DE1945413A1

DE1945413A1 - Neues Enzym und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE1945413A1
Application number: DE19691945413
Authority: DE
Inventors: Smalley Henry Marschall
Original assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Current assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Priority date: 1968-09-09
Filing date: 1969-09-08
Publication date: 1970-03-19
Also published as: US3697378A; DK133309B; DK133309C; BE738535A; NL6913656A; GB1285173A; FR2017633A1

Description

Dr. F. Zumöteln sen. - Dr. E. Assmann Dr. R. Koenlgsberger - Dlpl.-Phys. R. Holzbauer - Dr. F. Zumsteln Jun.

PATENTANWÄLTE

TELEt³ONi SAMMEL-MR. 22 5341

TELEX 52S9Va

TELeQRAMME-. ZUMPAT POSTSCHECKKONTO: MÖNCHEN 01139

BANKKONTO: BANKHAUS H. AUPHÄUSER

β MÖNCHEN 2.

BRÄUHAUSSTRASSE 4/III

53/n

Case 25*91-445

GLAXO LABORATORIES LIMITED, Middlesex, England Neues Enzym und Verfahren zu seiner Herstellung

Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit neuer a-Amylase und einem Verfahren zu ihrer Herstellung.

a-Amylaseenzyme werden beim Verdünnen oder bei der Verzuckerung (dextrinisation) von Stärke, beispielsweise bei der Herstellung von Glucose, verwendet. Solche Stärkeverzuckerungsreaktiönen, wie auch andere enzymkatalysierte Reaktionen ver·» laufen bei höheren Temperaturen rascher, vorausgesetzt, daß das Enzym nicht zerstört wird» und es wurde nun gefunden, daß öt-Amy» lasen, die durch Bakterien gebildet werden, besonders nützlich sind, da ihre bevorzugte Temperatur für die Stärkeverzuckerung int Bereich von 80°C liegt*

Es wurde nun eine neue bakterielle a-Ämyläse entwickelt» die sich von B, cöaguläns ableitet, die sogar bei höheren Temperätu* ren aktiv ist und daher besonders nützlich ist für den Gebrauch für Stärkeverzuckerung bei höheren Temperaturen»

g Wird eine «»Aiayl&fcfc .geliefert^ ateleitet und die Merkmale {&) bi& {%)

der vörliegehdea <lte sieh von B*

wie äle im

a) Das neue Enzym besitzt ein Molekulargewicht von 11 000 — 1000, wie es nach dem Verfahren von Andrews (biochem. J., 1964, 91_, S. 222) bestimmt wurde.

b) Für"seine optimale Aktivität ist der p„-Wert charakteristisch, und er beträgt für das gereinigte Enzym bei 37 C 4,8. Die Aktivität des Enzyms ist calciumabhängig, und die optimale Calciumolarität beträgt 5 bis 25 mMol.'Der p„ für die thermische Stabilität des gereinigten Enzyms liegt in dem Bereich von 6 bis 8, d.h. ungefähr um neutral, und in diesem Bereich beträgt die Halbwertzeit des gereinigten Enzyms bei 90⁰C etwa 90 Minuten, während in Gegenwart von Stärke die Halbwertzeit bei 90°C ungefähr 120 Minuten beträgt. Die optimale Temperatur für die Enzymaktivität beträgt 75°C im p_H-Bereich von 5 bis 7, wie es mit einer O,5%-igen Lösung von Stärke in Gegenwart von 20 mMol Glycero— phosphat-Acetat-Puffer und 5 mMol Calciumchlorid bestimmt wurde. Die zwischen den Grenzen erforderliche Z₄eit von 15 bis 40 Minuten, bis die Stärkelösung zu einem festen Endpunkt aufgelöst ist, ist die Anzahl der SKB-Einheiten in der Enzym-Präparation invers proportional. (Sanstedt, Kneen and Blish, Cereal Chemistry, (1939), 16_, 712.)

