DE3025424A1

DE3025424A1 - Verfahren zur herstellung von galactoseoxidase

Info

Publication number: DE3025424A1
Application number: DE19803025424
Authority: DE
Inventors: Kazuo Aisaka; Osamu Terada
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1979-07-05
Filing date: 1980-07-04
Publication date: 1981-01-15
Also published as: DE3025424C2; JPS6243666B2; JPS568686A; US4335213A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms Galactoseoxidase durch Züchtung eines zur Bildung dieses Enzyms fähigen Mikroorganismus der Gattung Gibberella.

Galactoseoxidase (EC 1.1.3.9) eignet sich zur Bestimmung von Galactose in Organismen und biologischen Flüssigkeiten, wie Serum. Es ist bekannt, Galactoseoxidase durch Züchtung eines Mikroorganismus der Art Polyporus circinatus (J.A.D. Cooper u. Mitarb., J. Biol. ehem., Bd. 234 (1959), S. 445 und JP-AS 5 900/1966) herzustellen.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein leistungsfähiges Verfahren zur Herstellung von Galactoseoxidase auf mikrobiologischem Wege zu entwickeln. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem Befund, daß Mikroorganismen der Gattung Gibberella dieses Enzym bilden.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Galactoseoxidase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen zur Bildung von Galactoseoxidase fähigen Mikro-Organismus der Gattung Gibberella in einem Nährmedium züchtet und aus der Kulturbrühe das Enzym abtrennt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren fällt das Enzym in hoher Ausbeute in der Kulturbrühe und insbesondere in der zellfreien Kulturbrühe an. Die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellte Galactoseoxidase beschleunigt die Oxidation des Monosaccharids Galactose sowie von Polysacchariden, wie Melibiose.

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Die für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Mikroorganismen gehören zur Gattung Gibberella. Innerhalb dieser Gattung sind Mikroorganismen der Art Gibberella fujikuroi und Gibberella zeae bevorzugt. Speziell bevorzugt sind Gibberella fujikuroi Y-530929 (FERM-P Nr. 5 066; NRRL 12168), Gibberella fujikuroi T-28O53O (FERM-P Nr. 5 067; NRRL 12169) und Gibberella zeae K-240319 (FERM-P Nr. 5 068).

Die mikrobiologischen Eigenschaften der Arten Gibberella fujikuroi und Gibberella zeae sind in dem "Dictionary of the Fungi", 6. Auflage, 1971, S. 241, beschrieben.

Als Nährmedium kommen zur Züchtung der vorstehend genannten Stämme entweder natürliche Medien oder synthetische Medien in Frage, die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und andere Nährstoffe enthalten.

Spezielle Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate, wie Galactose, Glucose, Fructose, Sucrose, Maltose, Mannose, Melibiose, Raffinosestärke, Stärkehydrolysatlösungen und Melasse, Zuckeralkohole, wie Glycerin, Sorbit und Mannit, organische Säuren, wie Essigsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Fumarsäure und Citronensäure, Alkohole, wie Methanol und Äthanol, Glykole, wie Äthylenglykol und Propylenglykol, Aminosäuren sowie Kohlenwasserstoffe, wie n-Hexadecan. Bevorzugt sind Galactose, Glycerin, Fructose, Sucrose, Glucose, Melibiose und Raffinose, da die Ausbeute an Enzym erhöht ist.

Spezielle Beispiele für Stickstoffquellen sind Ammoniak, anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumcarbonat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat und

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Γ"

Ammoniumacetat, stickstoffhaltige Verbindungen, wie Harnstoff und Aminosäuren, stickstoffhaltige organische Verbindungen, wie Pepton, NZ-Amin, ein enzymatisches Hydrolyseprodukt von Casein, Fleischextrakt, Hefeextrakt, lösliche Pflanzenproteine, Maisquellwasser, Caseinhydrolysate, Chrysalishydrolysate, Fischmehl oder seine Abbauprodukte, entfettete Sojabohnen oder ihre Abbauprodukte. Fleischextrakt, Hefeextrakt und lösliche Pflanzenproteine sind bevorzugt, da die Ausbeute an Enzym erhöht ist.

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Als anorganische Salze kommen beispielsweise Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Eisen (II)-sulfat, Natriumchlorid und Calciumcarbonat in Frage.

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Die Ausbeute an Galactoseoxidase kann im erfindungsgemäßen Verfahren durch die Gegenwart von Zinkionen oder Kupferionen im Nährmedium stark erhöht werden. Beispiele für Quellen, die Zinkionen liefern, sind Zinkverbindungen, wie Zinkchlorid und Zinksulfat. Beispiele für Quellen, die Kupferionen liefern, sind Kupferverbindungen, wie Kupfersulfat und Kupfer(II)-chlorid. Gute Ergebnisse werden erhalten, wenn eine Zinkverbindung in einer Menge von 0,0001 bis 0,005 Gewichtsprozent pro Volumen oder eine Kupferverbindung in einer Menge von 0,001 bis 0,05 Gewichtsprozent pro Volumen dem Nährmedium zugesetzt wird. Die Züchtung wird unter Belüften und Rühren bei 25 bis 35°C und einem pH-Wert von 6,0 bis 7,0 während 2 bis 3 Tagen durchgeführt.

