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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von säurefester
a-Amylase unter Verwendung von Mikroorganismen des schwarzen Aspergillus-Typs.
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Aus der USA.-Patentschrift 2 451567 ist es bekannt, einen Stärke
hydrolysierenden Enzymkomplex, der dextrin- und zuckerbildende Enzyme enthält, dadurch
herzustellen, daß man Aspergillus niger NRRL 337 aerob submers in einem wäßrigen
Nährmedium bei einem pH-Wert zwischen 3,5 und 8,0, vorzugsweise zwischen 4,5 und
6,0, in Gegenwart von Calciumcarbonat züchtet, wobei, wie aus Beispiel ? hervorgeht,
geringe Mengen säurefester a-Amylase gebildet werden.
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Es ist auch allgemein bekannt, daß die spezielle Art der jeweils erhaltenen
Amylase - oc-Amylase, die verzuckernde Amylase (Amyloglucosidase, Glucamylase),
y-Amylase und Grenzdextrinase - sowohl von der Art des verwendeten Schimmelpilzes
als auch von den Züchtungsbedingungen abhängt und dementsprechend variiert werden
kann.
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Überraschenderweise wurde festgestellt, daß man säurefeste oc-Amylase
bei der Züchtung von Mikroorganismen des schwarzen Aspergillus-Typs in größerer
Menge erhält, wenn man während der Züchtung den pH-Wert der Kulturflüssigkeit auf
bestimmte Werte einstellt. Auf diese Weise ist es möglich, säurefeste cc-Amylase
herzustellen, die in kristalliner Form anfällt.
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Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung und
Gewinnung von säurefester a-Amylase durch aerobe submerse Züchtung von Mikroorganismen
des schwarzen Aspergillus-Typs in üblichen wäßrigen Nährmedien, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man die Züchtung in einer ersten Stufe im wesentlichen bei einem pH-Wert
von 5,0 bis 5,5 durchführt, in einer zweiten anschließenden Stufe den pH-Wert zunächst
bei 2,2 bis 4,5 und gegen Ende dieser Stufe den pH-Wert dann bei 5,0 bis 5,8 hält
und schließlich die gebildete säurefeste a-Amylase aus der Kulturbrühe in an sich
bekannter Weise abtrennt.
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Die gemäß der Erfindung erhaltene säurefeste a-Amylase wirkt auf Stärke
unter schnellem Zurückgehen der Jodreaktion ein, und sie ist im sauren Milieu bei
einem pH-Wert von z. B. 2,5 stabil, wodurch sie sich sehr deutlich von der üblichen
zur Stärkeverflüssigung verwendeten a-Amylase unterscheidet, die ihre Wirksamkeit
bei einem pH-Wert von 2,5 praktisch sofort verliert.
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Die gemäß der Erfindung erhaltene säurefeste a-Amylase zeigt eine
sehr starke Wirkung bezüglich der Stärkeverflüssigung und der Bildung von Dextrinen.
Wenn im Verlauf der Stärkeumwandlung eine Glukosebildung entsprechend einem Reduktionswert
von 5,8 °/o stattgefunden hat, tritt bei der Reaktion mit Jod bereits eine rote
Farbe auf. Die Stärkeumwandlung mittels der säurefesten a-Amylase hört bei einem
Reduktionswert von etwa 40 °/o auf, ohne daß wesentliche Mengen an Glukose gebildet
worden sind. Die säurefeste a-Amylase zeigt keine Maltasewirkung und ist damit hinsichtlich
ihrer Wirkung der üblichen a-Amylase, die zwar Stärke hauptsächlich zu Glukoseeinheiten
abbaut, vergleichbar. Die säurefeste a-Amylase verliert ihre Wirksamkeit selbst
bei 30minutigem Stehenlassen bei einem pH-Wert von 2,5 und einer Temperatur von
37°C oder bei 10tägigem Lagern im Kühlschrank bei einem pH-Wert von 2,0 noch nicht
und ist daher außerordentlich säurestabil. Wenn man mit den beiden Amylasearten
eine Papierelektrophorese durchführt (pH-Wert 5,72, Temperatur 3°C, Spannung 10
V/cm, Ausgangsstromstärke 0,4 mA/cm, Endstromstärke 0,6 mA/cm, Versuchsdauer 5 Stunden),
so zeigt die übliche a-Amylase einen Endwert von +42 mm, während die säurefeste
a-Amylase einen Endwert von -E-35 mm aufweist. Die säurefeste oc-Amylase unterscheidet
sich daher hinsichtlich des Enzymproteins ganz deutlich von der üblichen a-Amylase.
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Die verzuckernde Amylase ist zwar gleichfalls säurestabil, sie unterscheidet
sich aber dadurch von der gemäß der Erfindung hergestellten säurefesten a-Amylase,
daß ihre Aktivität hinsichtlich einer Dextrinbildung aus der Stärke nur sehr schwach
ist, während der Reduktionswert des Stärkeumwandlungsproduktes zum Zeitpunkt des
Auftretens einer roten Jodreaktion einem Glukosegehalt von 70 bis 900/,) entspricht
und der Endwert bei der Papierelektrophorese unter den vorstehend genannten Bedingungen
bei -3 mm liegt. Außerdem zeigt die verzuckernde Amylase Maltaseaktivität, und aus
der Stärke entsteht hauptsächlich Glukose.
