DE2418716C3 - Verfahren zur Reinigung von Pilzalpha-Amylase - Google Patents

Description

Pilz-a-Amylase, die auch als a-I,4-Glucan-4-glucanhydrolase bekannt ist, ist eine bekannte Substanz, die die Hydrolyse von Stärke katalysiert und die Stärkeverflüssigung und die Verzuckerung (Saccharifizierung) von Stärke unter Bildung von Maltose unterstützt. Es ist bekannt, daß Pilz-a-Amylase gebildet wird durch Fermentationsverfahren, bei denen bestimmte Pilzstämme, die zu der Gruppe der Aspergillusarten gehören und bestimmte Stämme der Art Rhizopus angewandt werden. Typische Pilze sind solche der Art Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus phoenicis, Rhizopus delemar und ähnliche.

Es ist bekannt, daß die Fermentationsbrühe, die durch das Wachstum der oben genannten Pilzstämme in geeigneten Nährmedien entsteht, noch andere Enzyme als Pilze-a-Amylase enthält, sowie Kohlenhydrate, nicht-enzymatische Proteine und Mineralsalze. Bekannte Verfahren, die kommerziell angewandt wurden, um Pilz-a-Amylase aus der Fermentationsbrühe zu gewinnen, erforderten umständliche und aufwändige Verfahren, um ein gereinigtes Enzym zu erhalten und selbst dann waren noch unerwünschte Verunreinigungen vorhanden.

Die Erfindung betrifft die in den Patentansprüchen definierten Gegenstände.

Die Pilz-a-Amylase-enthaltenden Lösungen, die als AusgaugsmateriaJ für das erfindungsgemäße Verfahren angewandt werden, sind bekannt. Sie v.erden nach bekannten Verfahren durch Fermentation von ausgewählten Pilzstämmen, wie Aspergillus oryzae und anschließendes Abfiltrieren des Mycels gewonnen. Die entstehende wäßrige Fermentationsbrühe enthält die gewünschte Pilz-a-Amylase, zusammen mit löslichen Verunreinigungen, wie Salzen, Kohlenhydraten, organischen Säuren und anderen löslichen Enzymen, wie Amyloglucosidase.

Die erfindungsgemäß geeigneten Polycarbonsäuren sind die Polyacrylsäuren, die hydrolysierten Äthylen-Maleinsäureanhydrid-Copolymeren und die hydrolysierten Methylvinyläther-Maleinsäureanhydrid-Copolymeren. Diee Polyacrylsäuren sind bekannt und werden hergestellt durch Polymerisation von Acrylsäure oder Acrylsäurederivaten, wie Acrylamid oder Acrylsäureestern und anschließende Hydrolyse unter BiI-dung von freien Carboxylgruppen. Der Ausdruck »PoTyacrylsäuren« ist so zu verstehen, daß er PoIymethacrylsäuren und Salze von Polyacrylsäuren, wie die Natrium- und Ammoniumsalze umfaßt. Geeignete Polyacrylsäuren sind im Handel erhältlich. Diese feinteilieen festen Substanzen oder Flüssigkeiten sind alle in Wasser löslich oder leicht dispergierbar.

Die Äthylen-Maleinsäureanhydrid-Copolymeren, die nach Hydrolysierung erfindungsgemäß angewandt werden können, sind bekannt und im Handel erhältlich, als lineare Harze in Form der freien Säuren und des Anhydrids. Die freie Säure ist in Wasser löslich. Das Anhydrid isi im allgemeinen in Wasser unlöslich, aber es kann bequem durch Erhitzen gelöst werden, wobei durch Hydrolyse die frei Säure entsteht.

