DD69330B1 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung eines Pflanzenglucan abbauenden Enzyms - Google Patents

Description

a) Titel der Erfindimg

Verfahren zur biotechnischen Herstellung eines Pflanzengluc an abbauenden Enzyms

b) Anwendungsgebiet der Erfindung

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung eines Pflanzengluean abbauenden Enzyms vorgeschlagen.

Das Enzym kann zum Abbau von Getreideglucan, speziell von Glucan aus Gerste, Weizen oder anderer pflanzlicher Herkunft, mit ß-1,3- und ß~1,Ц-Bindung bei der Herstellung von Bier u, a. verwendet werden.

c) Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Glucan wird neben Xylan und Araban zu den sogenannten Gummistoffen dei· Gerste gerechnet. Es ist bekannt, daß Gerstenglucan ein Glucosepolymer ist, das aus ungleichen Anteilen von ß-1,3- und ß-1,^-glycosidischen Bindungen aufgebaut ist. Das Glucanmolekül besteht aus einer unverzweigten Kette von Glucosebausteinen, in der wahrscheinlich die ß-1,4-Bindungen häufiger vertreten sind als die ß-1,3-Bindungen.

Zur Zeit sind 3 Polysaccharide bekannt, die durch ß-1,3- und ß-1,4-Bindungen verknüpft sind. Es handelt sich dabei um Gerstenglucan, Weizenglucan uncl um Lichenin« Über die Sequenz der 1,3- bzw. 1,4-glycosidischen Bindungen gibt es widersprechende Angaben. Ein weiteres Glucan, das auc

B-Glucopyranoseresten aufgebaut ist und ß-1,3-BiDdUDgen enthält, ist in der Hefezellwaod eotdeckt worden. Die Synthese eines nicht näher definierten ß-Glucaos durch eine Mutante vod Alkaligeoes faecealis ist ebeofalls beschriebeo worden. Comyceteozellwände enthalten Glucane mit ß-1,3- und β-Ι,Α-glycosidischen Bindungen, Agrobacterium. tumefaciens scheidet in geeigneten Kulturlösungen einen weiteren Typ von Glucan mit ß-ljE-glycosidischen Bindungen ab. Ferner werden Glucane mit ß-1,6-Bindungen (Pustulan und Luteose) beschrieben.

Für den enzymatischen Abbau einiger Glucane sind je nach Bindungsverhältnissen einige spezifische Enzyme bekaont geworden. Bs wurde eine ß~1,3~Glucanase aus Pilzen hergestellt. Über ReiniguDg und Eigenschaften einer ß-1,3-Glucanase aus Bacillus circulans wird ebenfalls berichtet. Das Substrat Laminarin wird durch ß-1,3-Glucanase in Glucose, Laminaribiose, Laminaritriose und andere Oligosaccharide gespalten. Auch aus dem Magensaft von Helix pomatia konnte ein ähnliches Enzym gewonnen werden. Ebenfalls wurde über eine Isolierungsmethode einer Glucanase berichtet, die aus einem Amylasekonzentrat gewonnen wurde. Über die Gewinnung des Amylasekonzentrates lagen keine Angaben vor.

Weiterhin wurde über eine suboptimale Glucanasebildung im Iiabormaßstab uDter Verwendung eines Kulturmediums nach Güntelberg berichtet·

d) Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung eines Enzyms mit hoher Glucanaseaktivität, insbesondere zum Abbau von Getreideglucan, zu entwickeln.

e) Darlegung des Wesens der Erfindung

Der ErfinduDg liegt die Aufgabe zugrunde, einen Glucanase produzierenden Mikroorganismenstamm an ein hohes Glucan-

1.1» Fold der vegetativen ZeIlen

Spaltungsvermögen zu adaptieren und anschließend in einem geeigneten Nährmedium zu kultivieren.

Erfindungsgemäß wird das dadurch erreicht, daß als Mikroorganismen stamm Bacillus subtilis COHN 1872, der nicht mehr über die Fähigkeit verfügt, Nitrat zu reduzieren, eingesetzt wird. Der Stamm hat folgende Charakteristik:

a) Morphologische Charakteristika

Bewegliche Längsstäbchan mit abgerundeten Zellenden, als Einzel- oder Doppelstäbchen bzw. kurze Ketten

2,5 - 6,0 χ 0,6 - 0,8/i oval ohne bestimmte Lokalisation in den Sporangien nicht angeschwollen positiv, im Alter g^amlabil junge Zellen homogen tin-

2. 3*

4, 1.5.