Die Isolierung und Reinigung der Galactoseoxidase aus der Kulturflüssigkeit erfolgt nach üblichen Methoden, beispielsweise folgendermaßen:

Die Kulturflüssigkeit wird filtriert oder zentrifugiert, um die Mikroorganismenzellen abzutrennen. Sodann wird das Filtrat bzw. der überstand auf etwa 1/4 seines ursprünglichen Volumens

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Γ" ι- «ι η η C ί O /. '

unter vermindertem Druck eingedampft. Das Konzentrat wird mit Ammoniumsulfat bis zu 60prozentiger Sättigung versetzt. Die entstandene Fällung wird abfiltriert und in einem O,0imolaren Phosphatpuffer vom pH-Wert 7/0 gelöst. Die erhaltene Lösung wird zum Entsalzen dialysiert. Das Retentat wird der Säulenchromatographie an DEÄE-Cellulose und Sephadex G-150 unterworfen. Die erhaltene gereinigte Enzymlösung wird gefriergetrocknet. Es wird Galactoseoxidase in Pulverform erhalten .

Die Eigenschaften der aus Gibberella fujikuroi Y-530929 erhaltenen Galactoseoxidase sind nachstehend angegeben. Die aus Gibberella fujikuroi T-28O53O und Gibberella zeae K-240319 erzeugten Galactoseoxidasen haben praktisch die gleichen Eigenschaften.

Die enzymatische Aktivität der Galactoseoxidase wird durch Umwandlung von Galactose in Gegenwart von Galactoseoxidase und Sauerstoff in Galactohexodialdose und Wasserstoffperoxid, Umsetzung des entstandenen Wasserstoffperoxids mit 4-Aminoantipyrin und Phenol in Gegenwart von Peroxidase unter Bildung eines Chinonimins und anschließende Bestimmung des Chinonimins bestimmt. Die ablaufenden Verfahren werden durch folgende Reaktionsgleichungen (1) und (2) wiedergegeben.

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CHO

CH₂OH HO J— ₀ oh Galactose

Y H \ +0 °™^£

koH U λ

⁵ h\—P

H OH

Gralactose

O O

^H2°2

H OH H/

OH

Galactohexodialdose

H₃C ' ^NH,

4-Äminoantipyrin- -

OH

^eroxidase

Chxnonimin

(2)

30 Die Reaktionsgleichung (2) und die Bestimmung von Wasserstoffperoxid wurden von CC. Allain u. Mitarb., Clin. Chem., Bd. 20 (1974), S. 470, beschrieben.

Die Maßnahmen zur Bestimmung von Galactose unter Verwendung 35 von Galactoseoxidase und ein Verfahren zur Berechnung der Enzymaktivität sind nachstehend wiedergegeben:

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(A) Reagens

(1) Substrat:

(2) Puffer:

(3) 4-Aminoantipyrin:

(4) Phenol:

(5) wäßrige Lösung von Peroxidase

(6) Wasser

(7) Enzymlösung:

(B) Versuchsmethodik

0,5 molare wäßrige
Lösung von Galactose

(Protein 2 mg/ml;
spezifische Aktivität
100)

(wäßrige Lösung von
Galactoseoxid ase)

0,5 ml

0,25 molarer Phosphatpuffer ,pH-Wert 7 1,0 ml

24 millimolare wäßrige

Lösung 0,5 ml

42 millimolare wäßrige

Lösung 0,5 ml

0,1 ml 0,3 ml

0,1 ml

Die Reagentien (1) bis (6) werden in ein Reagensglas gegeben.

20 Der Inhalt des Reagensglases wird 5 Minuten bei 25⁰C geschüttelt. Sodann wird das Gemisch mit der Enzymlösung (7) auf 3 ml aufgefüllt. Die Umsetzung wird 10 Minuten bei 25⁰C unter Schütteln durchgeführt. Das gleiche Verfahren wie vorstehend beschrieben, wird wiederholt, jedoch wird Wasser als

25 Kontrolle anstelle des Substrats verwendet. Die Absorption der Reaktionslösung und der Kontroilösung bei 500 nm wird gemessen. Der Unterschied in der Absorption wird ausgedrückt durch

(C) Berechnung der Aktivität

Eine Einheit von Galactoseoxidase ist diejenige Enzymmenge, die 1 μΜοΙ Galactose bei 25⁰C innerhalb 1 Minute zersetzt.