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Die Grenzdextrinase greift hauptsächlich Grenzdextrine an und weist
genau wie die verzuckernde Amylase nur eine schwache Wirkung hinsichlich der Dextrinbildung
aus Stärke auf. Auch von diesen beiden Amylasesorten unterscheidet sich daher die
gemäß der Erfindung herstellbare säurefeste a-Amylase sehr deutlich.
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Neben den aus Schimmelpilzen herstellbaren Amylasen sind noch andere
Amylasesorten bekannt, z. B. a-Amylasen aus Bakterien, aus dem Speichel und aus
dem Pankreas sowie aus höheren Pflanzen, welche dem a-Typ angehören, und ß-Amylase
aus höheren Pflanzen, welche dem ß-Typ angehören. Übliche a-Amylase verliert ihre
Wirksamkeit nach 30minutiger Behandlung bei einem pH-Wert von 2,5 und einer Temperatur
von 37°C, während ß-Amylase bei der Zersetzung von Stärke eine negative Jodreaktion
ergibt. Die säurefeste a-Amylase unterscheidet sich daher auch von diesen a- und
ß-Amylasen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden im einzelnen erläutert:
Mikroorganismen des schwarzen Aspergillus-Typs sind z. B. Aspergillus awamori, Aspergillus
usami, Aspergillus niger, Aspergillus saitoi, Aspergillus inui, Aspergillus aureus,
Aspergillus nakazawai.
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Wenn jedoch nach dem erfindungsgemäßen Verfahren sauer reagierende
physiologische Nährstoffe, wie Ammoniumsulfat und Ammoniumtartrat, oder Säuren zugesetzt
werden, wodurch der pH-Wert in der zweiten Stufe der Züchtung im Bereich zwischen
2,2 und 4,5 gehalten werden kann und anschließend der pH-Wert durch Zusatz von Alkali,
Calciumcarbonat oder eines Zellautolysats oder andere geeignete Mittel auf 5,0 bis
5,8 eingestellt wird, dann kann sich zusätzlich zu der üblichen a-Amylase, die nicht
säurefest ist, und zu der verzuckernden Amylase säurefeste Amylase in größerer Menge
bilden.
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Als Kohlenstoffquellen können bei der Züchtung Stärke und Zuckerarten
dienen. Als Stickstoffquellen eignen sich Weizenkleie, Reiskleie, Pepton, Destillationsrückstände
der Alkoholdestillation, Maisquellwasser, Trockenhefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl
und andere pflanzliche Mehle sowie Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat,
Natriumnitrat, Ammoniumtartrat und andere organische Ammoniumsalze. Als Mineralstoffe
können
Calcium-, Kalium-, Natrium-, Phosphor-, Schwefel-, Magnesium-, Kupfer- und Zinkverbindungen
verwendet werden.
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In der folgenden Tabelle I sind die Ergebnisse von unter drei verschiedenen
Bedingungen durchgeführten Submerskulturen (A, B und C) bezüglich der Amylaseart
und ihrer Wirksamkeit zusammengestellt, wobei Aspergillus niger NRRL 330 als Mikroorganismus
verwendet wurde. Das Nährmedium hatte die folgende Zusammensetzung:
| Stärke ......................... 4,5 g |
| Reiskleie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0 g |
| Ammoniumsulfat . . . . . . . . . . . . . . . 0,2 g |
| Wasser ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
100 ml |
Die Züchtungsdauer betrug 85 Stunden. (A) Übliche Methode: Von Beginn der Züchtung
an wird Calciumcarbonat zugesetzt, um den pH-Wert während der gesamten Versuchsdauer
neutral zu halten.
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(B) Erfindungsgemäße Arbeitsweise: Nachdem man den pH-Wert des Nährmediums
48 Stunden lang im stärker sauren Gebiet gehalten hat, setzt man Calciumcarbonat
zu, um den pH-Wert in das schwachsaure Gebiet zu verschieben.
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(C) Versuchs -Arbeitsweise: Der pH-Wert des Nährmediums wird während
der gesamten Versuchsdauer im stärker sauren Gebiet gehalten.
| Tabelle 1 |
| Stunden Gesamt- I Säurefeste Amylase |
| 24 38 48 65 amylase (nach einer Säure- |
| 0 i Behandlung) |
| PH i PH PH ! PH i PH WE';""", |
| A 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 740 0 |
| B 5,4 2,2 2,2 5,8 5,8 370 185 |
| C 4,8 2,2 I 2,0 2,2 2,4 20 20 |
Anmerkung: Die Aktivität der Amylase wird nach dem Verfahren von W o h 1 g e m u
t h, Biochemische Zeitschrift, Bd.9 (1908), S.1, bei 37'C während 30 Minuten gemessen,
und die angegebenen WE-Werte beziehen sich auf die dabei erhaltenen Werte. Bei der
Messung wurde die Wirkung der verzuckernden Amylase durch den Zusatz eines Überschusses
dieser Amylase kompensiert.
