DE2003652A1

DE2003652A1 - Verfahren zur Gewinnung von Cellulase

Info

Publication number: DE2003652A1
Application number: DE19702003652
Authority: DE
Inventors: Masanobu
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1969-02-03
Filing date: 1970-01-28
Publication date: 1970-07-30
Also published as: DE2003652B2; US3677899A; DE2003652C3; FR2037059A1; GB1278195A

Description

Essen, den 23. Januar 1970 K«ttwigar Straß· 36

Kyowa Hakko Kogyo Kabushiki Kaisha,
No.6-1, 1-chome, Ohte-machi,
Chiyoda-ku, Tokyo-to ( J A P A N)

"Verfahren zur Gewinnung von Cellulase"

Man erhält durch Züchten eines Mikroorganismus, der Holz verfaulen läßt, vom Genus Lampteromyces oder Fomitopsis in einem Kulturmedium eine neue Cellulase und gewinnt sie aus dem Medium· Die so gewonnene Cellulase hat eine hohe C₁- und CMC-aae-Aktivität bei einem niederen p_H~0ptimum.

Vorliegend· Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Cellulaet duroh Züchten von Baeidiomyoetea in einem Kultur·

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Patentanwälte Dr. W. Andrejewski, Dr. M. Honice, 43 Essen, Kettwiger Straße

medium, das entsprechende Mengen an Kohlenhydraten, Stickstoff-Quellen, anorganischen Salzen, einen Fermentations-Aktivator und dergleichen enthält.

Cellulase ist eine bekannte Substanz, welche aus Tieren wie Schnecken, Venusmuscheln und dergleichen und einigen Mikroorganismen erhalten werden kann. Die aus diesen Quellen stammende Cellulase hat jedoch trotz umfassender Bemühungen keine weite praktische Anwendung gefunden.

Die Gründe dafür sind z.B. die, daß Mikroorganismen, die zu den Gattungen Chaetomium und Myrothecium gehören, aus den mikrobiellen Substanzen keine Cellulase abscheiden, daß zum Genus Trametes u.a. gehörende Mikroorganismen, die Holz zum Verfaulen bringen, infolge ihres langsamen Wachstums selten gezüchtet werden und daß es im Falle von Bakterien schwierig ist, im industriellen Maßstab die mikrobiellen Substanzen aus der Zuchtbrühe abzutrennen.

Ferner ist die durch Mikroorganismen erhaltene Cellulasemenge im allgemeinen so gering, daß es unpraktisch 1st, sie für kommerzielle Zweoke zu verwenden. Die Mikroorganismen, welche jetzt für eine industrielle Produktion gebraucht werden können, sind nur solche, die zu den Gattungen Aspergillus, Triohoderma, Trametes und dergleichen gehören. Man hat behauptet, daß Cellulase nicht aus einem einzigen Enzym, sondern aua einem Komplex verschiedener Enzyme besteht· Naoh Reede (E.T. Reede ι Applied Microbiology, 1956, Bd. 4, S. 39) kann das durch

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folgende Gleichung gezeigt werden:

Nattol. Cellulose !ΐ-ϋϋ?» n-Gluoan , gebunden in e-1,4

Cellobiase ^Cx-Enzym (CMC-ase) _Cellobiose ß-Glukosidase Glukose

Das c,-Enzym ist jedoch das praktisch allein Verwendete.

Andererseits wird die Cellulase vom Genus Aspergillus wehig gebraucht, weil sie eine schwache C₁-Aktivität hat, obgleich sie eine starke CMC -ase- Aktivität besitzt. Die Cellulase der Gattungen Trichoderma und Trametes hat eine starke C₁-Aktivität und ist gründlich als eine vielversprechende Art untersucht worden, obgleich sie in der CMC -ase- Aktivität schwächer ist als die Cellulase vom Genus Aspergillus. Jedoch kann Trichoderma nicht nach dem industriellen Unterwasser-Verfahren gezüchtet werden.