t.

c) Die ThermoStabilität des Enzyms wird durch die vorhandene

Menge an Calcium beeinflußt; die optimale Molarität der CaI-ciumionen für maximale "Stabilität bei 90⁰C beträgt zwischen 2 und 20 mMol. Die lonenstärke bzw. Ionenkonzentration hat ebenfalls auf die Thermostabilität des Enzyms Einfluß, und die optimale lonenkonzentration bei 9O°C beträgt 50 bis IOD mMöl, Organische Säuren stabilisieren das Enzym, beispielsweise Glutar- und Maleinsäuren, und Weinsäure ist besonders wirksam, wobei ihre optimale Molarität 18 bis 25 mMol beträgt» Das Enzym wird von wäßrigen Lösungen in Stärke leicht adsorbiert» und bei einem p_H von 7,0 und 4°C adsorbiert 1,0 § Maisstärke 1000 SKB-Einheiten der gereinigten

wobei die Menge unabhängig von der Enzymkonzen-1st» Eine andere Eigenschaft des Enzyms ist seine

Neigung, Stärke unter Bildung eines großen Polysaccharidteils, der aus 6 verbundenen Glucose—Einheiten besteht, abzubauen, der dann weiter abgebaut wird, langsamer als von anderen Oo —Amylasen, wie der aus B. subtilis.

d) Ein weiteres charakteristisches Merkmal des neuen Enzyms ist seine Fähigkeit, das Cycloheptamylose-System in Schardingerß-Dextrinen anzugreifen.

e) Das gereinigte Enzym besitzt die folgenden Elektrophorese-Eigenschaften: Gel-Elektrophorese an 5%-igem Polyacrylamidgel in tris-Borat-EDTA-Puffer, p_H 8,7 bei 4°C für 16 Stunden bei 4OO V und 20 mA zeigte nur eine Aktivitätszone; diese hatte eine Beweglichkeit von 5 cm gegen die Anode.

Die Erfindung befaßt sich ebenfalls mit einem Verfahren für die Verzuckerung von Stärke, worin die Stärke in einem wäßrigen Medium mit der erfindungsgemäßen ot-Amylase bei einer Temperatur im Bereich von 8O C oder mehr, vorzugsweise bei 90 C oder sogar bei 100°C, behandelt wird.

Die Erfindung befaßt sich ebenfalls mit einem Verfahren zur Herstellung des neuen Enzyms, wonach dieses dadurch erhalten wird, indem man eine aerobe Kultur eines Ot-Amy läse produzierenden Stamms von B. coagulans in ein Nährmedium gibt und danach das Enzym aus diesem isoliert.

Es wurde gefunden, daß die eingetauchte aerobe Kultur von B. coagulans-Organisnien, verglichen mit anderen anaeroben Kulturen, wie beispielsweise Kulturen in stationären Kolben, besonders hohe Ausbeuten des Enzyms liefern.

Das Nährmedium wird eine Quelle von Kohlenstoff und eine Energiequelle enthalten, eine Stickstoffquelle und eine Quelle für Spurenelemente. Die Kohlenstoff- und Energiequelle kann beispielsweise ein Kohlehydrat, beispielsweise ein Zucker, wie Lactose,

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Fructose oder Sucrose, oder Stärke oder eine natürliche Kohlenstoff- und Energiequelle, wie beispielsweise Magermilch, Molkepulver oder Maisöl, sein. Es wurde gefunden, daß besonders hohe Ausbeuten an Enzym erhalten werden, wenn man Glycerin als hauptsächliche Kohlenstoff- und Energiequelle verwendet. Es wurde ebenfalls gefunden, daß im Gegensatz zu früheren Vorschlägen für die Kultur von B. coagulans Stärke für die öt-Amylase-Herstellung nicht obligatorisch ist. Der Prozentgehalt der Kohlenstoffquelle im Medium ist üblicherweise nicht größer als 4 Gewichts-%, beispielsweise 0,5 bis 3,0 Gewichts-%.