35 Der Absorptionskoeffizient von 1 mMol des Chinonimins beträgt 5,33; vgl. Clin. ehem., Bd. 20 (1974>, S. 470. Die Ab-

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_ Λ Λ Λ Γ / 1 / '

sorption (AOD) von 3 ml der Reaktionslösung bei 500 nm, berechnet nach der Versuchsmethodik (B) wird durch "a" wiedergegeben. Die Aktivität (A) von 1 ml der Enzymlösung wird somit nach folgender Formel berechnet:

A = a χ —F—~ χ 3 χ

5,33 ^Λ " ^Λ 10 = a χ 0,056 (Einheiten/ml)

Verschiedene Eigenschaften der erfindungsgemäß hergestellten Galactoseoxidase sind nachstehend angegeben.

(1) Wirkung

Galactose wird in Gegenwart des Enzyms und Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid und Galactohexodialdose oxidiert.

(2) Substratspezifität

Das Enzym ist spezifisch für Galactose und wirkt unter anderem auch auf Melibiose, Raffinose und Dihydroxyaceton, jedoch nicht auf Glucose und Glycerin. Dies geht aus Tabelle I hervor.

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Tabelle I

Substrat relative Aktivität, %

Galactose 100

Galactonolacton 5

Galacturonsäure 0

Glucose 0

Mannose 0

Fructose 4 10

Rhamnose 1

Inosit 0

Xylose 0

Lactose 1

Melibiose . 68

Raffinose 98

Glycerin 1

Dihydroxyaceton 135

(3) pH-Optimum

Das pH-Optimum des Enzyms liegt bei 6,0 bis 7,0 bei 10-minütiger Umsetzung bei 25⁰C.

(4) Stabilität

Das Enzym ist im pH-Bereich von 5,0 bis 8,0 während der Minuten bei 45°C durchgeführten Reaktion stabil.

(5) Temperaturoptimum

Das Temperaturoptimum des Enzyms liegt bei 20 bis 30⁰C während der 10 Minuten bei einem pH-Wert von 7,0 durchgeführten Reaktion.

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(6) Wärmestabilität

Das Enzym ist bei Temperaturen bis zu 50⁰C und bei einem pH-Wert von 7,0 während 15 Minuten stabil. Es verliert etwa 90 % seiner Aktivität bei 60°C.

(7) Inhibitoren

Das Enzym wird durch die in Tabelle II aufgeführten Inhibitoren bei 25⁰C und einem pH-Wert von 7,0 inhibiert.

Tabelle II

Inhibitor	Konzentration, Mol	Hemmung, %
AgNO₀	ίο"⁴	100
NaN _	ΙΟ"³	94
ό PCMB *	ΙΟ"³	57
NH₀OH	10~⁴	100
EDTA **	ΙΟ"³	52
o-Phenanthrolin	ΙΟ"³	68
DDC ***	ίο"⁵	69,3
Il	ίο'⁴	84,8
Il	ΙΟ"³	100

Anm. :

* PCMB : p-Chlormercuribenzoat

** EDTA : Äthylendiamintetraessigsäure

*** DDC : Diäthyldithiocarbamat; Chelatbildner

speziell für Kupferionen 30

(8) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht des Enzyms beträgt etwa 45 000, bestimmt nach der Gelfiltrationsmethode an Sephadex G 35

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(9) Metallanalyse

Das Enzym enthält etwa 1 Grammatom Kupfer pro Mol. Die Analyse erfolgt durch Atomabsorptionsspektroskopie. 5

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1
Gibberella fujikuroi Y-530929 (NRRL 12168) wird in 300 ml eines Nährmediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung in einem 2 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben überimpft und 48 Stunden bei 30°C unter Schütteln gezüchtet. Das Nährmedium hat einen pH-Wert von 6,0 und es enthält 1g/dl Galactose, 1 g/dl lösliches Pflanzenprotein und 0,001 g/dl ZnCl₃.

Hierauf werden 600 ml der erhaltenen Kulturflüssigkeit in einen 30 Liter fassenden Fermenter überführt, der 15 Liter Nährmedium der gleichen Zusammensetzung, wie vorstehend beschrieben, enthält. Die Züchtung wird unter Belüftung mit 15 Liter/Minute Luft bei 30°C während 48 Stunden und einer Rührgeschwindigkeit von 300 U/min durchgeführt. Danach wird die gesamte Kulturbrühe durch einen großen Büchner-Trichter filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck auf etwa 1/4 seines Volumens eingedampft. Hierauf wird das erhaltene Konzentrat mit Ammoniumsulfat versetzt, und die bei 90prozentiger Ammoniumsulfatsättigung erhaltene Fällung wird abgetrennt. Die Ausbeute, ausgedrückt durch die Aktivität an Galactoseoxidase in der Fällung, beträgt etwa 70 %, und die spezifische Aktivität wird auf etwa das dreifache erhöht.