Der Anmelder hat schon vorher eine neue Methode zum Züchten von Basidiomycetes gefunden (japanische Patentanmeldung Nr, 45 596/1968) und hat durch diese Methode die CeIhn ζ.se-Ergiebigkeiten bei verschiedenen Mikroorganismen, Uta ;;.ol:⁷ zum Faulen bringen, untersucht. Als Ergebnis wurde enteeckt, da;. unter den Arten, welche vorher als von keinem prak',! -.au ^v. Nuten angesehen worden sind, einige Art-en sowohl ν bo zu.,; auf c,«- als auoh auf CMC-ase-Aktivität stark" sind und ferner;· imstande sind, eine neue Cellulase zu produzieren, die oi'i

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niederes Py-Optimum hat. Vorliegende Erfindung basiert auf dieser Entdeckung·

Es ist gefunden worden, daß jede beliebige Art, die zu den Gattungen Lampteromyces und Fomitopsis gehört, für den erfindungsgemäßen Zweck verwendet werden kann. Sie können durch Lampteromyces japonicus (ATCC 20 195), Fomitopsis cytisina (ATCC 20 196), Fomitopsis pinicola (ATCC 20 036) und Fomitopsis annosa (ATCC 20 194) und dergleichen belegt werden; diese Mikroorganismen sind der Öffentlichkeit auf uneingeschränkter Basis frei verfügbar.

Diese Arten sind durch Rokuya Imazeki und Tsuguo Hongo erläutert: Oenshoku Nippon Klnrui Zukan (Coloured Illustrations of Fungi of Japan), Hoiku-sha, Tokio (1957). Obgleich Basidiomycetes oft verschieden in Abhängigkeit von der Klassifikation und den darstellenden Methoden benannt ist, kann Jede Art, die durch Imazeki und Mitarbeiter in jenen Gattungen genannt ist, im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Erfindungsgemäß werden die Basidiomycetes in einem Medium gezüchtet, welohes flüssig oder fest sein kann. Ein flüssiges Medium ist vorzuziehen, und es kann entweder eine Oberflächenoder Unterwasser-Zucht angewendet werden.

Das Medium sollte assimilierbare Nährstoffe enthalten,velohe für die verwendete Art geeignet sind. Als C-Quelle können im

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allgemeinen Saccharose, Glukose, Maltose, Laktose, Stärke, Dextrin, Melasse, Cellulosepulver, aufsaugende Baumwolle und dergleichen und als N-Quelle anorganische und organische stickstoffhaltige Materialien, wie Ammoniumsalze, Nitrate, Peptone, Fleischextrakt, Maiswasser, Sojabohneneiweiß, Weizenmehl, Hefezellen, lösliche Destillate(distillers), Harnstoff und dergleichen verwendet werden« Es ist, falls gewünscht, auch möglich, anorganische Substanzen und Metallsalze zu verwenden, wie Phosphate,Kaliumsalze, Magnesiumsalze, Eisensalze, Zinksalze und de:· 'leichen. Ferner können Vitamine, wachstumsfordernde Faktoren und dergleichen zugesetzt werden.

Um Basidiomycetes zu züchten, variieren die Zuchtbedingungen in Abhängigkeit von der verwendeten Art, der Medium-Zusammensetzung und dergleichen« Vorzugsweise beträgt die Zuchttemperatur 20 bis J55°C und das p„ des Mediums liegt zwischen

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4 und 7· Die Anhäufung an Cellulase erreicht ihr Maximum nach 5- bis 10-tägigem Züchten. Die Bedingungen sollten natürlich so sein, daß sich ein Maximum an Cellulaser Ausbeute ergibt.

Die beim Züchten erhaltene Cellulase kann abgesetzt oder konzentriert werden durch Zufügen von 50 bis 65 (VA) % eines organischen Lösungsmittels, wie Aceton, Alkohol oder dergleichen, oder 4o ble 70 (W/V) % eines Fäilungsmlttels, wie Ammoniumsulfat, Calciumchlorid oder dergleichen, und zwar im Falle der Feststoff-Züchtung zu einem wässrigen Extrakt der Kultur und im Falle der Flüssigkeits-Züchtung zu einer filtrierten Zuohtbrühe. Das Konzentrat kann leicht durch

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konventionelle Methoden, wie z.B. "sephadex"-Behandlung, Adsorption auf und Eluierung von einem Ionenaustauscher, z.B. einem Ionenaustauscherharz oder dergleichen gereinigt werden. Die so erhaltene Cellulase ist in Wasser löslich und hat nicht nur eine starke C₁-Aktivität, sondern auch - wie in den nachfolgenden Tabellen 1 und 2 dargestellt - eine starke CMC-ase - Aktivität. Ferner ist das p^-Optimum niedriger als das irgendeiner der bekannten Cellulasen - wie in der nachfolgenden Tabelle 3 dargestellt. Diese Charakteristiken sind bei keiner der bekannten Cellulase-Typen gefunden worden. Die erfindungsgemäße Cellulase kann so als eine neue Enzym- Type angesehen werden. Die Optimum-Temperatur für die Cellulase-Aktivität ist 40 bis 50⁰C.

