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Verfahren ur Gewinnung von Poly- und Oligosaccharide spaltenden Enzymen
unter Verwenden, von Hefen Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Herstellung von Hefeenzyrnen, die geeignet sind, glycosidische Bindungen in Poly-
und Oligosacchariden hydrolytisch zu spalten.
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Der enzymatische Abbau von Poly- und Oligosacchariden hat grosse technische
Bedeutung u.a. in der Gärungsindustrie, der Lebensmittelindutrie, der Textilindustrie,
der chemisch-pharmazeutischen Industrie, der Medizin usw.
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Man hat bereits hierzu pflanzlische Enzyrne (z.B. die des Malzes)
e geeignete Enzyme aus Bakterien und oder Schimmelpil verwendet (vergl. Reed, G.,
Food Processing", Academic Pressm New York 81966)).
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Bekanntlich sind Alpha- und Beta-Amlyasen aus Malz vorwiegend geeignet
zum Abbau stärkeartiger Polysaccharide. Diese können auch durch Enzyme verschiedener
Bakterien und Schimmelpilze (z.B. α-Amylase aus Bacillum subtilis, Glucoamylase
aus Aspergillusarten
) gespalten werden. Hefeenzyme wurden für diesen
Zweck bisher nicht verwendet, da die Enzymaktivitaten dieser Organismen für eine
technische Nutzung als nicht ausreichend befunden wurden Neben stärke artigen Polysacchariden,
deren Glucosebausteine vorwiegend α-1,4-glycosidisch verknüpft sind, gibt
es in der Natur andere Polysaccharide, beispielsweise Dextrane bakteriellen Ursprungs,
deren vorwiegender Bindungstyp die α-1,6-glycosidische Verknüpfung der Glucoseeinheiten
ist.
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Die oben genannten Enzyme können aus diesem Grunde Dextrane nicht
hydrolysieren. Dextrane werden technisch in grossen Mengen hergestellt und nach
Zerlegung des sehr hochmolekularen Polysaccharids in geeignete Fraktionen (Säurehydrolyse/Ultraschalleinwirkung)
als Ersatz für Blutplasma bei Bluttransfusionen verwendet. Dextrane können unter
gewissen Umständen (bakterielle Infektionen) auch als Bestandteile von Lebensmitteln
oder l.oh- bzw. Zwischenprodukten der Lebensmittelherstellung auftreten. Nach neueren
zahnmedizinischen Erkenntnissen besteht auch die Matrix der Zahn-Plaques (u.U. kariesfördernde
Ablagerungen unlöslicher Polysaccharide bakteriellen Ursprungs an den Zähnen) zum
überwiegenden Teil aus Dextranen oder dextranähnlichen Polysacchariden, Einige spezielle
Bakterien und Schimmelpilze (z,G, Lactobacillus bifidus, Cellovibrio fulva, Bacteroides,
Penicillium funiculosum, P. lilaceum u.a.m.) sind in der Lage, Enzyme zu bilden,
die Dextrane spalten können (Dextranasen). Bei Hefen sind Dextranasen bisher unbekannt.
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Im Verlaufe von Untersuchungen, deren Ziel es war, die Fähigkeit von
Mikroorganismen zum Abbau verschiedener Polysaccharide zu prüfen, wurde nun gefunden,
dass Hefen der Gattung Lipomyces Enzyme bilden, die stärkeartige Polysaccharide
und Dextrane sowie Oligosaccharide der entsprechenden Bindungstypen hydrolytisch
spalten.
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Die Erfindung geht von einem Verfahren zur Herstellung von Enzymen
zur Spaltung von Poly- und Oligosacchariden aus und ist dadurch gekennzeichnet,
dass Hefen der Gattung Lipomyces in einem die für das Hefewachstum und die Enzymbildung
erforderlichen Nährstoffe aufweisenden Medium unter aeroben Bedingungen kultiviert
und die Poly- und Oligosaccharide spaltenden Enzyme in den Hefezellen und im Medium
angereichert werden Durch das erfindungsgemässe Verfahren unter Verwendung von Hefen
zu Herstellung dieser Enzyme wird technologisch eine Reihe von Vorteilen erreicht:
1.) Durch Züchtung im sauren pH-Bereich lassen sich unerwün.schte Infektionen durch
viele Bekterienarten vermeiden.