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Aus der Tabelle I ist ersichtlich, daß der pH-Wert entsprechend dem
Wachstum der Mikroorganismen bei der erfindungsgemäßen Arbeitsweise (B) plötzlich
auf 2,2 absinkt und daß ein Zusatz von Calciumcarbonat nach 48 Stunden zur Erhöhung
des pH-Wertes auf 5,8 zur Bildung von säurefester x-Amylase f ührt.
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Bei der Arbeitsweise (A) wird der pH-Wert während der gesamten Versuchsdauer
auf 5,8 gehalten. Die Messung der Aktivität der Gesamtamylase in diesem Nährmedium
zeigt, daß zwar die Ausbeute bei der Verfahrensweise (A) hinsichtlich der Aktivität
doppelt so groß ist wie bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, daß aber diese Aktivität
nach einer Behandlung bei einem pH-Wert von 2,5 und bei einer Temperatur von 37'C
während 30 Minuten vollständig verschwunden ist, während unter den gleichen Bedingungen
bei den Produkten, welche gemäß der Arbeitsweise (B) erhalten werden, die Aktivität
zur Hälfte erhalten bleibt, was auf die Bildung bzw. die Anwesenheit säurefester
a-Amylase hinweist. Bei der Arbeitsweise (C) wird während der ganzen Zeit nur bei
einem niedrigen pH-Wert gearbeitet, und es wird daher auch nur ein Endprodukt mit
geringer Aktivität erhalten.
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Aus dem bei der erfindungsgemäßen Verfahrensweise am Schluß der Züchtung
erhaltenen Nährmedium oder dem Extrakt des festen Endproduktes, welches die säurefeste
x-Amylase enthält, kann letztere in kristalliner Form isoliert werden, indem man
die verzuckernde Amylase und die anderen Amylasen durch geeignete Mittel entfernt,
z. B. durch eine Aussalzbehandlung oder durch eine halbstündige Säure-Behandlung
bei einem pH-Wert von 2,5 und einer Temperatur von 37'C, wodurch die nicht säurefeste
x-Amylase inaktiviert wird. Mit diesen Maßnahmen kann man eine Ausfällung mit 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin
oder andere übliche Reinigungsbehandlungen kombinieren.
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Wenn man das die säurefeste a-Amylase enthaltende Nährmedium mit Alkohol
versetzt und den sich bildenden Niederschlag trocknet, kann dieser als solcher als
peptisierendes Mittel verwendet werden.
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Zur industriellen Erzeugung der säurefesten oc-Amylase eignet sich
das sogenannte Submerskulturverfahren. Folgende Arbeitsweise zur Herstellung der
säurefesten a-Amylase wurde angewendet.
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Diese Arbeitsweise besteht in einem zweistufigen Verfahren, wobei
die Züchtung in jeder Stufe in einem anderen Fermenter und unter den für diese Stufe
geeigneten Bedingungen durchgeführt wird. In der ersten Verfahrensstufe wird der
Mikroorganismus gezüchtet, während in der zweiten Verfahrensstufe die säurefeste
a-Amylase erzeugt wird.
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Da das Arbeiten in der ersten Stufe vor allem auf das Wachstum des
betreffenden Mikroorganismus abgestellt ist, führt man sie unter submersen Bedingungen
und im wesentlichen bei einem pH-Wert von 5,0 bis 5,5 durch. Die Temperatur wird
hierbei vorzugsweise bei etwa 28 bis 30'C gehalten; die Züchtungszeit beträgt etwa
40 bis 60 Stunden. Wenn der betreffende Mikroorganismus genügend gewachsen ist,
wird die zweite Verfahrensstufe in einem anderen Fermenter unter Submersbedingungen
durchgeführt, wobei der pH-Wert im stärker sauren Bereich zwischen etwa 2,2 und
4,5 gehalten wird.
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Die Züchtung in der zweiten Verfahrensstufe soll bei niedrigeren Temperaturen,
vorzugsweise zwischen etwa 20 und 23'C, erfolgen, und außerdem rührt man langsamer
als in der ersten Verfahrensstufe. Nach 2tägiger Züchtung unter Submersbedingungen
wird der pH-Wert gegen Ende dieser Stufe auf 5,0 bis 5,8 eingestellt. Die Züchtung
wird dann unter diesen Bedingungen
noch einige Stunden, vorzugsweise
10 bis 30 Stunden, fortgesetzt.
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Die wesentlichen Merkmale des erfindungsgemäßen Verfahrens bestehen
darin, daß die einzelnen Verfahrensstufen jeweils in getrennten Fermentern durchgeführt
werden und daß man die Temperatur entsprechend den jeweiligen Stadien der Züchtung
variiert. Falls man die erste und zweite Verfahrensstufe in ein und demselben Fermentationsgefäß
durchführen will, so ist hierfür ein säurebeständiger geschlossener Druckbehälter
erforderlich, und die Geschwindigkeit des Rührers muß außerdem veränderlich sein.
Bei der praktischen Durchführung benötigt man für die erste Verfahrensstufe zwar
einen geschlossenen Druckbehälter, doch braucht dieser nicht unbedingt säurebeständig
zu sein, sondern es kann auch ein einfacher Eisenbehälter hierfür verwendet werden.