Größe Sporen

Sporangien Graorverhalten

1·6. Methylenblaufärbung

1·7. Wachstum

a) auf Fleischbouillon agar

b) Fleischbouillon giert nicht vakuolisiert

üppiges Wachstum, Kolonien mattglänzend, schmutzigweiß, Band gelappt, z.T. mycelartig ausgefranst Agarstrich: üppige Kolonie an der Oberfläche, entlang des Striches schwaches Wachstum üppiges Wachstum in Form weißer Schlieren und eines zarten, leicht brüchigen Oberflächenhäutchens, leichte Trübung

c) Fleischbouillon und üppigeres Wachstuni als in Glucose reiner Fleischbouillon,

dickes, festes Oberflächenhäutchen

d) Fleischbouillon und 7 % NaCl: sehr schwaches NaCl Wachstum

5 % NaCl: üppiges Wachstum

e) Wachstum auf Kartof- üppiges Wachstum, Kolonien felscheiben bzw, schleimig, feuchtglänzend, -.keilen schmutzweiß bis gelblichbraun, nach 3-4 Tagen bei 37° C Bläschenbildung (mit Schleim gefüllt), Kolonien im Alter dunkelbraun, keine Faltung

b) Physiologische Charakteristika

VOGES-PKOSKAÜSB-REÄKT K>N (Acetylmethylcarbinol) +

Gelatineverflüssigung +

Koagulation von Milch +

Caseinhydrolyse +

Katalase +

Kitratreduktase -

Gasbildung in nitrat- und glucosehaltiger Pepton-Kährlösung +

Gasbildung in nitrathaltiger Fleischbouillon (ohne Glucose) -

NHy-Bildung in Peptonnährlösung +

H₂S-Bildung

Indolbildung -

Citratverwertung +

Wachstum bei + 56° C

pH-Veränderung in Peptonnährlösungen (6 Tage bei 37° C) 7,0 8,6/8,8 Veränderungen von Lackmusmilch (10 Tage bei 37° C) Alkalisierung (pH 6,0/8,3)

Säurebildung aus Kohlenhydraten (ohne Gasbildung):

Glucose +

Saccharose +

Mannose +

Galactose +

Arabinose +

Lactose -

Maltose +

Dextrin +

Mannitol +

Salic in +

Stärke +

Die Diagnostik des verwendeten Stammes ergab trotz der morphologischen und physiologischen Variationsbreite eine sichere Zuordnung zur Art Bacillus subtilis COHN 1872 und eine eindeutige Abgrenzung zu anderen Arten entsprechend dem Bestimmungsschlüssel in Bergey's manual (Breed et al· 1957) und. dem von Smith et al. 1946 ("Aerobic mecophilic sporeforming bacteria U.S. Dept. AGR, Misc. Publ. No. 559)sowie Smith et al. 1952 ("Aerobic sporeforming bacteria" U.S. Dept. Agric. Monogr. No. 16).

Eine Probe des erfindungsgemäß verwendeten Produktionsstammes ist seit dem. 30. 3· 1967 in der Stammsammlung des Institutes für Mikrobiologie der Humboldt-tmiversitat zu Berlin, Außenstelle 1532 Kleinmachnow, Max-Reimann-Str. 16, unter der Stammsammlungsnummer 3712 hinterlegt.

Der in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur biotechnischen Herstellung eines glucanspaltenden Enzyms benutzte Stamm spaltet insbesondere Gerstenglucan, wobei als Spaltpro-

dukte Oligosaccharide und in geringem Umfang Glucose auftreten. Ferner konnte ait der hergestellten Glucanase kein enzymatischer Abbau des Laminarins erreicht werden. Da im Gerstenglucan sowohl ß-1,3- als auch ß-1,4-glycosidische Bindungen in bestimmter Sequenz und sterischer Anordnung enthalten sind, erstreckt sich das Spaltungsvermögen des genannten Enzyms auf die im Getreideglucan vorliegende spezifische chemische Struktur.

Der Bacillus subtilis COHN 1872, der nicht mehr über die Fähigkeit, Nitrat zu reduzieren verfügt, wird an ein hohes Glue anspaltungsvermögen adaptiert, indem er abwechselnd auf festen und flüssigen Nährböden, wahlweise mit oder ohne Glucan, kultiviert wird.

Die Produktion der Glucanase erfolgt mit dem o. g. Bacillus subtilis-Stamm im Submersverfahren. Das selektierte Stamm-Material wird zunächst in ein geeignetes Inoculum, welches Fleischwasser, Λ % Pepton und 0,5 % NaCl enthält, übertragen. Die Schüttelkolben werden 18 bis 24 Stunden bei 30° C auf einer Schutt elmase hin e mit etwa 220 Ausschlägen/min inkubiert. Danach erfolgt die Über impfung des Inoculums in das jeweilige Produktionsmedium·