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2.) Züchtungsmöglichkeit der Hefen unter Zusatz von Antibioticis,
die das Aufkommen unerwünschter Bakterien unterdrücken.
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3.) Zur Züchtung können einfache und daher preiswerte Substrate verwendet
werden.
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4.) Im Gegensatz u Schimmelpilzen bereitet die Submerskultur von Hefen
technologisch wenig Schwierigkeiten.
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5.) Im Gegensatz zu Bakterien lassen sich Hefen aus Nährsubstraten
leichter abtrennen.
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6.) DurchZugabe von Poly- bzw. Oligosacchariden entsprechender Konstitutionen
einzeln oder in Kombination zum Nährrnedium ist es möglich, wahlweise die Synthese
von Enzymen zur Spaltung vorwiegend α-1, 6-glucosidisch verknüpfter Poly-
und Oligosaccharide, vorwiegend a-l, 4-glycosidisch verknüpfter Poly- und Oligosaccharide
oder α-1, 6- und a-l, 4-glyeosiaisch verknüpfter Poly- und Oligosaccharide
zu intensivieren.
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Die Anwendung von Hefeenzymen, die Poly- und Oligosaccharide in vergärbare
Zucker spalten, ist für die Gärungsindustrie vor grosser Bedeutung, da wie schon
zu Beginn dargelegtbisher Hefen mit technisch nutzbaren Enzymaktivitäten zur
Spaltung
stärkeartiger Kohlenhydrate nicht bekannt waren. Der Einsatz von Bakterien- bzw.
Schimmelpilzenenzymen ist nicht in allen Bereichen der Gärungsindustrie möglich.
Hier führen die erfindungsgemäss beschriebenen Hefeenzyme zu technisch neuen Arbeitsweisen.
Bemerkenswert ist in diesem Zusammenhang, dass von diesen Hefen keine geschmacksnegativen
Stoffwechselprodukte gebildet werden.
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Die in der GärungDsindustrie, der Lebensmittelindustrie und Textilindustrie
gebräuchlichen Enzyme aus Malz, Bakterien und Schimmelpilzen zeichnen sich dadurch
aus, dass sie vornehmlich α-1,4-glycosidische Bindunen spalten Ihre Aktivität
gegenüber -l,ö-verknüpften Glucoseeinheiten ist sehr gering und wird durch die in
diesen Enzymen bzw. Enzymkomplexen enthaltenen "Grenzdextrinasen" bewirkt. Die erfindungsgemäss
erzielbaren Hefeenzyme zeichnen sich demgegenüber durch hohe Aktivität gegen α-1,4-
und α-1,6-verknüpften Glucoseeinheiten aus. In der Dextranindustrie werden
zum Plutplasmaersatz geeignete Dextranfraktionen überwiegend durch Behandlung der
hochmolekularen Rohdextrane mit Säuren oder Ultraschall hergestellt, die enzyrnatisciie
Hydrolyse hat sich hier vor allem wegen mangelnder Eignung der Enzyme und aus v^Jirtschaftlicllkeitsgründen
noch nicht eingeführt. Die Anwendung von Dextranasen aus Hefen ist hier vor allem
deshalb interessant, weil diese Enzyme technologiscll einfach und somit preiswert
herzustellen sind. In der chemischen Industrie ist die Anwendung der beschriebenen
Hefeenzyme geeignet zur präparativen Darstellung von auf üblichem Wege schwierig
zu erhaltenen Oligosacchariden. In der pharmazeutischen Industrie sowie der Zahnheilkund
schiesslich können die Dextranasen aus Hefen bzw. entsprechende Zubereitungsformen
zur Kariesprophylaxe eingesetzt werden.