Außerdem benötigt man für die erste Verfahrensstufe einen Rührer, dessen Geschwindigkeit
verändert werden kann. Für die zweite Verfahrensstufe ist dagegen ein säurebeständiger
Behälter erforderlich, der aber nicht geschlossen zu sein braucht und nicht druckfest
sein muß. Falls ein Behälter aus korrosionsbeständigem Stahl benutzt wird, brauchen
dessen Wände nicht sehr dick zu sein. Falls nur ein Eisenbehälter zur Verfügung
steht, muß dieser mit einer Auskleidung aus Gummi, einem Vinylharz oder einem anderen
Kunstharz oder einem entsprechenden Schutzanstrich versehen werden. Auch eignen
sich für diese Verfahrensstufe einfache Holzbehälter. In der zweiten Verfahrensstufe
benötigt man jedoch keinen Rührer mit veränderlicher Geschwindigkeit, und außerdem
können die Rührgeschwindigkeiten niedriger liegen als in der ersten Verfahrensstufe.
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Es ist an sich bekannt, daß den Rührbedingungen bei der üblichen aeroben
Submerskultur eine wesentliche Bedeutung zukommt. Auch die Bildung der erfindungsgemäßen
säurefesten a-Amylase wird von diesen Bedingungen in hohem Maße beeinflußt, so daß
es für eine Erhöhung der Produktion wesentlich ist, optimale Bedingungen einzustellen
und aufrechtzuerhalten. Die Belüftung kann in beliebigem Ausmaß geändert werden,
selbst wenn ein und derselbe Behälter verwendet wird, doch können die Rührgeschwindigkeiten
nur geregelt werden, falls ein entsprechendes variables Getriebe zur Anwendung kommt.
Da die Konstruktion eines Getriebes für variable Rührgeschwindigkeiten mit hoher
Rührleistung ziemlich schwierig ist, ist es praktisch unmöglich, die erforderliche
Änderung der Rührgeschwindigkeit in einem großen Fermenter durchzuführen. Bei Verwendung
von zwei Fermentern ist es leicht möglich, die Rührbedingungen den Erfordernissen
der einzelnen Züchtungsstadien anzupassen und in der ersten Verfahrensstufe eine
hohe Rührgeschwindigkeit und in der zweiten Verfahrensstufe eine niedrige Rührgeschwindigkeit
zu verwenden.
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Die in den folgenden Beispielen angegebenen Einheiten der säurefesten
a-Amylase beziehen sich auf die nach einer halbstündigen Vorbehandlung bei einem
pH-Wert von 2,5 und einer Temperatur von 37°C nach dem Verfahren von W o h 1 g e
m u t h gemessenen Werte, falls nicht etwas anderes angegeben Ist.
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Beispiel 1 Zu 3001 eines Nährmediums, das 8 kg Stärke, 9 kg Rückstände
der Alkoholdestillation und 45 kg Ammoniumtartrat sowie geringe Mengen Magnesium-,
Zink-, Eisen-, Calcium- und/oder Kupfersulfat enthielt, wurden 151 einer vegetativen
Kultur von Aspergillus niger NRRL 330 zugesetzt. Die Züchtung wurde unter Submersbedingungen
bei 30°C, einer Belüftung von 3001 je Minute und einer Rührgeschwindigkeit von 250
Umdr./Min. durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums sank innerhalb von 50 bis 60 Stunden
von einem Anfangswert von 5,28 auf einen Endwert von 3,9 bis 4,0 ab.
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Wenn der pH-Wert weitere 40 bis 50 Stunden bei etwa 4 gehalten wurde,
um eine Autolyse zu begünstigen, so stieg er schließlich auf 5,0 bis 5,5 an.
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Die Kulturbrühe (780 Einheiten) wurde anschließend filtriert, wodurch
man 2001 eines Filtrates erhielt, das zusammen mit den Waschwässern 700 säurefeste
a-Amylaseeinheiten enthielt. Dieses Filtrat wurde mit 1n-Salzsäure auf einen pH-Wert
von 4,8 eingestellt, dann entfärbt und filtriert, wodurch 2001 einer farblosen Lösung
anfielen (665 Einheiten, einschließlich der Waschwässer). 1501 dieser Lösung wurden
mit 1251 Äthanol versetzt, und der sich abscheidende Niederschlag wurde abfiltriert.
Nach dem Trocknen des Niederschlages bei 40°C im Vakuum erhielt man 770 g einer
rohen, pulverförmigen, säurefesten oc-Amylase (22300 Einheiten je Gramm Substanz).