Tabelle 1

Zerlegungs-Aktivität verschiedener Cellulasen mit Hilfe von Filterpapier

Filterpapier-Zerlegungszeit (Min. )

30 60 · 90 120 150 I80

Enzym der vorl.Erfindung + + ++ ++++

Enzym, durch Trichoderma + +++ ++++ SP. gewonnen

Enzym, durch Trametes + ++++
(sanguinae) gew.

Enzym, durch Aspergillus - + + + ++ ++ SP. gewonnen

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Die vorliegende Tabelle zeigt die Ergebnisse der Testversuche an, die nach der von Kitamikado und Toyoraa beschriebenen Methode ausgeführt wurdent Journal of Fermentation Technology, 1962, Bd, 40, S. 85 und die jeweiligen Aktivitäten sind in der Art ausgedruckt, wie sie von den Autoren definiert wurden· Jeder Test wurde unter Verwendung einer 1 jfcLgen Lösung des Enzyms in Citronensäure - Pufferlösung bei einer Temperatur von 4o°C durchgeführt· Die Lösung wurde im Falle des erfindungsgemäßen Enzyms bei einem p« von 3,0 gepuffert und in den anderen Fällen bei einem p„ von 4,5·

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Tabelle 2

CMC-Zerlegungsaktivität verschiedener Cellulasen

CMC-Zerlegungs-Aktivität

Enzym, nach der Erfindung gewonnen 2 8OO Enzym, durch Triohoderma SP · gewonnen 4 600 Enzym, durch Trametes (sanguinae) gew. 2 500 Enzym, durch Aspergillus SP · gewonnen 6 200

Die vorhergehende Tabelle zeigt die Ergebnisse von Testversuchen, die nach einer von Matsuba und Mitarbeitern beschriebenen Methode ausgeführt wurden: Journal of Fermentation Technology, Bd, 41, S· 47 (I963).

Ein Substrat, das eine Konzentration von 0,625 % hatte, ließ

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man eine Stunde bei 4O⁰C reagieren. Die Enzym-Menge, welche 10,8 mg eines reduzierenden Zuckers erzeugte, wurde als eine (1) Einheit definiert. Die Zucker-Bestimmung wurde nach der Nelson-Somogi-Methode durchgeführt. Jeder Test wurde bei 4o°C unter Verwendung einer 0,5 #igen Lösung des Enzyms in einer Citronensäure-Pufferlösung durchgeführt. Die Lösung wurde im Falle des erfindungsgemäßen Enzyms bei einem p„ von 3,0 und im Falle der anderen Enzyme bei einem p„ von 4,5 gepuffert.

Tabelle 3

Pu-Optimum der verschiedenen Cellulasen für die CMC-Zerlegung

- Optimum

Enzym, nach der Erfindung gewonnen 3*0

Enzym, durch Trichoderma S.P. gewonnen 4,5

Enzym, durch Trametes (sanguinae) gewonnen 4,5

Enzym, durch Aspergillus SP. gewonnen 5,0 bis 7*0

Die vorhergehende Tabelle zeigt die Ergebnisse der Testversuche, die nach einer von Matsumura und Mitarbeitern beschriebenen Methode durchgeführt wurden: Journal of Fermentation Technology,, 1963, Bd. 41, S. 154; Nara und Mitarbeiten Journal of Fermentation Technology, 1964, Bd. 42, S. 405, und Matsuba und Mitarbeiter: Record of the 2nd and 3rd Cellulase Research Meeting, 1963.

Die vorliegende Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen

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erläutert, welche jedoch nicht so auszulegen sind, als ob sie die Erfindung begrenzen würden.