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Für das vorliegende Verfahren sind z.B. .B. folgende Stämme der Gattungs
Lipomyces geeignet:
Art Hinterlegungsstelle Stamm Lip. starkeyi
I.f.G. Nr. 0101 " " " " 0102 Lip. starkeyi C.B.S. " 1807 " " " " 1808 " " " " 1809
" " " " 1810 " " " " 2511 " " " " 2512 " " " " 2516 " " " " 5607 " " " " 5910 "
" " " 5911 Lip. lipofer " " 944 " " " " 2513 Lip. kononenkoae " " 2514 " " " " 5608
Kultiviert man diese Hefen vorzugsweise unter Belüftung in Nährmedien, die auf der
Basis von Hefeextrakt und/oder Pepton, Yeast Nitrogen Base (Difco-B392) Zusammensetzung
vergl.: "Difco Manual"). Auflage, Seite 251, Difco Laboratories, Detroit oder einer
geeigneten an sich bekannten Kombination anorganischer Salze und Spurenelemente
aufgebaut sind, unter Zusatz einer geeigneten Kohlenstoffquelle oder auf Bierwürze,
Brennereischlampe bzw. Melasse selbst, wobei auch hier eine oder mehrere geeignete
Kohlenstoffquellen zusätzlich zugegeben werden können, bei pH-Werten zwischen etwa
3,0 und 7,0, insbesondere zwischen pH 4,0 und 6,0 und bei Temperaturen zwischen
etwa 15° und 40°C, insbesondere zwischen 20 und 35°C über eine @inreichende Zeit,
so bilden diese Hefen Enzyme oben beschriebenen Charakters. Als Kohlenstoffquellen
lassen sich verwenden z.B. lösliche oder unlösliche Dexrtrane, lösliche oder nicht
gelöste Stärke bzw. stärkeähnliche Poly- und Oligosaccharide, Malzextrakt, Bierwürze
oder
Biertreber bzw, ein Extrakt aus Biertrebern, Brennereischlempe, Kartoffelpülpe oder
Melasse, Glucose, Maltose oder Saccharose sowie andere Mono- und Oligosaccharide
Die gewonnene Kulturflüssigkeit kann direkt mit Hefe, nach .btrennung der Hefe oder
nach Abtrennung und Konzentrierung oder Lyophilisation zum Abbau der beschriebenen
Poly- und Oligosaccharide verwendet werden. Es ist vorteilhaft, die abgetrennte
Hefe gegebenenfalls mehrmals zu waschen und das Waschwasser bzw die dazu verwendete
Pufferlösung zusammen mit der zellfreien Kulturflüssigkeit u.U0jedoch auch getrennt
zu verwenden bzw. aufzuarbeiten. Aus der abgetrennten Hefe selbst kann ebenfalls
nach Zellaufschluss durch geeignete Methoden eine enzymhaltige Lösung gewonnen werden.
Eine Ab trennung der Enzyme durch Fällung mit Ammoniumsulfat, Aceton oder anderen
gebräuchlichen Fällungsmitteln ist möglich. Die abgetrennten Enzyme können nach
Wiederaufnahme in Wasser bzw. Pufferlösungen im pH-Bereich zwischen pH 3,0 und 7,0
zur Spaltung der angegebenen Kohlenhydrate eingesetzt werden.
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Zur Prüfunh aur die Fcihigkeit, Enzyme zum Abbau von stärkeartigen
Polysacchariden und Dextranen r,u bilden, wurden die angegebenen heben in vivo bzw
ein zellfreies Kulturfiltrat der Hefestämme im Agat-Diffusionstest (vergl. Fleming,
J.R., Johnson, J.A. Getreide u Meiil 15m (10), 120-122 (196) untersucht. Als Substrate
dienten mit Reaktivfarbstoffen gekoppelte lösliche und unlöslcieh Dextrane bzw.