Die Methvlvinyläther-Maleinsäureanhydnd-Copolymeren, die nach Hydrolyse erfindungsgemäß angewandt werden können, sind bekannt und im Handel erhältlich. Sie sind in Wasser löslich und hydrolysieren langsam unter Bildung der freien Säure.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wird eine wäßrige Lösung von Pilz-a-Amylase mit einer Lösung der Polycarbonsäure vermischt. Die Polycarbonsäure wird in einer solchen Menge angewandt, daß das entstehende Gemisch 0,1 bis 1% (Gewicht/Volumen) Polycarbonsäure, bezogen auf das Gesamtvolumen des Gemischs, enthält. Der pH-Wert der Lösung von Pilz-a-Amylase, sollte im Bereich von 4 bis 4,5 liegen, wenn sie mit der Polycarbonsäure vermischt wird. Wenn der pH-Wert über 4,5 liegt, ist die Bildung an dem gewünschten Niederschlag gering. Wenn der pH-Wert unter ungefähr 4 liegt, kann die Pilz-a-Amylase inaktiviert werden. Die Mischtemperatur sollte O bis 5 C betragen, um den Verlust an Enzymaktivität herabzusetzen. Die Vermischungszeit sollte günstigerweise 30 bis 120 min betragen. Es hat sich als besonders günstig erwiesen, eine Filterhilfe, wie Diatomeenerde zu der Lösung der Pilz-a-Amylase zuzusetzen, vor der Zugabe der Polycarbonsäure. Diese Maßnahme erleichtert das Ausflocken des Pilz-a-Amylase-Polycarbonsäure-Komplexes und verbessert die Abscheidung des Komplexes, aus der die Verunreinigungen enthaltenden Lösung.

Der wie oben hergestellte Niederschlag aus Pilz-a-Amylase und Polycarbonsäure, kann abfiltriert, abzentrifugiert oder auf andere Weise von der restlichen, die Verunreinigungen enthaltenden Lösung abgetrennt werden. Da Pilz-a-Amylase im allgemeinen für die eventuelle Verwendung zur Herstellung von Produkten

für den menschlichen Verzehr bestimmt ist, ist es notwendig, im wesentlichen alle Spuren von PoIycarbonsäure zu entfernen. Der Pilz-a-Amylase-Polycarbonsäure-Niederschlag-Komplex wird gelöst, indem man ihn mit einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert oberhalb von 5 vermischt. Vorzugsweise liegt der pH-Wert zwischen 6 und 7. Zu der entstehenden Lösung wird dann ein Calciumsalz, wie CaJciumcarbonat, Calciumacetat, Calciumchlorid, Calciumoxid oder ähnliches, ein Magnesiumsalz, wie ein Magnesiumacetat, Magnesiumchlorid oder ein ähnliches, ein Bariumsalz, wie Bariumacetat, Bariumchlorid, Bariumoxid oder ein ähnliches oder ein Aluminiuinsalz, wie Aluminiumkaliumsulfat, Aluminiumsulfat oder ein ähnliches, zugegeben. Das zugegebene Salz kann auch angewandt werden, um die erforderlichen pH-Bedingungen in einem Bereich über 5 einzustellen. Diese zugegebenen Substanzen können einen festen Komplex mit der Polycarbonsäure bei pH-Werten oberhalb 5 ergeben und der entstehende Komplex kann von der gereinigten Pilz-u-Amvlase-Lösung abgetrennt werden. Die entstehende isolierte, gereinigte Pilz-u-Amylase kann, so wie sie ist, verwendet werden oder sie kann auf irgendeine geeignete Konzentration eingeengt oder nach bekannten Verfahren /ur weiteren Verwendung getrocknet werden. Die Lösung »so wie sie ist«, ist im allgemeinen gegenüber der Ausgangslösung um ein Mehrfaches konzentriert, was neben der hohen Reinheit den Vorteil hat, daß diese Konzentrierung ohne die Anwendung von Vakuum-Verdampfungsverfahren erreicht wird, wie sie üblicherweise angewandt werden.

