach dem pn-Wert.

Bei der Einwirkung der 0-Amylase stellt sich im allgemeinen ein Maltosegehalt von ca. 60% ein.

Anschließend wird gemäß dem Verfahren der FrfinHiing Her Ahhan Her Stärke Hurrh Finwirkiing der speziellen Streptomyces-Amylasen der Erfindung fortgesetzt. Dabei kann noch vorhandene 0-Amylase vorher zerstört werden oder sie kann auch in der Lösung belassen bleiben.

Die Menge der eingesetzten speziellen Streptomyces-Amylasen der Erfindung liegt bei 200—1500 Einheiten pro Gramm Stärke bei einer Reaktionstemperatur von 45—65°C und einem pn-Wert von 5,0—7,0. Die verwendeten Einheiten des Enzyms (Aktivitätseinheiten) werden folgendermaßen bestimmt:

Eine Mischung aus 1 ml Enzymlösung, 2 ml 2%ige StI kelösung und 2 ml Mcllvaine-Pufferlösung vom pH = 5,5 werden während 3 Minuten bei 40⁰C inkubiert.

Durch Überführung von 1 ml der Mischung in SOMOGYI's Reagenz wird die Reaktion gestoppt, die Menge erzeugter reduzierender Zucker nach der Titrationsmethode von SOMOGYI bestimmt und als Maltosegehalt der Gesamtlösung von 5 ml berechnet. Eine Einheit entspricht der Enzymmenge, die in 60 Minuten Im g Maltose erzeugt.

Die Saccharifizierungszeit liegt in der Praxis bei 72 Stunden. Nach dieser Zeit wird ein Gehalt bzw. Umsatz von 80-90% Maltose erzielt.

Die Lösung wird anschließend durch Aktivkohle und Ionenaustauscher entfärbt 'ind gereinigt. Schließlich folgt die Konzentrierung auf die gewünschte Stärke.

Beispiel 1

6 kg Süßkartoffel-Stärke, enthaltend 16 Gew.-%

Wasser, werden in 11 Liter Wasser suspendiert, der pn ι> auf 6,0 eingestellt und bei 87°C mit 10 Einheiten/Gramm Stärke einer verflüssigenden Amylase behandelt. Nach Inaktivierung der Amlyase durch Verkochen liegt der DE-Wert bei 3_:6.

Die Lösung wird nun auf 55⁰C abgekühlt und durch .'» Zugabe von 15 Einheiten 0-Amylase/Gramm Stärke im

Verlauf von 4 Stunden saceharifiziert.
Anschließend wird die teilsaccharifizierte Lösung

zwecks Inaktivierung der ^-Amylase gekocht und

erneut auf 55⁰C abgekühlt.
y-i Während der pn-Wert der Lösung auf 6,0 gehalten wird, werden 1200 Einheiten Amylase von Streptomyces hygroscopicus (FERM 602; ATCC 21722) pro Gramm Stärke zugesetzt und die Saccharifizierung im

Verlauf von 70 Stunden zu Ende geführt.
in Dann wird erneut verkocht, anschließend filtriert und mit Aktivkohle oder einem Ionenaustauscher in

bekannter Weise entfärbt und gereinigt.
Die Zusammensetzung des erhaltenen Produkts,

bestimmt durch Gas/Flüssig-Chromatographie, ist folsi gende:

verfahren

% Zuckeranteil Glukose

Maltose

Maltotriose

a) gemäß Beispiel 1 7,2 15 Einheiten jS-Amylase plus 1200 Einheiten der Amylase aus Streptomyces hygroscopicus (FERM 602; ATCC 21722)

b) Vergleichsbeispiel 9,4 1500 Einheiten der Amylase aus Streptomyces hygroscopicus (FERM 602; ATCC 21722) allein, also ohne /i-Amylase

83,6

76,4

4.8

Beispiel 2

100 kg Kartoffelstärke mit 18 Gew.-% Wasser werden zu einer 30%igen wäßrigen Suspension verrührt, auf einen p_H von 6,0 eingestellt und durch 200 Einheiten einer Streptomyces-Amylase pro Gramm Stärke bei 85° C verflüssigt.