Stärke. An Hand der Bildung von Diffus ionshöfen konnte die Aktivität der Hefen
festgestellt werden. Der Hofdurchmesser ist direkt proportional dem Logarithmus
der Enzymkonzentration.
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Beispiel 1 Der Hefestamm Lipomyces starkeyi I.F.G. Nr. 0102 wurde
in 501 eines Nährmediums (0,5% Hefeextrakt, 0,5% Pepton, 0,5% Hohedextran, gepuffert
pH 5,2) unter Belüftung (1,5 1/Min.) 60 h bei 25° kultiviert. Die so erhaltene Kulturlösung
wurde
zentrifugiert, um die Hefe abzutrennen, Anschliessend wurde
die llawe Lösung sterilfiltriert. Ein Teil dieser Lösung wurde bei 4°C aufbewahrt
(Fraktionb, ein zweiter Teil bei 25°C zehnfach Konzentriert (Fraktion 2). Der dritte
Teil dieser Lösung (Fraktion 3) wurde lyopiiilisiert und für den nachfolgenden Test
in Pufferlösung (pH 5,5) in einer Menge, die 1,20 des ursprünglichen Volumens der
Fraktion 3 ausmachte, aufgenommen. Die Hefeernte wurde zweimal mit Pufferlösung
(pH 5ß-) ausgewaschen und ebenfalls lyophilisierta Die lyophilisierte Hefe wurde
anschliessend in Pufferlösung (pH ,,) aufgenommen und im Homogenisator nach Potter-Elvehjem
homoge ni iert. Nach Zentrifugieren des erhaltenen Homogenisats wurde der Überstand
sterilfiltriert (Fraktion 4)" Die zum Waschen der Hefe verwendete Pufferlösung,
wurde ebenfalls bei 4°C aufbewabrt (Fraktion 5) Die so erhaltenen fünf Fraktionen
wurden auf Dextranase- und Amylaseaktivität nach der oben angegebenen arbeitsweise
geprüpft (2% Agar; pH-Wert 0,5; 0,5% Substrat; 40°C; 24 h; 0,02 ml Probemenge an
Enzyme lösung). Unter den gleichen Bedingungen wurde der Hefestamm Lipomyces sta-rlreyi
I.F.G. Dir 0101 kultiviert, aufgearbeitet und auf Enzymaktivität geprüft. Die Dextranaseaktivitäten
der Kulturfiltrate und der zum Waschen verwendeten Pufferlösungen waren hoch. Durch
Konzentrieren oder Lyophilisation traten keine wesentlichen Aktivitätsverluste ein
Die aus den Homogenisierten Hefen gewonnenen Extrakte zeigten geringere Aktivitäten.
Die Amylaseaktivitäten waren bei allen Ansätzen ebenfalls gut, lagen aher etwas
niedriger als die Dextranaseaktivitäten.
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Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
Stamm Lipomyces
starkeyi I.F.G. Nr. 0101 Fraktion Hofdurchmesser Hofdurchmesser Nr. auf Dextran-
auf Stärke-Agar (mm) Agar (mm) 1 12,0 10,8 2 22,1 21,0 3 24,6 23,5 4 5,5 4,0 5 9,2
8,0 Stamm Lipomyces starkeyi I.F.G. Nr. 0102 Fraktion Hofdurchmesser Hofdurchmesser
NrQ auf Dextran- auf Stärke-Agar (mm) Agar (mm) 1 10,5 10,0 2 20,0 18,2 3 23,0 23,0
4 7,0 5,1 5 10,0 10,2 Beispiel 2 Kultivierung der Hefestämme wie unter Beispiel
1 beschrieben, jedoch unter Zusatz von 0,5% Stärke anstelle von Dextran. Bei Prüfung
der Enzymeaktivitäten wurde jetzt festgestellt, dans Stärke besser abgebaut wurde
als Dexrtrane.