Die Polycarbonsäure kann nur erneuten Verwendung in dem Verfahren zurückgewonnen werden. Der, wie oben gebildete Metallsalz-Polycarbonsäure-Komplex wird in Wasser aufgeschlämmt und mit einer stöchiometrischen Säure, wie Schwefelsäure, die stärker ist als die Polycarbonsäure, behandelt. Dabei wird die Polycarbonsäure aus dem Komplex freigesetzt und bildet sich ein Salz aus Jem Metallkation des Komplexes und der zugegebenen Säure. Wenn das entstehende Salz unlöslich ist, wie das Calciumsulfat, das bei der Umsetzung eines Calciumions und zugesetzter Schwefelsäure entsteht, wird der entstehende Niederschlag von der Polycarbonsäurelösung vor deren erneuter Verwendung abgetrennt. Wenn das entstehende Salz löslich ist, wie das Magnesiumsalz, das bei der Umsetzung zwischen einem Magnesiumkation und zugesetzter Schwefelsäure entsteht, kann die entstehende Lösung aus dem löslichen Salz und der Polycarbonsäure erneut verwendet werden, um F'ilz-a-Amylase zu gewinnen. Wenn der Amylase-Polycarbonsäure-Komplex-Niederschlag gebildet und vor Jen gebildeten Verunreinigungen abgetrennt wird, ist das wie oben entstehende lösliche Salz in der verbleibenden Flüssigkeit und wird verworfen.

Die Pilz-a-Amylase-Lösungen, die als Ausgangssubstanzen angewandt werden und die erhaltenen gereinigten Pilz-a-Amylase-Lösungen, die erfindungsgemäß hergestellt worden sind, wurden auf die folgende Weise auf ihre a-Amylaseaktivität untersucht. Eine α-Amylaseeinheit ist die Enzymaktivität, die erhalten wird, wenn in Gegenwart eines Überschusses an /9-Amylase, 1 g a-Amylase die Hydrolyse von 1 g Stärke zu Dextrin in 1 h unter Standard-Versuchsbedingungen katalysiert. Die Standard-Versuchsbedingungen sind 20 ml eines wäßrigen Substrats, enthaltend 0,4 §; lösliche Stärke und 0,01 g /5-Amylase; pH 5,0, 30⁰C; 10 ml einer a-Amylase-Lösung ausreichender Stärke, daß sie die Dextrinisierung der Stärke in ungefähr 8 bis 20 min katalysiert und eine Inkubationszeit, die ausreicht um die Dextrinbildung zu erreichen. Die Dextrinbildung wird bestimmt, wenn die Enzym-Stärke-Lösung eine gewünschte Standard-Farbe erreicht, wenn sie mit Jod zusammenkommt. Die Anzahl der a-Amylaseeinheiten wird nach der folgenden Formel berechnet:

a-Amylase-Einheit =

0,4 · 60

Enzym (g) ■ Dextrinisierungszeit (min)

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel näher erläutert:

Beispiel 1

Eine wäßrige: Lösung von Pilz-a-Amylase wurde erhalten durch Fermentieren eines wäßrigen Nährmediums mit einer Kultur von Aspergillus oryzae und Abfiltrieren des Mycels in an sich bekannter Weise. Das Filtrat wurde dann auf eine Temperatur im Bereich VOn O bis 4 C abgekühlt. Es wurde Diatomeenerde ?.ls Filterhilfe in einer Menge von 0,8% (Gewicht/ Volumen) zugegeben und gut vermischt. Der pH-Wert

Der Lösung wurde durch Zugabe ein?s Phosphorsäure-Natriummonohydrogenphosphat-Gemischs auf 4,0 eingestellt. Unter konstantem Rühren wurde eine 5%ige wäßrige Lösung einer Polyacrylsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von ungefähr 3 bis 5 Mill

zugegeben, um eine Gesamtkonzentration von 0,12% (Gewicht/Volumen), bezogen auf das Gesamtvolumen des Gemischs, zu erreichen. Das Gemisch wurde dann ungefähr 2 h stehengelassen und der entstehende Niederschlag von der die Verunreinigungen enthaltenden