Die Stickstoffquelle ist vorzugsweise eine Substanz organischen Ursprungs, wie Sojamehl, Fischmehl, Magermilch, Tryptose, Caseinhydrolysat, Molkepulver, Pepton oder Schlempenlösliches. Besonders hohe Ausbeuten an Enzym werden erhalten, wenn man als Stickstoffquelle Hefeextrakte verwendet, besonders Yeatex-Granulate (verkauft von English Grains Co'. Ltd.). Schließlich sei bemerkt, daß einige Verbindungen, wie beispielsweise Magermilch oder .,Molkepulver ,/wohl als Stickstof fquelle als auch als Kohlenstoff- und Energiequelle wirken können. Der Prozentsatz der Stickstoffquelle im Medium wird als Stickstoff ausgedrückt und liegt üblicherweise zwischen 0,025 und 0,3 Gewichts-% des Mediums.

Die Spurenelemente des Mediums schließen im besonderen Calciumionen ein, und Kalk kann als bequeme Quelle zugefügt werden, besonders, da sie fähig ist, die Säure, die während der Fermentation gebildet wird, zu neutralisieren. Der Prozentgehalt an Kalk im Medium liegt üblicherweise im Bereich von 4 bis 6 Gewichts-%. Andere Spurenelemente sind im allgemeinen in genügender Menge in den" natürlichen Bestandteilen, die oben angegeben sind, vorhanden, die aus diesem Grund bevorzugt sind.

Der p_H des Kulturmediums liegt am besten im Bereich von 5 bis 8, vorteilhaft zv/ischen 6 und 7. Vorteilhafterweise ist ein Puffen vorhanden, beispielsweise ein Phosphatpuffer.

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Die Temperatur des Mediums während der Kultur ist besonders wichtig, da es möglich erscheint, den Titer von hochthermostabiler oC-Amylase zu verbessern, indem man bei hohen Temperaturen, beispielsweise im Bereich von 40 bis 65 C, züchtet. Die optimale Wachstumstemperatur ist über 55°C.

Der Stamm von B. coagulans, der gezüchtet wird, ist vorteilhaft der NCIB 10278-Stamm oder eine Mutante davon und besonders Stamm NCIB 10279 und seine Mutanten,Ein besonders nützlicher Organismus ist Stamm NCIB 10280. Diese Stämme von B. coagulans sind vollkommen neu und, wie oben aufgeführt, geben diese Stämme besonders hohe Ausbeuten des neuen erfindungsge— mäßen Enzyms. Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung wird daher auch ein Verfahren zur Herstellung von B. coagulans geliefert, der (X-Amylase produziert, worin B. coagulans Stamm NCIB 10278 oder eine Mutante davon, besonders Stamm NCIB 1O279 oder Stamm NCIB 10280 in einem Nährmedium dafür gezüchtet wird.

Die Kultur für die Enzymherstellung wird im allgemeinen durch Zuqabe eines Inoculums zu dem Nährmedium, das den Organismus enthält, in Gang gebracht. Das Medium, das für die Inoculum-Herstellung verwendet werden kann, ähnelt stark dem, das für die Kultur des Organismus verwendet wird, aber es wird vorteilhaft erweise weniger stark belüftet. Das Wachstum des Inoculums kann durch Zugabe einer Zeil-Suspension aus einer Agar-Kultur des Organismus zu dem Medium erfolgen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch zu beschränken. Alle Temperatzren sind in ⁰C angegeben.