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Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
Stamm Lipomyces
starkeyi I.f.G. Nr. 0101 Fraktion Hofdurchmesser Hofdurchmesser Hr. auf Dextran
auf Stärke-Agar (mm) Agar (mm) 1 10,7 15,0 2 20,5 25,3 35 24,0 2b,0 4 3,0 8,5 5
7,5 15,1 Stamm Lipomyces starkeyi I.f.G. Nr. 0102 Fraktion Hofdurchmesser Hofdurchmesser
lir. auf Dextran- auf Stärke-Agar (mm) Agar (mm) 1 9,1 14,5 2 18,9 24,6 35 22,0
27>6 4 3,5 8,1 5 8,9 13,4 Beispiel 3 Kuktivierung der Hefestämme wie unter Beispiel
1 beschrieben, jedoch unter Zusatz von 0,25% Dextran und 0,25% Stärke. Die Prüfung
der Enzymaktivitäten zeigte, dass Stärke und Dextrane in etwa gleichem Masse hydrolysiert
wurden.
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Beispiel 4 a) Zu jeweils 100 ml einer 3%igen gepufferten Stärkelösung
(lösliche Stärke Merck 1253, pH 5,5, bei 40°C gerührt) wurden je 10 ml zellfreien
Kulturfiltrats der Hefestämme Lipomyces starkeyi I.f.G. Nr. 0101 und 0102 (Kultivierung
siehe Beispiel 2) zugesetzt. Nach 30 Minuten zeigten Proben, die den Ansätzen laufend
entnommen und mit Jodlösung versetzt wurden, Jodnormalität. Die gleichen Ansätze
wurden unter Verwendung von kurz aufgekochter Kartoffelstärke (unlöslich) wiederholt.
Die hochviskose Suspension war nach 5 Minuten verflüssigt, Jodnormalität
wurde
nach 70 Minuten beobachtet b) Zu jeweils 120 ml einer 3%igen Suspension von unlöslichern
Dextran (Sephadex G 200, gepuffert, pH 5,5, bei 400C gerührt) wurden je 1 ml eines
zehnfach konzentrierten zellfreien Kulturfiltrats der Hefestämme Lipomyces starkeyi
I.f.G. Nr. 0101 und 0102 (Kultivierung siehe Beispiel lr zugesetzt. nach 135 Minuten
(0102) bzwA 14,5 Minuten (0101) war das unlösliche Dextran vollständig in Lösung
gegangen. Die Ansätze wurden unter Verwendung von Sephadex s 150, q 100 und G 75
mit gleichem Erfolg wiederholt. In Ansätzen, die unter den beschriebenen Bedingun-Den,
jedoch unter Verwendung von 3% pulverisiertem unlöslichem Rohdextran durchgeführt
wurden, war die Suspension des unlöslichen Rohdextrans innerhalb von 9 Minuten in
eine klare dünnflüssige Lösung überführt. Als Nullproben dienten Reaktions-Ansätze,
denen zur Inaktivierung der Enzyme 0,» ml 50%ige Trichloressigsäure zugegeben worden
war. Hier liess sich kein Abbau der Substrate erkennen.
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Beispiel 5 Der Hefestamm Lipomyces starkeyi I.f.G. Nr. 0102 wurde,
wie unter Beispiel 1 beschrieben, jedoch auf filtrierter Brennereischlempe ohne
Zusatz von Dextran oder Stärke kultiviert. Ein Teil der zellfreien Kulturlösung
wurde lyophilisiert und auf α-Amylaseaktivität untersucht (vergl. Metl. of
Analysis of teile Am. Soc. of Brew. Chemists, 5. Auflg 1949). Der in der Bestimmungsmethode
angegebene Zusatz von α-Amylase unterlieb. Eine α-Amylaseeinheit ist
definiert als die Menge an α-Amylase, die 1 g lösliche Stärke bei 200C in
1 Ii bis zum Farbstandard rotbraun dextriniert. Die α-Amylaseeinheiten berechnen
sich nach:
Stärkemenge im Substrat (g). 60 Min.