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Glucanase erfolgt aerob unter submersen Bedingungen in Schüttelkolben mit etwa 10 % Füllung. Im technischen Maßstab werden Fermentationstanks aus nicht rostendem Stahl mit Rührwerken und steriler Luftzuführung benutzt. Das Produktionsvolumen der sorgfältig zu sterilisierenden Kulturflüssigkeit kann mehrere 10 m^J betragen. Die Nährlösung muß geeignete Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthalten, die durch den Sterilisationsmodus nicht wesentlich geschädigt werden dürfen. Die Beimpfung des sterilisierten Nährmediums erfolgt mit 1 bis 5 % Impfmaterial. Die Züchtungstemperaturen liegen vorzugsweise zwischen 28 und 37° C. Als Antischaummittel können beispielsweise Silikonöle und pflanzliche oder tierische Fette oder öle mit gutem

Erfolg verwendet werden. Die Kulturdauer ist in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des Nährbodens auf 24 bis 72 Stunden bemessen. Die Belüftungsmenge beträgt in Abhängigkeit von dem jeweiligen physiologischen Zustand der Kultur 0,3 bis 1 l/min. Am Ende der Fermentationszeit werden 100 bis 150 IS/ml Glucanase, 3 000 bis 5 000 ΙΕ/ml Amylase und 1 bis 2 PUcas Protease erreicht.

Die Bestimmung der Glucanase wurde in Anlehnung an die Empfehlungen des IUB (1961) unter Verwendung von Gerstenglucan als Substrat (I. A. Preese and KG Mackenzie J. Inst. Brew. J28, 353 - 363, 1952) mit 3,5-Dinitr©salicylsäure durchgeführt. Nach Beendigung der Fermentation wird die Kulturlösung von den Bakterien und Nährbodenbestandteilen abgetrennt, im Vakuum eingeengt und mit organischen Lösungsmitteln, anorganischen Salzen oder anderen Fällungsmitteln gefällt und danach getrocknet.

f) Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Bacillus subtilis COHN 1872, der nicht mehr über die Fähigkeit, Nitrat zu reduzieren verfügt, wird zunächst auf einem Selektionsagar ohne Glucose ausgeplattet. Die charakteristischen Einzelkolonien mit schwach gefaltetem Band, glänzend und leicht rosa gefärbt, wurden auf einem Nährboden, bestehend aus Gerstenschrot, Agar, NaCl und MgSO^, ausgestrichen. Die Inkubation dieser ersten Überimpfung, die gleichzeitig eine Adaptation an das Gerstenglucan beinhaltet, dauert mindestens 48 Stunden bei 30° C. Durch wenigstens zwei weitere Passagen auf dem gleichen glue anhält igen Nährboden wird die Adaptation an die GIucanspaltung weiter erhöht. Die Inkubationsdauer dieser Passagen wird zweckmäßigerweise auf mehrere Tage bis mehrere Wochen ausgedehnt. Zellsuspensionen von der letzten Passage werden dann in einen flüssigen Propagationsnährboden, der kein Glucan enthält, übergeimpft. In dieser Stufe kommt es· lediglich auf eine kurszeitige Vermehrung der Keime an,

weshalb dieses Medium neben 0,1 % Stärke auch 0,5 % Glucose enthält. Die Vermehrung ist nach 6 bis 7 Stunden beendet, ohne daß das hohe Glue anspaltungsv er mögen des Stamm-Materials abgeschwächt wird. Diese Propagationsstufe darf höchstens nur noch einmal bei einer Inkubationszeit, die Dicht länger als M bis 6 Stunden betragen darf, wiederholtwerden. Dieses Inbculum wird anschließend in Produktionsmedien, die bis zu 9 % Gerstenschrot enthalten (hohe Glucankonzentration) eingeimpft und fermentiert·

Beispiel 2

Pur das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von GIucanase mit dem erfindungsgemäßen Bacillus subtilis-Stamm wird folgender Nänrboden benutzt!

9 % Ger st en se brot

3 % Sojabohnenschrot

0,25 % (KV₂SO^

0,2 % KH₂PO^ und

1,2 * Na₂HPO^

Leitungswasser

pH -vor dem Sterilisieren: 7,2

pH nach dem Sterilisieren: 6,5 bis 6,9.

Das Produktionsmedium wird zu je 50 ml in 500 ml große ßundstehkolben abgefüllt, sterilisiert, beimpft und anschließend auf die Schüttelmaschine gebracht. Die notwendige Beimpfungsmenge beträgt 1 bis 2 %. Die Keimdichte des Impfmaterials soll zweckmäßigerweise bei 6 · 10 Keimen/ml liegen. Die Schütteldauer beträgt 3 Tage, die Inkubationstemperatur liegt zweckmäßigerweise bei 30° C. Während einer Inkubationsdauer von 3 Tagen wird in dem Produktionsmedium neben einer beachtlichen Menge an Glucanase, nämlich 80 bis 150 ΙΕ/ml, auch noch Amylase und Protease gebildet. Die Amylaseproduktion liegt zwischen 2 000 und 5 000 ΙΕ/ml. Die gebildete Menge der Amylase ist von der Menge der gebildeten Glucanase unabhängig.