Die Lösung wird anschließend zwecks Inaktivierung der Amylase mit Dampf behandelt und dann mit 15 Einheiten ^-Amylase pro Gramm Stärke während 2 Stunden bei ph 6,0 saceharifiziert

Die hierbei gewonnene Lösung enthält neben Wasser als Zucker 62% Maltose, 03% Maltotriose und 37,7% Dextrin.

Die Lösung wird auf 55° C abgekühlt, mit 1500 Einheiten οξγ Amylase von Sireptomyces hygroscopicus (FERM 602; ATCC 21 722) pro Gramm Stärke versetzt und im Verlauf von 48 Stunden bei p_H 6,0 zu Ende saceharifiziert. Schließlich wird, wie im Beispiel 1

angegeben, entfärbt und gereinigt, sowie auf 75% aufkonzentriert.

Der Zuekeranteil setzt sich aufgrund der gaschromatographischen Analyse wie folgt zusammen:

8,0% Glukose, 84,5% Maltose und 5,0% Maltotriose.

Beispiel 3

1,4 kg Kornstärke werden in 1,5 Liter Leitungswasser suspendiert, verflüssigende Amylase und Ca(OH)₂ in Mengen von 03% bzw. 0,02%, bezogen auf die Stärke, W) zugegeben, die Lösung auf einen ph von 6,0 eingestellt und in 1,3 Liter heißes Wasser von 90-91⁰C eingegossen.

Dann wird die Gesamtlösung während 10 Minuten auf 120⁰C erhitzt und durch Zusatz von 0,05% Amylase erneut verflüssigt

Danach wird zwecks Inaktivierung der Amylase auf 100° C erhitzt und auf 55° C abgekühlt

Jetzt wird durch Zugabe von ^-Amylase in einer

Menge von 0,2% der Stärke während 4 Stunden und anschließend durch Zugabe von 800 Einheiten der Amylase von Streptomyces hygroscopicus (FERM 602; ATCC 21 722) pro Gramm Stärke während 72 Stunden zu Ende saccharides.

Die Lösung wird wie im Beispiel 1 beschrieben aufgearbeitet und hüf 75% aufkonzentriert.

Der Zuckeranteil besteht aus 43% Glukose, 80,2% Maltose und 9,5% Maltotriose.

Beispiel 4

Die Wiederholung des Beispiels 3 bei einer Saccharin · zierungstemperatur von 60°C und 48 Stunden Dauer ergibt ein Produkt mit 4,2% Glukose, 81,4% Maltose und 9,2% Maltotriose.

Die in den Beispielen 1—4 verwendete Amylase aus Streptomyces hygroscopicus (FERM 602;

ATCC 21 722* wird folgendermaßen hergestellt:

100 ml einer Nährkultur aus 2% "Maismehl, 1% Weizenkeime und 0,5% eines durch Extraktion von Baumwollsamen gewonnenen pulverförmigen pflanzlichen Eiweiß, Ph = 7,0, wird in einem 500-ml-Kolben sterilisiert.

Nach dem Animpfen mit Sporen oder Mycellen von Streptomyces hygroscopicus (FERM 602;

ATCC 21 522) wird bei 28° C unter Schütteln während 24 Stunden kultiviert.

20 Liter eines Produktionsansatzes, enthaltend 12% lösliche Stärke, 3% Sojamehl und 0,2% Monokaliumphosphat (ph = 7,0), werden daneben in einer 30-Liter-Weithalsflasche sterilisiert, gekühlt und mit der vorstehend bereiteten Impfkultur versetzt.

Anschließend wird bei 35° C während weiteren 90 Stunden kultiviert

Die Maische wird dann filtriert, das Filtrat auf '/5 des ursprünglichen Volumens eingeengt und mit der doppelten Menge an kaltem Äthylalkohol das Enzym ausgefällt.

Nach dem Trocknen werden 77 Gramm Rohenzym mit 45 000 Einheiten je Gramm erhalten.