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Enzymmenge (g) Dextrinierungszeit Es betrugen: Stärkemenge im Substrat
(30 ml 2%ige Stärkelösung) 0,6 g Stärke Enzymmenge, die zugegeben wurde 50 mg Lyophilisat
Dextrinierungszeit 19 Min.
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Alpha-Amylasseinheiten = ####### = 37,9 Beispiel 6 a) Drei ml 1%ige
gepufferte Dextranlösung (pH 5,5, 40°C) wurde mit 100 mg zellfreiem Lyophilisat
des Hefestammes Lipomyces starkeyi I.f.G. Nr. 0102 (Kulturbedingungen wie im Beispiel
1 beschrieben) versetzt. Von diesem Ansatz werden zu den Zeiten O h, 35 11 und 6
h Proben entnommen, die Enzymwirkung durch Zugabe von Trichloressigsäure unterbrochen
und die entstandenen bbauprodukte gelchromatographisch nachgewiesen (Trenel, G.,
John, M., Dellweg, H.
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Gel Chromatographic Separation Of Oligosaccharide At Elevated Temperature,
FEBS Letters, Vol. 2, No. 1, 74-76, 1968).
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Dabei betrug die Aufgabemenge, die in die Trennsäule eingespritzt
wurde, 100 µl inaktivierten Enzymansatzes.
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Die Chromatogramme (s. abb. 2 - 4) zeigen den Verlauf der enzymatischen
Reaktion.
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Zur Zeit 0 h (Abb. 2) sind neben der hochmolekularen Fraktion Gn
nur die Oligosacchardie G4 (Isomaltotetraose) und G5 (Isomaltopentaose) nachweisbar.
Diese entstammen dem zugegebenen enzymhaltigen Lyophilisat (s. dazu Abb. 1 Chromatogramm
von 100 mg Lyopililisat, die in 3 ml Pufferlösun aufgenommen wurden. Dort wird darüber
hinaus sichtbar, das d hochmolekulare Dextran (Gn) der Nährlösung nahezu vollständig
abgebaut ist.) Zur Zeit 3 h (Abb. 3) ist das hochmolekulare Dextran des Enzymansatzes
schon weitegehend abgebaut. Die Bildung von Oliogosacchariden G1 (Glucose),
G2
(Isomaltose), G3 (Isomaltotriose), G4 (Isomaltotetraose) und G3 (Isomaltopentaose)
ist bereits stark fortgeschritten.
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Aus Abb. 4 zur Zeit 0 h ist zu ersehen, dass die hochmolekulare Fraktion
(Gn) nahezu vollständig zu Oliogsacchardien abgebaut ist. Darüber hinaus wird deutlich,
dass auc G4 und G3 zugunsten von G1, G2 und G3 abgenommen haben; dies stellt einen
eindeutigen Nachweis des Abbaus von α-1,6-glycosidisch verknüpften Oligosacchariden
der.
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b) In gleicher Weise die unter a) beschrieben wurden 3 ml einer 2%igen
Stärkelösung mit 100 mg Lyophilisat des gleichen Hefestammes (Kultur jetzt jedoch
wie in Beispiel 2 angegeben) inkubiert und untersucht. abb. (0 h) zeigt auch hier
nur die dem Lyophilisat entstammenden Oligosaccharide G4 (Maltotetraose) und G5
(Meltopentaose). Nach 3 h (Abb. 6) ist deutlcih zu erkennen, dass G4 und G5 zugenommen
haben und daneben auch G1 (Glucose), G2 (Maltose) und G3 (Maltotrioise) entstanden
sind. Nach 4 h (Abb. 7) hat die hochmolekulare Fraktion (Gn) stark abgenommen G1,
G2 und G3 treten auf Kosten von G4 und G5 in höhrer Konzentration auf, was auch
hier den Abbau von Oligosacchariden, diesmal jedoch solcher, die α-1,4-glycosidisch
verknüft sind, deutlich werden lässt.
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Patentansprüche