- 9 Beispiel 3

Die Produktion der Glucanase erfolgt in einem 500 1-V2A-Stahl-Fermentationstank mit Zwangsbelüftung. Die Zusammensetzung des Nährbodens ist folgende:

2 % Gerstenschrot

2. % Kartoffelstärke

0,95 % Sojamehl

1,5 % (NH^) 2HPO^

0,08 % Natriumzitrat und

diverse Spurenelemente, Leitungswasser,

Nach dem Sterilisieren bei 120° C und 30 Minuten wird die H-Ionenkonzentration auf pH 7,0 bis 7,2 eingestellt. Nach dem Erkalten erfolgt die Beimpfung unter sterilen Bedingungen mit 2 % Impfmaterial. Die Belüftung während der logarithmischen Wachstumsphase beträgt 0,7 1 Luft auf 1 1 Flüssigkeit in der Minute. Die Rühr geschwindigkeit des Ruhrers beträgt je nach Beschaffenheit desselben 160 bis 420 U/min. Nach 36 Stunden wird die Fermentation unterbrochen, da die Kohlenhydrate aufgebraucht sind und eine Verschiebung des pH-Wertes auftritt. Nach eine» Kultur dauer von 36 Stunden werden 100 bis I50 IE Glucanase, 2 000 bis 3 000 IS Amylase und etwa 1 PUase gebildet.

Beispiel Ц

1 000 ml Kulturfiltrat mit einer ß-Glucanaseaktivität von 150,0 ΙΕ/ml und einer Alpha-Amylaseaktivität von 5 000 XE/ pil werden durch den Zusatz von Calciumgel geklärt. Die Ausfällung des gewünschten Enzyms erfolgt unter Rühren mit festem (NH^)₂50^. Das Fällungsinittel kann in pro analysi oder technischer Qualität eingesetzt werden. Die Fällung erfolgt bei einer Temperatur von 10° C bis Zimmertemperatur. Der Niederschlag wird im Vakuum bei einer Temperatur bis maximal 40° C getrocknet und anschließend homogenisiert .

Durch kurzzeitiges Behandeln des feuchten Präparates mit Aceton unter 0° C wird die Trocknungszeit des Präparates wesentlich herabgesetzt und eine Aufhellung des Präparates erreicht. Das Endprodukt ist pulverförmig, nicht hygroskopisch und in Wasser gut löslich.

Ausbeute

Aus 1 000 ml Kulturfiltrat obiger Aktivität werden 10 g Festprodukt mit einer Aktivität von 9,0 IS/mg ß-Glucanase und 160 IE Alpha-Amylase erhalten, das entspricht einer Ausbeute von ca. 90 % ß-Glucanase und ca. 35 % Alpha-Amylase.

Beispiel 5

Fällung mit Aceton

1 000 ml Kulturfiltrat von obiger Aktivität werden unter Rühren bei einer Temperatur unter 0° C mit Aceton bis zum Sättigungsgrad von 0,65 versetzt. Der pH-Wert der Kulturlösung wird mit Phosphatpuffer nach SORENSEN auf pH 7 eingestellt. Das Fällungsprоdukt wird nach obiger Beschreibung aufgearbeitet.

Ausbeute

Es werden 11,5 g Festprodukt mit folgender Aktivität erhalten :

ß-Glucanase: 8,0 ΙΕ/mg = 82 %

Alpha-Amylase: 300 ΙΕ/mg = 77 %.

Claims (3)

1. Erfindungsansprüche

   Verfahren zur biotechnischeD Herstellung eines Pflanzenglucan abbauenden Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß Bacillus subtilis СОШТ 1372, der nicht mehr über die Fähigkeit verfügt, Nitrat zu reduzieren und der unter der Nummer 3712 in der Stammsammlung des Institutes für Mikrobiologie der Humboldt-Universität zu Berlin hinterlegt ist, eingesetzt wird.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm an ein hohes Glucanspaltungsvertnögen adaptiert wird und daß die vom natürlichen Substrat stammenden Bacillus subtilis-Stäcime abwechselnd auf festen oder flüssigen und andererseits glueanhaltigen bzw. glueanfreien Nährmedien kultiviert werden.
3. 3. Verfahren nach don Punkten 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Stamm zur Steigerung einer Glucanasebildimg Glucan als Induktor in dem SelektionsnährbodeE, dein Inoculum und/oder dem Produktionsmedium verwendet wird und daß als Kohlenhyirat- und Glueanquellen Gerstenschrot, Wei2.enkleie, Weizen schrote oder Weizenmehle- in Verbindung mit Stärke sowie alle Glucanquellon anderer pflanzlicher Herkunft dienen.