Die erhaltene Fällung wird in etwa 100 ml eines 0,01 molaren Phosphatpuffers vom pH 7,0 gelöst. Diese Lösung wird gegen 10 Liter des gleichen Puffers während 24 Stunden dialysiert. Das Retentat wird auf eine Säule mit einem Durchmesser von 6 cm gegeben, die mit 1 Liter DEAE-Cellulose gefüllt ist,

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und die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist. Die Galactoseoxidase wird an der DEAE-Cellulose nicht adsorbiert. Das Eluat wird in Fraktionen entnommen. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und mit Ammoniumsulfat versetzt. Die bei 90prozentiger Ammoniumsulfatsättigung erhaltene Fällung wird abzentrifugiert (20 Minuten bei 12 000 g) und in 10 ml eines 0,01 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 gelöst. Die Lösung wird gegen 5 Liter des gleichen Puffers während 24 Stunden dialysiert.
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Nach der Dialyse wird die Enzymlösung auf eine Säule mit einem Durchmesser von 3,5 cm gegeben, die mit 500 ml Sephadex G-150 gefüllt ist, der vorher mit dem gleichen Puffer äquilibriert wurde. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet. Es werden 25 mg eines gereinigten Galactoseoxidasepräparats mit einer spezifischen Aktivität von 13 Einheiten/mg als Pulver erhalten.

Die spezifische Aktivität des gereinigten Enzyms ist um das 100-fache gegenüber dem Zellfiltrat erhöht. Die Ausbeute, ausgedrückt durch die Aktivität, beträgt 50 %.

Beispiel 2

Beispiel 1 wird mit Gibberella fujikuroi T-28O53O (NRRL 12169) wiederholt. Es wird ein Nährmedium vom pH-Wert 6,0 mit 1 g/dl Sucrose, 1 g/dl löslichem Pflanzenprotein und 0,001 g/dl ZnCl„ verwendet. Es werden etwa 20 mg gereinigte Galactoseoxidase mit einer spezifischen Aktivität von 10 Einheiten/mg erhalten. Die Ausbeute, ausgedrückt durch die Aktivität, beträgt 45 %.

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BAD ORIGINAt

Beispiel 3

Beispiel 2 wird wiederholt, jedoch wird Gibberella zeae K-240319 (FERM-P Nr. 5 068) verwendet. Es werden etwa 20 mg gereinigte Galactoseoxidase einer spezifischen Aktivität von 8 Einheiten/mg erhalten. Die Ausbeute, ausgedrückt durch die Aktivität, beträgt 40 %.

Beispiel 4

Beispiel 1 wird wiederholt, jedoch wird ein Nährmedium vom pH-Wert 6,0 mit 1 g/dl Galactose, 1 g/dl Hsfeextrakt und 0,01 g/dl CUSO.« 5 ELO verwendet. Es werden etwa 20 mg gereinigte Galactoseoxidase mit einer spezifischen Aktivität von 12 Einheiten/mg erhalten. Die Ausbeute, ausgedrückt durch die Aktivität, beträgt 5O%.

Etwa 2 mg gereinigte Galactoseoxidase einer spezifischen Aktivität von 11 Einheiten/mg werden erhalten, wenn das vorstehend beschriebene Verfahren mit einem Nährmedium vom pH-Wert 6,0 mit 1 g/dl Galactose und 1 g/dl Hefeextrakt verwendet wird.

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Claims

VOSSIUS .VOSSIUS TAUCHNER · Ηρατε nt α ν walte u.Z.: P 708 (Vo/kä) Case: 253-4 KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD. Tokyo·, Japan 10 " Verfahren zur Herstellung von Galactoseoxxdase " Priorität: 5.7.1979, Japan, Nr. 84 407/79 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Galactoseoxidase, dadurch gekennzeichnet, daß man einen zur Bildung von Galactoseoxidase fähigen Mikroorganismus der Gattung Gibberella in einem Nährmedium züchtet und aus der Kulturbrühe das Enzym abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Gibberella fujikuroi oder Gibberella zeae verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß 2Q man als Mikroorganismus Gibberella fujikuroi Y-530929 (NRRL 12168), Gibberella fujikuroi T-28O53O (NRRL 12169) oder Gibberella zeae K-240319 (FERM-P Nr. 5 068) verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in Gegenwart von Zinkionen durchführt.

_L 030063/0928 _,

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in Gegenwart von Kupferionen durchführt.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium Zinkionen in Form von Zinkchlorid oder Zinksulfat in einer, Menge von 0,0001 bis 0,005 Gewichtsprozent pro Volumen zuführt.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium Kupferionen in Form von Kupfersulfat oder Kupfer(II)-chlorid in einer Menge von 0,001 bis 0,05 Gewichtsprozent pro Volumen zuführt.

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