Lösung abgetrennt. Die gewonnenen Feststoffe wurden dann mit Wasser in einer Menge von ungefähr 20%, bezogen auf das urpsrüngliche Volumen der Lösung, vermocht. Zu dieser Suspension wurde Calciumcarbonat in einer Menge von 1,5% (Gewicht/Volumen)

gegeben. Der pH-Wert des Gemischs stieg nach 1 stündigem Rühren auf 6. Das Reaktionsgemisch wurde dann filtriert. Die Gesamtmenge an isolierter, gereinigter Pilz-a-Amylase in dem entstehenden Filtrat betrug 93% der Enzymaktivität, wie sie in dem Filtrat

der ursprünglichen Fermentationsbrühe vorhanden war. Diese Enzymlösung konnte dann für ein bekanntes Verfahren zum Verflüssigen von Stärke angewandt werden.

Beispiel 2

200 mg Pilz-a-Amylase von Aspergillus oryzae wurden mit 100 ml einer 0,05 m Essigsäurepufferlösung, pH 3,5 vermischt, wobei ein pH-Wert von 4,0 auftrat. Der Puffer war vorher auf 0 bis 5°C abgekühlt worden.

Zu diesem Gemisch wurde eine wäßrige Lösung von 1 Gewichtsprozent einer Polyacrylsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von 90000 gegeben, um eine Gesamtkonzentration von 0,19% (Gewicht/ Volumen), bezogen auf das Gesamtvolumen des Ge-

mischs, zu erreichen. Die Gesamtkontaktzeit zwischen dem Enzym und der Polyacrylsäure betrug ungefähr 25 bis 30 min. Der entstehende Niederschlag wurde abgetrennt und es zeigte sich, daß er 71 % der Pilz-a-Amylaseaktivität des Ausgangsenzyms enthielt. Um

das Enzym in reiner Form zu erhalten, wurde der oben angegebene Niederschlag mit einer Calciumcarbonatlösung vermischt, um die Polyacrylsäure auszufällen und das gereinigte Enzym in Lösung zu erhalten.

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Reinigung von Pilz-a-Amylase, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung von Pilz-a-Amylase, die Verunreinigungen enthält, mit einer Polycarbonsäure bei einem pH-Wert von 4 bis 4,5 vermischt, daß man den entstandenen Niederschlag aus Pilz-a-Amylase und ό'ΐ Polycarbonsäuie von der die Verunreinigung cuthaltenden Lösung abtrennt, daß man diesen Niederschlag durch Vermischen mil einer wäßrigen I Ssung mit einem pH-Wert vor über 5 löst, dali man die entstandene Lösung mit einer Substanz, die bei pH-Werten oberhalb 5 einen festen Komplex mit der Polycarbonsäure ergibt, vermischt und daß man den aus dieser Substanz und der Polycarbonsäure entstandenen Niederschlag von der gereinigten Pilz-a-Amylase-Lösung abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Substanz ein Calciumsalz, Magnesiumsalz, Bariumsalz und/oder Aluminiumsalz und als Polycarbonsäure Polyacrylsäure, hydrosiertes Äthylen-Maleinsäureanhydrid-Copolymer und/oder hydrolysiertes Methylvinyläther-Maleinsäureanhydrid-Copolymer einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch I bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Polycarbonsäure in einer Konzentration \on 0,1 bis 1% (Gewicht/ Volumen), bezogen auf das Gesamtvolumen des entstehenden Gemischs, verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch I bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lösung der Pilz-u-Amylase auf eine Temperatur von 0 bis 5 C bringt.

5. Verfahren nach Anspruch I bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man zu der Pilz-a-Amylase-Lösung vor dem Vermischen mit der Polycarbonsäure eine Filterhilfe zusetzt.