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501 der restlichen farblosen Lösung wurden bei 15°C mit 14,8 kg Ammoniumsulfat
versetzt. Der entstehende Niederschlag wurde abzentrifugiert, und die überstehende
Flüssigkeit wurde mit weiteren 7,4 kg Ammoniumsulfat versetzt. Der Niederschlag
wurde wiederum abzentrifugiert, in destilliertem Wasser gelöst, dialysiert und schließlich
filtriert. Hierbei erhielt man 41 eines Filtrates (1620 Einheiten), das auf einen
pH-Wert von 2,5 eingestellt und 30 Minuten auf 37°C erwärmt wurde. Das Filtrat wurde
anschließend nochmals mit Ammoniumsulfat versetzt und der erneut ausgefallene Niederschlag
abzentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde in der gleichen Weise mit 600
g Ammoniumsulfat versetzt, der entstandene Niederschlag abzentrifugiert, in Wasser
aufgenommen und gegen destilliertes Wasser dialysiert und filtriert. 21 des erhaltenen
Filtrates (2860 Einheiten) wurden mit 320 ml einer 1 o/oigen Lösung von 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin
versetzt. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert, die überstehende Lösung erneut
mit 180 ml der 6,9-Diamino-2-äthoxyacridin-Lösung behandelt. Der sich bildende gelbe
Niederschlag wurde abzentrifugiert und in 1000 ml einer Acetatpufferlösung mit einem
pH-Wert von 5,5 aufgelöst. Danach wurden unter Rühren 200 g eines sauren Tons zugesetzt,
und schließlich wurde filtriert. In dieser Verfahrensstufe erhielt man 850 ml eines
Filtrates (4150 Einheiten), das man unter Kühlen mit Aceton bis 50 Volumprozent
versetzte und dann in Eis abkühlte. Der ausgefallene Niederschlag wurde wiederum
abzentrifugiert. Zu der in dieser Verfahrensstufe anfallenden überstehenden Flüssigkeit
setzte man nochmals Aceton bis 60 Volumprozent hinzu. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert
und in 150 ml einer 1/5omolaren Calciumacetatlösung aufgelöst (3480 Einheiten),
worauf man unter Kühlen Aceton bis etwa 35 Volumprozent zu der Lösung hinzusetzte
und im Kühlschrank stehenließ, bis sich 120 mg säurefeste a-Amylase in kristalliner
Form abgeschieden hatten.
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In der folgenden Tabelle II sind die Eigenschaften der so erhaltenen
säurefesten a-Amylase denjenigen der üblichen nicht säurefesten a-Amylase und der
verzuckernden Amylase gegenübergestellt.
| Tabelle Il |
| Säurefeste Übliche Verzuckernde |
| a-Amylase a-Amylase Amylase |
| Säurebeständigkeit) |
| PH 1 ................... . .................. 64% 0%
72% |
| pH 2 ........................................ 86% 0% 91% |
| pH 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . 970/, 7% - 960/, |
| Papierelektrophorese**) . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . -I-35 mm -I-42 mm -3 mm |
| Reduktionswert zum Zeitpunkt des Auftretens einer |
| roten Jodreaktion im Stärkehydrolysat (Umwand- |
| Jung in Glukose) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 5,80/0 5,30/0 70 bis 900/0 |
| Maltaseaktivität ................................ - - - |
| *) Verhältnis der Enzymaktivität nach einer Behandlung während
30 Minuten und einer Temperatur von 37°C bei den ange- |
| gebenen p11-Werten zu der ursprünglichen Enzymaktivität. |
| **) Die Elektrophorese wurde unter den folgenden Bedingungen
durchgeführt: pH-Wert 5,72; Temperatur 3°C; Anfangsstrom- |
| stärke 0,4 mA/cm; Endstromstärke 0,64 mA/cm; Versuchsdauer
5 Stunden. |
In der nachfolgenden Tabelle III werden die Eigenschaften des gemäß Beispiel 1 erhaltenen
Rohproduktes in Pulverform mit denjenigen von im Handel erhältlichen Enzymen verglichen.