Beispiel 1

Fermentation in einem Schüttelkolben 20 ml einer Kochsalzlösung (0,9 % Gewichts-% Natriumchloridlösung) wurden zu einer Agar-Kultur von E. coagulans, Stamm NCIB 10280, zugegeben, und 1 ml der Zeil-Suspension wurde

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verwendet, um einen eingetauchten konischen 250 ml-Kolben, der 250 ml des Keimmediums (P 2) enthielt, zu impfen, wobei das Keimmedium die folgende Zusammensetzung besaß:

* Bestandteile Gewichts-%

Glycerin O,7

Yeatex-Körnchen 1,O

Natriumdihydrogenphosphat O,16

P_H 5,8

Nach 18 Stunden des Wachstums bei 55° auf einem Rotary-Schüttler bei 220 Umdrehungen pro Minute wurde 1 ml der Zellsuspension verwendet, um 2O ml des folgenden Mediums in einem eingetauchten konischen 25O ml-Kolben zu impfen:

Bestandteile	Gewichts-%
Glycerin	2,O
Ye a t ex-Körnch en	3,5
Na₂HPO₄	O,25
KH₂PO₄	Ο,Ι
Kalk.	4,O

Amylase wurde in dem Nährbrühenfiltrat nach 48-stündiger Fermentation bei 55° in einem Rotary-Schüttler hergestellt und durch eine autoanalytische Methode, die auf den SKB-Versuchen basiert, bestimmt (Sandstedt, Kneen and Blish, Cereal Chemistry, (1939), 16. 712). Ein Titer von 4,OO SKB-Einheiten/ml wurde erhalten.

Beispiel 2

500 ml des Mediums P 2 wurden in einem 2 1-Rundkolben mit Boden mit 5 ml einer Zellsuspension von einer Agat-Kultur von B. coagulans (Glaxo Laboratories Limited, Stamm (K5_t Mutante von Stamm NCIB 10278) geimpft, und die Kultur wurde 18 Stunden bei 55 in einem Rotary-Schüttler gezüchtet. Dies lieferte ein Inoculum (2 % V/V) für einen 5 1-Fermentierer, der 3 1 desselben Mediums enthielt.

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Diese Keimstufe wurde mit 2 1 pro Minute belüftet und durch 5,08 χ 7,6 an (2 χ 3 inches)-Turborührer, die mit 550 Umdrehungen pro Minute liefen, gerührt. Nach der Inokulation bei 55 gezüchtet, und die Züchtung wurde geschätzt, indem man die optische Dichte der Kultur gegenüber klarem Wasser unter Verwendung eines tragbaren Evans Electroselenium Limited-Kolorimeters mit einem 621-Filter bestimmte. 60 ml der Kultur wurden bei einer optischen Dichte von 25 Einheiten bei 1 zu 2 Verdünnungen der Brühe in einen 5 1-Fermentierer gegeben, der 3 1 des folgenden sterilen Mediums enttielt:

Glycerin 2,0 Gewichts-%

Yeatex 2,5

Na-,ΗΡΟ. 0,25

KH₂PO₄-SaIZe 0,1

NaCl ■ . 0,1

Kalk (getrennt sterilisiert) 7,5

Die Produktionsstufe wurde unter ähnlichen Bedingungen wie die Keimstufe fermentiert, aber der Luftstrom wurde auf 5 1 pro Minute erhöht. Die Menge von Amylase wurde durch eine autoanalytische Methode des SKB-Versuchs bestimmt. Die Bxldung von Amyläse wurde IG bis 20 Stunden nach der Impfung beobachtet.

Die Amylaseproduktion geschah im allgemeinen während des Wachstums stadiums des Organismus, wenn Glycerin verwendet wurde, und der p_H-Wert der Brühe fiel. Ein Titer von 2 SKB-Einheiten pro ml wurde erhalten.