Beispiel 1

30 ml eines Mediums mit einer Zusammensetzung aus 2 % Saccharose, 1 % Cellulosepulver, 3 % lösliche Destillate (distillers), 0,3 % Hefeextrakt, 0,5 % KH₂PO^ und 0,05 % M SO^.7HgO werden auf ein ρ von 5,5 eingestellt, in einen 250 ml-Kolben eingefüllt und sterilisiert. Teile dieses Mediums werden getrennt mit Lampteromyces japonicus, Pomitopsis cytisina, Fomitopsis annosa und Pomitopsis pinicola beimpft, und mit diesen wurde sieben Tage lang unter Schütteln bei 30°C gezüchtet. Die Aktivitäten (pro ml) der filtrierten Zuchtbrühen waren folgende:

A B

Lampteromyces japonicus ATCC 20 195 Fomitopsis cytisina ATCC 20 I96 Fomitopsis pinicola ATCC 20 036 Fomitopsis annosa ATCC 20 194

A - Aktivität auf dem Filterpapier

(Zeit bis zur vollständigen Zerlegungs-Min.)

B-Aktivität in verflüssigt. CMC

(Länge der verflüssigt. Schicht von 4 % CMC-Gel nach

24 Stunden).

105	min.	50	mm
120	min.	50	mm
180	min.	50	mm
180	min.	35	mm

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Beispiel 2

Weizenkleie, Reiskleie, Sojabohnenmehl und lösliche Destillate (distillers) werden im Verhältnis 10 : 1 : 1 : 1 vermischt, gut mit Wasser angefeuchtet und sterilisiert, um ein festes Medium zu erhalten, welches mit dem Mycel von Lampteromyces japonious und Pomitopsis oytisina geimpft wird, und welches vorher in flüssigem Medium gezüchtet und dann zehn Tage lang bei 25°C weiter gezüchtet wurde· Nach dem Züchten wurde jedes der Kulturmedien fein unterteilt und zwei Stunden lang bei Zimmertemperatur mit der fünffachen Volumenmenge Wasser extrahiert· Die Aktivitäten (pro ml) der Extrakte waren folgende:

AB

Lampteromyces japonicus ATCC 20 195 !50 min. 2 600 Fomitopsis cytisina ATCC 20 I96 I60 min. 2 100

Α-Aktivität auf dem Filterpapier (Zerlegung) in Minuten B-Aktivität zur Zerlegung von CMC

Beispiel 3

3000 ml eines Mediums einer Zusammensetzung von 2 % Saccharose, 1 # Sojabohnenmehl, 3 % lösliche Destillate (distillers), 0,3 % Hefeextrakt, 0,5 % KH₂PO^ und 0,05 % MgSO^*7H₂0 werden

auf ein p„ von 5» 5 eingestellt· Das Medium wird mit Lampteromyn

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ces japonicus (ATCC 20 195) beimpft, und dann züchtet man fünf Tage lang unter Rühren aerob bei 30°C· Am Ende des Züchtens wird der mikrobielle Teil durch Filtration abgetrennt. Das Filtrat wird auf 0°C abgekühlt und dann werden 65 (V/V) # Aceton zugefügt, welches vorher auf -20°C heruntergekühlt war. Der erhaltene Niederschlag wird mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet, um 27 g eines kräftig braunen Pulvers zu ergeben· Die Filterpapier-Zerlegungs-Aktivität erfolgte pro g des Pulvers in 95 Minuten· Die CMC-Zerlegungs-Aktivität betrug 5 000 CÜN/g·

Patentansprüche

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Claims

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Ansprüche

lj) Verfahren zur Gewinnung einer Cellulase, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus, der Holz verfaulen läßt, aus der Gattung Lampteromyces und Pomitopsis in einem dafür geeigneten Zuchtmedium gezüchtet und die Cellulase aus diesem Medium gewonnen wird.

w 2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Lampteromyces japonicus ATCC 20 195 ist.

3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Pomitopsis cytisina ATCC 20 I96 ist.

K) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Fomitopsis pinicola ATCC 20 036 ist.

5) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Pomitopsis annosa ATCC 20 19^ ist.

6) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur des Zuchtraediums bei e
bei etwa K bis 7 gehalten werden.

Temperatur des Zuchtraediums bei etwa 20 bis 35°C und das

7) Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Züchten in fünf bis zehn Tagen durchgeführt wird.

8) Cellulase, hergestellt nach den Verfahren der Ansprüche 1 bis 7.

PAe Dr.Andrejewski, Dr.Honke

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