| Tabelle III |
| Pulverför- Verdauungs- Verdauungs- Diastase der |
| mige, rohe, enzym von enzym von |
| säurefeste gelbem schwarzem Japanischen - |
| x-Amylase Aspergillus Aspergillus Arzneibücher |
| Aktivität bezüglich einer Stärkeverflüssigung |
| Einheiten je Gramm Substanz) |
| pH 2,0 ......,............................. 144700 0 - 0 |
| pH 3,0 . . . ................................. 1010000 608000
- 0 |
| pH 4,0 .................... . .............. 1520000 20300M
- 21700 |
| pH 5,0 .................................... 1520000
1220000 - 30400 |
| pH 6,0 .................................... 2030000 1010000
- 28100 |
| pH 7,0 .................................... 434000
380000 - 14900 |
| Aktivität bezüglich einer Stärkeverzuckerung |
| Einheiten je Gramm Substanz**) |
| pH 1,8 .................................... 3,15 0,23 0,55
0,06 |
| pH 2,8 .................................... 5,16 0,65
1,62 0,09 |
| pH 4,36 ..................... ........... 12,65 8,92 6,87 2,85 |
| pH 5,90 ................................... 12,02 8,84 6,87
3,50 |
| pH 7,2 .................................... 5,41 5,55 4,97
2,67 |
| 'k) Die abbauende Aktivität der Amylase wird charakterisiert
durch die Kennwerte nach W o hlgemu th, die nach einer halb- |
| stündigen Behandlung bei einer Temperatur von 37°C und bei
den angegebenen pH-Werten gemessen wurden. |
| * *) -Die verzuckernde Aktivität der Amylase wird gekennzeichnet
durch die innerhalb einer Stunde bei 40° C gebildete Glukosemenge, |
| welche in Kubikzentimeter verbrauchter Jodlösung angegeben
ist. |
Beispiel 2 12001 eines Nährmediums, das 72 kg Stärke, 48 kg Baumwollsaatmehl und
die im Beispiel 1 angegebenen Mineralstoffe enthält, werden mit 501 einer vegetativen
Kultur von Aspergillus niger NRRL 330 beimpft. Die Züchtung wird während 65 Stunden
bei einer Temperatur von 30°C, einer Belüftung von 12001/Min. und einer Rührgeschwindigkeit
von 160 Umdr./Min. und gegen Ende der Wachstumsperiode bei einer Temperatur von
23°C durchgeführt. Der pH-Wert fällt innerhalb von 50 bis 60 Stunden von 5,5 auf
einen Wert zwischen 3,9 und 4,0 ab. Die Kulturbrühe wird dann noch weitere 20 bis
40 Stunden bei diesem stärker sauren pH-Wert gehalten. Anschließend wird der pH-Wert
durch Zusatz von Alkali in den Bereich von 5,0 bis 5,5 eingestellt und die Bebrütung
weitere 20 bis 30 Stunden fortgesetzt. 10001 der Kulturbrühe (1070 Einheiten) werden
filtriert und ergeben 10001 eines Filtrates mit einem Gehalt von 964 Einheiten,
einschließlich der Waschwässer. Zu diesem Filtrat werden 5 kg Aktivkohle zugesetzt,
wodurch nach einer Filtration 10001 eines farblosen Filtrates erhalten werden (916
Einheiten, einschließlich der Waschwässer). Dieses Filtrat wird bei einer Temperatur
unterhalb 30°C im Vakuum eingedampft, auf einen pH-Wert von 5,25 eingestellt und
filtriert. Es fallen 2001 eines Konzentrates an (4120 Einheiten, einschließlich
der Waschwässer). Dieses Konzentrat versetzt man mit 1601 Isopropanol und filtriert
den entstehenden Niederschlag ab. Zu dem dabei erhaltenen Filtrat werden nochmals
1401 Isopropanol zugesetzt, und die dabei entstehende zweite Abfällung wird gleichfalls
abfiltriert. Die beiden Niederschläge werden getrennt im Vakuum bei 40°C getrocknet
und ergeben 2700 bzw. 1180 g einer rohen,'
säurefesten a-Amylase
in Pulverform mit einem Gehalt von 70000 bzw. 276000 Einheiten je Gramm Substanz.
Beispiel 3 6001 eines Nährmediums, das 24 kg Stärke, 18 kg Sojabohnenmehl und die
im Beispiel 1 beschriebenen Mineralstoffe enthält, werden mit 401 einer vegetativen
Kultur von Aspergillus niger NRRL 337 beimpft. Die Züchtung wird bei einer Temperatur
von 30°C und bei einer Belüftung von 600I/Min. sowie einer Rührgeschwindigkeit von
200 Umdr./Min. durchgeführt. Das Kulturmedium wird 65 Stunden bei einem pH-Wert
von 5,0 bis 5,5 gehalten, indem man von Zeit zu Zeit 1
% Calciumcarbonat
in kleinen Anteilen zusetzt. Hierauf wird die Kulturbrühe in zwei Teile geteilt.
Ein Anteil wird kontinuierlich in dem gleichen Fermenter weiter irrkubiert (Einstufenverfahren),
und der andere Anteil wird in einen kleineren Behälter übergeführt, der mit einer
Geschwindigkeit von
150 Umdr./ Min. gerührt wird, während gleichzeitig die
Temperatur 23'C beträgt und der pH-Wert des Mediums durch Säurezusatz auf 3,9 bis
4,0 eingestellt wird. Die Züchtung wird unter diesen Bedingungen weitere 40 bis
50 Stunden durchgeführt, um eine Autolyse des Mycels zu begünstigen. Wenn der pH-Wert
des Mediums auf etwa 5,0 bis 5,5 angestiegen ist, ist die Züchtung beendet (Zweistufenverfahren).
Vergleicht man das Einstufenverfahren gemäß der üblichen Arbeitsweise mit dem Zweistufenverfahren
gemäß der Erfindung, so ergibt sich, daß das erstere ein Endprodukt mit 289 Einheiten,
das letztere aber ein Endprodukt mit 400 Einheiten liefert. 2501 der am Schluß erhaltenen
Kulturbrühe des Zweistufenverfahrens werden filtriert. Dabei fallen 2501 eines Filtrates
an, das einschließlich der Waschwässer 357 Einheiten enthält. Dieses Filtrat wird
durch Zusatz von 1250 g Aktivkohle entfärbt und filtriert, wodurch man 2501 einer
farblosen Lösung erhält (340 Einheiten einschließlich der Waschwässer). Diese Lösung
läßt man mit einer Geschwindigkeit von 1 I/Min. durch eine Säule (250 cm Höhe, 20
cm Durchmesser) fließen, die mit dem Ionenaustauscherharz »Amberlite IRA-400K in
der essigsauren Form gefüllt ist. Auf diese Weise werden aus der Lösung die organischen
Säuren entfernt, und man erhält 3001 eines Eluates (280 Einheiten), das im Vakuum
bei 30°C bis auf insgesamt 601 eingedampft wird. Dieses Konzentrat enthält 1250
Einheiten. Beim Zusatz von 901 Äthanol zu dem Konzentrat fällt ein Niederschlag
aus, der abfiltriert und im Vakuum bei 40°C getrocknet wird. Man erhält so 758 g
einer rohen, säurefesten x-Amylase in Pulverform (88500 Einheiten je Gramm Substanz).