Beispiel 3

B. coagulans, Stamm NCIB 10279, wurde in trockengefrorenen Ampullen aufbewahrt und alle 3 Tage subkultiviert und bei 55° bei p„ 7,2 (NaOH) 1 Tag in einem Medium, das folgende Bestandteile aufwies, inkubiert:

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Bestandteile % Gewicht/VoIumen

Oxoid Pepton 1,0

NaCl 0,5

Oxoid Hefeextrakt 0,1

Lab-Lemco 1,0

Oxoid Agar 1,5

to

inykubiert, danach wurde es verwendet, um 100 ml des folgenden sterilen Mediums in einem" konischen 25Ό'mT-Kö'lben anzüimpfen·

Bestandteile ^% Gewicht/Volumen

Glycerin 0,7

Yeatex _t 2,5

Na₂HPO₄ 0,25

KH₂PO₄ 0,1

NaCl 0,1

schwach ausgefälltes CaCO- 0,5 _n ₇o (getrennt steri-^PH '»³ lisiert)

Der angeimpfte Schüttelkolben wurde bei 55° 10 Stunden auf einem Rotary-Schüttler mit einer 5 cm (2 inches) Schwingweite und einer Geschwindigkeit von 220 Umdrehungen pro Minute inkubiert. Nach Beendigung dieser Zeit wurde die gut gezüchtete Kultur verwendet, um 3 1 des folgenden Mediums in einem 5 1-Fermentiergefäß, das Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm (15 pounds per square inch) sterilisiert war, zu impfen.

Bestandteile: % Gewicht/Volumen

Glycerin	0,7
Yeatex-Körnchen	2,5
Na₂HPO₄ (wasserfrei)	0,25
KH₂PO₄	0,1
NaCl	0,1

natürlicher p_H 6,35
schwach ausgefällter Kalk. 5,0 (getrennt sterilisiert)

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Dies· wurde bei 65° inkubiert, mit 550 Umdrehungen pro Minute . • gerührt und mit 3 1 Luft pro Minute 6 Stunden belüftet. Während dieser Zeit stieg der p„ von 6,6 auf 7,05, und ein gutes Wachs- , turn wurtie erreicht.

Der Inhalt dieses Permentierungsgefäßes wurde zu 400 1 des folgenden Ferment!erungsmediums bei p„.6,3 bis 7,0 gegeben, dessen p_H-Wert erforderlichenfalls nach der Sterilisation für 30 Minu- -ten bei 50°, 30 Minuten bei 90° und 90 Minuten bei 120° durch Zugabe von Kaliumhydroxyd eingestellt wurde.

Bestandteile % Gewicht/Volumen

Glycerin 0,7

Yeatex-Körnch en 2,5

Na₂HPO₄ (wasserfrei) 0,25

KH₂PO₄ 0,1

NaCl 0,1

gering ausgefällter Kalk' ; 2,5 (getrennt sterilisiert)

Dies wurde bei 350 Umdrehungen pro Minute gerührt, mit Luft, 56 dm³ (20 cubic feet) pro Minute,belüftet und bei 55° 20 Stunden gehalten. Während dieser Zeit fiel der p_H von 7,45 auf 7,0, gutes Wachstum wurde erreicht, und man erhielt eine Ol-Amylaseaktivität von 0,21 SKB-Einheiten/ml.

100 1 der reifen Brühe, die, wie durch Versuche festgestellt war, ca. 23 000 SKB-Aktivitätseinheiten enthielt, wurde durch ein Rotary-Filter mit einer Hyflo-Kieselgurschicht bei Raumtemperatur filtriert und das Filtrat mit 5 g/l rahmartiger Maisstärke 1/4 Stunde bei p„ 7,0 und 6° gerührt. Die Suspension wurde durch Whatman-No.54-Filterpapier auf einem Doulton-Filter filtriert, mit 500 ml eiskaltem destillierten Wasser gewaschen und bei 55° in einem Heißluftofen getrocknet.

446 g des Adsorbats,aas ca.23 üGöSKB-Einheiten von a^-Amylase-Aktivität enthielt, wurden erhalten. Das Adsorbat enthielt 11,47 % (Gewicht/Volumen) Feuchtigkeit, und der Gesamtproteingehalt betrug 6,86 mg/g. Dies stellt eine spezifische Aktivität

von 7,76 Einheiten/mg Protein dar.