Beispiel 5

Das Beispiel 4 liefert unter gleichen Bedingungen wie angegeben, jedoch mit dem Enzym aus Streptomyces tosaensis (FERM 601; ATCC 21 723) anstelle des Enzyms von Streptomyces hygroscopicus (FERM 602; ATCC 21 722) ein Produkt mit folgendem Zuckeranteil: Glukose 4,5%, Maltose 80,6% und Maltotriose 9,4%.

Das von Streptomyces tosaensis (FERM 601;

ATCC 21 723) erhaltene Enzym wird nach folgender Vorschrift hergestellt:

Sporen oder Mycelien von Streptomyces tosaensis (FERM 601; ATCC 21 723) werden in 100 ml einer Einzelkultur eingeimpft^ die aus 2% Maismehl, 1% Weizenmehl und 0,5% eines durch Extraktion von Baumwollsamen gewonnenen pulverförmigen pflanzlichen Eiweiß besteht.

Bei einem ph von 7,0 wird dann in einem 500-ml-Kolben unter Schütteln bei 28⁰C während 24 Stunden mit Belüftung kultiviert

Die Kultur wird anschließend in 20 Liter einer Produktionsmaische eingerührt, die 8,4% Maismehl, 2% Polypepton und 0,2% Monokaliumphosphat enthält und einen pn von 7,0 aufweist.

Kultiviert wird bei 28°C während 85 Stunden unter Schütteln und Belüften.

Die Maische wird filtriert und d?*s Fütret be· ?in?r Temperatur unter 40°C im Vakuum auf 'Λ des ursprünglichen Volumens eingedampft. Die nach dem Ausfällen mit der zweifachen Menge kaltem Äthylalkohol erhaltene Amylase von Streptomyces tosaensis (FERM 601; ATCC 21 723) wird getrocknet.

Dabei fallen 28 Gramm eines Rohprodukts an, das 22 000 Einheiten pro Gramm enthält

Beispiel 6

Bei gleicher Arbeitsweise wie in Beispiel 4 beschrieben wird mit der Amlyase von Streptomyces albus (FERM 604; ATCC 21 725) ein Produkt enthalten, dessen Zuckeranteil aus 3,9% Glukose, 81,0% Maltose und 9,0% Maltotriose besteht.

Das Enzym wird folgendermaßen gewonnen:

Eine Einzelkultur aus 2% Maismehl, 1 % Weizenkeime und 0,5% eines durch Extraktion von Baumwollsamen gewonnenen pulverförmigen pflanzlichen Eiweiß vom Ph 7,0 wird sterilisiert und mit Sporen von Streptomyces albus (FERM 604; ATCC 21 725) geimpft. Es wird bei 28° C und 24 Stunden kultiviert.

Die Kultur wird mit 20 Liter einer Stamrolösung vereinigt, die 9,4% Stärke, 1,3% Fischmehl und 0,2% Monokaliumphosphat enthält und einen pn von 7,0 aufweist.

Bei 35⁰C wird während 90 Stunden zu Ende kultiviert.

Nach dem Einengen des Filtrats auf Vs des ursprünglichen Volumens wird mit der zweifachen Menge kaltem Äthanol gefällt Dabei wird nach dem Trocknen ein Rohenzym erhalten (53 Gramm), das 10 000 Einheiten pro Gramm enthält

Claims

Patentansprüche:

1, Verfahren zur Herstellung von Maltose durch enzymatische Spaltung verflüssigter Stärke, dadurch gekennzeichnet, daß die verflüssigte Stärke gleichzeitig oder nacheinander mit 0-Amylase und Streptomyces-Amylase, die von

Streptomyces tosaensis ATCC 21723, Streptomyces hygroscopicus ATCC 21722, Streptomyces viridochromogenes ATCC 21724, Streptomyces albus ATCC 21725, Streptomyces flavus ATCC 31378, Streptomyces aureofaciens ATCC 31379 und Streptomyces hygroscopicus var. angustomycetes ATCC 31380

erhalten wurde, behandelt wird, wobei die Menge der eingesetzten Streptomyces-Amylase jeweils zwischen 200 und 1500 Einheiten pro Gramm Stärke 2u

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