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2001 der bei dem einstufigen Verfahren am Schluß der Züchtung anfallenden
Kulturlösung werden gleichfalls filtriert. Das Filtrat (260 Einheiten, einschließlich
der Waschwässer) wird durch Zusatz von 1000 kg Aktivkohle entfärbt und nochmals
filtriert. 2001 der erhaltenen farblosen Lösung (245 Einheiten, einschließlich der
Waschwässer) werden bei 30°C im Vakuum konzentriert und nochmals filtriert. Die
erhaltenen 401 Konzentrat (1100 Einheiten, einschließlich der Waschwässer) werden
durch Zusatz von 400 g Calciumacetat auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Der
sich bildende Niederschlag wird abfiltriert. Das Filtrat wird mit 601 Äthanol versetzt,
der Niederschlag abfiltriert und im Vakuum bei 40°C getrocknet. Es werden 710 g
rohe, säurefeste a-Amylase in Pulverform erhalten (58400 Einheiten je Gramm Substanz).
Beispiel 4 3,51 eines Nährmediums, das 210g Stärke, 105g
Rückstände der Alkoholdestillation,
52,5g Ammoniumtartrat, eine geringe Menge Magnesium-, Zink-, Eisen- und Kupfersulfat
sowie 35 g Calciumcarbonat enthält, werden mit 200 ml einer vegetativen Kultur von
Aspergillus awamori geimpft. Das beimpfte Nährmedium wird dann in einem 51 fassenden
gläsernen Fermenter unter Submersbedingungen bei 30°C, einer Belüftung von 3,51/Min.
und einer Rührgeschwindigkeit von 550 Umdr./Min. irrkubiert.
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Während der 40stündigen Züchtung zeigt sich unter diesen Bedingungen
ein starkes Wachstum des Mycels mit maximaler Wachstumsgeschwindigkeit. Der pH-Wert
ändert sich nur wenig und sinkt von etwa 6,0 auf 5,3 bis 5,5 ab. Außerdem bildet
sich innerhalb dieses Zeitraumes nur wenig säurefeste a-Amylase.
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Nach dieser Stufe mit praktisch gleichbleibendem pH-Wert wurde die
Kulturflüssigkeit in einen 101 fassenden offenen rotierenden Glaskolben übergeführt,
der sich mit 85 Umdr./Min. drehte. Der pH-Wert wurde durch Zusatz von Phosphorsäure
auf 4,0 eingestellt, und unter diesen Bedingungen wurde die Züchtung bei einer Temperatur
von 23'C kontinuierlich fortgeführt, während gleichzeitig durch eine Düse sterile
Luft mit einer Geschwindigkeit von 51/Min. zugeführt wurde. In diesem Stadium des
Verfahrens vermehrt sich das Mycelium nicht mehr, dagegen läßt sich die Bildung
von säurefester a-Amylase beobachten.
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Die Züchtung wird unter den angegebenen Bedingungen weitere 60 bis
80 Stunden durchgeführt, wobei schließlich Autolyse des Myceliums einsetzt und der
pH-Wert dadurch auf 5,5 ansteigt. Anschließend wird die Züchtung noch weitere 10
bis 20 Stunden fortgesetzt. Die Kulturflüssigkeit wird zum Schluß filtriert. Es
werden 21 Filtrat mit einem Gehalt von 585 Einheiten, einschließlich der Waschwässer,
erhalten.
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Falls man einen entsprechenden Ansatz im üblichen Einstufenverfahren
in eindm - gläsernen Fermenter behandelt, erhält man 2,31 eines Filtrates mit einem
Gehalt von 240 Einheiten, einschließlich der Waschwässer.
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Die erhaltenen Filtrate werden mit 3 bzw. 3,451 Äthanol versetzt.
Die sich bildenden Niederschläge werden abfiltriert und in einem Exsikkator getrocknet.
Man erhält rohe, säurefeste a-Amylase in Pulverform.