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Morphologische Charakteristika von B. coaqulans. Stamm NCIB 10 280:

Stab: Gram-positiv, 0,6 bis 1,0 χ 2,5 bis 5,0 Mikron,

bewegungsfähig.

Sporen: 0,9 bis 1,0 χ 1,2 bis 1,5 Mikron, ellipsoid,

dünnwandig, subterminal bis terminal; Sporulation gering in üblichen Medien.

Sporangien: gequollen

Agar-Schräg- Wachstum sehr schwach - eben, durchscheinend und kulturen: glatt.

Agar-Kolonien: klein, rund, undurchsichtig, nicht kennzeichnend.

Glucose-Agar- Wachstum gering - wie auf Nähragar. Schragkulturen:_säure^ _{afaer kein Gag wurde aus} Glucose und

Saccharose und Glycerin entwickelt, aber nicht aus Arabinose, Xylose, Lactose und Mannitol.

Glucosebrühe: p_H 5,0 oder geringer in 7 Tagen. Nitrat: wurde zu Nitrit reduziert.

Gelatinestrei- Hydrolysezone (wenn überhaupt) sehr gering, fen-Agar:

Wachstumserfordernisse:

Nicotinsäure, Biotin und Thiamin sind erforderlich, Kein Wachstum bei 37°C; Wachstum bei 45 bis 65°C, optimal bei 55 bis 60°C.

Die Stämme NCIB 10278 und NCIB 10279 zeigten im wesentlichen ähnliche Morphologie und Eigenschaften.

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Claims

- Il Patentansprüche

BBSSSSBSCSSSSSaB=SS SBSSSSS = SSsS

l.M-Amylase, die von B. coagulans gebildet wird und die folgenden charakteristischen Merkmale besitzt:

a) ein Molekulargewicht von 11 000 ± 1000;

b) für seine optimale Aktivität ist der p_H~Wert charakteristisch, und er beträgt für die gereinigte Form bei 37°C 4,8; seine Aktivität ist calciumabhängig, und die optimale Calciummolarität beträgt 5 bis 25 mMol; in einem p_H-Bereich von 6 bis 8 beträgt die Halbwertzeit der gereinigten Form bei 90⁰C etwa 90 Minuten, während in Gegenwart von Stärke die Halbwertzeit bei 90⁰C ungefähr 120 Minuten beträgt; die optimale Temperatur"für seine Aktivität beträgt 75°C im p_H-Bereich von 5 bis 7, bestimmt mit einer 0,5%-igen Lösung von Stärke in Gegenwart von 20 mMol Glycerophosphat-Acetat- , Puffer und 5 mMol Calciumchlorid;

c) ihre Thermostabil!tat wird durch die vorhandene Menge an Calcium beeinflußt; die optimale Molarität der Calciumionen für maximale Stabilität bei 90°C beträgt zwischen 2 und 20 mMol, die Ionenstärke bzw. lonenkonzentration hat ebenfalls auf ihre Thermostabilität Einfluß, und die optimale lonenkonzentration bei 90⁰C beträgt 50 bis 100 mMol; sie wird von wäßrigen Lösungen in Stärke leicht adsorbiert, und bei einem p_H von 7,0 und 4°C adsorbiert 1,0 g Maisstärke 1000 SKB-Einheiten ihrer gereinigten Form, wobei die Menge unabhängig von ihrer Konzentration ist; eine andere Eigenschaft ist ihre Neigyng, Stärke unter Bildung eines großen Teils eines PoIysaccharids, der aus 6 verbundenen Glucose-Einheiten besteht, abzubauen;

d) sie greift das Cycloheptamylose-System in Schardinger-ß-Dextrinen an;

e) sie zeigt folgende Elektrophorese-Eigenschaften: Gel-Elektrophorese an 5%-igem Polyacrylamidgel in Tris-borat-EDTA-Puffer, ρ 8,7 bei 4°C für 16 Stunden bei 400 V und 20 mA zeigte nur

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eine Aktivitätszone; diese hatte eine Beweglichkeit von 5 cm gegen die Anode.

2. Verfahren zur Herstellung von oi.-Amylase gemäß Anspruch 1,

φ dadurch gekennzeichnet, daß eine aerobe Kultur eines oi-Amylase produzierenden Stamms von B. coagulans in ein Nährmedium gegeben wird und danach das Enzym aus diesen isoliert wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium eine Kohlenstoff- und Energiequelle, eine Stickstoffquelle und eine Quelle für Nähr-Spurenelemente enthält.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenstoff und Energiequelle ein Kohlehydrat, Magermilch, Molkepulver oder Maisöl ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Kohlehydrat Zucker oder Stärke ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Zucker Lactose, Fructose oder Saccharose enthält.

7. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenstoff- und Energiequelle Glycerin ist.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Prozentgehalt der Kohlenstoffquelle in dem Medium nicht größer als 4,0 Gewichts-% ist.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Prozentgehalt von 0,5 bis 3,0 Gewichts-% beträgt.

ΙΟ* Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Stickstoffquelle eine Verbindung organischen Ursprungs ist.

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11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung organischen Ursprungs Sojamehl, Fischmehl, Magermilch, Tryptose, Caseinhydrolysat, Molkepulver, Peptin oder Schlempenlösliches ist.

12. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz organischen Ursprungs Hefeextrakt ist.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Prozentgehalt an Stickstoffquelle von 0,025 bis 0,3 Gewichts-%, berechnet als Stickstoff in dem Medium, beträgt.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Nähr-Spurenelemente Calcium einschließen, das als Kalk geliefert wird.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Prozentgehalt an Kalk im Medium von 4,0 bis 6,0 Gewichts-% beträgt.

16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß andere Spurenelemente durch natürliche Zutaten geliefert werden.

17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der p„ des Kulturmediums zwischen 5 und 8 liegt.

18. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der p_H 6 bis 7 beträgt.

19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Medium ein Puffer vorhanden ist.

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20. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer ein Phosphatpuffer ist.

21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur des Mediums während der Kultur 40 bis 65°C beträgt.

22. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur etwa 55°C beträgt.

23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß der zur Kultur verwendete Stamm von B. coagulans der Stamm NCIB 102 78 oder eine Mutante davon ist.

24. Verfahren gemäß 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm der Stamm NCIB 10279 oder eine Mutante davon ist.

25. Verfahren gemäß Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm der NCIB 10280-Stamm ist.

26. Verfahren zur Herstellung von B. coagulans, deroC-Amyläse produziert, dadurch gekennzeichnet, daß B. coagulans, Stamm NCIB 10278 oder eine Mutante davon, in einem Nährmedium dafür gezüchtet wird.

27. Verfahren gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm der Stamm NCIB 102 79 oder NCIB 10280 ist.

28. Verfahren gemäß Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultur durch Zugabe eines Inoculums zu dem NMhrmedium in Gang gebracht wird und das Medium, das für die Herstellung des Inoculums verwendet wird, weniger stark belüftet wird als das Nährmedium, das für die Kultur verwendet wird.

29. B. coagulans, Stamm NCIB 10278 und Mutanten davon.

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30. B. coagulans, Stamm NCIB 10279 und Mutanten davon.

31. B. coagulans, Stamm NCIB 10280.

32. Verfahren zur Verzuckerung von Stärke, dadurch gekennzeichnet, daß die Stärke mit einer o£-Amylase gemäß Anspruch behandelt wird.

33. Verfahren gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Snzymbeh and lung bei einei hoher durchgeführt wird.

Enzymbehandlung bei einer Temperatur im Bereich von 80⁰C oder

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