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Die Ausbeute an Rohprodukt betrug bei dem Zweistufenverfahren 12,6
g (24200 Einheiten je Gramm Substanz) und bei dem einstufigen Kontrollverfahren
10,9 g (16000 Einheiten je Gramm Substanz). Beispiel s 3001 eines Nährmediums, das
15 kg Stärke, 9 kg
Sojabohnenmehl, eine geringe Menge an Magnesium, Zink-,
Eisen- und Kupfersulfat sowie 1,5 kg Calciumcarbonat enthielt, wurde mit 151 einer
vegetativen Kultur von Aspergillus niger NRRL 337 beimpft. Das beimpfte Nährmedium--
wurde in einem 4001 fassenden Fermenter aus Eisen bei 30°C, einer Luftzufuhr von
1501 je Minute und einer Rührgeschwindigkeit von 350 Umdr./Min. unter Submersbedingungen
irrkubiert. Nach etwa 40 Stunden wurden 401 der Kulturflüssigkeit in einen Behälter
aus Holz übergeführt, der mit einem Rührer versehen war, der
mit
einer Geschwindigkeit von 210 Umdr./Min. betrieben wurde. Der pH-Wert der Kulturbrühe
wurde durch Zusatz von Phosphorsäure auf 3,9 bis 4,0 eingestellt. Die Züchtung wurde
bei 23'C fortgesetzt, während gleichzeitig sterile Luft mit einer Geschwindigkeit
von 41 je Minute durch eine Düse eingeblasen wurde.
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Nach weiterer 40- bis 50stündiger Züchtung unter diesen Bedingungen
wurde der pH-Wert mit Alkali auf 5,5 erhöht und die Züchtung weitere 20 bis 30 Stunden
fortgesetzt. Danach wurde die Kulturbrühe filtriert. Man erhielt 401 Filtrat, das
einschließlich der Waschwässer 617 Einheiten enthielt. Falls man jedoch bei einem
Kontrollversuch die Züchtung von Anfang bis zu Ende in ein und demselben Fermenter
durchführte, wurden 2501 Filtrat mit einem Gehalt von 460 Einheiten, einschließlich
der Waschwässer, erhalten. Beispiel 6 3001 eines Nährmediums, das 15 kg Stärke,
9 kg
Sojabohnenmehl und geringe Mengen Magnesium-, Zink-, Eisen- und Kupfersulfat
enthielt, wurden mit 151 einer vegetativen Kultur von Aspergillus usamii beimpft.
Das beimpfte Nährmedium wurde anschließend in einem 4001 fassenden Fermenter aus
rostfreiem Stahl bei 30°C unter Submersbedingungen bebrütet, wobei die Belüftungsgeschwindigkeit
1501/ Min. und die Rührgeschwindigkeit 350 Umdr./Min. betrug. Nach 40stündiger Züchtung
wurde die Kulturbrühe in einem mit einem Phenolharz ausgekleideten Fermenter aus
Eisen übergeführt, der mit einem Rührer ausgestattet war, der mit einer Geschwindigkeit
von 150 Umdr./Min. betrieben wurde. Der pH-Wert des Mediums wurde durch Zusatz von
Phosphorsäure auf 4,0 eingestellt. Die Züchtung wurde bei 23'C und einer Belüftungsgeschwindigkeit
von 3001 je Minute weitere 60 bis 80 Stunden fortgesetzt. Anschließend wurde die
Kulturbrühe filtriert, wobei 3001 eines Filtrates anfielen, das 490 Einheiten, einschließlich
der Waschwässer, enthielt. Bei einem Kontrollversuch wurde derselbe Ansatz von Anfang
an in ein und demselben Fermenter gezüchtet, wobei schließlich 3001 eines Filtrates
mit einem Gehalt von 430 Einheiten, einschließlich der Waschwässer, erhalten wurden.
B e i s p i e 1 7 (Vergleichsbeispiel) Das Verfahren der Erfindung (Verfahren A)
wird nachstehend mit dem Verfahren der USA.-Patentschrift 2 451567 (Verfahren B)
unter Verwendung von Aspergillus niger NRRL 337 verglichen. Verfahren A Zusammensetzung
des Nährmediums:
| Stärke ........................... 4,5% |
| Kleie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. 3,00/0 |
| (NH4)2S04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,20/0 |
Verfahren B Zusammensetzung des Nährmediums:
| Stärke . . . . . . .. . .. . . .. .. . . . . 2,8 bis 6,90/0 |
| Maisquellwasser. . ... ... . . . .. 3,0 bis 7,00/0 |
| Maismehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,00/0 |
Jeweils 40 ml der beimpften Kulturen in 250-ml-Erlenmeyerkolben werden bis 28'C
auf Drehschüttelmaschinen 65 Stunden inkubiert. Im Verfahren A fällt der anfängliche
pH-Wert innerhalb 24 bis 48 Stunden auf 2,8 bis 3 und wird dann während der 48.
bis 65. Stunde auf 5,7 eingestellt. Im Verfahren B wird während der Inkubation ein
pH-Wert von etwa 4 bis 4,3 eingehalten. Die pH-Werte in den beiden Verfahren wurden
mit CaCOs eingestellt.
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In der Tabelle sind die Verfahrensbedingungen und die Amylaseaktivitäten
- bestimmt nach der Wohlgemuth-Methode - angegeben,
| pH-Werte Aktivität der |
| Verfahren säurefesten |
| Anfang I 24 Stunden I 48 Stunden I 65 Stunden a-Amylase |
| A 5,0 2,8 2,8 5,7 516 |
| B 5,7 4,0 |
| 4,0 4,3 80 |